專利名稱：一種人白細胞介素-2的基因合成表達質(zhì)粒的構(gòu)建及產(chǎn)物的生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為一種用基因工程技術(shù)生產(chǎn)人白細胞介素-2的方法，國際專利分類為CN12 15/26。
近年來發(fā)現(xiàn)細胞分泌一系列具有不同活性的細胞因子，其中許多因子有很強的抗病毒和抗腫瘤作用，如白細胞介素、干擾素、集落刺激因子、腫瘤壞死因子等。它們有的能直接殺傷腫瘤細胞，有的能激活免疫效應(yīng)細胞和誘導(dǎo)產(chǎn)生其他細胞因子，共同有效地清除腫瘤細胞、病毒或細菌感染的細胞，起到防病和治病的作用。由于這些因子的重要生物學作用使得它們成為目前基因工程藥物研究和開發(fā)的主要對象。
白細胞介素-2(IL-2)是其中最有應(yīng)用開發(fā)前景的細胞因子之一。尤其是通過IL-2激活免疫細胞而用以進行的過繼免疫治療，已成為腫瘤治療一個十分有力的手段。估計IL-2對下述方面的疾病有潛在的醫(yī)療價值1.通過激活LAK(Lymphokine Activated Killer)細胞，清除病毒感染的細胞而起到防病治病作用。如對病毒性乙型肝炎的治療;
2.通過激活LAK細胞，清除細菌感染的細胞。如治療麻瘋病。
3.通過激活LAK及TIL(Tumor Infitcating Lymphocyte)細胞殺仿和清除癌變細胞。已經(jīng)證實，將IL-2直接注入腫瘤組織，療效可達50%以上(如對黑色素瘤，局部循環(huán)應(yīng)用效果更好)。
4.作為免疫佐劑，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)對成年人的免疫原性較差，故無預(yù)防作用，但加入IL-2后，可大為提高其免疫原性，產(chǎn)生較多的抗HBs抗體，這將有實用價值。
5.IL-2對其它免疫功能低下的疾病，如AIDS和SCID等也可能有治療作用。
由于IL-2的實用價值，全世界有許多公司和廠家在研制生產(chǎn)IL-2的新方法和新工藝。鑒于遺傳密碼有簡并性，鑒于大腸桿菌對氨基酸密碼子的喜愛與人細胞的不同，本發(fā)明通過專門設(shè)計合成了含大腸桿菌喜愛密碼子的能生產(chǎn)人天然IL-2的基因，它不改變產(chǎn)物人IL-2的氨基酸組成與排列順序，而提高了基因在大腸桿菌中的表達水平。通過將-人工合成的IL-2基因組裝入專門設(shè)計的，有強表達能力的載體pLy4中，構(gòu)建成IL-2表達質(zhì)粒pLy-IL。它能在大腸桿菌JF1125和K802中高表達，使IL-2占菌體總蛋白的30-40%。轉(zhuǎn)化后的工程菌為大腸桿菌Escherichia coli SIB-203-1 pLy4-IL，保藏編號CCTCC NO. (中國典型培養(yǎng)物保藏中心，中國，武漢，珞珈山武漢大學校內(nèi))。同時，本發(fā)明也提供了一種高效的產(chǎn)物IL-2的分離純化技術(shù)。在制得純凈的包涵體后，只用一步SephacrylS-200柱層桿就可獲得純度>96%，比活達2×106單位/毫克蛋白的IL-2，相當于1.2×107國際單位/毫克蛋白。產(chǎn)品經(jīng)PAGE及HPLC分析驗證，N未端15個氨基酸順序分析均證明它與天然IL-2相同。生物功能測定與天然IL-2一樣。因此，本發(fā)明具有大規(guī)模生產(chǎn)的意義。
本發(fā)明的示意圖說明如下

圖1，合成設(shè)計的人IL-2基因及其相應(yīng)的氨基酸順序。
圖2，合成IL-2的20個小片段的順序。
圖3，IL-2基因大片段合成及完整基因組裝示意圖。
圖4，合成的IL-2基因序列測定。
圖5，完整IL-2基因組裝過程。
圖6，IL-2表達質(zhì)粒的構(gòu)建。
圖7，IL-2表達質(zhì)粒的酶切鑒定。
1.λDNA標準Ⅲ(EcoRI+HindⅢ)2.EcoRⅠ+BamHⅠ酶切3.BamHⅠ+ScaⅠ酶切4.BgLⅡ+EcoRⅠ酶切圖8，溫度誘導(dǎo)表達IL-2。
圖中30，42分別代表30℃，42℃培養(yǎng)。
圖9，圖8的黑度掃描。
圖10，包涵體分離的結(jié)果。
圖11，Sephacryl S-200分離IL-2。
圖12，IL-2的電泳鑒定。
