本發(fā)明屬于保健食品技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種櫻桃酵素脂質(zhì)體及其制備方法。

背景技術(shù)：

隨著人們逐漸開始注重養(yǎng)生調(diào)理，酵素產(chǎn)品受到人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。酵素又稱酶，合理適量地補(bǔ)充酶對(duì)于人體健康十分有益。然而傳統(tǒng)酵素類產(chǎn)品以口服為主要攝取方式，經(jīng)過(guò)胃液的消化作用，酶的結(jié)構(gòu)遭到破壞，活性受到抑制，喪失保健養(yǎng)生功效。

因此研發(fā)一種有利于酵素口服吸收的制劑，以保存其有益功能十分必要。如發(fā)明專利《一種促腸吸收的纖溶酶載酶脂質(zhì)體及其制備方法》中所描述使用脂質(zhì)體包載有效成分避免胃液的消化作用破壞功能性因子。脂質(zhì)體是一種由天然可食用原料通過(guò)自組裝形成的納米微囊，作為食品營(yíng)養(yǎng)成分的理想載體，具有良好的生物相容性以及可生物降解等特性；能夠提高包載成分的穩(wěn)定性、生物利用度并延長(zhǎng)體內(nèi)循環(huán)時(shí)間。

常規(guī)脂質(zhì)體使用磷脂與膽固醇作為膜材料，過(guò)多的膽固醇攝入會(huì)引發(fā)一系列健康問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種不含膽固醇、利于人體消化吸收、能夠保持酵素酶結(jié)構(gòu)和活性的穩(wěn)定、延長(zhǎng)其在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間的櫻桃酵素脂質(zhì)體的制備方法。本發(fā)明主要是將三種菌混合發(fā)酵得到的櫻桃酵素包載于磷脂和豆甾醇自組裝形成的脂質(zhì)體中。

本發(fā)明的制備方法如下：

一、混合菌發(fā)酵制備櫻桃酵素

原料按質(zhì)量計(jì)量，包括以下組分：安琪酵母菌1-5份，植物乳桿菌2-8份，奧爾蘭醋桿菌1-3份，櫻桃5000-7000份，白砂糖1000-6000份。

所述安琪酵母菌菌數(shù)大于1-2×10⁹個(gè)/g，植物乳桿菌菌數(shù)大于2×10⁸個(gè)/g，奧爾蘭醋桿菌菌數(shù)大于2×10⁸個(gè)/g。

(1)將櫻桃洗凈晾干去核去蒂，將發(fā)酵容器洗凈滅菌烘干；

(2)按照上述比例，將三株菌種按質(zhì)量濃度0.05-0.2g/ml分別溶于櫻桃汁，25-35℃恒溫水浴中均速攪拌10-40min以活化菌株；

(3)將櫻桃和白砂糖裝入發(fā)酵容器中反復(fù)堆疊至容器體積的70-75％，加入容器體積15-20％的無(wú)菌水，將步驟(2)中活化后的三種菌液加入到瓶中，于28-35℃環(huán)境中密封保存；

(4)15-20天后將瓶中發(fā)酵液取出過(guò)濾除去濾渣；

(5)將發(fā)酵液在干冰-水體系和35℃溫水中循環(huán)浸泡2-5次，使發(fā)酵液經(jīng)歷迅速凍結(jié)和融解的循環(huán)，以破壞發(fā)酵菌和櫻桃的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，獲取其內(nèi)酶類；

(6)對(duì)步驟(5)制得的酵素采用0.45μm無(wú)菌微孔濾膜過(guò)濾除菌，于4℃保存。

二、櫻桃酵素脂質(zhì)體的制備

原料按質(zhì)量計(jì)量，包括以下組分：磷脂40-60份，豆甾醇4-7份，聚乙二醇3-8份，櫻桃酵素6000-15000份。

(1)將磷脂、豆甾醇、聚乙二醇溶于無(wú)水乙醇中，在溫度30-60℃，轉(zhuǎn)速30-80rpm條件下，真空旋蒸1.5-6h除去無(wú)水乙醇，在瓶壁形成透明脂質(zhì)薄膜；

