專利名稱：合成的人γ-干擾素基因(CDNA)在大腸桿菌中的高效表達的制作方法
技術領域：
本發(fā)明為一種用基因工程技術生產人γ-型干擾素的方法。
干擾素是一類蛋白質，又稱免疫干擾素分為α、β和γ三大類型，簡稱IFN-α、β和γ。其中IFN-γ是1965年Wheelock發(fā)現的(Wheelock，F，W;Science，149，P310)。干擾素具有重要的生物學活性，主要表現為抗病毒、抗腫瘤(抑制細胞增殖)和對免疫系統(tǒng)的調節(jié)作用等。這包括它能激活巨噬細胞、促進多種免疫細胞的成熟與淋巴因子的分泌、誘導Ⅰ和Ⅱ型MHC基因的表達等。IFN-γ在癌癥治療中有一定作用。已發(fā)現它對腎細胞癌、小細胞肺癌、結腸癌和黑色素瘤等有一定療效;IFN-γ與腫瘤壞死因子(TNF)、IFN-α、IFN-β合用，有協同作用，而且效果更好(Shah，P.，et al，Br.J.Cancer，59，P206;Fleischmann，W.R.，et al，Infect and Immun.，26，P248)。因此，研究和生產INF-γ，將它作為一類新型抗病毒和抗腫瘤藥物已成為世界許多國家生物學和藥學界的一項重要課題。美國Amgen、Biogen、Genetech等公司已在進行IFN-γ的生產，幾家日本公司也在生產。
常規(guī)的從人血中分離IFN-γ技術費用昂貴，無法滿足人們的需要。用基因工程技術生產IFN-γ已是大勢所趨，而且是切實可行的。
IFN-γ基因位于染色體12q24.1處，由3個內含子和4個外顯子成(Naylor，S.L，et al.J.Exp.Med.，，157，P1020)。IFN-γ cDNA克隆已經得到(Gray，P.W.，et al，Nature，，295，03和Devos，R. et al，Nucleic Acids Res.，，10，P2487)，基因的全部順序已經測定;用INF-γ的cDNA在細菌中表達已成為大量生產IFN的途徑。
由于大腸桿菌對蛋白質中氨基酸密碼子的偏愛性與人細胞是不同的，并鑒于氨基酸密碼子的簡并性，本發(fā)明采用人工設計的方法，將人IFN-γ中的一些氨基酸的密碼子改為大腸桿菌喜愛的密碼子，其目的在于使合成IFN-γ基因能在大腸桿菌中高效表達，而不改變IFN-γ的氨基酸組成和排列順序，故能大量生產IFN-γ。
本發(fā)明包括構建含合成的IFN-γ基因的表達質粒，質粒在大腸桿菌中發(fā)酵表達后，IFN-γ可達菌體總蛋白的60-80%，這比用cDNA直接表達(一般在35%左右)高得多，它們以包涵的形式存在于細菌中，也為分離純化提供了優(yōu)越的條件。本發(fā)明的工程菌大腸桿菌Escherichia coli SIB-203-2 pLY4-γ，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(中國.武漢.珞珈山武漢大學校內)，保藏編號CCTCC NO。
本發(fā)明也提供了一個分離純化IFN-γ的方法，在制得包涵體后，只用一步Sephacryl S-200柱層析就可得到純度≥96%，比活約2×107國際單位/毫克蛋白產品。這為高效、大量生產IFN-γ開創(chuàng)了有利途徑。
本發(fā)明的示意圖說明如下

圖1，設計并合成的IFN-γ基因及其相應的氨基酸順序。
圖2，合成IFN-γ26個小片段的順序。
圖3，部分小片段放射自顯影鑒定。
圖4，IFN-γ基因大片段合成及完整基因組裝示意圖。
圖5，IFN-γDNA大片段的克隆。
圖6，IFN-γ合成基因的全順序分析。
圖7，完整IFN-γ基因的組裝。
圖8，含完整IFN-γ基因的M13mp18-LW-γ5重組DNA的酶切鑒定。
圖9，IFN-γ表達質粒pLY4-γ之構建。
圖10，IFN-γ表達產物的鑒定。
圖11，對圖10的黑度掃描。
圖12，全菌與包涵體中IFN-γ含量的比較。
圖13，所得包涵體中IFN-γ蛋白電泳圖。
1為標準分子量，粗黑帶為溶菌酶。
2、4、6為包涵體。
3、5、7為相應上清液。
圖14，圖13中蛋白質掃描結果。
圖15，用Sephacryl S-200純化IFN-γ。
圖16，Sephacryl S-200色層中各峰的電泳。
圖17，對圖16的黑度掃描。
通過下述實施例對本發(fā)明的技術特征作詳細描述。
材料與方法a.人工合成DNA片段的試劑，包括bzA二異丙基亞磷酰胺、bzC二異丙基亞磷酰胺、bzG二異丙基亞磷酰胺、T異丙基亞磷酰胺、bzA-CPG、bzC-CPG、bzG-CPG、T-CPG和其他合成試劑均購自ABI公司。退火液(10X)為0.5M Tris.HCl，pH7.6，0.1M MgCl2，0.5MNaCl。