圖13，還原型IL-2的HPLC鑒。
圖14，氧化型IL-2的HPLC鑒定。
圖15，IL-2對維持CTLL-2的細胞生長的作用。
圖16，IL-2單抗對IL-2生物功能的抑制作用。
圖17，IL-2活化LAK細胞對腫瘤細胞的殺傷作用。
通過下述實施例對本發(fā)明的技術(shù)特征作詳細描述。
材料與方法。
(1)限制性內(nèi)切酶、T4DNA聚合酶、T4DNA連接酶、CIP堿性磷酸酯酶、DNA聚合酶I Klenow片段和DNA分子量標準Ⅲ、Ⅴ均購自Boehringer公司，New England公司和BioLabs公司。
(2)菌種與質(zhì)粒。JM101、103和105，BMH71-18 K802為本實驗室保存;JF1125由劉愛萍贈予;pRC23由Crowl贈予;pTZ-12、pLR-1由本實驗室構(gòu)建。
(3)放射性同位素α-32P-dATP、α-32P-dCTP和r-32P-ATP購自Amersham公司。
(4)使用ABI公司的DNA合成儀、試劑及方法合成DNA片段。
(5)化學試劑。Tris購自Sigma公司，SDS購自Serva公司，Sephacryl S-200購自Pharmacia公司;RPM1-1640購自日本制藥株式會社;標準IL-2為2×106單位/毫克蛋白質(zhì)，購自Boehringer公司。
(6)質(zhì)粒DNA制備，DNA序列分析，DNA轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子篩選，限制性內(nèi)切酶水解等常規(guī)方法均參照Molecular Cloning。
(7)工程菌發(fā)酵，挑單個含IL-2的工程菌菌落接種于3ml LB培養(yǎng)基中，30℃搖床培育過夜，然后按2%比例接種于M9培養(yǎng)基(補加VitB1，4mg/L，AMP 50mg/L)。30℃培養(yǎng)到OD600為0.35-0.55時，將溫度升高到42℃，再培養(yǎng)3小時，讓IL-2大量表達。
(8)IL-2產(chǎn)物鑒定用SDS-PAGE法。電泳產(chǎn)物用島津CS-930雙波長掃描儀進行黑度掃描。
(9)IL-2活性檢測方法參照文獻Glillis，S，et al.J.Immunol，1202027-2032，1978。
(10)包涵體制備法，發(fā)酵后，離心5000rpm，10′，菌體用PBS洗一次，每1克濕菌加50ml PBS，用上海超聲波儀器廠CSF-1A型超聲波發(fā)生器破菌，每次30秒，間隔30秒，反復(fù)計10次。然后離心15，000rpm，15′，棄上清液，沉淀即包涵體。
(11)柱層析純化IL-2。上述包涵體用PBS洗1次，加入鹽酸胍至8M濃度，pH7.5，溶解，離心除去不溶物，用同一條件平衡的Sephacryl S-200層析柱，分離純化IL-2。
實施的具體步驟分別敘述如下實施例1.IL-2基因的合成及鑒定。
第一步是設(shè)計基因;第二步是合成小片段;第三步是合成大片段;第四步是組裝成完整的基因;第五步是鑒定。
A.基因的設(shè)計(圖1)IL-2由133個氨基酸組成，其基因有399bp，加上起始密碼子ATG，終止密碼子TAG和TGA及5′和3′末端克隆時用的限制性內(nèi)切酶切點，共有426 bp。將它分為20個小片段來合成，20個小片段的序列見圖2。這些片段中一些氨基酸密碼子是選用了大腸桿菌喜愛的密碼子。
B.小片段合成。
用二異丙亞磷酰胺保護的單體，以亞磷酸三酯法在ABI公司的DNA合成儀上進行。反應(yīng)結(jié)束后，取出帶有合成DNA片段的多孔玻璃珠(CPG)柱，加濃氨水，密封，55℃過夜，脫去保護基，將DNA片段從硅膠樹脂上洗脫下來。將上清液轉(zhuǎn)移到小管子中，用重蒸水洗滌CPG柱，合并上清液，減壓冷凍抽干。加TE溶解，用7M Urea-20%PAGE分離，切下DNA片段，浸泡在TE(pH8.0)-0.3M NaCl中，洗脫DNA片段。用乙醇沉淀后，溶于重蒸水，上Sephadex G25柱，回收DNA片段。取ln mol合成的DNA小片段，用γ-32P ATP和T4多核苷酸激酶標記后，上同一凝膠電泳鑒定，證明純度是好的。
