專(zhuān)利名稱(chēng)：涉及植物半矮化的sd1基因和其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分離和鑒定植物半矮化的基因和利用該基因的植物半矮化。
背景技術(shù)：
1956年在Taiwan，新的稻品種臺(tái)中本地1號(hào)(Taichung Native 1)獲得了在常規(guī)的秈稻品種中觀察不到的高產(chǎn)量，臺(tái)中本地1號(hào)由當(dāng)?shù)匕氚贩N低腳鳥(niǎo)尖(Dee-geo-woo-gen)和抗病菜園品種(Tsai-yuang-chung)雜交育成。在1960年后期，相同的半矮化品種低腳鳥(niǎo)尖和印度尼西亞優(yōu)質(zhì)長(zhǎng)稈(long-culm)稻品種(Peta)于菲律賓國(guó)際水稻研究所(IRRI)雜交育成。由于其顯著改進(jìn)了單位面積的產(chǎn)量，所以將該半矮化品種[IR8]稱(chēng)作“奇跡稻(miracle rice)”?！捌孥E稻”播種的日益擴(kuò)大拯救了亞洲的食物危機(jī)并且也引起了“綠色革命”。臺(tái)中本地1號(hào)和IR8對(duì)高產(chǎn)貢獻(xiàn)的基因是源于低腳鳥(niǎo)尖的半矮化基因sd1。然而，時(shí)至今日，僅僅確定了sd1基因的大致染色體基因座(Maeda等，Breeding Science47317-320，1997)。
一般而言，植物，尤其是有用的農(nóng)業(yè)作物例如水稻，如果想增加它們的產(chǎn)量則必須在非常肥沃的條件(即富集氮的條件)下種植。然而，在這種條件下植株會(huì)變得非常高使得其受臺(tái)風(fēng)等影響易于倒伏，結(jié)果是降低產(chǎn)量。解決該問(wèn)題的一種方法是矮化植株并將它們?cè)谪S富的肥料條件下培養(yǎng)。sd1基因僅稍稍矮化植株，并沒(méi)有因此而降低分蘗數(shù)和谷粒大小，或降低種子數(shù)。其還可以在豐富的肥料條件下抑制植物倒伏并改進(jìn)株型。在這種情形下，sd1基因使表型不同于那些已知的矮化基因d1和d61所誘導(dǎo)的表型(Ashikari M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，9610284-10289，1999；YamamuroC.等，Plant Cell，121591-1605，2000)。這種抗倒伏的改善使得植物能在肥沃的條件下種植；同樣地，植株型的改善增強(qiáng)物質(zhì)的生產(chǎn)能力和同化產(chǎn)物向谷粒和種子的分配率。時(shí)至今日，利用這些特性，許多水稻品種，包括在世界范圍內(nèi)有最大種植面積的IR64，已經(jīng)通過(guò)回交被賦予了由sd1基因誘導(dǎo)的表型以育出新的水稻品種。
另一方面，隨著最近人口爆炸式的劇增，谷物產(chǎn)量需要進(jìn)一步增加50％，因而迫切地需要培育出多種高產(chǎn)有用的作物品種。所以為了提高各種植物，特別是包括水稻(rice)的有用的農(nóng)作物的產(chǎn)量，利用sd1基因誘導(dǎo)在肥沃條件下穩(wěn)定地提高產(chǎn)量是有利的。然而，分離和鑒定包括水稻在內(nèi)的植物的sd1基因尚未報(bào)道過(guò)。
發(fā)明公開(kāi)本發(fā)明是在這些情況下進(jìn)行的。本發(fā)明的目的是提供一種涉及植物半矮化的sd1基因。此外，本發(fā)明另一目的是提供一種使用sd1基因使植物半矮化的方法。
植物激素赤霉素(GA)涉及在許多生長(zhǎng)進(jìn)程，例如萌發(fā)，莖/葉的延伸，以及花芽的形成。GA合成途徑已經(jīng)被詳細(xì)研究，并且編碼催化GA合成的酶的基因已經(jīng)從擬南芥，水稻，玉米，南瓜等中分離出(Hedden和Kamiya，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48431-460，1997)。在涉及GA合成或遺傳信息傳遞的基因變得異常時(shí)，植物不能將GA用于其生長(zhǎng)，因而變得矮化。事實(shí)上，許多報(bào)道已經(jīng)顯示缺乏涉及GA合成或遺傳信息傳遞的基因會(huì)產(chǎn)生矮化突變體(Hedden和Kamiya，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48431-460，1997)。因此，本發(fā)明人推測(cè)GA涉及水稻的半矮化，并將GA應(yīng)用于sd1突變的低腳鳥(niǎo)尖(Dee-geo-woo-gen)以檢測(cè)GA反應(yīng)性。結(jié)果，使用GA導(dǎo)致低腳鳥(niǎo)尖(Dee-geo-woo-gen)莖/葉的延伸。此外，一種GA生物合成的酶，C20氧化酶，在GA生物合成途徑中催化下面的步驟GA53-GA44-GA19-GA20和GA12-GA15-GA24-GA9?，F(xiàn)在C20氧化酶已經(jīng)從南瓜，擬南芥和水稻中分離出來(lái)(Lange等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，918552-8556，1994；Phillips等，Plant physiol.1081049-1057，1995；Xu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，926640-6644，1995；Toyomasu等，Physiol.Plant.99111-118，1997)，并且據(jù)報(bào)道在擬南芥基因組中至少存在三種C20氧化酶基因(Phillips等，Plant Physiol.1081049-1057，1995)。
由此可見(jiàn)，本發(fā)明人推測(cè)sd1基因是涉及GA生物合成的基因，尤其是植物基因組中重復(fù)出現(xiàn)的C20氧化酶基因。如果如此，這就解釋了為什么水稻sd1基因不誘導(dǎo)植株型的顯著矮化。因此，本發(fā)明人意欲首先分離和鑒定了擬南芥C20氧化酶的水稻對(duì)應(yīng)物(couterpart)。
結(jié)果，本發(fā)明人成功地分離和鑒定了一種新的水稻GA C20氧化酶基因。此外，本發(fā)明人又研究該基因的染色體座位是否接近水稻sd1座位，以及在水稻半矮化品種中是否該新的水稻GA C20氧化酶基因突變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因的染色體基因座非常接近于水稻sd1的基因座。此外在確定和比較一些包含低腳鳥(niǎo)尖(Dee-geo-woo-gen)和相應(yīng)野生型的sd1突變體中GA C20氧化酶基因的核苷酸序列時(shí)，該GA C20氧化酶基因在所有的突變體中sd1發(fā)生突變。因此，第一次表明水稻sd1基因等同于編碼新的C20氧化酶的基因，暗示植物sd1基因(C20氧化酶基因)的突變會(huì)誘導(dǎo)植物的半矮化。
植物sd1基因可通過(guò)標(biāo)記選擇而用于高效育種。在利用常規(guī)雜交育種來(lái)制備導(dǎo)入了sd1基因的品種時(shí)，例如在將sd1基因?qū)肴毡咀顝V泛種植的品種Koshihikari時(shí)，有必要通過(guò)將Koshihikari與IR64或具有sd1基因的品種雜交來(lái)制備F1，接著將F1與Koshihikari重復(fù)回交直至除了sd1基因座的所有染色體被Koshihikari的那些所取代。由于利用sd1基因作為分子標(biāo)記允許人們有效地選擇具有僅被sd1基因取代的Koshihikari染色體的個(gè)體，因而分離sd1基因節(jié)省了育種所需的大量時(shí)間和勞動(dòng)，而且，植物sd1基因可以允許使用分子生物學(xué)技術(shù)諸如反義和RNAi方法制備植物轉(zhuǎn)化體。還可預(yù)計(jì)提高有用農(nóng)作物，包括谷物，諸如小麥，大麥，玉米，蔬菜和果樹(shù)的產(chǎn)量，而且通過(guò)矮化賦予觀賞植物，諸如觀葉植物(foliage plants)以美學(xué)價(jià)值，培育出新品種。