b.限制性內切酶EcoRⅠ.BamHⅠ、HindⅢ、SalⅠ、BglⅡ、PVUⅡ和ScaⅠ、T4DNA連接酶、CIP堿性磷酸酯酶、T4核苷酸激酶和大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段等來自Boehringer公司、New England公司和BioLabs公司。
c.菌種及質粒JM101、JM105和K802為本組傳代菌種;JF1125由劉愛萍惠贈;M13mp18和M13mp19為本組庫存;pLY-質粒系列由虞建良構建。
d.放射性同位素α-32P-dATP、α-32P-dCTP和γ-32P-ATP購自Amersham公司。
e.分離載體Sephadex G25、G100、G200，Sephacryl S-200和DEAE-Sephacryl購自Pharmacia-LKB公司。
f.基他試劑瓊脂糖、IPTG、X-gal和鹽酸胍購自BRL公司;聚丙烯酰胺購自Sigma公司;EB購自Fluka chemical公司;SDS購自Serva公司;PEG購自Koch Light公司。
g.DNA片段合成用ABI公司的DNA合成儀，用亞磷酸三酯法進行。
h.DNA克隆和轉化按照文獻方法(Messing J.et al N.A. Res.9309;Maniatis T.et al. Molecular CloningP254;Sanger F.et al Proc Natl.Acad Sci 2 USA.745463)進行。
i.DNA序列測定按照文獻方法(Messing J. et al N.A. Res.9309;Sanger F. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA745463;Sanger F. et al. J.Mol Biol. 143161)進行。
j.表達質粒的構建將合成的IFN-γ基因片段回收后組裝成完整的IFN-γ基因，然后將它連接到表達載體上并構建成表達質粒。
k.INF-γ的誘導表達。當基因工程菌生長到對數期時進行熱誘導，表達產生IFN-γ。
l.IFN-γ產物的電泳鑒定參照文獻的方法(Laemmli U.K.Nature 227680)進行。
m.干擾素抗病毒活力參照文獻(Familletti P.C. et al. Method Enzymol 78387)進行。
n.IFN-γ產品鑒定方法SDS-PAGE見上述之l;HPLC鑒定，用Beckman公司的Golden System和TSK柱，平衡及洗脫液均用PBS，pH7.0，比活測定見m;氨基酸組成分析用酸水解法，由生化所陳德明測定;N末端測定用Edman法，由復旦大學柴常青測定。
實施的具體步驟分別敘述如下實施例1，IFN-γ基因的合成及鑒定第一步是基因設計。第二步是小片段合成。第三步是大片段合成。第四步是完整基因的組裝。第五步是鑒定。
A.基因設計(圖1)。
IFN-γ由143個氨基酸組成，其基因有429bp，加上起始密碼子ATG，兩個終止密碼子TAA、TAG及克隆用的EcoRⅠ及SalⅠ限制性內切酶接頭，共有447bp。將它分為24個小片段來合成。24個小片段的序列見圖2。這些片段中一些氨基酸密碼子是選用了大腸桿菌使用頻率高的密碼子。
B.小片段DNA合成。
用DNA合成儀進行DNA小片段合成。反應結束后，取出帶有合成DNA片段的CPG柱，用硫酚二氧六環(huán)三乙胺(112)在室溫下處理半小時，脫去寡核苷酸中磷酸上的保護基甲基，再先后用甲醇和乙醚洗滌，經空氣干燥后，加濃氨水并密封，于55℃保溫過夜。將DNA小片段從硅膠樹脂上洗脫下來，同時也脫去N-?；系谋Ｗo基。凍干樣品，經醋酸處理和NaOH中和，再凍干。溶于水，用乙醇使之沉淀，將沉淀再溶于水。然后，用20%PAG-7M脲素(urea)電泳分離?；厥蘸枰狣NA片段的凝膠。凝膠經切碎后用含0.3M NaCl的TE(pH8.0)浸泡過夜，離心后取上清液，用乙醇沉淀DNA。再經SephadexG25脫鹽，就回收到各個DNA小片段。為鑒定這些片段的純度，用T4多核苷酸激酶和γ-32P-ATP標記這些片段后經7M Urea-20%PAGE，放射自顯影顯示為均一條帶(圖3)。
C.大片段DNA合成。
將24個小片段分成若干組(圖4)，將相應片段用上述方法在其5′末端加上磷酸后，與沒有被磷酸化的片段用T4-DNA連接酶相連接。產物用7M Urea-8%PAGE分離。割下含大片段的凝膠后用上述方法回收DNA片段。共得到Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三個大片段。為了鑒定合成片段的準確性，將三個大片段分別與M13mp19RFDNA重組(圖5)，篩選到重組DNA后，用Sanger方法測定DNA序列。得到含正確DNA序列的三個大片段重組DNAM13mp19-Ⅰ、M13mp19-Ⅱ和M13mp19-Ⅲ(圖4)。其DNA序列測定結果見圖6。
