專利名稱：編碼人α-干擾素的重組基因、表達載體及該干擾素的純化的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一個編碼人α-干擾素的重組基因及在酵母細胞中的表達。尤其是本發(fā)明涉及一個用酵母大量生產(chǎn)人α-干擾素的編碼人α-干擾素的重組基因，表達載體及用該載體轉化的酵母細胞，使用所述的酵母轉化體生產(chǎn)人α-干擾素的過程和以高收率在酵母細胞中生產(chǎn)的所涉及α-干擾素的純化過程。
干擾素，一種細胞活素，它是在動物細胞對病毒感染應答中所產(chǎn)生的一種抗病毒活性的蛋白質(zhì)。仍其來源不同將干擾系分為α-干擾素(IFN-α)，也稱為淋巴細胞干擾素，它最多是由B淋巴細胞，裸淋巴細胞或巨噬細胞產(chǎn)生;β-干擾素(IFN-β)，也稱為成纖維細胞干擾素，主要是由成纖維細胞或表皮細胞產(chǎn)生;γ-干擾素(IFN-γ)，又稱為免疫干擾素，主要是由T淋巴細胞與巨噬細胞產(chǎn)生(Stanton，G.J.etal.，Tex.Rep.Biol.Med.41，84-88(1981);Kirchner，H.etal.，TexRep.Biol.Med.41，89-93(1981)。
到目前為止，已有20多種類型α-干擾素基因被鑒定出，它們中編碼165或166個氨基酸。
在臨床試驗中最先使用的α-干擾素是由仙臺病毒(Sendaivirus)刺激淡黃層淋巴細胞所產(chǎn)生的。它的純度僅約為1%(Cantell，K.andHirvonen，Tex.Rep.Biol.Med.35，138-144(1977))。
最近，由重組DNA技術生產(chǎn)的人α-干擾素已經(jīng)用于臨床。結果，已經(jīng)報告它們在治療許多腫瘤疾病，特別是膀胱癌(Torti，F(xiàn).M.etal.，J.Clin.Onco.3，506-512(1985))和腎癌(Vugrin，D.etal.，CancerTreat.Rep.69，817-820(1985))進一步用于治療丙型肝炎(Davis，G.G.etal.，N.Engl.J.Med.321，1501-1506(1989);Bisceglie，A.D.etal.，N.Engl.J.Med.321.1506-1510(1989))。
用重組DNA技術生產(chǎn)人α-干擾素通常已被限制到以使用大腸桿菌作為受體菌的那些過程(Nagata，S.etal.，Nature284，316-320(1980);Goeddel，D.V.etal.，Nature287，411-416(1980);Streuli，M.etal.，Science209，1343-1347(1980);Goeddel，D.V.etal.，NAR8，4057-4074(1980);Dreynck，R.etal.，Nature287，193-197(1980))。這樣生產(chǎn)的α-干擾素可能與天然的α-干擾素不相同，因為大腸桿菌不能使這樣產(chǎn)生的蛋白質(zhì)糖化。此外，在α-干擾素被純化以后象大腸桿菌天然蛋白內(nèi)毒素內(nèi)仍然能殘留在α-干擾素內(nèi)。
在這種情況下，作為生產(chǎn)α-干擾素的受體菌，酵母菌比大腸桿菌有幾個優(yōu)點，即是說，在酵母菌中的糖化機制與在動物細胞中的糖化機制相似，進而，酵母菌還不產(chǎn)生對人體有害的任何物質(zhì)。相反酵母菌在幾個世紀以來具有被用于食品發(fā)酵這樣的事實。
盡管如此，當用重組DNA技術在酵母細胞中生產(chǎn)干擾素時，始終重要的仍然是從酵母天然產(chǎn)物中純化出所需要的干擾素用于臨床。
在大腸桿菌或酵母菌中生產(chǎn)的α-干擾素用反相高效液相色譜(Rubinstein，M.etal.，Arch.Biochem.Biophys.210，307-318(1981))或單克隆抗體親和層折(Berg.K.andHeron，I.，MethodsEnzymol.78，487-499(1981))已經(jīng)純化到高純度水平。
不必說，為了在臨床上能夠有用，干擾素的生物活性是很重要的。在這方面天然的α-干擾素有二個二硫鍵，即第1和第98個氨基酸位上的二個胱氨酸之間的一個和第29及第138個氨基酸位上的另一對胱氨酸之間的一個?？墒谴蠖鄶?shù)用大腸桿菌或酵母菌生產(chǎn)的α-干擾素以一種還原型形式存在。這種形式不具備以上所述的二硫鍵，或作為一種不完全氧化型形式即只有所述的一個二硫鍵，所有這樣的干擾素全部為變性狀態(tài)。進而，它們常常在純化過程中形成寡聚體，如相互間連鍵的雙聚體。
因而，人們一直做了許多努力以企圖獲得活性好、純度高的α-干擾素。
例如韓國第90-13450號專利申請披露的方法包含下述各步用一個常規(guī)方法在溶液中溶解從受體菌純化后獲得的變性α-干擾素，而這種溶液中已加入了一種還原劑，如β-巰基乙醇或二硫羥丁醇;重新折疊(refolding)所說的還原型α-干擾素，然后用離子交換層析分離出重折疊的α-干擾素，以獲得高純度、高活性的α-干擾素?？墒谴朔N方法有一個重折疊方面的缺陷，無活性的α-干擾素蛋白，如不完全氧化的或二聚體類物質(zhì)仍殘存在最終產(chǎn)品里。
如果使用一種陽離子交換層析，所說的無活性α-干擾素蛋白可被除去?？墒沁@種除去對提高活性α-干擾素的產(chǎn)量并無幫助。
本發(fā)明的目的是提供一個用在酵母細胞中有效地表達的編碼人α-干擾素的重組基因(rhIFN-α基因)。
本發(fā)明的另一個目的是提供一個含有所述rhIFN-α基因的表達載體和用此載體轉化的酵母細胞。
本發(fā)明的進一步目的是提供一種用酵母轉化體生產(chǎn)α-干擾素(hIFN-α)的方法。
本發(fā)明另一個目的就是提供一個以高產(chǎn)酵母轉體生產(chǎn)(hIFN-α)的方法。
因此，本發(fā)明在這里提供一個具有如

圖1所示的核苷酸序列rhIFN-α基因，它被設計成在酵母中生產(chǎn)成熟的hIFN-α。
另外，本發(fā)明提供一個能在酵母細胞中起作用的表達載體，以及包括所述的rhIFN-α基因和由此載體轉化的酵母細胞。
再者，本發(fā)明提供一個在酵母細胞中生產(chǎn)hIFN-α的方法，包括在一個適合表達rhIFN-α基因的培養(yǎng)條件培養(yǎng)酵母轉化體。
進一步，本發(fā)明提供一個高產(chǎn)量生產(chǎn)活性hIFN-α的方法，包括一種將無活性hIFN-α轉化成活性形式的步驟，即在含有一種還原劑的溶液中溶解由酵母細胞分離出的hIFN-α;在重折疊條件下，重折疊還原過的hIFN-α;進一步將含重折疊hIFN-α的溶液進行陰離子交換層析，洗脫出重折疊的hIFN-α;將這種洗脫液進行陽離子交換層析，從有活性hIFN-α中分離出無活性hIFN-α;以及用含有氧化硫醇殘基和還原硫醇殘基類的兩性氧化還原劑處理無活性hIFN-α，使之轉化為活性hIFN-α。
附圖簡要說明圖1A和1B分別表示本發(fā)明rhIFN-α基因的核苷酸序列和由此編碼的氨基酸序列，以及用一個分離的人mRNA制備的hIFN-αcDNA的核苷酸序列和由此編碼的氨基酸序列。
圖2表示啟動子AG885的核苷酸序列。
圖3A和3B為組建含有rhIFN-α基因的兩個表達載體的流程圖。
圖4A和4B給出在一個適合表達rhIFN-α基因的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的酵母轉化體細胞抽提物電泳結果。
圖5給出酵母轉化體蛋白樣品的CM-Sepharose柱層析結果。
圖6表示非還原性十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳使用CM-Sepharose柱層析所獲得的二聚體以及用兩性氧化還原劑處理二聚體得到的單體的圖譜。
圖7提供C18反相高效液相色譜分析用CM-Sepharose柱層析獲得的二聚體以及用兩性氧化還原試驗得到單體的結果。
所有在此引述的文獻中的下列述語具有如下的含義“人α-干擾素的活性形式”或“活性hIFN-α”術語是指具有2個雙硫鍵的單體人α-干擾素，即指第1和第98個氨基酸位上的兩個胱氨酸間的一個雙硫鍵和第29和第138個氨基酸位上的兩個胱氨酸間的另一個雙硫鍵。
“人α-干擾素的無活性形式”或“無活性hIFN-α”術語系指所有上述描述中無雙硫鍵的人α-干擾素，包括以寡聚形式未完全氧化的有一個雙硫鍵一類不正確連接的雙硫鍵類人α-干擾素。