具體地，本發(fā)明涉及分離和鑒定植物半矮化的基因，和利用該sd1基因使植物半矮化，更具體的是提供下述的[1]用于半矮化植物的根據(jù)(a)到(c)中任一所述的DNA(a)編碼與植物sd1基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補(bǔ)的反義RNA的DNA；(b)編碼具有特異切割植物sd1基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的核酶活性的RNA的DNA；和(c)編碼通過(guò)共抑制效果抑制植物sd1基因表達(dá)的RNA的DNA；[2][1]的DNA，其中所述植物sd1基因是水稻sd1基因；[3]包含[1]或[2]的DNA的載體； 保持[1]或[2]的DNA處于可表達(dá)狀態(tài)的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；[5][4]的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述植物是水稻；[6]包含[4]或[5]轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的植物轉(zhuǎn)化體；[7]一種植物轉(zhuǎn)化體，其是[6]的植物轉(zhuǎn)化體的后代或克?。籟8][6]或[7]植物轉(zhuǎn)化體，其中所述植物是水稻；[9][6]到[8]中任一植物轉(zhuǎn)化體的繁殖材料；[10]制備[6]到[8]中任一植物轉(zhuǎn)化體的方法，其中所述方法包括下述步驟將[1]或[2]的DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞，以及從所述植物細(xì)胞再生植物體；[11]一種半矮化植物的方法，其中所述方法包括抑制植物細(xì)胞中內(nèi)源sd1基因表達(dá)的步驟；[12][11]的方法，其中表達(dá)的抑制通過(guò)將[1]或[2]的DNA導(dǎo)入植物實(shí)現(xiàn)；[13][10]到[12]中任一項(xiàng)的方法，其中所述植物是水稻；和[14]編碼水稻sd1蛋白的DNA。
本發(fā)明揭示植物sd1基因的突變誘導(dǎo)植物半矮化。因此，在肥沃的條件下通過(guò)抑制植物sd1基因的表達(dá)有可能制備出能獲得穩(wěn)定高產(chǎn)量的半矮化品種。
本發(fā)明所述的“植物半矮化”是指僅使植株的高度稍微矮化而沒(méi)有降低分蘗數(shù)，谷粒大小及種子數(shù)。通過(guò)這種半矮化，植株被賦予了在肥沃的條件下的抗倒伏性并且其植株型得以改善。結(jié)果，可以獲得穩(wěn)定的高產(chǎn)量。
在本發(fā)明中所述“植物sd1基因”指的是編碼植物C20氧化酶的基因，并且包括水稻sd1基因(編碼SEQ ID NOs3和4的DNA)，擬南芥sd1基因(Phillips等，Plant physiol.1081049-1057，1995)，和源于其它植物的sd1基因。
可以利用雜交(Southern等，Journal of Molecular Biology 98503，1975)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)(Saiki等，Science 2301350-1354，1985；Saiki等，Science 239487-491，1988)技術(shù)實(shí)施鑒定未知“植物sd1基因”。也就是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以分離與來(lái)自其它目的植物的sd1基因高度同源的DNAs，并測(cè)定它們的序列，例如通過(guò)用水稻sd1基因的核苷酸序列(編碼SEQ IDNOs3和4的DNA)或其部分作為探針，或通過(guò)用與sd1基因的核苷酸序列特異雜交的寡核苷酸作為引物。
雜交反應(yīng)通常在嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行以分離所述DNA，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件包括諸如下面的條件6M尿素，0.4％ SDS，0.5×SSC；和那些有類(lèi)似嚴(yán)謹(jǐn)度的條件。分離具有更高同源性的DNAs可以通過(guò)更高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下實(shí)施雜交而達(dá)到，例如，6M尿素，0.4％ SDS，和0.1×SSC?？梢詫⒎蛛x的DNAs通過(guò)已知的方法測(cè)序。
是否所分離的DNA是編碼sd1蛋白的DNA通?？梢酝ㄟ^(guò)序列間的同源性程度而判斷。使用諸如BLASTN(核酸序列水平)或BLASTX(氨基酸序列水平)的程序測(cè)定(Altschul等，J.Mol.Biol.215403-410，1990)。該程序基于Karlin和Altschul所述的算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877，1993)。在根據(jù)BLASTN分析核苷酸序列時(shí)，參數(shù)設(shè)置為例如得分(score)＝100和字段長(zhǎng)(word length)＝12。另一方面，為了通過(guò)BLASTX分析氨基酸序列，參數(shù)設(shè)置為例如得分＝50和字段長(zhǎng)＝3。此外，在氨基酸序列使用Gapped BLAST程序分析時(shí)，分析可以按照Altschul等所述進(jìn)行(Nucleic Acids Res.253389-3402，1997)。利用BLAST和Gapped BLAST程序時(shí)使用各程序的默認(rèn)參數(shù)。這些分析方法的具體技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的(見(jiàn)http//www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
本發(fā)明中，并不對(duì)通過(guò)抑制sd1基因的表達(dá)而賦予半矮化性狀的植物進(jìn)行具體限定。因此，任何植物可以被半矮化，盡管優(yōu)選的是使用有用的農(nóng)作物或觀賞植物。有用的農(nóng)作物包括，例如，單子葉植物，諸如水稻，玉米，小麥和大麥，以及雙子葉植物諸如油菜，大豆，棉花，蕃茄，馬鈴薯。觀賞植物(ornamental plant)包括花卉植物，諸如菊花，玫瑰，康乃馨(carnation)，和仙客來(lái)(cyclamen)。
根據(jù)本發(fā)明的方法制備半矮化的植物是通過(guò)下述方法得到的將抑制sd1基因表達(dá)的DNA插入合適的載體，將該載體導(dǎo)入植物細(xì)胞，然后再生所得的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“抑制sd1基因的表達(dá)”指的是抑制sd1基因轉(zhuǎn)錄和抑制翻譯成蛋白質(zhì)。它還包括DNA表達(dá)的停止和這種表達(dá)的降低。
