專利名稱：一種合成的鴨β-防御素-2基因、含該基因的重組質(zhì)粒與重組酵母轉(zhuǎn)化子及重組鴨β-防御 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種動物生物醫(yī)藥工程領(lǐng)域的基因的合成、重組質(zhì)粒構(gòu)建、重組酵母轉(zhuǎn)化子的獲得及重組蛋白的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)代畜牧業(yè)飼用動物在具有高產(chǎn)性能的同時(shí)，對環(huán)境應(yīng)激和病原愈加敏感。特別是在集約化飼養(yǎng)條件下，飼用動物面臨更多的應(yīng)激和病原的侵襲。畜牧生產(chǎn)中迫切需要一種高效、無毒害、無殘留的免疫促進(jìn)劑和生長促進(jìn)劑，在提高飼用動物抗病力的同時(shí)，又能提高飼用動物的生產(chǎn)性能及動物產(chǎn)品的安全，以促進(jìn)畜牧業(yè)的健康發(fā)展，降低畜牧生產(chǎn)對人類健康及生態(tài)環(huán)境的破壞。前人研究發(fā)現(xiàn)，防御素具有廣譜殺菌活性以及超強(qiáng)的抗微生物作用，且作用機(jī)理特殊，微生物不易產(chǎn)生抗性，對腫瘤細(xì)胞還有細(xì)胞毒性作用，同時(shí)也可以作為免疫增強(qiáng)劑用于調(diào)節(jié)動物機(jī)體免疫系統(tǒng)，給人們展現(xiàn)了一條開發(fā)理想促生長及免疫促進(jìn)的新途徑。由于動物體天然防御素含量低，直接提取遠(yuǎn)不能滿足需要，且成本高、得率低、工序繁；化學(xué)合成可行但成本太高，應(yīng)用受到局限；隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，通過基因重組技術(shù)生產(chǎn)防御素多肽，以滿足研究和生產(chǎn)的需要成為可能。目前，防御素的基因工程已是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)?；诜烙氐闹匾砉δ芗捌湓谏a(chǎn)實(shí)際中具有非常好的應(yīng)用前景，我們進(jìn)行了一種重組鴨β -防御素-2蛋白體外重組表達(dá)生產(chǎn)方法的發(fā)明研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的在于提供一種抗菌促生長活性，適合于在畜牧生產(chǎn)中進(jìn)行應(yīng)用，而且生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)效率高的基因的合成的鴨β-防御素-2基因、含該基因的重組質(zhì)粒與重組酵母轉(zhuǎn)化子及重組鴨β -防御素-2蛋白的生產(chǎn)方法。本發(fā)明重組鴨β-防御素-2基因是這樣實(shí)現(xiàn)的，依次包括鴨β-防御素-2 (AvBD2)基因核苷酸序列設(shè)計(jì)與體外合成、重組質(zhì)粒pPICZ α -A-AvBD2的構(gòu)建過程、含鴨 β-防御素-2 (AvBD2)的酵母重組轉(zhuǎn)化子的篩選過程、含鴨β-防御素-2 (AvBD2)的酵母重組轉(zhuǎn)化子體外誘導(dǎo)表達(dá)過程，
本發(fā)明的鴨防御素-2 (AvBD2)基因核苷酸序列設(shè)計(jì)與體外合成過程是這樣實(shí)現(xiàn)
的，
參照GenBank中注冊的鴨AvBD2基因cDNA基因序列，同時(shí)根據(jù)酵母密碼子偏好性對鴨 AvBD2基因成熟肽段核苷酸序列進(jìn)行改造，然后利用基因合成方法合成(送上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行基因合成)，改造后合成的鴨防御素-2 (AvBD2)基因核苷酸序列如下
GATATGTTTTTGTGTAGAATTGGTTCTTGTCATTTTGGTAGATGTCCAATTCATTTGGTTAGAGTTGGTTCCT GTTTTGGTTTTAGATCTTGTTGTAAGTCTCCATGGGATGTTTAA。
本發(fā)明的含有重組鴨β -防御素-2基因的重組質(zhì)粒pPICZ α _A_AvBD2是這樣實(shí)現(xiàn)的，
重組質(zhì)粒pPICZ α -A-AvBD2的構(gòu)建過程依次是
1、鴨防御素_2(AvBD2)基因上游引物、下游引物的設(shè)置過程根據(jù)合成的鴨β-防御素_2(AvBD2)基因核苷酸序列經(jīng)多重比較后設(shè)計(jì)而成，上游引物設(shè)計(jì)在該基因起始端，同時(shí)根據(jù)表達(dá)載體pPICZ α -A上的酶切位點(diǎn)，上游引物設(shè)計(jì)時(shí)添加了 Xho I酶切位點(diǎn)及Kex2 與蛋白酶裂解位點(diǎn)，在ZAo I酶切位點(diǎn)前加有3個(gè)保護(hù)性堿基TCT ；下游引物設(shè)計(jì)在基因末端，并加上Λ^ I酶切位點(diǎn)，在Λ^ I酶切位點(diǎn)位點(diǎn)前加有4個(gè)保護(hù)性堿基GCTG，所設(shè)置的鴨β-防御素-2 (AvBD2)基因上游引物、下游引物分別為，
鴨β-防御素-2 (AvBD2)基因上游引物
5，-TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGGATATGTTTTTGTGTAG-3' Xho I 酶切位點(diǎn)，