所有測序過的酵母基因，特別是高表達基因，表明在61個可能的密碼子中有25個密碼子具有明顯優(yōu)勢;以及在每個基因中這25個優(yōu)勢密碼子傾向(bias)程度與它在細胞中的mRNA水平的相關性(BennetzentJ.L.andHallB.D.，TheJournalofBio.Chem.257，3026-3031(1982))。強表達的基因比較低水平表達基因有更多的傾向性。
進而，通常已知一個基因的轉錄和轉譯的效率會因mRNA二級結構的存在而下降，因而表達一個基因，其效率是一個很重要的因素。
基于上述事實，本發(fā)明rhIFN-α基因被設計成有酵母優(yōu)勢的密碼子以降低mRNA二級結構的形成，這一點是通過用新從人細胞分離出mRNA制備的hIFN-αcDNA5’-端區(qū)80個堿基對所對應的區(qū)域被替代達到的，這導致在酵母細胞中rhIFN-α基因轉錄和轉譯的效率。
為了基因操作的方便，將4個不同的限制性內(nèi)切酶酶切識別位點引入到rhIFN-α基因xbaⅠ位點(5’-TCTAGA-3’)位于第12和第13氨基酸(Ser和Arg)的密碼區(qū);HindⅢ位點(5’-AAGCTT-3’)位于第25到27氨基酸(Ile，Ser和Leu)的密碼區(qū);BalⅡ(5’-AGATCT-3’)位于第63到第65氨基酸(Glu，Ile和Phe)的密碼區(qū);SacI(5’-GAGCTC-3’)位于第88和89氨基酸(Glu和Leu)的密碼區(qū)。
起始密碼子ATG正好放在成熟IFN-αN端氨基酸(Cys)前面;兩個終止密碼子5’-TAA-3’和5’-TAG-3’放在C端第166氨基酸(Glu)的后面。為方便克隆起見，限制性內(nèi)切酶一個適當識別位點放在終止密碼子下游的位置或/和在起始密碼ATG之前。
按上述要求本發(fā)明制備的rhIFN-α基因有一個如圖1A中所描述的核苷酸序列。圖1A還顯示出在所述基因編碼多肽的氨基酸序列。
為表達所述rhIFN-α基因，本發(fā)明的表達載體可以用各種在酵母中起作用的系統(tǒng)來制備。
按照一種優(yōu)選實施方案，在一個含有GAP啟動子的載體中提供了一個由克隆rhIFN-α基因來制備的表達載體。更具體的是，用一個pYLBC-GAP-HGH質(zhì)粒制備表達載體，在這個質(zhì)粒中已含有GAP啟動子。這個表達載體在下面所給的實施例中將加以描述，并命名為Luck-α-IFN-1Y。
按照另一個優(yōu)選實施例方案，在一個含有按本發(fā)明所設計的AG885啟動子的載體中提供一個由克隆rhIFN-α基因來制備的表達載體，具體如下釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)的乙醇脫氫酶2(ADH2)活性是由乙醇和葡萄糖的存在而控制。亦已報告，當葡萄糖在培養(yǎng)基中被耗盡時，ADH2基因表達將提高約200倍，因為含有22個堿基對的上游激活序列(UAS)可通過ADR1-活性蛋白的結合得到刺激(Yuetal.，MolecularandCellularBiology9，34-42(1989))。在上述基礎上，本發(fā)明為在酵母菌上基因表達發(fā)育出一個新啟動子，它有200個核苷酸堿基對，內(nèi)含大量與GAPDH的TATA盒相同的DNA序列，并有90個核苷酸堿基對，內(nèi)含大量與ADH2上游激活序列相對的DNA序列，這個新啟動子稱為AG885。
啟動子AG885的核苷酸序列見圖2。
使用啟動子AG885的rhIFN-α基因的表達載體是按以下所述的實施例描述的方法制備的，命名為pYLBC-AG885-α-IFN。
本發(fā)明的表達載體，特別是pYLBC-AG885-α-IFN，可表達高產(chǎn)量的hIFN-α，至少約占總酵母菌蛋白的10%。
用Luck-α-IFN-1Y載體轉化的釀酒酵母菌于1990年12月12日保藏在韓國微生物培養(yǎng)保藏中心(KCCM)，編號為KFCC10715。1992年12月12日又請求將原保藏轉化為符合國際公認的用于專利程序目的的布達佩斯微生物保藏條約的保藏，保藏號為KCCM10019。用pYLBC-AG885-α-IFN載體轉化的釀酒酵母菌，于1991年12月17日保藏在韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)，保藏號為KCTC0028BP，該保藏符合布達佩斯條約的規(guī)定。
含有rhIFN-α-基因的、由表達載體轉化的酵母細胞是在能表達rhIFN-α基因的條件下培養(yǎng)。這些培養(yǎng)條件是按載體的特性和受體酵母菌細胞來確定的。
轉化酵母生產(chǎn)出的hIFN-α，可結合使用一些常規(guī)方法，例如，細胞破碎、離心、透析，鹽析出、層析，凝膠過濾，電泳和電洗脫等進行分離和純化。因此，和天然產(chǎn)品有相同生物活性的hIFN-α可按下述方法高產(chǎn)量獲得在一個含有還原劑的溶液里溶解從酵母細胞中分離出的hIFN-α;在重折疊條件下對還原過的hIFN-α進行重折疊;再將該溶液進行陰離子交換層析洗脫出重折疊rhIFN-α;將該洗脫液進一步進行陽離子交換層析從活性hIFN-α中分離出無活性hIFN-α，用含有氧化硫醇殘基和還原硫醇殘基的氧化還原劑處理無活性hIFN-α，使之轉化為活性hIFN-α。
無活性型的hIFN-α通過用一種氧化還原劑，特別是以一種含有適當比例的氧化硫醇殘基和還原硫醇殘基的氧化還原劑處理后就能轉變?yōu)榛钚孕蚳IFN-α。
在所述的氧化還原劑中，還原硫醇殘基的濃度最好約為1-10mM，氧化硫醇殘基濃度最好約0.1-1mM。所述的氧化還原劑還包括半胱氨酸和胱氨酸，也包括氧化谷胱苷肽和還原谷胱苷肽。
按上述純化方法，與人α-干擾素具有相同生物活性的多肽可以高產(chǎn)得以純化。
下面的實施例企圖特別地無限制范圍地舉例說明本發(fā)明;在實施例中使用的試驗方法按下述參考例進行實施。
除非特別指出，在下面所給出的在固體混合物中的固體，液體混合物中的液體、液體混合物中的固體的百分數(shù)分別按wt/wt，vol/vol和wt/vol來表示。
參考例1用限制性內(nèi)切酶消化DNA在此例中使用的限制性內(nèi)切酶和反應緩沖液均購自NEB(NewEnglandBiolabs，U.S.A)。
這種反應通常在一個滅菌的Eppendorf管中進行，反應體積范圍從50至100μl，37℃下進行1-2小時。最后，反應混合物在65℃熱處理15分鐘(或用酚抽提，乙醇沉淀以防熱抗性內(nèi)切酶)以滅活限制性內(nèi)切酶。
10x限制性內(nèi)切酶反應的反應緩沖液的組成如下10 x NEB反應緩沖液1∶100mM 雙Tris丙烷-HCL，100mM MgCl2，10mM 二硫蘇醇(DTT)，pH7.0。
10 x NEB反應緩沖液2∶100mM Tris-HCL，100mM MgCl2，500mM NaCl，10mM DDT，pH7.0.10xNEB反應緩沖液3∶100mM Tris-HCL，100mM MgCl2，100mM DTT，pH7.0。
10xNEB反應緩沖液4∶200mMTris乙酸，100mM乙酸鎂，500mM乙酸鉀，10mMDDT，pH7.0。
參考例2酚抽提和乙醇沉淀在酶反應完成以后，反應混合物用酚抽提其目的是滅活酶以及從反應液中提出DNA。但是，抽提用的酚應事先用10mMTris-HCl(pH8.0)和1mMEDTA緩沖液預平衡成飽和。酚抽提可通過混合等體積樣品和酚，然后劇烈振搖，在15000rpm的轉速下離心5分鐘，將水相移入一支新管中。上述過程應重復2-3次。
然后，水相用等體積氯仿溶液(氯仿∶異戊醇＝24∶1)抽提，再次分離出水相，加入0.1體積的3M乙酸鈉和2.5體積的乙醇，于-70℃放置30分鐘或-20℃放置12小時后，再用15000rpm于4℃離心20分鐘收集核酸。
參考例3連接反應DNA連接反應是在從NEB購買的T4 DNA連接酶和10 x 連接反應緩沖液(0.5M Tris-HCl，0.1M MgCl2，0.2M DTT，10mM ATP，0.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA))中進行的。反應體積通常為20μl，10單位T4連接酶被用于連接DNA粘性末端，而100單位T4連接酶被用于連接鈍性端的DNA。