植物中特定內(nèi)源基因的表達(dá)通過(guò)使用本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍使用的反義技術(shù)的方法而得以抑制。Ecker等首先證實(shí)使用瞬時(shí)基因表達(dá)的方法通過(guò)電穿孔將反義RNA導(dǎo)入植物細(xì)胞的反義效果(Ecker和Davis(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 835372)。其后，據(jù)報(bào)道靶基因的表達(dá)通過(guò)表達(dá)反義RNAs而在煙草和矮牽牛花中降低(Krol等(1988)Nature 333866)。反義技術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)被確立為抑制植物中基因表達(dá)的一種方法。通過(guò)反義核酸多重因素導(dǎo)致靶基因表達(dá)受到抑制。這些包括由三鏈形成抑制轉(zhuǎn)錄的起始；在RNA聚合酶已經(jīng)形成局部開(kāi)放環(huán)結(jié)構(gòu)的位點(diǎn)處形成雜交而抑制轉(zhuǎn)錄；與不斷繼續(xù)合成的RNA形成雜交而抑制轉(zhuǎn)錄；由在內(nèi)含子和外顯子交接處形成雜交抑制拼接；由在剪接體形成的位點(diǎn)形成雜交抑制剪接；與mRNA形成雜交而抑制mRNA由核向細(xì)胞質(zhì)的移動(dòng)；在加帽位點(diǎn)或添加poly A的位點(diǎn)形成雜交而抑制拼接；對(duì)于翻譯起始因子在結(jié)合位點(diǎn)形成雜交而抑制翻譯的起始；在起始密碼子附近的核糖體結(jié)合位點(diǎn)形成雜交而抑制翻譯；在mRNA的翻譯區(qū)中或在多核糖體結(jié)合的位點(diǎn)形成雜交而抑制肽鏈的延長(zhǎng)；和在核酸和蛋白質(zhì)相互作用的位點(diǎn)形成雜交而抑制基因表達(dá)。這些因素通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄，剪接，和/或翻譯過(guò)程而抑制靶基因的表達(dá)(Hirashima和Inoue，“Shin Seikagaku Jikken Koza(New Biochemistry Experimentation Lectures)2，Kakusan(Nucleic Acids)IV，Idenshi No Fukusei To Hatsugen(Replication andExpression of genes)”，Nihon Seikagakukai(The Japanese Biochemical Society)(ed.)，Tokyo Kagaku Dozin，pp.319-347，(1993))。
因此，本發(fā)明的反義序列可以通過(guò)上述機(jī)制而抑制靶基因的表達(dá)。在一實(shí)施方案中，如果將反義序列設(shè)計(jì)成與接近該基因mRNA的5’末端的非翻譯區(qū)互補(bǔ)，將會(huì)有效地抑制基因的翻譯。還可能使用與編碼區(qū)或3’側(cè)非翻譯區(qū)互補(bǔ)的序列。因此，本發(fā)明所用反義DNA包括具有基因非翻譯區(qū)和翻譯區(qū)反義序列的DNA。將所要使用的反義DNA連接到合適啟動(dòng)子的下游，并且，優(yōu)選的是，將包含轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的序列連接到3’側(cè)。
基于SEQ ID NO3的DNA的序列信息，例如通過(guò)硫代磷酸法，制備反義DNA(Stein，Nucleic.Acid.Res.163209-3221，1988)。將所制得的DNA通過(guò)已知的方法轉(zhuǎn)染至目的植物。反義DNA的序列優(yōu)選的是與要轉(zhuǎn)化的植物的內(nèi)源基因或其部分互補(bǔ)的序列，然而并不需要100％的互補(bǔ)，只要其可以有效地抑制基因表達(dá)。轉(zhuǎn)錄RNA優(yōu)選的是90％或更高，甚至是更優(yōu)選的是95％或更高地與靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補(bǔ)。為了有效地通過(guò)反義序列抑制靶基因的表達(dá)，反義DNA應(yīng)至少長(zhǎng)為15個(gè)核苷酸甚至更長(zhǎng)，優(yōu)選的是100個(gè)核苷酸或更多，更優(yōu)選的是500個(gè)核苷酸或更長(zhǎng)。通常所用的反義DNA一般是短于5kb，更優(yōu)選的是短于2.5kb。
編碼核酶的DNA可用于抑制內(nèi)源基因的表達(dá)。核酶是指具有催化活性的RNA分子。RNA雖然具有各種核酶活性，但是對(duì)核酶作為切割RNA的酶的研究使得能夠設(shè)計(jì)特異切割RNA位點(diǎn)的目的核酶。而諸如I組內(nèi)含子類(lèi)型和包含于RnaseP中的MIRNA核酶可以是大的，具有400個(gè)核苷酸或更多，也有更小的，包括具有約40個(gè)核苷酸活性結(jié)構(gòu)域的錘頭型和發(fā)夾型(Koizumi和Ohtsuka(1990)Tanpakushitsu Kakusan Kohso(Protein，Nucleicacid，and Enzyme)352191)。
錘頭型核酶的自我切割結(jié)構(gòu)域在序列G13U14C15的3’側(cè)C15處切割。在U14和在第九位的A之間形成的核苷酸對(duì)被認(rèn)為對(duì)于核酶的活性是重要的。而且，顯示當(dāng)在第15位的核苷酸是A或U而不是C時(shí)，切割也可以發(fā)生(Koizumi等(1988)FEBS Lett.228225)。如果核酶的底物結(jié)合位點(diǎn)被設(shè)計(jì)為與靶位點(diǎn)臨近的RNA序列互補(bǔ)，可以生成能識(shí)別靶RNA內(nèi)序列UC，UU或UA限制酶樣RNA切割核酶(Koizumi等(1988)FEBS Lett.239285；Koizumi和Ohtsuka(1990)Tanpakushitsu Kakusan Kohso(Protein，Nucleic acid，and Enzyme)，352191；Koizumi等(1989)Nucleic Acids Res.177059)。
發(fā)夾型核酶也可以用于本發(fā)明中。例如煙草環(huán)斑病毒衛(wèi)星RNA負(fù)鏈中可以發(fā)現(xiàn)發(fā)夾型核酶(Buzayan(1986)Nature 323349)。該酶也顯示靶特異性地切割RNA(Kikuchi和Sasaki(1992)Nucleic Acids Res.196751；Kikuchi(1992)Kagaku To Seibutsu(Chemistry and Biology)30112)。
被設(shè)計(jì)用于切割靶的核酶與啟動(dòng)子諸如花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)錄終止序列融合，以使得其在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄。然而，如果將額外序列添加到轉(zhuǎn)錄RNA的5’末端或3’末端，就會(huì)失去核酶活性。在這種情況下，可以將附加的修飾(trimming)的核酶，其是順式作用以進(jìn)行在核酶部分5’側(cè)或3’側(cè)的修飾，從而自包含核酶的轉(zhuǎn)錄RNA精確地切割核酶部分(Taira等(1990)Protein Eng.3733；Dzaianott和Bujarski(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 864823；Grosshands和Cech(1991)Nucleic.Acids.Res.193875；Taira等(1991)Nucleic.Acid.Res.195125)。靶基因內(nèi)的多位點(diǎn)可以通過(guò)將這些結(jié)構(gòu)單元串聯(lián)而被切割以獲得更大的效果(Yuyama等，Biochem.Biophys.Res.Commun.1861271(1992))。使用這種核酶，就有可能特異地切割本發(fā)明靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，從而抑制該基因的表達(dá)。