鴨β-防御素-2 (AvBD2)基因下游引物
5，-GCTGGCGGCCGCTTAAACATCCCAT-3 ’ Not I 酶切位點(diǎn)，
2、鴨β-防御素-2(AvBD2)基因片段的PCR擴(kuò)增過程以合成的鴨β-防御素_2 (AvBD2)基因?yàn)槟０澹尤隕xTaq DNA聚合酶、鴨β-防御素_2 (AvBD2)上/下游引物、 dNTPs 進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，PCR 的反應(yīng)體系為10XPCR Buffer(包含 0. 5mmol/L MgC12, 50mmol/ L KCl, lOmmol/L Tris (三羥甲基氨基甲烷)*HC1，0. 001% 明膠)5 μ L, 4X dNTPs (包含 dATP (三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸)、dTTP (三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸)、dCTP (三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸)和dGTP (三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸)各2. 5mmol/L) 4 μ L，濃度均為20 μ mol/L 的鴨β-防御素-2 (AvBD2)上、下游引物各lyL，模板為合成的鴨β -防御素_2 (AvBD2) 基因1 μ L，ddH20 (雙蒸水)37. 5 μ L，濃度為5 μ mol/L的ExTaq DNA聚合酶0. 5 μ L，反應(yīng)過程依次為a、94°C處理:3min ；b、依次94°C處理30s、56°C處理30s、72°C處理30s ；反應(yīng)過程進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；c、72°C延伸IOmin ；即獲得鴨β -防御素_2 (AvBD2)基因的PCR產(chǎn)物， 鴨β -防御素_2(AvBD2)基因的PCR產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，可見大小約130bp 的擴(kuò)增條帶，與預(yù)期的結(jié)果一致。3、重組質(zhì)粒pPICZ α -A_AvBD2的構(gòu)建將過程2的鴨β -防御素_2 (AvBD2)基因的PCR產(chǎn)物用氛氯仿抽提純化，加入乙醇獲得沉淀物，將沉淀物干燥后用TE (TE包含有 IOmmol/L iTris .HCl，lmmol/L EDTA(乙二胺四乙酸))溶解，TE 溶解物用 IoAIjoi I 進(jìn)行雙酶切處理，膠回收大小約130bp的條帶；以同樣的方法對pPICZ α -A質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切處理， 膠回收大小約3. 6kb的DNA片段，分別取5 μ L雙酶切后膠回收的鴨β -防御素_2(AvBD2) 基因片段和3 μ L雙酶切后膠回收的pPICZ α-A質(zhì)粒，加入IyL的IOX1M DNA連接Buffer (10XT4 DNA 連接 Buffer 包含有 0. 5mol/L Tris · HCl，0. lmol/L MgCl2, 50mmol/L DTT (二硫蘇糖醇)，5mmol/L DATP，0. 25mg/mL BSA (牛血清白蛋白))，1 μ L Τ4 DNA連接酶，在 16°C下連接處理18小時(shí)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top 10感受態(tài)細(xì)胞，在含有25 μ g/mL Zeocin 的低鹽LB瓊脂培養(yǎng)板中，37°C培養(yǎng)過夜，即完成重組質(zhì)粒pPICZ α _A_AvBD2的構(gòu)建。培養(yǎng)板上長出來的白色菌落即為含有重組質(zhì)粒pPICZ α -A-AvBD2的陽性菌。pPICZ α -A質(zhì)粒為 Invitrogen公司的產(chǎn)品。不呢發(fā)明的重組鴨β -防御素-2蛋白的重組酵母陽性轉(zhuǎn)化子的生產(chǎn)方法是這樣實(shí)現(xiàn)的，1、重組質(zhì)粒的制備和線性化挑取轉(zhuǎn)化入重組質(zhì)粒pPICZ α -A-AVBD2的Top 10陽性菌接種于25 mL含25yg/mL kocin的低鹽液體LB培養(yǎng)基中，37°C，220 rpm振搖培養(yǎng)對h。 將菌液于4°C，5 OOOrpm離心10 min，沉淀細(xì)菌。然后用質(zhì)粒DNA抽提試劑盒抽提質(zhì)粒。用 Sac I酶將抽提的重組質(zhì)粒pPICZ α _A_AvBD2線性化。2、畢赤酵母電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備接種畢赤酵母宿主菌X33單菌落至5mL YPD(含lwt%酵母抽提物，2Iwt %蛋白胨，21wt %葡萄糖)培養(yǎng)基中，30°C過夜培養(yǎng)。然后接種0. 1 0. 5mL過夜培養(yǎng)菌液至Ij 500mL新鮮YPD培養(yǎng)液，30°C培養(yǎng)，使0D600nm達(dá)到1. 