反應在16℃進行5小時，或在4℃進行14小時以上，反應完成后，反應混合物在65℃加熱15分鐘以滅活T4DNA連接酶。
參考例4轉化大腸桿菌下面例子使用的大腸桿菌菌株包括大腸桿菌HB101(ATCC33694)，大腸桿菌W3110(ATCC27325)和大腸桿菌JM105(ATCC47016)。
宿主細胞在100ml LB液體培養(yǎng)基(1%Bacto胰胨，0.5% Bacto酵母浸膏，0.5% NaCl)中37℃培養(yǎng)，直到在650nm處光密度(OD)值達到0.25到0.5范圍為止。離心分離細胞培養(yǎng)物，然后用50ml 0.1M 氯化鎂(MgCl2)溶液洗細胞。離心獲得的沉淀細胞丸中加入50ml 0.1M CaCl2和0.05M MgCl2溶液，然后置冰浴30分鐘。再離心分離細胞并其懸浮在5ml 0.1M CaCl2和0.05M MgCl2溶液中。上述使用的試劑和材料在使用前需冷至0℃。
向上述獲得的0.2ml細胞懸液中加入10μl連接反應混合液。這種反應混合液在4℃放置40分鐘，然后在42℃加熱1分鐘。再加入2.0mlLB液體培養(yǎng)基，這樣處理的細胞在37℃培養(yǎng)1小時。然后，將其覆蓋到一陪替氏培養(yǎng)皿(Petridish)，該培養(yǎng)皿內(nèi)裝有LB固體培養(yǎng)基和適當?shù)目股?，例如氨芐青霉素，37℃過夜以獲得轉化體菌落。
一旦用M13載體轉化大腸桿菌，連接一個基因的M13載體DNA被加入到100μ1JM105細胞懸液中，15μl10mM異丙β-thioglactopyranoside，25μl4%X-Gal和3ml經(jīng)38℃預熱的2xYT軟固體培養(yǎng)基(1%NaC1，1%酵母浸膏，1.6%Bacto胰胨，0.7%Bacto瓊脂)。該混合物攪拌后加以2xYT固體培養(yǎng)基上(1%NaCl，1%酵母浸膏，1.6%Bacto胰胨，1.5%Bacto瓊脂)，37℃培養(yǎng)過夜獲得噬斑。
參考例5寡核苷酸的合成寡核苷酸的合成可采用自動固相磷胺化學法DNA合成儀(AppliedBiosystemInc.，380B，U.S.A.)來完成。
合成后的寡核苷酸用變性聚丙烯酰胺凝膠(2M脲，12%丙烯酰胺和雙叉丙烯酰胺(29∶1)，50mM Tris，50mM硼酸，1mM EDTA-Na2)電泳和乙腈與水的混合物作為洗脫液的SEP-PAK(Waters Inc.，U.S.A)柱層析進行純化。在260nm測量OD值確定洗脫液中寡核苷酸的量。
參考例6多聚酶鏈反應(PCR)向10-100ng模板DNA混合物中加入10x Taq多聚酶反應緩沖液(10mM Tris-HCl，500mM KCl，15mM MgCl2，0.1%(W/V)明膠，pH8.3)，10μl dNTP混合物(其中每一種dGTP，dATP，dTTP和dCTP為1.25mM)，2μg引物(通常2個引物用于該反應，一旦用3種引物，則位于中間的引物量為0.02μg)和0.5μlAmpliTaqDNA聚合酶(PerkinElmerCetus，U.S.A.)。用蒸餾水加至總體積為100μl，再加入50μl礦物油以保護反應物免于蒸發(fā)。
PCR是用一個熱循環(huán)儀來進行的，(PerkinElmerCetus，U.S.A.)熱循環(huán)要重復進行25次或更多，循環(huán)是這樣進行的95℃1分鐘→55℃1分鐘→72℃2分鐘。最后該反應在72℃進行10分鐘。
在反應完成后，用酚抽提反應物，用乙醇沉淀出PCR擴增產(chǎn)物，沉淀物溶解在20μlTE緩沖液中(10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH7.5)。
實施例1制備人α-干擾素cDNA(1-A)從人細胞中制備mRNA＜第1步＞從人細胞系KG-1中抽提總RNA人細胞系KG-1(ATCCCCL246)培養(yǎng)在RPMI164培養(yǎng)液(Gibco，Cat.430-3400EB，GrandIsland，NewYork14072U.S.A.)2-3天;離心移去培養(yǎng)液(750xg，10分鐘)。細胞沉淀丸(約5×107細胞)，懸浮在新鮮RPMI164培養(yǎng)基中，濃度為106細胞/毫升。向該懸浮細胞液中加入1/200體積的200mM J酸鈉，混勻后37℃培養(yǎng)48小時，再離心，細胞沉淀丸重新懸浮在新鮮的RPMI164培養(yǎng)基中。
為了誘導獲得的細胞產(chǎn)生hIFN-αmRNA，將新城疫病毒(NCD Virus-New Castle disease virus.ATCC VRO107)加入細胞懸液，混勻后于37℃培養(yǎng)12-20小時。上述誘導的約5×107細胞離心沉淀(750xg，10分鐘)，細胞沉淀丸用10mM RNAzo1B(Cinna/Biotecs，U.S.A.)溶解。向細胞溶解液中加入1ml氯仿，混合物劇烈振蕩15秒，在冰浴中放置5分鐘，然后在4℃以1200xg離心15分鐘，分成水/氯仿兩相，上層水相吸出再加入等體積異丙醇。
混合物在4℃放置15分鐘，并在4℃經(jīng)1200xg離心15分鐘沉淀出RNA。沉淀的RNA懸浮在200μl用二乙基焦碳酸鹽(DEPC)處理過的蒸餾水中，之后立即從中分離出帶有Poly(A)+尾巴的mRNA(Poly(A+)mRNA。
＜第2步＞Poly(A)+mRNA的分離按下述方法用mRNA分離試劑盒(StratageneInc.，Cat.＃200348，U.S.A.)進行Poly(A)+mRNA的分離。
取在＜第1步＞中獲得的樣品200μl在65℃加熱5分鐘，然后將其置于冰上加入20μl 10x樣品緩沖液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，5.0M NaCl，pH7.5)，將該混合物立即放在一個寡d(T)纖維素柱上以每秒1滴的速率洗脫。然后寡d(T)纖維素柱通過每次加入200μl高鹽緩沖液(10mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EDTA，0.5M NaCl)洗2次，洗脫速度每2秒1滴。用低鹽緩沖液(10mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EDTA，0.1MNaCl)200μl洗脫出Poly(A)+mRNA。被洗脫出的樣品用乙醇沉淀，然后溶解在100μl TE溶液中。
(1-B)cDNA文庫的制備＜第1步＞cDNA的制備為了以Poly(A)+mRNA制備cDNA，使用了Zap-cDNA合成試劑盒(Stratagene Ine.，U.S.A.，Cat.＃200400)。以Poly(A)+mRNA為模板，含有5′-GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCG AG(T)18-3′的核苷酸序列作為寡d(T)引物。
按下述方法制備cDNA的第一股鏈取在實施例(1-A)中制備的mRNA液18μl與2μl 0.1 MCH3HgOH混合，在室溫下放置10分鐘以使RNA二級結構折疊散開。然后加入2μl 1M β-巰基乙醇，進一步在室溫下保存5分鐘，依次加入5μl反轉錄酶反應緩沖液(500mM Tris-HCl，pH8.3，750mM KCl，30mM MgCl210mM DTT)，10mM dATP，dGTP，dTTP，和5-甲基dCTP各2.5μl，2μl寡-d(T)引物(1.4μg/μl)，15μl用DEPC處理過的蒸餾水和1.0μlRNA酶抑制劑(1單位/μl，Promega Inc.，U.S.A.)。上述混合物置室溫中10分鐘將引物連接到模板上，然后加入2.5μl Superscript RNA酶H-反轉錄酶(180單位/μl，BRL Inc.，Cat.No.8853SA)，反應混合物在37℃培養(yǎng)1小時以合成cDNA的第一股鏈。
cDNA的第二股鏈接下述方法進行在45μl上述第一股鏈溶液中按順序加入40μl 10 x 第二股鏈緩沖液(188mM Tris-HCl，pH6.9，906mM KCl，46mM MgCl2，1.5mM β-NAD(尼酰胺腺嘌呤二核苷酸)，10mM(NH4)2SO4)，分別加入10mM dATP，dCTP，dTTP，和dGTP各6.0μl，以及298μl蒸餾水。最后沿管壁滴入1.0μlRNA酶H(4單位/μl)和10.0μlDNA聚合酶I(11單位/μl)。連續(xù)振搖后，反應物置16℃培養(yǎng)2.5小時。