內(nèi)源基因的表達(dá)也可通過(guò)共抑制，用與靶基因序列具有相同或相似序列的DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化而得以抑制?！肮惨种啤敝傅氖沁@種現(xiàn)象，其中將具有與靶內(nèi)源基因序列具有相同或相似序列的基因通過(guò)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入植物，導(dǎo)入的外源基因和靶內(nèi)源基因的表達(dá)被抑制。盡管詳細(xì)的共抑制的機(jī)制還未被完全理解，然而其在植物中被經(jīng)常觀察到(Curr.Biol.7R793，1997；Curr.Biol.6810，1996)。例如，如果希望獲得其中sd1基因被共抑制的植物體，所研究的植物體可用載體DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化，所述載體DNA為被設(shè)計(jì)成表達(dá)sd1基因或具有類(lèi)似序列的DNA，以在所得的植物中選擇具有sd1突變體特性的植物，即半矮化植物。用于共抑制的該基因不需要完全與靶基因相同，然而，其應(yīng)該至少有70％或更多，優(yōu)選80％或更多，更優(yōu)選90％或更多(例如95％或更多)的序列同一性。
此外，本發(fā)明內(nèi)源基因的表達(dá)也可通過(guò)用具有靶基因顯性陰性表型的基因轉(zhuǎn)化植物而得以抑制。具有顯性陰性表型的基因指的是通過(guò)基因表達(dá)，能夠消除或降低植物的野生型內(nèi)源基因活性的基因。
本發(fā)明還提供包含能抑制上述內(nèi)源基因表達(dá)的DNA的載體，保持該DNA在可表達(dá)狀態(tài)的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，包含該轉(zhuǎn)化植物體細(xì)胞的植物轉(zhuǎn)化體，上述植物轉(zhuǎn)化體的后代的或克隆的植物轉(zhuǎn)化體，和植物轉(zhuǎn)化體的繁殖材料。
此外本發(fā)明涉及制備前述植物轉(zhuǎn)化體的方法，包括將能抑制內(nèi)源基因表達(dá)的DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞；自植物細(xì)胞再生植物體。
本發(fā)明的DNA可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法導(dǎo)入植物細(xì)胞，例如，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移方法，電穿孔的方法和粒子轟擊的方法。
如上所述的農(nóng)桿菌的方法，例如可以使用Nagel等的方法(Microbiol.Lett.67325，1990)。根據(jù)該方法，將重組載體轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌細(xì)胞，然后將轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌通過(guò)已知的方法例如葉盤(pán)法(leaf disk method)導(dǎo)入植物細(xì)胞。上述載體，例如，包括在其導(dǎo)入植物體后允許本發(fā)明的DNA在植物體中表達(dá)的啟動(dòng)子。一般而言，本發(fā)明的DNA位于所述啟動(dòng)子的下游，而且終止子位于該DNA的下游。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)轉(zhuǎn)化的方法和植物類(lèi)型合適的選擇用于所述轉(zhuǎn)化的重組載體。前述啟動(dòng)子包括例如，衍生自花椰菜花葉病毒的CaMV35S啟動(dòng)子和玉米遍在蛋白的啟動(dòng)子(未經(jīng)審查的公開(kāi)的日本專(zhuān)利申請(qǐng)(JP-A)Hei2-79983)。
此外，上述的終止子包括衍生自花椰菜花葉病毒的和煙堿合成酶基因的。然而，本發(fā)明并不限于此，在植物體中起功能的任何啟動(dòng)子和終止子都可以應(yīng)用。
此外，導(dǎo)入本發(fā)明DNA的植物體可以是外植體移植?；蛘撸蛇@些植物培養(yǎng)的細(xì)胞，并且這種DNA可以被導(dǎo)入培養(yǎng)細(xì)胞。本文中，術(shù)語(yǔ)“植物細(xì)胞”包括，例如，來(lái)自葉，根，莖，花，以及種子中的盾片(胚盤(pán))的植物細(xì)胞，愈傷組織，和培養(yǎng)細(xì)胞懸浮物。
而且，為了有效選擇通過(guò)導(dǎo)入本發(fā)明DNA轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，上述重組載體優(yōu)選包含合適的選擇標(biāo)記基因，或優(yōu)選和包含這種選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒一起導(dǎo)入植物細(xì)胞。本文所用的選擇標(biāo)記基因，例如，對(duì)抗生素潮霉素有抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，對(duì)卡那霉素或慶大霉素有抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，對(duì)除草劑膦絲菌素有抗性的乙酰轉(zhuǎn)移酶基因。
將導(dǎo)入了重組載體的植物細(xì)胞涂平板并在已知包含合適篩選藥物的選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述藥物根據(jù)導(dǎo)入的選擇標(biāo)記基因的種類(lèi)而變化。結(jié)果，可以得到轉(zhuǎn)化植物培養(yǎng)細(xì)胞。
植物體由本發(fā)明DNA轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞而得以再生。依據(jù)植物細(xì)胞的類(lèi)型用已知的方法實(shí)施植物體再生(Toki等，(1995)Plant Physiol.1001503-1507)。例如，轉(zhuǎn)化和再生水稻植株的方法包括(1)使用聚乙二醇將基因?qū)朐|(zhì)體，并再生植物體(適合秈稻品種(indica))(Datta等，(1995)in“Gene Transfer To Plants”，Potrykus I and Spangenberg Eds.，pp66-74)；(2)使用電脈沖將基因?qū)朐|(zhì)體，并再生植物體(適合粳稻品種(japonica))(Toki等(1992)Plant Physiol.1001503-1507)；(3)通過(guò)粒子轟擊將基因直接導(dǎo)入細(xì)胞，并再生植物體(Christou等(1991)Bio/Technology，9957-962)；和(4)使用農(nóng)桿菌導(dǎo)入基因，并再生植物體(Hiei等(1994)PlantJ.6271-282)。這些方法已經(jīng)得以確立并在本領(lǐng)域中廣泛利用。因此，這些方法可適合用于本發(fā)明中。
由轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生的植物體然后在條件培養(yǎng)基上培養(yǎng)。當(dāng)馴化的再生植物體隨后培養(yǎng)在通常的培養(yǎng)條件下時(shí)得到半矮化植物體，然后該植物體成熟并結(jié)實(shí)而形成種子。
本文中，所存在的導(dǎo)入的外源基因可以通過(guò)已知的PCR或Southern雜交方法，或通過(guò)植物體中DNA的核苷酸序列分析在已經(jīng)如上再生并培養(yǎng)的植物轉(zhuǎn)化體中得以證實(shí)。
在這種情況下，根據(jù)已知的J.Sambrook等方法由植物轉(zhuǎn)化體進(jìn)行DNA提取(Molecular Cloning，2nded，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。