2 1.3。40C 3 000r/m離心5min，棄上清；依次以500mL、250mL冰浴滅菌水及20mL冰冷Imol/ L山梨糖醇重懸菌體洗滌，4°C 3 000r/m離心5min，離心3次；最后將細(xì)胞重懸于ImL冰浴滅菌的lmol/L山梨糖醇，即為畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞。3、畢赤酵母的電擊轉(zhuǎn)化取80 μ L準(zhǔn)備好的畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，與5 10 μ g 線性化的重組質(zhì)粒pPICZ α -A-AvBD2混合，轉(zhuǎn)移到冰浴的0. 2cm電轉(zhuǎn)杯中，冰浴15min，于 2000-Y型基因?qū)雰x進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，電脈沖參數(shù)為電壓1500V，電容量25 μ F，電阻200 Ω。 電擊后立即加入ImL冰浴的lmol/L山梨糖醇到電轉(zhuǎn)化小杯中，將小杯內(nèi)懸液轉(zhuǎn)移到一個(gè)滅菌的15mL的試管中，將試管在30°C下孵育1 2小時(shí)，取10、25、50、100與200uL分別鋪到含有200 μ g/mL Zeocin YPDS (1%酵母抽提物，2%蛋白胨，21葡萄糖，IM山梨糖醇，20g瓊脂粉)平板上以篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子，30°C孵化平板2 3d至出現(xiàn)乳白色的酵母轉(zhuǎn)化菌落即為含鴨β -防御素-2 (AvBD2)的酵母重組轉(zhuǎn)化子。4、畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定抽提含鴨β -防御素-2 (AvBD2)的酵母重組轉(zhuǎn)化子，以其為模板，加入ExTaq DNA聚合酶、鴨β -防御素_2 (AvBD2)上/下游引物、dNIPs進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，PCR 的反應(yīng)體系為10XPCR Buffer (包含 0. 5mmol/L MgC12, 50mmol/L KCl, lOmmol/L Tris · HC1，0. 001wt% 明膠)5μ L，4XdNTPs (包含 dATP, dTTP, dCTP, dGTP 各 2. 5mmol/L) 4 μ L，濃度均為20 μ mol/L的鴨AvBD2上、下游引物各1 μ L，模板為抽提轉(zhuǎn)化的酵母基因組DNA 1 μ L，ddH20 (雙蒸水)37. 5 μ L，濃度為5 μ mol/L的ExTaq DNA聚合酶 0. 5 μ L，反應(yīng)過程依次為a、94°C處理!Min ；b、依次94°C處理30s、56°C處理30s、72°C處理 30s ；反應(yīng)過程進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；c、72°C延伸IOmin ；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1. 5wt%瓊脂糖凝膠電泳觀察，可見約130bp的擴(kuò)增條帶，即表明所抽提的酵母為陽性酵母轉(zhuǎn)化子。本發(fā)明重組鴨β -防御素-2蛋白的生產(chǎn)方法是這樣實(shí)現(xiàn)的，
1、陽性酵母轉(zhuǎn)化子的誘導(dǎo)表達(dá)挑取經(jīng)鑒定的陽性酵母轉(zhuǎn)化子接種于3 mL YPD液體中，30°C、250 r/min振搖培養(yǎng)過夜；再接種于50 mL BMGY (lwt%酵母抽提物，2 wt %蛋白胨，lmol/L磷酸鉀緩沖液(pH6.0)，1.34 wt %YNB (無酵母氮源)，4X 10_5 wt %生物素，1 wt %甘油)體培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)對h，至菌體0D600nm達(dá)到2 6時(shí)離心棄去上清， 加入25 mL BMMY液體培養(yǎng)基(1 wt %酵母抽提物，2 wt %蛋白胨，lmol/L磷酸鉀緩沖液 (pH6. 0), 1. 34 wt %YNB (無酵母氮源)，4X 10-5 wt %生物素，0.5 wt %甲醇)，連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h，在誘導(dǎo)過程中，每間隔24h加入100 wt%甲醇使其終濃度為0.5%，培養(yǎng)至7 收集樣品，離心，取上清進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示誘導(dǎo)培養(yǎng)后的菌體蛋白與未誘導(dǎo)的對照組相比，有一條大小為4. 32kD非常明顯的蛋白表達(dá)條帶。經(jīng)超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜鑒定，與目的蛋白氨基酸序列相吻合，表明目的基因已經(jīng)得到表達(dá)即重組鴨 β -防御素-2基因蛋白已經(jīng)生產(chǎn)出來。