在上述反應物中加入等體積的酚-氯仿混合液1∶1)(v/v)抽提3次，其中酚事先已用0.5MTris-HCl(pH7.5)和0.1%(v/v)β-巰基乙醇液飽和過。上部水相吸入另一管中加入0.1體積3M乙酸鈉和2體積100%乙醇，-20℃過夜，進一步在4℃1200xg離心20分鐘獲得cDNA沉淀物。
＜第2步＞cDNA文庫的制備為了使雙股cDNA成為一個鈍性末端，在上述＜第1步＞中制備的cDNA沉淀物溶解在43.5μl蒸餾水中，并取出39μl與5.0μl T4 DNA聚合酶反應液(670mM Tris-HCl，pH8.8，166mM(NH4)2SO4，67mM MgCl2，100mMβ-巰基乙醇，67μM EDTA)，2.5μl 2.5mM dNTP混合物和3.5μl T4 DNA聚合酶(2.9單位/μl)混合，37℃放置30分鐘，用酚-氯仿抽提產(chǎn)品，與＜第1步＞中相同的方法用乙醇沉淀。
為了分別在5’-末端和3’，-末端提供限制性內(nèi)切酶Eco RI和xho I識別位點，鈍性末端雙股cDNA按下述方法處理向上述獲得的鈍性末端cDNA沉淀物中加入7.0μl Eco RI接頭(Stratagene Inc.，Zap-cDNA Synthesis Kit Cat.No.200400，U.S.A.)，1.0μl 10x連接緩沖液(500mM Tris-HCl，pH7.8，100mM MgCl2，200mM DTT，500μg/ml BSA)，1.0μl T4 DNA連接酶(1000單位/μl)和1.0μl 10mM ATP。上述混合物置4℃過夜，然后在70℃加熱10分鐘以滅活連接酶。
這樣獲得的產(chǎn)品用酚一氯仿抽提，用上述相同方法進行乙醇沉淀，然后將沉淀物溶解在16μlTE緩沖液中。
進一步在上述得到的溶液中加入2μl 10x緩沖液(0.5M NaCl，0.5M Tris-HCl，50mM MgCl2，5mM DTT，pH7.9)和1μl Eco RI和1μl xho I酶(New England Biolabs.Inc.，U.S.A.)。于37℃放置10分鐘以部分消化cDNA。再用酚一氯仿抽提cDNA片段。用上述相同方法進行乙醇沉淀，然后溶解在10μl TE緩沖液中。
所得的cDNA片段按下述方法克隆到UNI-ZAPXR載體上取10μl用EcoRI-XhoI酶消化的cDNA片段溶液，加入2.0μl10x連接緩沖液，2.0μl 10mM ATP，4.0μl已經(jīng)用Eco RI/Xho I酶消化過的載體UNI-ZAPXR溶液(1μg/μl，Stratagene Inc.，U.S.A.)以及2.0μlT4DNA連接酶(4Weiss單位/μl)，然后將反應混合物于16℃培養(yǎng)10小時。
＜第3步＞在體外將含有cDNA的載體裝入噬菌體，并增殖cDNA文庫。
為了將連接后的DNA裝入噬菌體，在＜第2步＞獲得的10μl溶液中加入Gigapack Ⅱ Gold PackagingExtract (Stratagene Inc.，U.S.A.)在室溫下靜置2小時，然后加入500μl噬菌體稀釋液(每1升中含有5.8g NaCl，2.0g MgSO4·7H2O，50ml 1M Tris-HCl，pH7.5，5ml 2%明膠)和20μl氯仿(參見Kretz et al.，Nucl.Acid.Res.17，5409(1989))。
按下述方法進行感染和增殖在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)PLK-F'(Stratagene Inc.，Zap-cDNA合成試劑盒，Cat，＃200400)，大腸桿菌merA-，和merB-菌株，直到于600nm處OD值(O，D，600)達到0.5為止。沉淀出培養(yǎng)的細胞，然后溶解在10mM MgSO4中，調(diào)整O.D.600值到1.0，取600μl這種菌液加入20μl裝入的混合物，37℃靜止15分鐘以允許被裝的噬菌體顆粒感染大腸桿菌。再在這種大腸桿菌菌液中加入6.5ml 0.7%溶化并保持在48℃的NZY瓊脂(每升中有7g NZ 胺，5gNaCl，2g MgSO4·7H2O，5g酵母浸膏，7g Bacto瓊脂)，混勻后倒入150mm直徑的NZY瓊脂平皿上(每升中含有7g NZ胺，5g NaCl，2g MgSO4·7H2O，5g酵母浸膏，16g Bacto瓊脂)，然后于37℃培養(yǎng)5-8小時以產(chǎn)生噬斑。將10ml噬菌體稀釋液倒入平皿中，于4℃輕搖該皿15小時以溶解噬菌體，該液經(jīng)4000xg離心沉淀出大腸桿菌并棄去。這樣獲得的cDNA文庫液中加入0.3%體積的氯仿，cDNA文庫的滴度被檢測為1010至1018PFU/ml(噬斑形成單位)，再加入100%二甲基亞砜(DMSO)使最終濃度為7%(v/v)，于-70℃保存cDNA文庫。
(1-C)用免疫測定法篩選cDNA文庫以及進行cDNA序列的定序。
用Huynh，T.V.etal.，DNACloningTechniquesAPracticalApproach(D.M.Glover.ed.)，pp49-78，IRLPress，Oxford(1985)介紹的免疫篩選法對cDNA文庫進行篩選以選出含有IFN-αcDNA的噬菌體。
在實施例(1-B)中制備的cDNA文庫液稀釋到每150mm直徑平皿上5萬個PFU，這種被稀釋的cDNA文庫液與600μl大腸桿菌XL-1藍(Stratagene Inc.，U.S.A.，Zap-cDNA合成試劑盒，Cat.No.200400)培養(yǎng)物(O.D.600＝0.5)混合，該培養(yǎng)物是用同實施例(1-B)中的＜第2步＞相同的方法制備得到的，然后加入6.5ml 0.7% NYZ瓊脂。每種混合液注入-40 NZY瓊脂平皿上，于37℃培養(yǎng)12小時，以產(chǎn)生2×106噬菌體噬斑。
進而，將132mm直徑的硝酸纖維素濾膜浸在10mMIPTG(isopropylβ-D-thiogalactopyrano-side)溶液中，然后在Whatman3MM濾紙上吸干，每張濾膜置于一每平皿中的瓊脂上，37℃培養(yǎng)3.5小時，然后將印有噬菌斑的每一張濾膜用15ml洗液(10mMTris-HCl，pH8.0，150mMNaCl，0.05%吐溫20)洗膜。將膜浸入15ml封閉液(1%牛血清白蛋白，20mMTris-HCl，pH7.5，150mMNaCl)中，室溫下輕輕振蕩培養(yǎng)1小時，再用15mlTBST緩沖液(20mMTris-HCl，pH7.5，150mMNaCl，0.05%(v/v)吐溫)在室溫下5分鐘內(nèi)溫和地洗膜5次。再放入15ml經(jīng)TBS緩沖液(20mMTris-HCl，pH7.5，150mMNaCl，內(nèi)含1%(w/v)胎牛血清(FBS)100倍稀釋過的抗IFN-α抗體液(Cat.＃853569;BoehringerMannheim.U.S.A.)中于室溫下輕蕩1小時。進一步在室溫下用TBST緩沖液輕蕩沖洗5次，每次5分鐘。將每一張膜放入15ml經(jīng)用TBS緩沖液(內(nèi)含1%(w/v)FBS)2000倍稀釋過的生物素化山羊抗鼠(biotinylated-goatanti-mouse)IgG和抗生物素蛋白堿性磷酸酶結合物(avidinconjugated-alkalinephosphatease(PierceInc.，U.S.A.))，，室溫下輕輕振蕩1小時。進一步在室溫下用TBST緩沖液在5分鐘內(nèi)輕輕地振蕩洗膜5次，每張膜用Whatman3MM濾紙吸干。
為了進行顯色反應，每張膜和15ml顯色液(100mM Tris-HCl，pH9.5，100mM NaCl，5mM MgCl2，5mg 硝基藍-四氮唑(nitro blue-tetrazolium)，2.5mg5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽)在暗室中于室溫下反應30分鐘?？捎萌庋鄞_定紫色的陰性噬斑，這就是所期望的表達了編碼IFN-αcDNA，每張膜用TBS緩沖液洗一次，加入顯色終止液(20mM Tris-HCl，pH2.9，1mMEDTA)終止顯色過程。然后在室溫下將膜干燥，用偏振光膠片記錄結果。