在使用PCR方法分析存在于再生植物體的包含本發(fā)明DNA的外源基因時(shí)，使用如上所述自再生植物體提取的DNA為模板，實(shí)施擴(kuò)增反應(yīng)。而且，具有根據(jù)本發(fā)明DNA或由本發(fā)明修飾的DNA合適選出的核苷酸序列的合成寡核苷酸可以用作引物以在反應(yīng)溶液中實(shí)施擴(kuò)增反應(yīng)，該反應(yīng)溶液包括這種寡核苷酸混合物的反應(yīng)溶液。在擴(kuò)增反應(yīng)中，包含本發(fā)明DNA序列的DNA片段擴(kuò)增產(chǎn)物可通過(guò)重復(fù)DNA的變性，退火，和延伸反應(yīng)幾十次而獲得。當(dāng)包含擴(kuò)增產(chǎn)物的反應(yīng)溶液，例如，在瓊脂糖凝膠上電泳時(shí)，各種擴(kuò)增的DNA片段被分級(jí)分離以證實(shí)所述DNA片段如何對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的DNA。
一旦獲得染色體中導(dǎo)入本發(fā)明DNA-的轉(zhuǎn)化的植物體，就有可能通過(guò)有性或無(wú)性繁殖(sexual or vegetative propagation)獲得該種植物體的后代。或者，植物可由該轉(zhuǎn)化植物以及其后代或克隆獲得的育種材料(例如種子，果實(shí)，穗(ears)，塊莖，塊根(tubercles)，單株(tubs)，愈傷組織和原生質(zhì)體)而大規(guī)模制備。轉(zhuǎn)化了本發(fā)明DNA的植物細(xì)胞，包括這些細(xì)胞的植物體，這些植物體的后代和克隆，以及由這些植物獲得的育種材料，其后代和克隆，都包括在本發(fā)明中。
本發(fā)明中植物的半矮化可以如上所述通過(guò)抑制sd1基因的表達(dá)而誘導(dǎo)。由本發(fā)明方法制得的半矮化植物預(yù)計(jì)是有用的，例如作為農(nóng)作物，其可以穩(wěn)定提供高產(chǎn)量，以及賦予觀賞植物新的審美價(jià)值。
此外，本發(fā)明提供編碼水稻sd1蛋白的DNA。sd1 DNA可以用于促進(jìn)植物生長(zhǎng)，尤其是促進(jìn)莖/葉的延伸。使用編碼水稻sd1蛋白的DNA制備植物轉(zhuǎn)化體可通過(guò)上述的方法實(shí)施。也就是，這種制備可以通過(guò)將所述DNA插入前述載體，將所得的載體導(dǎo)入植物細(xì)胞，由該轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生植物體而實(shí)施。而且，基于本發(fā)明編碼水稻sd1蛋白的DNA序列，可以制備出編碼反義RNA的DNA，編碼具有核酶活性的RNA的DNA，以及編碼具有共抑制效果的RNA的DNA等，用于抑制植物sd1基因的表達(dá)。由此制備的DNAs可用于誘導(dǎo)植物半矮化。
本發(fā)明的“水稻sd1蛋白”不僅包括SEQ ID NO4的蛋白而且包括與該蛋白功能等價(jià)的源于水稻的蛋白。這種蛋白包括人工制備的和水稻中內(nèi)源存在的那些蛋白。本文中術(shù)語(yǔ)“功能等價(jià)的”表示目的蛋白具有GA合成的活性且在導(dǎo)入植物時(shí)具有莖/葉延伸的活性。這種蛋白包括根據(jù)SEQ ID NO4的蛋白的突變體，同系物和變體。
與水稻sd1蛋白功能等價(jià)的蛋白質(zhì)可使用例如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于在蛋白質(zhì)氨基酸序列中導(dǎo)入突變的定點(diǎn)誘變的方法(Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biology edit.Publish.Jhon Wily & Sons Section 81-8.5，1987)]制備。此外，在自然界中由氨基酸突變產(chǎn)生(arising nature)的水稻內(nèi)源蛋白質(zhì)可基于SEQ ID NO3的DNA使用雜交技術(shù)，基因擴(kuò)增技術(shù)(PCR)等進(jìn)行分離。
具有SEQ ID NO4中取代，缺失，插入和/或添加了一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，被包括在本發(fā)明中，只要它們具有與水稻sd1蛋白相同的功能。蛋白中的突變數(shù)目通常是30個(gè)氨基酸或更少，優(yōu)選是10個(gè)氨基酸或更少，更優(yōu)選是5個(gè)氨基酸或更少(例如，3個(gè)氨基酸或更少)。然而，并不限制突變的數(shù)目和位點(diǎn)，只要該蛋白的功能能夠得以保持即可。就保持蛋白質(zhì)功能方面，用于取代的氨基酸優(yōu)選與要取代的氨基酸具有類(lèi)似的性質(zhì)。例如，由于Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Met，Phe和Trp均歸類(lèi)為非極性氨基酸，它們可能相互具有類(lèi)似的性質(zhì)。此外不帶電荷的氨基酸包括Gly，Ser，Thr，Cys，Tyr，Asn和Gln。而且，酸性氨基酸舉例為Asp和Glu，堿性氨基酸舉例為L(zhǎng)ys，Arg和His。
本發(fā)明中，對(duì)編碼水稻sd1蛋白的DNAs類(lèi)型并不具體限制，只要它們能夠編碼上述的蛋白；它們可以是基因組DNAs，化學(xué)合成的DNAs或cDNA，其形式不限。此外，本發(fā)明的DNAs包括具有那些基于遺傳密碼簡(jiǎn)并性的任意核苷酸，只要它們能夠編碼水稻sd1蛋白。本發(fā)明編碼水稻sd1蛋白的DNAs可以如上述，通過(guò)使用諸如SEQ ID NO3的DNA序列或其部分作為探針的雜交技術(shù)和使用基于這所述DNA序列信息設(shè)計(jì)的引物的基因擴(kuò)增方法(PCR)，進(jìn)行分離。這些探針或引物可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員利用已知技術(shù)根據(jù)編碼本發(fā)明水稻sd1蛋白的DNAs容易地制備。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是顯示低腳鳥(niǎo)尖(Dee-geo-woo-gen)，Calrose 76和黎明(Reimei)中sd1基因的突變位點(diǎn)的圖。
實(shí)施發(fā)明的最佳模式下文通過(guò)實(shí)施例更具體地描述了本發(fā)明。然而，然而本發(fā)明并不應(yīng)被限制。
實(shí)施例1基于擬南芥C20氧化酶基因的序列，設(shè)計(jì)引物OsC20U(5’-ccgctcgccgagaagcgccg-3’/SEQ ID NO1)和OsC20L(5’-atgaaggtgtcgccgatgtt-3’/SEQ ID NO2)。利用日本晴(Nipponbare)水稻基因組DNA作為模板實(shí)施PCR，以分離水稻GA C20氧化酶基因。結(jié)果得到618bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，測(cè)序顯示其是新的水稻GA氧化酶基因。GAC20屬于2-氧化戊二酸依賴(lài)型雙加氧酶(2-ODD)家族，保留用于結(jié)合2-氧化戊二酸的功能必需結(jié)構(gòu)域(NYYPXCXXP)。此外，GAC20還保留三個(gè)組氨酸殘基以結(jié)合Fe離子和涉及GA結(jié)合的LPWKET結(jié)構(gòu)域。水稻GAC20基因顯示與擬南芥有50％的同源性。
實(shí)施例2使用BIL(1998；TAG 96997-1003，Mapping quantitative trait locicontrolling seed dormancy and heading date in rice，Oryza sativa L.，usingbackcross inbred lines.)對(duì)新的GAC20氧化酶基因的染色體基因座進(jìn)行連鎖分析顯示該基因位于水稻第1染色體上約155cM。該基因座非常接近sd1基因座，事實(shí)很有力地暗示水稻C20氧化酶基因可能等同于sd1基因。