將含鴨β -防御素_2(AvBD2)的酵母重組轉(zhuǎn)化子體外誘導(dǎo)表達(dá)過程所生產(chǎn)的發(fā)酵液直接用于體外抗菌實(shí)驗(yàn)表明重組鴨β-防御素-2 (AvBD2)蛋白具有抗大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌能力。體內(nèi)治療實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重組鴨β-防御素_2(AvBD2) 蛋白有較好的體內(nèi)防治大腸桿菌與沙門氏菌作用效果。本發(fā)明與已有技術(shù)相比，是對重組鴨AvBD2蛋白進(jìn)行體外表達(dá)生產(chǎn)研究，采用了酵母密碼子優(yōu)化方法對鴨AvBD2基因核苷酸進(jìn)行優(yōu)化，有利于鴨AvBD2在酵母中的誘導(dǎo)表達(dá)生產(chǎn)，能提高表達(dá)量。另外就是，酵母屬于真核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)出來的重組蛋白更接近于天然蛋白，有利于重組蛋白活性的保持。從活性檢測也可以看出表達(dá)的重組蛋白呈現(xiàn)出鴨 AvBD2蛋白所具有的抗菌促生長活性，適合于在畜牧生產(chǎn)中進(jìn)行應(yīng)用，而且生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)效率高。
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述
本發(fā)明的鴨防御素-2 (AvBD2)基因核苷酸序列設(shè)計(jì)與體外合成過程是這樣實(shí)現(xiàn)
的，
參照GenBank中注冊的鴨AvBD2基因cDNA基因序列，同時(shí)根據(jù)酵母密碼子偏好性對鴨 AvBD2基因成熟肽段核苷酸序列進(jìn)行改造，然后利用基因合成方法合成(送上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行基因合成)，改造后合成的鴨防御素-2 (AvBD2)基因核苷酸序列如下
GATATGTTTTTGTGTAGAATTGGTTCTTGTCATTTTGGTAGATGTCCAATTCATTTGGTTAGAGTTGGTTCCT GTTTTGGTTTTAGATCTTGTTGTAAGTCTCCATGGGATGTTTAA。本發(fā)明的含有該基因的重組質(zhì)粒pPICZ α _A_AvBD2是這樣實(shí)現(xiàn)的， 重組質(zhì)粒pPICZ α -A-AvBD2的構(gòu)建過程依次是
1、鴨防御素_2(AvBD2)基因上游引物、下游引物的設(shè)置過程根據(jù)合成的鴨β-防御素_2(AvBD2)基因核苷酸序列經(jīng)多重比較后設(shè)計(jì)而成，上游引物設(shè)計(jì)在該基因起始端，同時(shí)根據(jù)表達(dá)載體pPICZ α -A上的酶切位點(diǎn)，上游引物設(shè)計(jì)時(shí)添加了 Xho I酶切位點(diǎn)及Kex2 與蛋白酶裂解位點(diǎn)，在ZAo I酶切位點(diǎn)前加有3個(gè)保護(hù)性堿基TCT ；下游引物設(shè)計(jì)在基因末端，并加上Λ^ I酶切位點(diǎn)，在Λ^ I酶切位點(diǎn)位點(diǎn)前加有4個(gè)保護(hù)性堿基GCTG，所設(shè)置的鴨β-防御素-2 (AvBD2)基因上游引物、下游引物分別為，
鴨β-防御素-2 (AvBD2)基因上游引物
5，-TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGGATATGTTTTTGTGTAG-3' Xho I 酶切位點(diǎn)， 鴨β-防御素-2 (AvBD2)基因下游引物 5，-GCTGGCGGCCGCTTAAACATCCCAT-3 ’ Not I 酶切位點(diǎn)，
2、鴨β-防御素-2(AvBD2)基因片段的PCR擴(kuò)增過程以合成的鴨β-防御素_2 (AvBD2)基因?yàn)槟０?，加入ExTaq DNA聚合酶、鴨β-防御素_2 (AvBD2)上/下游引物、 dNTPs進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，PCR 的反應(yīng)體系為10XPCR Buffer(包含0. 5mmol/L MgC12, 50mmol/L KC1，lOmmol/L Tris ·Ηα，0· 001% 明膠)5μ L，4XdNTPs(包含 dATP, dTTP, dCTP, dGTP 各 2. 5mmol/L)4y L，濃度均為20μ mol/L的鴨β -防御素-2 (AvBD2)上、下游引物各1 μ L，模板為合成的鴨β-防御素-2 (AvBD2)基因lyL，ddH20 (雙蒸水)37. 5 μ L，濃度為5 μ mol/ L的ExTaq DNA聚合酶0. 5 μ L，反應(yīng)過程依次為a、94°C處理!Min ；b、依次94°C處理30s、56 °C處理30s、72 °C處理30s ；反應(yīng)過程進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；c、72°C延伸IOmin ；即獲得鴨β-防御素-2 (AvBD2)基因的PCR產(chǎn)物，鴨β -防御素-2 (AvBD2)基因的PCR產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，可見大小約130bp的擴(kuò)增條帶，與預(yù)期的結(jié)果一致。