D.完整基因的組裝。
如圖7所示，先用BamHⅠ和HindⅢ水解M13mp19-Ⅱ，分離188bp的INF-γ大片段，與用BamHⅠ和HindⅢ切開的M13mp19-Ⅰ重組，得到M13mp19-LW-γ4，它含有合成的IFN-γ大片段Ⅰ和Ⅱ。為了與片段Ⅲ連接，將M13mp19-LW-γ4中的IFN-γ片段用EcoRⅠ和HindⅢ切出來后克隆人M13mp18，得到M13mp18-LW-γ4，然后再用BglⅡ和HindⅢ切開這一重組DNA，與由M13mp19-Ⅲ中用BglⅡ和HidⅢ切出的IFN-γⅢ大片段重組，就得到含有完整IFN-γ基因的M13mp18-LW-γ5。通過酶切鑒定說明上述連接是正確的。
從上述過程可知，含IFN-γ的M13mp18-LW-γ5的RF DNA中有2個EcoRⅠ切點，一個來自IFN-γ基因的5′末端，另一個來自M13mp18DNA的MCS區(qū)，這一DNA只含一個SalⅠ的切點。因此，用EcoRⅠ水解時可產生2個片段(圖8)。其中一個片段大小與M13mp18DNA接近，另一片段為447bp，用SalⅠ水解，則只得到一個線性DNA，其大小相當于M13mp18DNA與IFN-γ基因之和。這些結果證明，這一重組質粒中含有完整正確的IFN-γ基因。
實施例2，表達質粒pLY4-γ的構建與鑒定。
表達載體是用我們構建的pLY4-γ，它帶有PL強啟動子，CⅠts857溫度敏感阻遏蛋白基因，合適的ATG-SD順序間距和強5SrRNA基因的終止子t1t2。
實施例3，IFN-γ的發(fā)酵生產及表達產物的鑒定。
將pLY4-γ轉化受體菌K802和JF1125。挑單個菌落接種于3mlLB培養(yǎng)液中，在30℃振蕩培養(yǎng)過夜。然后以2%比例接種于補充VitBl(4mg/L)、AMP(50mg/L)的M9培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)至OD600為0.35-0.55。然后將溫度增至42℃，再培養(yǎng)3小時，誘導IFN-γ的產生。其IFH-γ的量可達菌體可溶質總蛋白的60-80%(圖10-12)。
采用2個方法鑒定發(fā)酵生產的IFN-γ。第一個是SDS-PAGE。濃縮膠是4.5%丙烯酰胺，分離膠是15%丙烯酰胺。按方法中所引文獻的電泳方法，結果如圖10所示。在30℃培養(yǎng)時IFN-γ產物極少，而在42℃誘導后有大量產物。黑度掃描表示IFN-γ占菌體總蛋白量的68.7%(圖11)。第二個方法是測定表達IFN-γ的抗病毒活性及比活。發(fā)酵菌經5000rpm離心10分鐘后，菌體用TE(pH8.0)-100mM NaCl洗滌，然后用8M鹽酸胍破碎細菌，離心后取上清液測活性。人羊膜細胞Wish株在96孔板上貼壁生長過夜(5%CO2，37℃)，每孔有4萬個細胞。然后加入不同稀釋度的待測樣品或標準干擾素，在5%CO2再培養(yǎng)15-18小時，加入水泡性口類病毒(VSV)攻擊一定時間后，用0.1%結晶紫檸檬酸染色。結果如表1所示。由結果可知，一般每升發(fā)酵液可得到109國際單位約相當于200-300mg的IFH-γ用發(fā)酵罐高密度發(fā)酵，產量更高(數字未列出)。
表1表達IFN-γ的活性鑒定
注表中數字為每立升的IFN-γ活性單位(國際標準)實施例4，IFN-γ的分離純化。
外源基因在大腸桿菌中表達時，如果表達速度快，產量高，而產物又有較強的疏水性時，它們將通過疏水鍵相互聚集形成包涵體，這為表達產物的制備提供了基礎。我們使用的包涵體制備和一步柱層析是純化基因工程生產IFN-γ最好方法之一。
(a)包涵體制備發(fā)酵結束后，經5000rpm離心10分鐘，沉淀細菌。用PBS洗滌后，以50ml PBS/克濕菌的比例懸浮細菌，用超聲波破碎細菌，250A，每次30秒鐘，間隔30秒鐘，共10次。然后離心15000rpm，15分鐘，沉淀就是包涵體。再用PBS-NaCl充分洗滌，用本法制備的包涵體其中IFN-γ含量為90%左右(圖13、14)。這些結果證明我們分離包涵體的方法十分有效，這為進一步純化IFN-γ打下了良好的基礎。
(b)一步色層純化IFN-γ將上述分離到的包涵體用PBS洗后，加入鹽酸胍至8M(pH7.5)溶解，離心除去不溶物雜質。清液進行上Sephacryl S-200柱層析，柱先用同一溶液平衡，結果見圖15。主峰比活為2×107國際單位/mg蛋白，每升發(fā)酵液產量為200-300mg。對圖16中分離到的IFN-γ峰及雜峰進行電泳鑒定，結果見圖16。掃描表明，主峰中IFN-γ的純度為96-97%(圖17)。