實(shí)施例3由野生型日本晴(Nipponbare)構(gòu)建基因組文庫(kù)，利用噬菌斑雜交方法分離包含GAC20氧化酶基因的基因組克隆以測(cè)定該基因的全部核苷酸序列(SEQ ID NO3)。所推導(dǎo)出的GAC20氧化酶的氨基酸序列在SEQ ID NO4中顯示。
實(shí)施例4
測(cè)定在sd1突變體低腳鳥(niǎo)尖(Dee-geo-woo-gen)和相應(yīng)的野生型鳥(niǎo)尖(Woo-gen)中的GAC20氧化酶基因的核苷酸序列作比較。由此，發(fā)現(xiàn)自第一外顯子到第二外顯子延伸的386bp的核苷酸序列在低腳鳥(niǎo)尖中缺失。還在其它sd1突變體中測(cè)定了GAC20氧化酶基因核苷酸序列。結(jié)果，在sd1突變體Calrose 76中，在第二外顯子中一個(gè)堿基(胞嘧啶)被胸腺嘧啶取代，并且在氨基酸水平上，亮氨酸被苯丙氨酸取代。類(lèi)似地，在sd1突變體Reimei中，在第三外顯子中一個(gè)堿基(鳥(niǎo)嘌呤)改變?yōu)榘奏ぃ诎被嵝蛄兴缴?，天冬氨酸被組氨酸取代(圖1)。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供一種植物sd1基因和利用該基因的方法。本發(fā)明十分期望利用植物sd1基因能增加植物尤其是有用農(nóng)業(yè)作物和觀賞植物的產(chǎn)量，通過(guò)矮化來(lái)增加觀賞作物的審美價(jià)值，并且通過(guò)標(biāo)記選擇來(lái)提高矮化植物的產(chǎn)量并促進(jìn)高效培育。
序列表<110>本田技研工業(yè)株式會(huì)社(HONDA MOTOR CO.，LTD.)<120>涉及植物半矮化的sd1基因和其應(yīng)用<130>H3-A0101P<140>
<141>
<150>JP 2001-185128<151>2001-06-19<160>4<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成引物序列<400>1ccgctcgccg agaagcgccg 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成引物序列<400>2atgaaggtgt cgccgatgtt 20<210>3<211>5575<212>DNA
<213>稻(Oryza sativa)<400>3gtatatttac tagttaacga catcatgtat taaaaatcgg aggaggtata gaagtatgtt 60ctcctttctt gtaaacatag gttgatctgt atatttgttt ttgtcttatt ttgttttttc 120attgatctca ccattaaaca ggtggcctcc aaaaatgcat gcagccatgt atcttcccag 180tccatgaaat taatcttgaa ttattataaa ttaaaaacat attaggattt gatatatgaa 240aggtataatg gtagcagatc tatcatagaa aacctataac acgtagatga ccgagtagag 300aaaaaagata tacccaacat aatcaagtac cttgttaatt agtaagaagt aagaaamcca 360tataaataca agcatttggg tgaagctaga atgggaacta tattaccatg tatcccatac 420atatctatta cgcacttaat acctgaatta ttcgtgtaac gaagaacatg ctttggtaaa 480aaataaaata tttggaccgt ataccatgcg gttatcgcag ttatcacgtg cggtaatatt 540ctcagttttt caaaccgcgg tataacttgc aataaccgcg tggttttcgc ggtaaccacc 600aaaccgtggg gctgtggtaa ccccacctaa aacgatttgg taaaccctag tcagagctag 660cttgatcgtg gctccgccct ctgcatctcc tcatggtcac aagatcaatt tagaacctct 720tataagctgt tgaaccatca gtactacagt cccaagatta acatattttt taaaatatca 780aaattgctca tgatgaattg attaccgttc atgtgcctgt atggtgcatg ggtggtatag 840tgcaccgtga cctgtactgt gctagatgtt ccttccaacc ttagtacttc acgaaaagga 900gaggaaccat ttccctgtca ccttcctgca acatggtcag gcataaacca aacacgatcg 960aagcgaatcg gcgataccac acaatagccg cgcgtcgcaa acaacaattc cgcggctagc 1020tacttccgac ctccgaaact actgcgagcc caagtgggta cggttttagt gcaaataggg 1080taagtcttgt ttacatcata tcggtttcat tttggtacac gaatggagaa gaaatgaaag 1140agatcgaaaa aaggaagagc tcgctgtgta tctgtctcgt aacagccccg gtgttacacg 1200tgctctaaga gagattaatt aaatcgataa gctaccagag gtttagtttt ccacgtgtta 1260attagattgg aaagcgagag aaattaaaaa tagcgagtaa aaatagagat aaccttattg 1320ctattttgtt ttttttccag caacaaactt atctttcagg ctagtttagg cgatcgctta 1380gattccgcat cgtccttttc actatttttt ttctgtcagt gacaatgtga aaatttattg 1440gacagacgac tagcttgtgg tactagctag gaaattccct atcctcgata tgaacaactt 1500actcaactca gtagagtagc aaatgcccaa gaaagcccga gtcaatctat ttggaaatcc 1560aatctatttt ctcgtattcg tgtgggaaat caagctatac tagttgaaat tcaccggaag 1620aaatgcacgg cacttcaata taccaaaatt gcaaaggaga atcattcgat taacagtgga 1680attcaaccaa gaaatgaaaa ggtatatata ggaaatgcac tccaaccacc aaccaataag 1740tgattccggg caatcaattc tatccgcgag ttgtgggtct gttcagattc attatattag 1800aacgcgtcac gtaatggatg gagtattata caacaccatt ggttttgcca ctagtgttaa 1860ctctaataca tgggggttag ttttaccttt aaacttggtc taaaaggatg gacatatggc 1920aatgcaattg catgggggtc attgattcga ccatcatgtc tgtccagtgg caaccccctc 1980cctcatcccc tgtggtgggc cccccacggc gctcgtcttc tcccctgtta caaatacccc 2040accctcctgc ccagacagct cgccctgcac acacacacac actcacactc acacacgctc 2100tcaactcact cccgctcaac acagcgctca cttctcatct ccaatctcat ggtggccgag 2160caccccacgc caccacagcc gcaccaacca ccgcccatgg actccaccgc cggctctggc 2220attgccgccc cggcggcggc ggcggtgtgc gacctgagga tggagcccaa gatcccggag 2280ccattcgtgt ggccgaacgg cgacgcgagg ccggcgtcgg cggcggagct ggacatgccc 2340gtggtcgacg tgggcgtgct ccgcgacggc gacgccgagg ggctgcgccg cgccgcggcg 2400caggtggccg ccgcgtgcgc cacgcacggg ttcttccagg tgtccgagca cgggcgtcga 2460