3、重組質(zhì)粒pPICZ α -A_AvBD2的構(gòu)建將過程2的鴨β -防御素_2 (AvBD2)基因的PCR產(chǎn)物用氛氯仿抽提純化，加入乙醇獲得沉淀物，將沉淀物干燥后用TE (TE包含有 IOmmol/L Tris · HCl，lmmol/L EDTA)溶解，TE溶解物用IoAI、Λ^ I進(jìn)行雙酶切處理，膠回收大小約130bp的條帶；以同樣的方法對pPICZ α-A質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切處理，膠回收大小約 3. 6kb的DNA片段，分別取5 μ L雙酶切后膠回收的鴨β -防御素_2 (AvBD2)基因片段和 3yL雙酶切后膠回收的pPICZa-A質(zhì)粒，加入IyL的10XT4 DNA連接Buffer (IOX T4 DNA 連接 Buffer 包含有 0. 5mol/L Tris · HCl，0. lmol/L MgCl2, 50mmol/L DTT,5mmol/ L DATP，0. 25mg/mL BSA), 1 μ L T4 DNA連接酶，在16°C下連接處理18小時(shí)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top 10感受態(tài)細(xì)胞，在含有25 μ g/mL Zeocin的低鹽LB瓊脂培養(yǎng)板中，37°C培養(yǎng)過夜， 即完成重組質(zhì)粒pPICZa-A-AVBD2的構(gòu)建。培養(yǎng)板上長出來的白色菌落即為含有重組質(zhì)粒 pPICZ a -A-AvBD2的陽性菌。pPICZ a -A質(zhì)粒為Invitrogen公司的產(chǎn)品。用于生產(chǎn)重組鴨β -防御素-2蛋白的重組酵母陽性轉(zhuǎn)化子是這樣實(shí)現(xiàn)的，
1、重組質(zhì)粒的制備和線性化挑取轉(zhuǎn)化入重組質(zhì)粒pPICZ a -A-AvBD2的Top 10陽性菌接種于25 mL含25 μ g/mL kocin的低鹽液體LB培養(yǎng)基中，37°C，220 rpm振搖培養(yǎng)對h。 將菌液于4°C，5 OOOrpm離心10 min，沉淀細(xì)菌。然后用質(zhì)粒DNA抽提試劑盒抽提質(zhì)粒。用 Sac I酶將抽提的重組質(zhì)粒pPICZ a _A_AvBD2線性化。2、畢赤酵母電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備接種畢赤酵母宿主菌X33單菌落至5mL YPD(含lwt%酵母抽提物，2Iwt %蛋白胨，21wt %葡萄糖)培養(yǎng)基中，30°C過夜培養(yǎng)。然后接種0. 1 0. 5mL過夜培養(yǎng)菌液至Ij 500mL新鮮YPD培養(yǎng)液，30°C培養(yǎng)，使0D600nm達(dá)到1. 2 1.3。40C 3 000r/m離心5min，棄上清；依次以500mL、250mL冰浴滅菌水及20mL冰冷Imol/ L山梨糖醇重懸菌體洗滌，4°C 3 000r/m離心5min，離心3次；最后將細(xì)胞重懸于ImL冰浴滅菌的lmol/L山梨糖醇，即為畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞。3、畢赤酵母的電擊轉(zhuǎn)化取80 μ L準(zhǔn)備好的畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，與5 10 μ g 線性化的重組質(zhì)粒pPICZ a -A-AvBD2混合，轉(zhuǎn)移到冰浴的0. 2cm電轉(zhuǎn)杯中，冰浴15min，于 2000-Y型基因?qū)雰x進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，電脈沖參數(shù)為電壓1500V，電容量25 μ F，電阻200 Ω。 電擊后立即加入ImL冰浴的lmol/L山梨糖醇到電轉(zhuǎn)化小杯中，將小杯內(nèi)懸液轉(zhuǎn)移到一個(gè)滅菌的15mL的試管中，將試管在30°C下孵育1 2小時(shí)，取10、25、50、100與200uL分別鋪到含有200 μ g/mL Zeocin YPDS (1%酵母抽提物，2%蛋白胨，21葡萄糖，IM山梨糖醇，20g瓊脂粉)平板上以篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子，30°C孵化平板2 3d至出現(xiàn)乳白色的酵母轉(zhuǎn)化菌落即為含鴨β -防御素-2 (AvBD2)的酵母重組轉(zhuǎn)化子。4、畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定抽提含鴨β -防御素-2 (AvBD2)的酵母重組轉(zhuǎn)化子，以其為模板，加入ExTaq DNA聚合酶、鴨β -防御素_2 (AvBD2)上/下游引物、dNIPs進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，PCR 的反應(yīng)體系為10XPCR Buffer (包含 0. 5mmol/L MgC12, 50mmol/L KCl, lOmmol/L Tris · HC1，0. 