分離陰性噬斑，室溫下的噬斑置1ml噬菌體稀溶液(10mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2)中培養(yǎng)1-2小時。重復上述免疫篩選試驗以獲得作為單一噬斑的菌落。
象獲得編碼hIFN-α基因一樣確定的每一個噬斑放入一個無菌的微滲出管(microfuge tube)，該管中已裝有500μl SM緩沖液(每升中含有5.8g NaCl，2.0g MgSO4，50μl 1M Tris-HCl，pH7.5，5ml 2%明膠)。然后加入20μl氯仿，在室溫下振蕩培養(yǎng)管中內(nèi)容物1-2小時。將200μl這樣獲得的溶液(＞1×105噬斑顆粒)，1μl輔助噬菌體R408(＞1×106PFU/ml)，Stratagene Inc.，U.S.A.)和20μl大腸桿菌XL-1藍細胞懸液(O.D.600＝1.0)混合，然后于37℃培養(yǎng)15分鐘，再加入5ml2 x YT培養(yǎng)基(每升中有10g NaCl，10g 酵母浸膏，16g Bacto胰胨)，37℃振蕩培養(yǎng)3小時，再在70℃加熱20分鐘。最后將培養(yǎng)物稀釋100倍，取稀釋后的培養(yǎng)物200μl與200μl大腸桿菌XL1-藍細胞(O.D.600＝1.0)混合，37℃培養(yǎng)1小時后，再由其中取100μl加到含有50μg/ml氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)10小時以獲得含有雙股cDNA的pBluescript噬菌體轉染菌落。
為了制備單股DNA，上述獲得的pBluescript菌落進一步在含有四環(huán)素(12.5μg/ml)的LB瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，再次篩選獲取陰性菌落，這樣獲得的單個陰性菌落在一個四環(huán)素+LB肉湯培養(yǎng)基(2-3ml)中培養(yǎng)過夜，然后再用0.3ml超級液體培養(yǎng)基(3.5g Bacto胰胨，20g 酵母浸膏，5g NaCl，用NaOH調(diào)整pH至7.5)在37℃振蕩培養(yǎng)，用輔助噬菌體R408感染培養(yǎng)物，進一步培養(yǎng)8小時，直至OD600達到0.3。
用Sambrook，J.等(MolecularCloning，1，2.73-2.81，ColdSpringHarbor，N.Y.(1989))介紹的方法進行重組噬菌體核苷酸的分離和純化。
用純化的單股重組pBluescript噬菌體質(zhì)?；螂p股pBluescript噬菌體質(zhì)粒作為模板，按照Sanger的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.74，5405(1977))使用M13-20聚體，T7引物，KS引物，SK引物或T3引物(StratageneInc.，U.S.A.)進行核酸序列測定，從這些序列中推出的氨基酸序列在圖1B中。
實施例2用合成的寡核苷酸修飾hIFN-αcDNA的核苷酸序列設計和合成下列四個寡核苷酸以便于hIFN-αcDNA表達能夠達到最佳程度。這主要是在不改變氨基酸序列的前提下用更適合酵母菌的密碼子替代hIFN-αcDNA5’-末端的密碼，同時，以去除能夠形成mRNA二級結構的問題，這樣可以在轉錄和轉譯水平上提高hIFN-α在酵母菌中的表達效率。
IFN1: 5'-AAAACATGTGTGATCTGCCTCAAACTCACAGCCTGGGTTCTAGAAGAACCTTXbaI 位點GATGTTGCTAGCTCAAATGAGAAAGATAAGCTTGTTCTCCTG-3'IFN2:5'-GTCATTCAGTTGCTGGTAGACCTCAGT-3'IFN3:5'-ACTGAGCTCTACCAGCAACTGAATGAC-3'IFN4:5'-GGGGTCGACTATTATTCCTTACTTCTTAAACTTTCTTGCAAGTTTGTTGACSalI 位點AAAGAAAAGGATCTCATGA-3'用上述寡核苷酸進行PCR反應。在A管中加入2μgIFN1和2μgIFN2，在B管中加入2μgIFN3和2μgIFN4，每一個管中加入100ng在實施例(1-C)中所得到的含hIFN-αcDNA的DNA，10μl10xTaq聚合酶緩沖液，10μl10mMdNTP和2.5單位Taq聚合酶;加入蒸餾水調(diào)整總體積到100μl。按參考例6的方法進行第1次PCR之后，從每一個A管和B管中有大約250bp的PCR產(chǎn)物(PCR產(chǎn)物A和產(chǎn)物B)用乙醇沉淀出。
進一步，在上述相同條件下用PCR產(chǎn)物A和產(chǎn)物進行第2次PCR，可獲得大約510bp核酸片段，稱為IFN-Y。
實施例3rhIFN-α基因克隆到M13mp18載體及其核苷酸序列的測定。
在實施例2中獲得的含有IFN-Y的TE緩沖液10μl(約2μg核酸)中加入3μl10xNEB緩沖液3，16μl蒸餾水和1μl限制性內(nèi)切酶SalI(20單位/μl);混合物在37℃反應一個多小時，在5%聚丙烯酰胺凝膠電泳上分離出510bp消化片段，該分離片段用Elutip-D(Schleicher＆Schuell，U.S.A.)進行純化。純化片段稱為IFN-L，并在用于連接之前溶于10μl蒸餾水中。
另一方面，雙股M13mp 18 DNA(New England Biolabs，U.S.A.)用限制性內(nèi)切酶SmaI和SalI消化，在純化狀態(tài)下分離片段，在2μl 10 x 連接緩沖液(660mM Tris-HCl，pH7.6，66mM MgCl2，100mM DTT)，2μl 100mM ATP，2μl(0.2μg)IFN-L，1μl(約0.1μg)M13mp18 DNA(已用SmaI和SalI消化)和12μl蒸餾水混合物中加入1μl T4 DNA連接酶;16℃反應5小時，然后，將上述反應物10μl與大腸桿菌JM105(ATCC 47016)反應，使大腸桿菌被轉化，采用的方法是Hanahan法(刊載在J.Mol.Biol.116，557(1983))。
向上述處理過的大腸桿菌細胞混合物中再加入7.5μl0.2MIPTG，再與3ml2xYT軟瓊脂培養(yǎng)基(每升中有16gBacto胰胨，10g酵母浸膏，5g NaCl，6g Bacto瓊脂)和25μl 4%X-gal溶液混合，平輔在Min A 固體培養(yǎng)基上(每升中含有10.5g K2HPO4，4.5g KH2PO4，1g(NH4)2SO4，0.5g 檸檬酸鈉，12g Bacto瓊脂，1ml 20%MgSO4，0.5ml 1%維生素B和10ml葡萄糖)，37℃培養(yǎng)過夜。
這樣獲得的噬斑，按照Sambrook，J.等人的方法(MolecularCloning，ColdSpringHarbor，N.Y.(1989))挑選出來并用來得到一個單股核酸。重組hIFN-α基因的核苷酸序列用雙脫氧DNA測序方法(Sanger，F(xiàn)，etal.，P.N.A.S.，844767(1987))來確定;在圖1A中有這段序列的rhIFNA-α基因被選出;含有所述核苷酸序列的M13mp18，被命名為M13mp18-IFN-α。
實施例4表達載體的制備(4-A)Luck-α-IFN-1Y載體的制備用限制性內(nèi)切酶PstI和SalI在NEB緩沖液3中將約2μgpYLBC-GAP-HGH質(zhì)粒(韓國公開的專利第90-9975號)完全消化，用限制性內(nèi)切酶PstI和BstBI在NEB緩沖液4中完全消化另外2μg所述的質(zhì)粒。每一種被消化的質(zhì)粒都通過0.7%瓊脂糖凝膠分離出約9.8Kb和3.4Kb的片段，并分別被稱為PL和PB片段。
含有在實施例3中獲得的rhIFN-α基因的M13mp18-IFN-α載體約5μg用限制性內(nèi)切酶XbaI和SalI在NEB緩沖液3中完全消化，然后用氯仿-酚抽提，乙醇沉淀。沉淀出的核酸(這里稱為IFN-X/L)溶解在10μlTE液中。
用上述獲得的片段進行連接反應;同時使用一個合成的連接子。
(5'-TCGAATAAACACACATAAACAAACACCATGTGTGATCTGCCTCAAACTCACAGCCT3'-TATTTGTGTGTATTTGTTTGTGGTACACACTAGACGGAGTTTGAGTGTCGGA-GGGTT-3'-CCCAAGATC-5').