C.大片段合成如圖3所示，將各相應(yīng)的DNA小片段，有的如上法加5′-P，有的不必加，用T4DNA連接酶連接成FⅠ和FⅡ兩個大片段。在將FⅠ和FⅡ組裝成完整基因前要測DNA序列，鑒定合成基因的準確性。為此，分別將FⅠ和FⅡ片段與相應(yīng)限制性內(nèi)切酶水解的M13mp18RF DNA相連接，連接后轉(zhuǎn)化JM105受體菌。經(jīng)篩選后，取有外源DNA片段的單個噬菌斑制取單鏈重組M13mp18-IL-2FⅠ和M13mp18-IL-2FⅡ DNA，用末端終止法測定DNA序列，證明FⅠ和FⅡ的DNA序列準確無誤。
D.完整IL-2基因組裝如圖4所示，先用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和PStⅠ切開含F(xiàn)Ⅰ大片段的M13mp18-FⅠ，用限制性內(nèi)切酶PStⅠ和BamHⅠ切開含F(xiàn)Ⅱ大片段的M13mp18-FⅡ，再用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ切開M13mp18RF DNA，組裝成含F(xiàn)Ⅰ和FⅡ大片段，即完整IL-2基因的M13mp 19-Syn IL-2質(zhì)粒，結(jié)果如圖5所示。
E.鑒定由上述過程可知，含完整IL-2合成基因的M13mp19-Syn-IL-2RF DNA中有一個EcoR I和一個Bam HI切口，它們分別位于IL-2基因的5′末端和3′末端。用這兩個酶水解這一重組DNA可得到兩個片段，一個是載體M13mp19，一個是合成的IL-2基因。
實施例2.表達載體pLY4的構(gòu)建我們構(gòu)建了一個高表達的載體。其技術(shù)特征是含有強啟動子PRPL;含有溫度敏感的PRPL啟動子阻遏蛋白的基因CIts857;含有合適的SD-ATG距離;含有較好的轉(zhuǎn)錄終止信號;含有“MCS”區(qū)。分別敘述如下(1)選擇PRPL作啟動子的原因是表達率高;可以通過溫度改變誘導(dǎo)IL-2的產(chǎn)出，有利于生產(chǎn)。
(2)一般在帶有PRPL和CIts857基因的表達載體中，CIts857基因是用BglⅡ組裝進入的，這樣的片段有2.4Kb大小，這不僅片段較大，而且在組裝后要篩選方向正確的產(chǎn)物。我們研究了λDNA中PRPL啟動子與CIts857基因結(jié)構(gòu)，發(fā)明了用BglⅡ和PLtⅠ兩個酶切獲得一個包含PR和CIts857的DNA片段，并能夠很容易地，定向地組裝入載體。這樣CIts857的整入和切出都十分方便，還省去了CI857方向篩選的工作。
(3)SD順序與ATG起始密碼子之間有AATTC五個堿基，試驗證明是最合適的順序間距。
(4)5S rRNA基因的終止信號是個較強終止信號，將它納入IL-2基因的3′末端有助于基因轉(zhuǎn)錄的有效終止，從而節(jié)約了能量和減少基因連續(xù)而造成的產(chǎn)品不純，這都可大為提高大腸桿菌中LL-2的表達效率。
(5)pLy4含有的MCS區(qū)來自PVC19，多個單一限制性內(nèi)切酶的點，有利于外源基因的插入。
實施例3.表達質(zhì)粒pLy4-IL的構(gòu)建。
用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ水解M13mp19-SynIL-2，經(jīng)電泳后回收Syn-IL-2基因，與用同樣兩種限制性內(nèi)切酶水解的pLy4重組，構(gòu)建了在表達載體pLy-4上表達pLy4-IL的質(zhì)粒(圖6)。為驗證Syn-IL-2基因是否已克隆入此質(zhì)粒，同樣，用EcoRⅠ和BamHⅠ水解這一質(zhì)粒，圖7顯示其中確實含有Syn-IL-基因。
實施例4.IL-2的發(fā)酵生產(chǎn)將PLy4-IL轉(zhuǎn)化宿主菌K802，構(gòu)成IL-2的基因工程菌。工程菌在30℃過夜培養(yǎng)后，以2%比例接種于補充VitB1(4mg/L)和AMP(50mg/L)的M9培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)到OD600為0.35-0.55時，將溫度升至42℃，IL-2就誘導(dǎo)產(chǎn)生。溫度誘導(dǎo)表達IL-2的結(jié)果如圖8所示。對圖8進行黑度掃描，其結(jié)果見圖9。IL-2占菌體總蛋白的32-37.9%，說明這一表達質(zhì)粒的表達效率是高的。