cgccgctctg gcgcgcgccg cgctcgacgg cgccagcgac ttcttccgcc tcccgctcgc 2520cgagaagcgc cgcgcgcgcc gcgtcccggg caccgtgtcc ggctacacca gcgcccacgc 2580cgaccgcttc gcctccaagc tcccatggaa ggagaccctc tccttcggct tccacgaccg 2640cgccgccgcc cccgtcgtcg ccgactactt ctccagcacc ctcggccccg acttcgcgcc 2700aatggggtaa ttaaaacgat ggtggacgac attgcatttc aaattcaaaa caaattcaaa 2760acacaccgac cgagattatg ctgaattcaa acgcgtttgt gcgcgcagga gggtgtacca 2820gaagtactgc gaggagatga aggagctgtc gctgacgatc atggaactcc tggagctgag 2880cctgggcgtg gagcgaggct actacaggga gttcttcgcg gacagcagct caatcatgcg 2940gtgcaactac tacccgccat gcccggagcc ggagcggacg ctcggcacgg gcccgcactg 3000cgaccccacc gccctcacca tcctcctcca ggacgacgtc ggcggcctcg aggtcctcgt 3060cgacggcgaa tggcgccccg tcagccccgt ccccggcgcc atggtcatca acatcggcga 3120caccttcatg gtaaaccatc tcctattctc ctctcctctg ttctcctctg cttcgaagca 3180acagaacaag taattcaagc ttttttttct ctctcgcgcg aaattgacga gaaaaataag 3240atcgtggtag gggcggggct ttcagctgaa agcgggaaga aaccgacctg acgtgatttc 3300tctgttccaa tcacaaacaa tggaatgccc cactcctcca tgtgttatga tttatctcac 3360atcttatagt taataggagt aagtaacaag ctactttttt catattatag ttcgtttgat 3420tttttttttt taaagttttt ttagttttat ccaaatttat tgaaaaactt agcaacgttt 3480ataataccaa attagtctca tttagtttaa tattgtatat attttgataa tatatttatg 3540ttatattaaa aatattacta tatttttcta taaacattat taaaagccat ttataatata 3600aaatggaagg gagtaattaa tatggatctc ccccgacatg agaatatttt ccgatggtgt 3660gacgacgcca tgtaagcttc ggtgggcctg gacggccaga ggtgccaaca gccacgtcca 3720acaacccctg ggtccccccc taacactcca aacagtagtg agtagtgtct cgtcgcgttt 3780tagtatttga tgacaaacaa agtgtgagtt gagttagcca ccaccaactt gcacacgagc 3840acatacattt gtgtccattc tcgccagtca cttccatctc tagtcctaac tcctatctag 3900cgatgtaagc ggataatttc atcatccgta tataaacctg tttgttatag ttaatttcct 3960atataatact ataacagtat acattttaaa agaaaacaaa attaggataa acaggccctg 4020ctcctatcca tccatggcac ttggaaggac cagactcggt catgccatgc caagccaaga 4080tatgggttat ggaagagtag agaagaggag agatgagaga taagcatgcg ttctcctcct 4140cgttggatgt gtattttgga gggatttgtg tagtagtagc agcggcgccg cggggacgga 4200tgcggatggt ggcgctttcg gtggcgtttt cccggggggg ttttggtttg gcgcttgggg 4260gggatggcat ggcgcggcgt gcggctgcac gccacacaca cgcgcgcgca cgcacgtacg 4320tcgtcgtcgc cgcgggcgga cggtagctta gggtggtgtg ttccgcgcgc gggcgcggat 4380tgttccatgc cgatcgattt ggcgccaccc tcgccgcggc tcttgtcgcg tcgtgcgcct 4440ctctcgcgcg gtttgtcctt gtcgcgttgc tcagccggcg acgggggcac ggacattggc 4500gatgtagccc tgcacgtgtc ggcctctccg ttgatgaatg atgatgtatg tatgtatttt 4560tttttgtctg aaggaatttg tggggaattg ttgtgtgtgc aggcgctgtc gaacgggagg 4620tataagagct gcctgcacag ggcggtggtg aaccagcggc gggagcggcg gtcgctggcg 4680ttcttcctgt gcccgcggga ggacagggtg gtgcggccgc cgccgagcgc cgccacgccg 4740cagcactacc cggacttcac ctgggccgac ctcatgcgct tcacgcagcg ccactaccgc 4800gccgacaccc gcacgctcga cgccttcacg cgctggctcg cgccgccggc cgccgacgcc 4860gccgcgacgg cgcaggtcga ggcggccagc tgatcgccga acggaacgaa acggaacgaa 4920cagaagccga tttttggcgg ggcccacgcc cacgtgaggc cccacgtgga cagtgggccc 4980gggcggaggt ggcacccacg tggaccgcgg gccccgcgcc gccttccaat tttggaccct 5040accgctgtac atattcatat attgcaagaa gaagcaaaac gtacgtgtgg gttgggttgg 5100