給一支試管中加入200ngIFN-X/L片段，50ng連接子，100ngPL片段，100ngPB片段，2μl10x連接反應緩沖液，10單位T4DNA連接酶，再加入蒸餾水使總體積為20μl，置16℃培養(yǎng)12小時。這樣獲得的含有rhIFN-α的表達載體稱為Luck-α-IFN-1Y。上述過程在圖3A中表示出。
(4-B)pYLBC-AG885-α-IFN表達載體的制備
＜第1步＞合成引物和進行PCRADH2(5’-TCTCCAACTTATAAGTTGGAGA-3’)啟動子的UAS，GAPDH啟動子的TATA盒和含有在hIFN-α基因5’-端核序列的111bpDNA，連同下述的二個啟動子ADHGAP和GAPIFN用PCR。
合成如下引物1、ADHGAP引物5'-AGACGGATCCTCCTCTGCCGGAACACCGGGCATCTCCAACTTATAATGTTGGAGAAATAAGAGAATTTCAGATTGAGAGAATGAAAAAAAAAAACTGAAAAAAAAGGTTGAAAC-3'2、GAPIFN引物5'-TTCTTCTAGAACCCAGGCTGTGAGTTTGAGGCAGATCACACATGGTGTTTGTTTATGTGTG-3'ADHGAP引物由114個堿基組成，在5’-端第94個堿基含有一個BamHI識別位點和ADH2啟動子的UAS，其余部分序列能夠被連接到GAPDH啟動子上(GAPDH的第198至第178個堿基上)。
GAPIFN引物含有一個限制性內(nèi)切酶的XbaI的識別位點，一個hIFN-α基因的啟始密碼子以及在3’-端處的一段GAPDH啟動子序列(含有18個堿基，從第1至第18位)(Holland，etal.，J.Biol.Chem.254，9839-9845(1979);Bitteretal.，Gene32，263-274(1984)。
這兩種引物的結構如下ADHGAP引物5'-AGAC-GGATCC-TCCTCTGCCGGAACACCGGGCATCTCCAACTTATAATGTTGGAGAABamHI位點含有下述序列的UAS堿基序列ATAAGAGAATTTCAGATTGAGAGAATGAAAAAAAAAAACT-GAAAAAAAAGGTTGAAC-3ADH2啟動子GAPDH(第198至第178位)GAPIFN引物
5'-TTCT-TCTAGA-ACCCAGGCTGTGAATTTGAGGCAGATCACACAT-XbaI位點rhIFN-α基因起始密碼子GGTGTTTGTTTATGTGTG-3'GAPDH(第1至第18位)啟動子區(qū)使用所述的兩種引物和含有GAPDH啟動子(ATCC74119，參見韓國專利申請?zhí)?1-25882)的pYLBC5質(zhì)粒作為模板，按下述方法進行PCR。
給10ng至100ng作為模板的pYLBC5質(zhì)粒DNA，10μl 10xTaq多聚酶緩沖緩(10mM Tris-HCl，pH8.3，500mMKCl，15mM MgCl2，0.1%(w/v)明膠)，10μl dNTP混合物(1.25mM.dGTP，dATP，dTTP和dCTP)，2μgADHGAP引物，2μg GAPIFN引物和0.5μl Amp li Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus，U.S.A.)組成的混合液中加入蒸餾水，使終體積達到100μl，另再加50μl礦物油防止蒸發(fā)。用熱循環(huán)儀進行最初的PCR(Perkin Elmer Cetus，U.S.A.)，按下列熱循環(huán)程序重復進行25次90℃1分鐘。55℃1分鐘。70℃2分鐘，最后于70℃放置10分鐘。
向上述反應液中加入等體積酚/氯仿，離心除去聚合酶。上清液被移入一支新試管，然后加入1/10體積3M乙酸鈉和2.5體積100%乙醇。離心分離混合物以獲得320bpDNA片段，稱為AG885。將該核酸溶解在20μlTE緩沖液(10mMTris-HCl，pH7.5，1mMEDTA)待下步使用。
＜第2步＞消化pYLBC5質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶PstI和SalI在NEB緩沖液3完全消化2μgpYLBC5質(zhì)粒。用同樣方法再完全消化另外2μgpYLBC5質(zhì)粒。消化后，每一種質(zhì)粒片段用0.7%瓊脂糖凝膠電泳分離出約9.84kb和3.0kb片段，分別稱為PK和PS。
＜第3步＞分離rhIFN-α基因片段由實施例3中獲得的含有rhIFN-α基因的M13mp18-IFN-α載體約5μg用限制性內(nèi)切酶XbaI和SalI在NEB緩沖液3中進行完全消化再行瓊脂糖凝膠電泳，從而獲得約450bprhIFN-α基因片段，稱為IFN-XL。
在上述＜第1步＞獲得的AG885片段約2μg用限制性內(nèi)切酶XbaI和BamHI在NEB緩沖液3中完全消化后，進一步用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。將沉淀所得的核酸片段(這里稱為AG885-X/B)溶解在10μlTE液中。
＜第4步＞制備pYLBC-AG885-α-IFN質(zhì)粒對＜第2步＞和＜第3步＞獲得的片段按下述方法進行連接。在一支試管中加入200ngIFN-X/L片段，200ngAG885-X/B片段，100ngPK片段，100ngPS片段，2μl10x連接緩沖液和10單位T4DNA連接酶。然后加蒸餾水至終體積20μl，混合物在16℃反應12小時。上述過程在圖3B中給出。
實施例5用表達載體轉化酵母菌，從而進行rhIFN-α基因的表達(5-A)用Luck-α-IFN-1Y轉化酵母菌并表達rhIFN-α基因在實施例(4-A)中獲得的重組質(zhì)粒Luck-α-Y用堿溶法(Ish-Horowicz，D.，etal.，Nucl.AcidRes，9，2989(1981))大量抽提以用于下列轉化過程。用質(zhì)粒轉化酵母菌是用Veges(Nature275，104(1978)和Hinnen(P.N.A.S.751929(1978))介紹方法進行。
用已經(jīng)過夜培養(yǎng)的S.cerevisiae酵母菌DCO4(YeastGeneticStockCenter，DepartmentofBiophysicsandMedicalPhysics，UniversityofCalifornia，，CA94720，U.S.A.)接種到50ml新鮮YEPD培養(yǎng)基，在30℃下振蕩培養(yǎng)直到于650nm處O.D值達到0.8到1.0為止。然后以5000rpm離心5分鐘分離出細胞。沉淀細胞懸浮在20ml水中，離心，再懸浮在20ml1M山梨醇溶液中，進一步重新離心分離。
沉淀細胞丸溶解在5ml SP(1M山梨醇，50mM 磷酸鈉，pH7.5)和5μl 1M DTT;然后加入50μl xymolase(10mg/ml溶于50%甘油/50%SP中)。30℃以15Orpm的轉速振蕩培養(yǎng)30分鐘。在培養(yǎng)期間可取出少量培養(yǎng)物用1/10體積的0.1%SDS處理;在光學顯微鏡下檢查原生質(zhì)球(Spheroplast)形成的程度，直到至少大約90%酵母細胞轉為原生質(zhì)球，通常30分鐘就停止培養(yǎng)。在完成培養(yǎng)后，該培養(yǎng)物用Dynac離心機以1500rpm離心3分鐘以獲得原生質(zhì)球。這樣得到的原生質(zhì)球用5ml 1M 山梨醇和5mlSTC(1M山梨醇，10mM CaCl2，10mM Tris-HCl，pH7.5)洗滌，最后溶解在1mlSTC以備Luck-α-IFN-1Y轉化用。
在12.5μl 5-10μg質(zhì)粒核酸與12.5μl 2x STC的混合液中加入50μl原生質(zhì)球，然后在室溫下培養(yǎng)10分鐘，再往其中加入500μl PEG/TC溶液(40%PEG-4000，10mM CaCl2，10mM Tris-HCl，pH7.5)靜置10分鐘后，用Dynac離心機以1500rpm離心13分鐘分離出原生質(zhì)球。沉淀的原生質(zhì)球再溶解在200μl 1M山梨醇溶液中。