實施例5.工程菌保存及穩(wěn)定性工程菌保存于25%甘油中，-20℃。傳代培養(yǎng)基為軟瓊脂糖，軟瓊脂糖菌在4℃保存。為檢查工程菌的穩(wěn)定性，每傳10代作一次酶的圖譜分析，結(jié)果與原始菌種相同。在50代時進行的IL-2基因序列分析與原始基因相同，證明本發(fā)明中的工程菌是十分穩(wěn)定的。
實施例6.IL-2的分離純化由于IL-2在細菌中表達得快，產(chǎn)量高，并以包涵體顆粒存在于細菌，本發(fā)明中提供了包涵分離和一步層析純化的技術(shù)，可以快速、高速地得到IL-2產(chǎn)物。
a.包涵體的制備發(fā)酵后，5000rpm，10分鐘離心，沉淀菌體，用PBS洗滌后，以每克濕菌體用50ml PBS的比例懸浮菌體。用超聲波破菌體后，于15000rpm，15分鐘離心，用PBS-NaCl徹底洗滌得到包涵體。本法分離的包涵體幾乎包含了細菌中產(chǎn)生的全部IL-2(圖10)，本法分離包涵較好為進一步純化IL-2打下了良好的基礎(chǔ)，也是本發(fā)明的重要內(nèi)容之一。
b.一步色層制備IL-2用8M鹽酸胍溶解包涵體后，上用同一溶液平衡的Sephacryl S-200柱，分部收集，可得到一個含IL-2的主峰(圖11)。本發(fā)明中IL-2的一步色層分離是簡便、快速、產(chǎn)量高、純度好。
實施例7.IL-2產(chǎn)物的鑒定a.SDS-PAGE。
圖12表明，經(jīng)柱層析純化后的IL-2為單一條帶。
b.HPLC鑒定圖13、圖14是IL-2的HPL鑒定，其主峰中IL-2含量達99%以上。
c.N末端分析N端15個氨基酸鑒定結(jié)果與天然一樣。順序是A·P·T·S·S·S·T·K·K·T·Q·L·Q·L·E·H·L·L。
實施例8.IL-2產(chǎn)物的生物功能鑒定a.維持CTLL-2細胞的增殖作用圖15顯示，本發(fā)明制備的IL-2可維持CTLL-2細胞生長28天以上，細胞數(shù)目增加了1，000倍。不加IL-2或同時加入IL-2單抗時，細胞很快死亡。
b.IL-2單抗對IL-2生物功能的抑制作用。
取T淋巴細胞，加入本發(fā)明制取的IL-2到20單位/毫升，再加不同量的單抗，所得結(jié)果如圖16。IL-2單抗含量在15μg/ml時對20U/ml的IL-2無抑制作用，但單抗增到50μg/ml時則有明顯抑制作用，到200μg/ml時可100%地抑制IL-2的生物功能，這一抑制作用是不能用鼠等其它來源的單抗代替，有種屬特異性，這說明本發(fā)明的IL-2制品是種專一的。
C.IL-2對NK細胞活性的增強作用列于下表IL-2濃度(U/ml)Blood donor 1 Blood donor 20 23.18 23.9610 22.46100 32.19 33.301000 44.98 35.0210000 19.94 6.91100000 3.24 1.38從表上說明本發(fā)明制備的IL-2對NK細胞活性有增強作用。
d.IL-2對LAK細胞的誘導(dǎo)及其對腫瘤細胞的殺傷作用。
圖17表明IL-2可誘導(dǎo)LAK細胞的生長。隨著培養(yǎng)時間延長，其增殖作用與殺傷作用增大。用IL-2誘導(dǎo)的LAK細胞處理HL-60細胞株及人新鮮肺細胞表明，LAK對此三類細胞均有殺傷作用，殺傷率為37.96-54.84%。
權(quán)利要求
1.一種人白細胞介素-2(IL-2)基因的合成及表達質(zhì)粒的構(gòu)建，其特征是(a)使用人工設(shè)計、化學合成的基因，基因結(jié)構(gòu)式如下AATTCTT ATG GCT CCG ACT TCT TCT TCT ACT AAA AAG ACT CACMet Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr GlnCTT CAG CTG GAA CAT CTG CTG CTG GAC CTC CAG ATG ATC CTG AACLeu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu AsnGGT ATC AAC AAC TAC AAA AAC CCG AAA CTG ACC CGT ATG CTG ACCGly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu TnrTTC AAA