001wt% 明膠)5μ L，4XdNTPs (包含 dATP, dTTP, dCTP, dGTP 各 2. 5mmol/L) 4 μ L，濃度均為20 μ mol/L的鴨AvBD2上、下游引物各1 μ L，模板為抽提轉(zhuǎn)化的酵母基因組DNA 1 μ L，ddH20 (雙蒸水)37. 5 μ L，濃度為5 μ mol/L的ExTaq DNA聚合酶0. 5 μ L，反應(yīng)過程依次為a、94°C處理!Min ；b、依次94°C處理30s、56°C處理30s、72°C處理 30s ；反應(yīng)過程進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；c、72°C延伸IOmin ；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1. 5wt%瓊脂糖凝膠電泳觀察，可見約130bp的擴(kuò)增條帶，即表明所抽提的酵母為陽性酵母轉(zhuǎn)化子。重組鴨β -防御素-2蛋白的生產(chǎn)方法，
1、陽性酵母轉(zhuǎn)化子的誘導(dǎo)表達(dá)挑取經(jīng)鑒定的陽性酵母轉(zhuǎn)化子接種于3 mL YPD液體中，30°C、250 r/min振搖培養(yǎng)過夜；再接種于50 mL BMGY (lwt%酵母抽提物，2 wt %蛋白胨，lmol/L磷酸鉀緩沖液(pH6. 0),1.34 wt %YNB (無酵母氮源)，4X 10_5 wt %生物素，1 wt %甘油)體培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)對h，至菌體0D600nm達(dá)到2 6時(shí)離心棄去上清， 加入25 mL BMMY液體培養(yǎng)基(1 wt %酵母抽提物，2 wt %蛋白胨，lmol/L磷酸鉀緩沖液 (ρΗ6. 0), 1. 34 wt %YNB (無酵母氮源)，4X 10-5 wt %生物素，0.5 wt %甲醇)，連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h，在誘導(dǎo)過程中，每間隔24h加入100 wt%甲醇使其終濃度為0.5%，培養(yǎng)至7 收集樣品，離心，取上清進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示誘導(dǎo)培養(yǎng)后的菌體蛋白與未誘導(dǎo)的對照組相比，有一條大小為4. 32kD非常明顯的蛋白表達(dá)條帶。經(jīng)超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜鑒定，與目的蛋白氨基酸序列相吻合，表明目的基因已經(jīng)得到表達(dá)即重組鴨 β -防御素-2基因蛋白已經(jīng)生產(chǎn)出來。本發(fā)明所使用的限制性內(nèi)切酶)(ho I、Not I.Sac I、T4DNA連接酶、ExTaq DNA聚合酶等均購自廣州寶泰克生物科技有限公司。菌株X-33、kocin抗生素、pPICZa -A質(zhì)粒為Invitrogen公司的產(chǎn)品。體外抗菌活性檢測發(fā)現(xiàn)重組鴨AvBD2蛋白具有抗大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌能力，對大腸桿菌44103、豬霍亂沙門氏菌(ATCC13312)、金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、枯草芽孢桿菌(ATCC6633)、分離株大腸桿菌和分離株豬霍亂沙門氏菌的最小抑菌濃度分別為16. 41,65. 63,32. 81,16. 41,65. 63和131. 25μ g/ml。以兩周齡的雛雞為對象，初步研究了重組鴨AvBD2蛋白防治雛雞細(xì)菌感染的效果。在治療實(shí)驗(yàn)中，對大腸桿菌攻毒的雛雞注射250 μ g重組鴨AvBD2蛋白治療效果最好，一周后雛雞存活率達(dá)到90% ； 對沙門氏菌攻毒雛雞注射300 μ g重組鴨AvBD2蛋白治療效果最好，一周后雛雞存活率達(dá)到 80% ；結(jié)果表明，重組鴨β -防御素-2蛋白有較好的體內(nèi)防治效果。
權(quán)利要求
1.一種合成的重組鴨β-防御素-2基因，其特征在于參照GenBank中注冊的鴨AvBD2 基因cDNA基因序列，同時(shí)根據(jù)酵母密碼子偏好性對鴨AvBD2基因成熟肽段核苷酸序列進(jìn)行改造，然后利用基因合成方法合成，改造后合成的鴨防御素-2基因核苷酸序列如下GATATGTTTTTGTGTAGAATTGGTTCTTGTCATTTTGGTAGATGTCCAATTCATTTGGTTAGAGTTGGTTCCT GTTTTGGTTTTAGATCTTGTTGTAAGTCTCCATGGGATGTTTAA。