gcttctctct attactaaaa aaaatataat ggaacgacgg atgaatggat gcttatttat 5160ttatctaaat tgaattcgaa ttcggctcat ggatttcgcg aatgtggatg gtggatgccc 5220gcctcgatga atccgctttg tccgatagag aaatttgaat ttaaatccgg gacctggatt 5280ttgcaatgtg gacgggtgtg ctttgcgaaa tctgctttgt tcgatagcgc tgcacaaaac 5340atgcggtggg ccctgcatga gaatccgctt cttctttgtt gccttggtag gcgaaatcgt 5400atatggtccc aacgattttc tttgtttggt ttcaacataa atgggagttt ttatgaattt 5460aggcttatct acatcagagc tactcctaac ttgtgatatg atgaaccaat cgtgttcttc 5520tcatacttgt ttaagttggc caatatagga ttaatgcaga gtatccaagg gtttt 5575<210>4<211>389<212>PRT<213>稻(Oryza sativa)<400>4Met Val Ala Glu His Pro Thr Pro Pro Gln Pro His Gln Pro Pro Pro1 5 10 15Met Asp Ser Thr Ala Gly Ser Gly Ile Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala20 25 30Val Cys Asp Leu Arg Met Glu Pro Lys Ile Pro Glu Pro Phe Val Trp35 40 45Pro Asn Gly Asp Ala Arg Pro Ala Ser Ala Ala Glu Leu Asp Met Pro50 55 60Val Val Asp Val Gly Val Leu Arg Asp Gly Asp Ala Glu Gly Leu Arg65 70 75 80Arg Ala Ala Ala Gln Val Ala Ala Ala Cys Ala Thr His Gly Phe Phe85 90 95Gln Val Ser Glu His Gly Val Asp Ala Ala Leu Ala Arg Ala Ala Leu100 105 110Asp Gly Ala Ser Asp Phe Phe Arg Leu Pro Leu Ala Glu Lys Arg Arg115 120 125Ala Arg Arg Val Pro Gly Thr Val Ser Gly Tyr Thr Ser Ala His Ala130 135 140Asp Arg Phe Ala Ser Lys Leu Pro Trp Lys Glu Thr Leu Ser Phe Gly145 150 155 160
Phe His Asp Arg Ala Ala Ala Pro Val Val Ala Asp Tyr Phe Ser Ser165 170 175Thr Leu Gly Pro Asp Phe Ala Pro Met Gly Arg Val Tyr Gln Lys Tyr180 185 190Cys Glu Glu Met Lys Glu Leu Ser Leu Thr Ile Met Glu Leu Leu Glu195 200 205Leu Ser Leu Gly Val Glu Arg Gly Tyr Tyr Arg Glu Phe Phe Ala Asp210 215 220Ser Ser Ser Ile Met Arg Cys Asn Tyr Tyr Pro Pro Cys Pro Glu Pro225 230 235 240Glu Arg Thr Leu Gly Thr Gly Pro His Cys Asp Pro Thr Ala Leu Thr245 250 255Ile Leu Leu Gln Asp Asp Val Gly Gly Leu Glu Val Leu Val Asp Gly260 265 270Glu Trp Arg Pro Val Ser Pro Val Pro Gly Ala Met Val Ile Asn Ile275 280 285Gly Asp Thr Phe Met Ala Leu Ser Asn Gly Arg Tyr Lys Ser Cys Leu290 295 300His Arg Ala Val Val Asn Gln Arg Arg Glu Arg Arg Ser Leu Ala Phe305 310 315 320Phe Leu Cys Pro Arg Glu Asp Arg Val Val Arg Pro Pro Pro Ser Ala325 330 335Ala Thr Pro Gln His Tyr Pro Asp Phe Thr Trp Ala Asp Leu Met Arg340 345 350Phe Thr Gln Arg His Tyr Arg Ala Asp Thr Arg Thr Leu Asp Ala Phe355 360 365Thr Arg Trp Leu Ala Pro Pro Ala Ala Asp Ala Ala Ala Thr Ala Gln370 375 380Val Glu Ala Ala Ser38權(quán)利要求
1.一種根據(jù)(a)到(c)中任一用于半矮化植物的DNA(a)編碼與植物sd1基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補(bǔ)的反義RNA的DNA；(b)編碼具有特異切割植物sd1基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的核酶活性的RNA的DNA；和(c)編碼通過(guò)共抑制效果抑制植物sd1基因表達(dá)的RNA的DNA。
2.權(quán)利要求1的DNA，其中所述植物sd1基因是水稻sd1基因。
3.一種載體，其中包含權(quán)利要求1或2的DNA。
4.一種保持權(quán)利要求1或2的DNA處于可表達(dá)狀態(tài)的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。
5.權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述植物是水稻。
6.一種植物轉(zhuǎn)化體，其中包含權(quán)利要求4或5的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。
7.一種植物轉(zhuǎn)化體，其是權(quán)利要求6的植物轉(zhuǎn)化體的后代或克隆。
8.權(quán)利要求6或7植物轉(zhuǎn)化體，其中所述植物是水稻。
9.權(quán)利要求6到8中任一植物轉(zhuǎn)化體的繁殖材料。
10.制備權(quán)利要求6到8中任一植物轉(zhuǎn)化體的方法，其中所述方法包括下述步驟將權(quán)利要求1或2的DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞，以及從所述植物細(xì)胞再生植物體。
全文摘要
本發(fā)明人推測(cè)sd1基因是C20氧化酶基因，并且分離和鑒定了水稻的擬南芥C20氧化酶基因的對(duì)應(yīng)物。結(jié)果顯示水稻sd1基因編碼新的C20氧化酶。進(jìn)一步的研究顯示該基因的突變導(dǎo)致植物半矮化。預(yù)計(jì)利用該植物sd1基因可以提高植物產(chǎn)量，尤其是有用農(nóng)業(yè)作物和觀賞植物等，通過(guò)矮化以賦予植物的審美價(jià)值，并且通過(guò)標(biāo)記選擇提高產(chǎn)量和有效培育矮化植物。
文檔編號(hào)C12N5/04GK1896240SQ20061008420
公開(kāi)日2007年1月17日 申請(qǐng)日期2002年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月19日
發(fā)明者大河美保, 松岡信, 蘆苅基行 申請(qǐng)人:本田技研工業(yè)株式會(huì)社