TTC TAC ATG CCG AAA AAA GCT ACC GAA CTG AAA CAT CTGPhe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His LeuCAG TGC CTT GAA GAA GAA CTG AAA CCG CTG GAA GAA GTT CTG AACGln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu AsnCTG GCT CAG TCT AAA AAC TTC CAT CTG CGT CCG CGT GAC CTG ATCLeu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu IleTCT AAC ATC AAC GTT ATC GTT CTG GAA CTG AAA GGT TCT GAA ACCSer Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu ThrACC TTC ATG TGC GAA TAC GCT GAC GAA ACC GCT ACC ATC GTT GAGThr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val GluTTC CTG AAC CGT TGG ATC ACC TTC TGC CAG TCT ATC ATC TCT ACCPhe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser ThrCTG ACC TGA TAG GATCLeu Thr TermTermIL-2由133個氨基酸組成，合成的該基因有399 bp，加上起始密碼子ATG，終止密碼子TAG和TGA及5′和3′末端克隆用的限制性內(nèi)切酶切點，共有421 bp，選用了大腸桿菌使用頻率高的密碼子，使合成的IL-2基因能在大腸桿菌中高效表達，產(chǎn)生大量的人IL-2，而不改變IL-2的氨基酸順序；(b)將合成的IL-2基因克隆入帶有PL啟動子CIts857溫控阻遏蛋的基因、核糖體5S rRNA基因終止信號t1t2和MCS區(qū)的基因載體pLy-4中，構(gòu)建成IL-2的表達質(zhì)粒Ply4-IL-2，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后獲得高效表達；轉(zhuǎn)化后的工程菌為大腸桿菌Escherichia col SIB-203-1 pLy4-IL，保藏編號CCTCC NO. (中國典型培養(yǎng)物保藏中心.中國.武漢.珞珈山 武漢大學校內(nèi))；(c)表達產(chǎn)物以包涵體的形式存在，得包涵體產(chǎn)物后用8M鹽酸胍溶解，上Sephacryl S-200柱，一步柱層析可以得到純度＞95%，比活＞2×106Boehringer單位/毫克蛋白的IL-2，相當于1.2×107國際單位/毫克蛋白的IL-2；
2.根據(jù)要求1所述的IL-2構(gòu)建的表達質(zhì)粒，其特征是使用了表達載體pLy-4，它是由PL強啟動子、CIts857溫度敏感阻遏蛋白基因，這個基因用Pst和BglⅡ酶裝入質(zhì)粒的，易于切出。SD順序與起始密碼子之間有AATTC5個堿基距離，在IL-2基因的3′端裝有轉(zhuǎn)錄終止信號t1t2(來自5SrRNA基因)，以上結(jié)構(gòu)使pLy4載體成為一個高效表達載體。
全文摘要
白細胞介素-2是作為一種免疫藥物可用于治療某些病毒性疾病和癌癥，有很好的應(yīng)用前景，臨床需要量很大，是國際上競相開發(fā)的產(chǎn)品。本發(fā)明是通過構(gòu)建帶有天然白細胞介素-2基團的表達質(zhì)粒，在大腸桿菌中高效表達，表達量達菌體總蛋白的30—40％。本發(fā)明還建立了一個高效的包涵體分離技術(shù)和獲得高比活的白細胞介素-2純化方法，這為大量生產(chǎn)白細胞介素-2創(chuàng)造了很好的條件。
文檔編號C12N15/70GK1109907SQ94112090
公開日1995年10月11日 申請日期1994年3月29日 優(yōu)先權(quán)日1993年3月31日
發(fā)明者劉新垣 申請人:中國科學院上海生物化學研究所