2.一種含有合成的重組鴨防御素-2基因的重組質(zhì)粒，其特征在于，含有重組鴨β -防御素-2基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建過程依次是(1)鴨β-防御素-2基因上游引物、下游引物的設(shè)置過程根據(jù)合成的鴨防御素-2 基因核苷酸序列經(jīng)多重比較后設(shè)計(jì)而成，上游引物設(shè)計(jì)在該基因起始端，同時(shí)根據(jù)表達(dá)載體pPICZ α -A上的酶切位點(diǎn)，上游引物設(shè)計(jì)時(shí)添加了損ο I酶切位點(diǎn)及Kex2與蛋白酶裂解位點(diǎn)，在ZAo I酶切位點(diǎn)前加有3個(gè)保護(hù)性堿基TCT ；下游引物設(shè)計(jì)在基因末端，并加上Λ^ I酶切位點(diǎn)，在Λ^ I酶切位點(diǎn)位點(diǎn)前加有4個(gè)保護(hù)性堿基GCTG，所設(shè)置的鴨β-防御素-2基因上游引物、下游引物分別為，鴨β-防御素-2基因上游引物5，-TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGGATATGTTTTTGTGTAG-3' Xho I 酶切位點(diǎn)，鴨β-防御素-2基因下游引物5，-GCTGGCGGCCGCTTAAACATCCCAT-3 ’ Not I 酶切位點(diǎn)，(2)鴨β-防御素-2基因片段的PCR擴(kuò)增過程以合成的鴨β-防御素-2基因?yàn)槟０澹?加入ExTaq DNA聚合酶、鴨β -防御素_2上/下游引物、dNTPs進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，PCR的反應(yīng)體系為10XPCR Buffer5y L，4XdNTPs4y L，濃度均為 20ymol/L 的鴨 β -防御素 _2 上、 下游引物各1 μ L,模板為合成的鴨β -防御素-2基因1 μ L，ddH2037. 5 μ L，濃度為5 μ mol/ L 的 ExTaq DNA 聚合酶 0· 5 μ L，IOXPCR Buffer 包含 0. 5mmol/L MgC12、50mmol/L KCl, lOmmol/L Tris · HC1、0. 001wt% 明膠，4X dNTPs 包含用量均為 2. 5mmol/L 的 dATP、dTTP、 dCTP、dGTP，反應(yīng)過程依次為a、94°C處理!Min ；b、依次94°C處理30s、56°C處理30s、72°C 處理30s ；反應(yīng)過程進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；c、72°C延伸IOmin ；即獲得鴨β _防御素_2基因的PCR 產(chǎn)物，(3)重組質(zhì)粒pPICZα -A-AvBD2的構(gòu)建將過程(2)的鴨β -防御素-2基因的PCR產(chǎn)物用氛氯仿抽提純化，加入乙醇獲得沉淀物，將沉淀物干燥后用TE溶解，TE包含有IOmmol/ L Tris · HCl、lmmol/L EDTA，TE溶解物用ΙοΑΙ、Λ^ I進(jìn)行雙酶切處理，膠回收大小約 130bp的條帶；以同樣的方法對pPICZ α-A質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切處理，膠回收大小為3. 6kb的 DNA片段，分別取5 μ L雙酶切后膠回收的鴨β -防御素-2基因片段和3 μ L雙酶切后膠回收的 pPICZ α-A 質(zhì)粒，加入 IyL 的 10ΧΤ4 DNA 連接 Buffer，1 μ L Τ4 DNA 連接酶，在 16°C 下連接處理18小時(shí)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top 10感受態(tài)細(xì)胞，在含有25 μ g/mL Zeocin的低鹽LB瓊脂培養(yǎng)板中，37°C培養(yǎng)過夜，即完成重組質(zhì)粒pPICZ α _A_AvBD2的構(gòu)建，形成轉(zhuǎn)化入重組質(zhì)粒 pPICZ α -A-AvBD2 的 iTop 10 陽性菌，10 X T4 DNA 連接 Buffer 包含有 0. 5mol/L Tris · HC1、0. lmol/L MgC12、50mmol/L DTT、5mmol/L DATP。
3.一種合成的重組鴨防御素-2蛋白的重組酵母陽性轉(zhuǎn)化子的生產(chǎn)方法，其特征在于，(1)重組質(zhì)粒的制備和線性化挑取轉(zhuǎn)化入重組質(zhì)粒pPICZ α -A-AvBD2的Top 10陽性菌接種于25 mL含25 μ g/mL Zeocin的低鹽液體LB培養(yǎng)基中，37°C，220 rpm振搖培養(yǎng)M h，將菌液于4°C，5 OOOrpm離心10 min，沉淀細(xì)菌，然后用質(zhì)粒DNA抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，用 Sac I酶將抽提的重組質(zhì)粒pPICZ α _A_AvBD2線性化，(2)畢赤酵母電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備接種畢赤酵母宿主菌X33單菌落至5mLYPD 培養(yǎng)基中，30°C過夜培養(yǎng)，YPD含lwt%酵母抽提物、2 wt %蛋白胨、2 wt %葡萄糖，然后接種0. 1 0. 5mL過夜培養(yǎng)菌液至Ij 500mL新鮮YPD培養(yǎng)液，30°C培養(yǎng)，使0D600nm達(dá)到1. 2 1. 3 AV 3 000r/m離心5min，棄上清；依次以500mL、250mL冰浴滅菌水及20mL冰冷Imol/ L山梨糖醇重懸菌體洗滌，4°C 3 000r/m離心5min，離心3次；最后將細(xì)胞重懸于ImL冰浴滅菌的lmol/L山梨糖醇，即為畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，(3)畢赤酵母的電擊轉(zhuǎn)化取80μ L準(zhǔn)備好的畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，與5 10 μ g線性化的重組質(zhì)粒pPICZ α -A-AvBD2混合，轉(zhuǎn)移到冰浴的0. 