含有原生質(zhì)球的溶液與7ml再生瓊脂(每100ml中含有3g Bacto瓊脂，50ml 2M山梨醇，0.67g無氨基酸的酵母氮堿基，0.1g無亮氨酸的氨基酸混合物，0.4ml50%葡萄糖，45ml水)，將該混合液倒入一個缺乏亮氨酸的瓊脂平皿中(182g山梨醇，20g Bacto瓊脂，6.7g無氨基酸的酵母氮堿基(Difco，U.S.A.)，0.25g Leu-補充劑，4ml 5%蘇氨酸，40ml 50%葡萄糖和820ml水)，于30℃培養(yǎng)3-5天以得到用重組質(zhì)粒Luck-IFN-α-1Y轉化的酵母菌落。
每一個轉化的酵母菌菌落應在3ml缺乏亮氨酸的培養(yǎng)基中(每升中含6.7g無氨基酸的酵母氮堿基，0.25g無亮氨酸的氨基酸混合物和6%葡萄糖)于37℃培養(yǎng)24小時，然后將培養(yǎng)物接種到100mlYEPD培養(yǎng)基(2%胰胨，1%酵母浸膏，2%葡萄糖)進一步在30℃培養(yǎng)24小時。
培養(yǎng)物的最終OD值(650nm處)約為25，對應于10個OD值的培養(yǎng)物量進行離心，溶解在400μl緩沖液中(10mMTris-HCl，pH7.5，1mMEDTA，2mMPMSF，8M脲)。再向該溶液中加入等體積0.4mm直徑大小的玻璃珠，劇烈攪拌以破壞細胞壁。10μl這樣獲得的酵母提取物按Laemmli等介紹的方法(Nature277，680(1970)在15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳并用考馬斯亮蘭(CoomassieBrilliantBlue)R250染色以確定基因產(chǎn)品的表達情況。結果顯示在圖4A中。
在圖4A中，第1和第2行均顯示含有Luck-α-IFN-1Y表達載體的酵母細胞的提取物;第3行顯示不含有表達載體的酵母細胞提取物;第4行表示出標準蛋白大小標志，從上至下分子量分別為43kd，29kd，18.4kd，6.5kd和3.8kd。
(5-B)用pYLBC-AG885-α-IFN表達載體轉化酵母菌和rhIFN-α基因表達在實施例(4-B)中獲得的重組質(zhì)粒pYLBC-AG885-α-IFN可通過堿溶法(Ish-Horowicz，D，etal.，Nucl，AcidRes，9，2989(1981)大量制備以用于轉化。
實施例(5-A)的轉化過程可用pYLBC-AG885-α-IFN質(zhì)粒替代Luck-α-IFN-1Y質(zhì)粒重復進行以獲得用pYLBC-AG885-α-IFN重組質(zhì)量轉化的酵母菌落。
轉化的酵母菌在3ml缺乏亮氨酸的培養(yǎng)基中(每升中含6.7g無氨基酸的酵母氮堿基，0.25g無亮氨酸的氨基酸混合物和6%葡萄糖)30℃培養(yǎng)24小時。然后，該培養(yǎng)物接種到100mlYEPD培養(yǎng)基中(2%胰胨，1%酵母浸膏，2%葡萄糖)并在30℃培養(yǎng)24小時。
該培養(yǎng)物最終OD值(650nm處)大約是25，對應于10個OD值的培養(yǎng)物量離心后溶解在400μl緩沖液中(10mMTris-HCl，pH7.5，1mMEDTA，2mMPMSF，8M脲)。向該培養(yǎng)液中加入等體積的直徑為0.4mm的玻璃珠，劇烈攪拌破碎細胞壁。取這樣獲得的酵母抽提物10μl按Laemmli等介紹的方法(Lature277，680(1970))進行15%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，再用考馬斯亮蘭R250染色，以確定基因產(chǎn)品的表達，結果顯示在圖4B中。
在圖4B中，第1行表示不含有pYLBC-AG885-α-IFN表達載體的酵母細胞提取物，第2行和3行表示含有pYLBC-AG885-α-IFN表達載體的酵母菌在培養(yǎng)4小時后的菌體提取物，第4和第5行表示含有pYLBC-AG885-α-IFN在培養(yǎng)48小時后的菌體提取物，第6行表示標準蛋白大小標志，從上至下分子量分別為43kd，29kd，18.4kd，14.3kd，6.5kd和3.3kd。
實施例6純化酵母菌生產(chǎn)的hIFN-α(6-A)破碎酵母轉化體培養(yǎng)物在實施例(5-B)中獲得的用重組質(zhì)粒Luck-α-IFN-1Y轉化的能表達hIFN-α酵母菌1kg懸浮在緩沖液(20mMTris-HCl，1M脲，1mMEDTA，1mMPMSF，pH8.0)勻漿器(Beckman)混勻，然后以每分鐘750ml的速度用裝有0.5-0.75mm直徑玻璃珠的珠磨破碎儀(BiospecProduct，U.S.A.)處理。將含有破碎的酵母菌溶液在4℃以12000rpm離心50分鐘(BeckmanJA-14，Rotor)，上清液棄去，收集沉淀物并懸浮在2升緩沖液(20mMTris-HCl，1M脲，1mMEDTA，0.1%TritonX-100，pH8.0)中，用勻漿器(Beckman)混勻，懸液進一步用離心機(BeckmanJA-14，Rotor)以12000rpm離心50分鐘，分離出沉淀，收集的沉淀物再懸浮在2升1M鹽酸胍溶液(Amresco)用勻漿器混勻后以12000rpm離心30分鐘，分離出大約600g沉淀物。
(6-B)溶解在胍溶液中的蛋白沉淀物在實施例(6-A)中獲得的600g沉淀物溶于1.8升6M胍溶液(6M鹽酸胍，20mMTris-HCl，100mMβ-巰基乙醇，pH8.0)中，4℃攪拌過夜。該溶液用離心機(BeckmanJA-14Rotor)在4℃以12000rpm離心除去沉淀，大約收集到2.1升深棕色上清液，用緩沖液(20mMTris-HCl，0.1mMPMSF，pH8.0)稀釋4倍，離心得到上清液，該上清液用超濾膜濃縮到2升。然后，將該濃縮液對50升緩沖液(20mMTris-HCl，0.12MNaCl，0.1mMPMSF，pH8.0)在4℃透析3次。
(6-C)DEAE-纖維素柱層析將實施例(6-B)獲得的溶液在4℃以12000rpm離心30分鐘(BeckmanJA-14Rotor)以棄去沉淀物，收集的上清液上樣到DEAE-纖維素基質(zhì)柱(Whatman)上，該柱事先已用緩沖液(20mMTris-HCl，0.12MNaCl，0.1mMPMSF，pH8.0)以10cm/hr速度平衡過。將通過該柱而沒有吸附到柱內(nèi)基質(zhì)上的蛋白溶液用50升緩沖液(50mM乙酸鈉，pH4.5)透析3次。
透析過的蛋白溶液在4℃以12000rpm離心30分鐘(BeckmanJA-14Rotor)除去沉淀。
(6-D)CM-葡萄糖柱層析將實施例(4-C)中獲得的50mM乙酸鈉和透析過的蛋白溶液(pH4.5)混合液加樣到事先以15cm/hr速率用緩沖液(20mMTris-HCl，0.12MNaCl，0.1mMPMSF，pH8.0)平衡過的CM-Sepharose基質(zhì)柱中。該柱用相同緩沖液洗到未結合到基質(zhì)上的蛋白峰降到足夠低時，用另一種緩沖液(50mM乙酸鈉，0.12MNaCl，pH4.5)進行洗脫結合在基質(zhì)上的蛋白質(zhì)。當這時出現(xiàn)的蛋白峰降低時，可改用另一種緩沖液(50mM乙酸鈉，0.5MNaCl，pH4.5)進一步進行洗脫過程。CM-Sepharose層析的結果以280nm處的OD值來表示，已列在圖5中。
在圖5中，暗杠(a)表明含有部分氧化的hIFN-α洗脫組份;暗杠(b)表明主要含活性型的與天然hIFN-α的單體hIFN-α洗脫組份;暗杠(c)表示主要含有雙聚體hIFN-α的洗脫組份。部分氧化的hIFN-α，活化型hIFN-α和雙聚體hIFN-α按順序依次洗脫出。為了完全從hIFN-α中移出部分氧化的hIFN-α和雙聚體hIFN-α，對應于杠(b)洗脫組分液加樣到CM-Sepharose柱層析，從而獲得高純活性型單體hIFN-α。
如果必要，用凝膠滲透層析可進一步進行純化。