權利要求
1.一種合成的人γ-型干擾素(IFN-γ)基因(cDNA)在大腸桿菌中的高效表達，其特征是(a)使用人工設計，化學合成的基因，基因結構式如下ATG CAG GAC CCG TAC GTT AAA GAA GCT GAA AAC CTG AAG AAA TAC TTC AAC GCT GGT CATMet Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly HisTCT GAC GTT GCT GAC AAT GGT ACC CTG TTC CTC GGG ATC CTG AAA AAC TGG AAA GAA GAASer Asp Val Asa Asp Asn Gly Thr Leu Gly Thr leu Phe leu Glt Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu GluTCT GAC CGT AAA ATC ATG CAA TCT CAG ATC GTT TCT TTC TAC TTC AAA CTG TTC AAA AACSer Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys AsnTTT AAA GAT GAT CAG TCT ATC CAG AAA TCT GTT GAA ACT ATC AAG GAA GAC ATG AAC GTTPhe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn ValAAA TTT TTC AAC TCT AAC AAG AAG AAA CGT GAC GAC TTC GAA AAG CTT ACT AAC TAC TCTLys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr SerGTT ACC GAT CTG AAC GTT CAA CGT AAA GCT ATC CAC GAG CTC ATC CAG GTT ATG GCT GAAVal Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala GluCTG TCT CCC GCG GCT AAA ACT GGT AAA CGT AAA AGA TCT CAG ATG CTG TTC CGC GGT CGTLeu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly ArgCGT GCT TCT CAG TAA TAGArg Ala Ser Gln TermTermIFN-γ由143個氨基酸組成，合成的該基因有429bp，加上起始密碼子ATG，兩個終止密碼子TAA、TAG及克隆用的EcoRI及SalI限制性內切酶接頭，共有447bp，選用了大腸桿菌使用頻率高的密碼子，使合成的IFN-γ基因能在大腸桿菌中高效表達，產生大量人IFN-γ，而不改變IFN-γ而不改變IFN-γ的氨基酸順序；(b)將合成的IFN-γ基因克隆人帶有PL啟動子、CIts857溫控阻遏蛋白基因、核糖體5SrRNA基因的終止信號t1t2和MCS區(qū)的表達載體pLY4后，構建成IFN-γ的表達質粒pLY4-γ，轉化大腸桿菌后獲得高效表達，IFN-γ占菌體可溶性總蛋白的60-80%；本發(fā)明的工程菌為大腸桿菌Escherichia coli SIB-203-2 pLY4-γ，保藏編號CCTCC NO (中國典型培養(yǎng)物保藏中心，中國.武漢.珞珈山.武漢大學校內)；
2.根據權利要求1中所述設計的人γ-型干擾素基因結構序列，其特征在于全部連續(xù)堿基序列在大腸桿菌中能高效表達，并涵蓋其5′末端有≥15個連續(xù)堿基序列(ATG CAG GAC CCG TAC GTT)與本結構有同源順序的DNA均能高效表達，因為這一片段含有使基因在大腸桿菌中高效表達的所必需的結構元件。
3.根據權利要求1、2中所述的含設計的基因結構序列的表達質粒pLY4-γ，其特征在于不僅在大腸桿菌體系中高表達，而且能在任何原核細胞體系中高表達。
全文摘要
γ型干擾素(IFN-γ)具有免疫調節(jié)、抗病毒和抗腫瘤等多種生物功能，是世界上競相開發(fā)的基因工程產品。本發(fā)明是將設計的化學合成人γ型干擾素基團插入含有λ噬菌體P
文檔編號C12N15/23GK1109506SQ9411209
公開日1995年10月4日 申請日期1994年3月29日 優(yōu)先權日1994年3月29日
發(fā)明者劉新垣 申請人:中國科學院上海生物化學研究所