2cm電轉(zhuǎn)杯中，冰浴15min，于 2000-Y型基因?qū)雰x進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，電脈沖參數(shù)為電壓1500V，電容量25 μ F，電阻200 Ω， 電擊后立即加入ImL冰浴的lmol/L山梨糖醇到電轉(zhuǎn)化小杯中，將小杯內(nèi)懸液轉(zhuǎn)移到一個(gè)滅菌的15mL的試管中，將試管在30°C下孵育1 2小時(shí)，取10、25、50、100與200uL分別鋪到含有200 μ g/mL Zeocin YPDS平板上以篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子，30°C孵化平板2 3d至出現(xiàn)乳白色的酵母轉(zhuǎn)化菌落即為含鴨β-防御素-2的酵母重組轉(zhuǎn)化子，Zeocin YPDS包含1 wt % 酵母抽提物、2 wt %蛋白胨、2 wt %葡萄糖、IM山梨糖醇、20g瓊脂粉。
4. 一種重組鴨防御素-2蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于，含鴨β -防御素-2的酵母重組轉(zhuǎn)化子體外誘導(dǎo)表達(dá)過程(1)陽性酵母轉(zhuǎn)化子的誘導(dǎo)表達(dá)挑取經(jīng)鑒定的陽性酵母轉(zhuǎn)化子接種于3 mL YPD液體中，30°C、250 r/min振搖培養(yǎng)過夜；再接種于50 mL BMGY體培養(yǎng)基中，BMGY包含lwt% 酵母抽提物、2 wt %蛋白胨，lmol/L的pH為6.0的磷酸鉀緩沖液、1.3#t%無酵母氮源、 4X10-5wt %生物素、l%wt甘油，30°C振蕩培養(yǎng)對h，至菌體0D600nm達(dá)到2 6時(shí)離心棄去上清，加入25 mL BMMY液體培養(yǎng)基，BMMY液體培養(yǎng)基包含lwt%酵母抽提物、2 wt %蛋白胨、lmol/L的pH為6. 0的磷酸鉀緩沖液、1. 34 wt %無酵母氮源、4X 10_5 wt %生物素、 0. 5 wt %甲醇，連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h，在誘導(dǎo)過程中，每間隔24h加入100%甲醇使其終濃度為0. 5%，培養(yǎng)至7 收集樣品，離心，取上清進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示誘導(dǎo)培養(yǎng)后的菌體蛋白與未誘導(dǎo)的對照組相比，有一條大小為4. 32kD非常明顯的蛋白表達(dá)條帶， 經(jīng)超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜鑒定，與目的蛋白氨基酸序列相吻合，表明目的基因已經(jīng)得到表達(dá)即重組鴨β -防御素-2蛋白已經(jīng)生產(chǎn)出來。
全文摘要
一種合成的鴨β-防御素-2基因、含該基因的重組質(zhì)粒與重組酵母轉(zhuǎn)化子及重組鴨β-防御素-2蛋白的生產(chǎn)方法，其中重組鴨β-防御素-2基因參照GenBank中注冊的鴨AvBD2基因cDNA基因序列，同時(shí)根據(jù)酵母密碼子偏好性對鴨AvBD2基因成熟肽段核苷酸序列進(jìn)行改造，然后利用基因合成方法合成，含該基因的重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒的構(gòu)建過程依次是(1)鴨β-防御素-2基因上游引物、下游引物的設(shè)置過程；(2)鴨β-防御素-2基因片段的PCR擴(kuò)增過程；(3)重組質(zhì)粒pPICZα-A-AvBD2的構(gòu)建；重組鴨β-防御素-2蛋白的重組酵母陽性轉(zhuǎn)化子的生產(chǎn)方法包括(1)重組質(zhì)粒的制備和線性化、(2)畢赤酵母電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備、(3)畢赤酵母的電擊轉(zhuǎn)化；重組鴨β-防御素-2蛋白的生產(chǎn)方法包括(1)陽性酵母轉(zhuǎn)化子的誘導(dǎo)表達(dá)。本發(fā)明與已有技術(shù)相比，具有抗菌促生長活性，適合于在畜牧生產(chǎn)中進(jìn)行應(yīng)用，而且生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)效率高的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12N15/66GK102433342SQ20111040078
公開日2012年5月2日 申請日期2011年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月6日
發(fā)明者張輝華, 李辰, 畢英佐, 謝青梅, 韓小鳳, 馬保華, 馬靜云 申請人:佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院