上述獲得的蛋白溶液以3cm/hr的流速通過S-300(Pharmacia)柱，該柱事先已用緩沖液(20mM乙酸銨，0.12MNaCl，pH4.5)平衡過。洗脫出的各種收集組份加樣進行非還原SDS-PAGE，只有含活性型單體hIFN-α的，量并不大的寡聚hIFN-α組分被收集到。該收集的蛋白溶解液對20升PBS緩沖液透析3次。
(6-E)將無活性的hIFN-α轉化為活性型在實施例(6-D)中所得到的雙聚體hIFN-α(圖5(C))經(jīng)15%非還原SDS-PAGE鑒定后，收集并對20mMTris-HCl(pH8.0)透析。
在上述透析過的溶液中加入半胱氨酸(Sigma)和胱氨酸(Sigma)使終濃度分別為5mM和0.5mM，攪拌后在4℃或室溫下靜置5個多小時。將該溶液上樣進行SDS-PAGE以確定二聚體轉化為單體。結果，將溶液對緩沖液(50mM乙酸鈉，pH4.5)進行透析。圖6顯示15%非還原SDS-PAGE在未轉化前二聚體hIFN-α(a)和轉化成單體hIFN-α(b)的結果。
相同的結果也通過用氧化谷胱甘肽和還原谷胱甘肽獲得過。
透析樣品，采用與實施例(6-D)相同的方法加樣到CM-Sepharose柱層析和凝膠滲透層析可獲得高純活性型單體hIFN-α。
在實施例(6-D)中獲得的部分氧化hIFN-α(圖5中的(a))可采用上述相同的轉化步驟而獲得活性型hIFN-α。
(6-F)hIFN-α的生物活性測定純化的hIFN-α的生物活性可以通過hIFN-α抗病毒的抗致細胞病變活性來確定。
雄牛犢腎細胞懸液(MDBK，3.5×105細胞/ml)在T75瓶中培養(yǎng)后，分別以每孔100μl加入到96孔平底板孔中，在5%CO2培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)18-24小時。100μl水泡性口膜炎病毒(1×105至4×105PFU/ml)接種到用PBS緩沖液(pH7.0)洗過的板孔中，進一步在5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)18-24小時以形成細胞單層。在實施例(6-D)和(6-E)中獲得的hIFN-α樣品，每一種100μl按順序稀釋后加入板孔內(nèi)，在5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)48小時。最后，每孔中加入結晶紫雜液，測定其O.D.600值。
用Lowry方法測定hIFN-α中的蛋白濃度，從美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)獲得的hIFN-α標準品(Gxa-01-901-535)特異性活性為2.0×105IU/mg。
活性測定結果表明在實施例(6-D)和(6-E)中獲得的單體hIFN-α都有1.8×108IU/mg或更高的特異性活性。據(jù)此，從雙聚體hIFN-α和部分氧化hIFN-α轉化的hIFN-α具有與開始從CM-Sepharose層析中獲得的活性型單體hIFN-α相等的生物學活性。
(6-G)反相HPLC進行反相HPLC主要是確定在實施例(6-D)和(6-E)中獲得的hIFN-α之間的同一性。
兩種蛋白樣品通過C18柱(μ-Bondapak，Waters)該柱事先用15%(v/v)乙腈(15%乙腈/0.05%三氟乙酸/H2O)平衡。加樣后在5分鐘后快速殘性梯度達到25%(v/v)乙腈，然后在35分鐘后緩慢線性梯度達到56%(v/v)乙腈。圖7顯示該結果，在同一位置洗脫出2個蛋白峰，據(jù)此可以證實，用上述兩種方法獲得所述的hIFN-α從生理化學角度講與天然hIFN-α是相同的。
雖然按上述特別具體化的說明了本發(fā)明，但還應該認識到可能作了各種修飾和改變。這些可能對那些本領域普通技術人員來說是明顯的，也可能落入像權利要求所限定的本發(fā)明范圍之中。
權利要求
1.一種具有下列核苷酸序列的重組人α-干擾素基因30ATG TGT GAT CTG CCT CAA ACT CAC AGC CTG60GGT TCT AGA AGA ACC TTG ATG TTG CTA GCT90CAA ATG AGA AAG ATA AGC TTG TTC TCC TGC120TTG AAG GAC AGA CAT GAC TTT GGA TTT CCC150CAG GAG GAG TTT GGC AAC CAG TTC CAA AAG180GCT GAA ACC ATC CCT GTC CTC CAT GAG ATG210ATC CAG CAG ATC TTC AAT CTC TTC AGC ACA240AAG GAC TCA TCT GCT GCT TGG GAT GAG ACC270CTC CTA GAC AAA TTC TAC ACT GAG CTC TAC300CAG CAA CTG AAT GAC CTG GAA GCC TGT GTG330ATA CAG GGG GTG GGG GTG ACA GAG ACT CCC360CTG ATG AAG GAG GAC TCC ATT CTG GCT GTG390AGG AAA TAC TTC CAA AGA ATC ACT CTC TAT420CTG AAA GAG AAG AAA TAC AGC CCT TGT GCC450TGG GAG GTT GTC AGA GCA GAA ATC ATG AGA480TCC TTT TCT TTG TCA ACA AAC TTG CAA GAAAGT TTA AGA AGT AAG GAA TAA TAG
2.含有如權利要求1所述的重組人α-干擾素基因的表達載體，其中所述的基因位于酵母細胞中能被表達的位點上。
3.如權利要求2所述的載體，它是Luck-α-IFN-1Y(KCCM 10019)。
4.如權利要求所述的載體，它是pYLBC-AG885-α-IFN(KCTC 0028BP)。
5.用權利要求2所述的表達載體轉化的酵母細胞。
6.如權利要求5所述的轉化酵母細胞，它是釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae DCO4 Luck-α-IFN-1Y。
7.如權利要求5所述的轉化酵母細胞，它是釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae DCO4 pYLBC-AG 885-α-IFN。
8.一種生產(chǎn)人α-干擾素的方法，包括培養(yǎng)如權利要求5、6或7中所述的酵母細胞。
9.一種由權利要求8所述的方法生產(chǎn)的人α-干擾。
10.一種純化酵母細胞生產(chǎn)的人α-干擾素的方法包括將無活性形式的人α-干擾素轉化為活性形式的步驟，該方法包括(A)溶解酵母細胞產(chǎn)生的人α-干擾素，溶液中含有一種還原劑，然后在重新折疊條件下控制已還原的人α-干擾素;(B)將上述含有重折疊的人α-干擾素溶液進行陰離子交換層析以分離出已重折疊過的人α-干擾素;(C)將上述已重折疊過的人α-干擾素進行陽離子交換層析，從有活性的人α-干擾素分離出無活性的人α-干擾素;(D)用含有氧化巰殘基和還原巰殘基的氧化還原試劑處理無活性人α-干擾素，使其轉化為活性型。
11.如權利要求10所述的方法，其中所述的氧化還原試劑含有1-10mM還原巰殘基和0.1-1mM的氧化巰殘基。
12.如權利要求10所述的方法，其中所述的氧化還原試劑包括胱氨酸和半胱氨酸。
13.如權利要求10所述的方法，其中所述的氧化還原試劑包括氧化谷胱甘肽和還原谷胱甘肽。
14.由權利要求10所述的方法純化得到的人α-干擾素多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種編碼人α-干擾素，并能有效的在酵母菌中表達的重組基因，其核苷酸序列在附圖中列出；一種含所述基因的表達載體；用所述表達載體轉染的酵母細胞；用所述的酵母轉化體生產(chǎn)人α-干擾素的方法；高產(chǎn)純化所述人α-干擾素的方法。
文檔編號C12N15/21GK1073977SQ9211182
公開日1993年7月7日 申請日期1992年12月31日 優(yōu)先權日1991年12月31日
發(fā)明者曹重明, 樸榮祐, 樸淳宰, 裴泰玉, 張虎振 申請人:株式會社樂喜