(2)將步驟一制得的櫻桃酵素倒入到步驟(1)的脂質(zhì)薄膜中，在溫度40-50℃，轉(zhuǎn)速50-120rpm條件下，常壓旋轉(zhuǎn)水化0.5-2h，形成脂質(zhì)體乳濁液；

(3)對(duì)步驟(2)得到的乳濁液進(jìn)行超聲處理，使用水浴超聲或者冰浴探頭超聲，水浴超聲時(shí)間為15-30min，冰浴探頭超聲功率為300-600w，超聲模式為工作2-5秒/間歇2-5秒，時(shí)間為5-15min，得到脂質(zhì)體溶液；

(4)將步驟(3)得到的脂質(zhì)體溶液經(jīng)過(guò)無(wú)菌微孔濾膜除菌后，在-20℃冷凍長(zhǎng)期保存，或者放置4℃冰箱隨時(shí)飲用。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)：

食品級(jí)脂質(zhì)體包載由三種菌共同發(fā)酵而成的櫻桃酵素，形成納米級(jí)脂質(zhì)體，利于人體的消化吸收，同時(shí)通過(guò)脂質(zhì)體的包載，避免酵素酶被胃液破壞，保持結(jié)構(gòu)和活性的穩(wěn)定、增加其在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，促進(jìn)人體對(duì)櫻桃酵素的利用率。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例1制得的櫻桃酵素脂質(zhì)體的電鏡圖。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例2制得的櫻桃酵素脂質(zhì)體的電鏡圖。

圖3是本發(fā)明實(shí)施例3制得的櫻桃酵素脂質(zhì)體的電鏡圖。

圖4是本發(fā)明實(shí)施例1制得的櫻桃酵素脂質(zhì)體的粒徑分布圖。

圖5是本發(fā)明實(shí)施例2制得的櫻桃酵素脂質(zhì)體的粒徑分布圖。

圖6是本發(fā)明實(shí)施例3制得的櫻桃酵素脂質(zhì)體的粒徑分布圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

稱量1g安琪酵母，2g植物乳桿菌，1g奧爾蘭醋桿菌，分別溶于10ml櫻桃汁中，35℃恒溫水浴攪拌10min，以活化菌株，安琪酵母菌數(shù)大于1-2×10⁹個(gè)/g，植物乳桿菌菌數(shù)大于2×10⁸個(gè)/g，奧爾蘭醋桿菌菌數(shù)大于2×10⁸個(gè)/g；將5kg櫻桃洗凈晾干對(duì)半切開去核去蒂，裝入洗凈滅菌的8l廣口瓶中，將櫻桃和1kg白砂糖反復(fù)堆疊幾層裝至瓶中70％處，加入1.6l無(wú)菌水；將上述活化后的三種菌液加入到瓶中，于35℃恒溫通風(fēng)干燥環(huán)境中密封保存；

每日觀察一次確保未染菌，15天后取出瓶中產(chǎn)物過(guò)濾收集發(fā)酵液。將發(fā)酵液經(jīng)干冰-水和35℃溫水浸泡反復(fù)循環(huán)凍融三次后加壓過(guò)0.45μm微孔濾膜。置于冰箱4℃保存。

將55mg大豆卵磷脂(購(gòu)自沈陽(yáng)天峰生物制藥有限公司)、5mg豆甾醇(購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司)、6mg聚乙二醇(購(gòu)自天津市光復(fù)化工研究所)，溶解于4ml無(wú)水乙醇中。接上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，調(diào)節(jié)溫度30℃，轉(zhuǎn)速30rpm，開啟真空泵旋蒸6h，除去無(wú)水乙醇，瓶壁出現(xiàn)脂質(zhì)薄膜。

取10ml櫻桃酵素溶液作為水化液，倒入燒瓶中與脂質(zhì)薄膜充分接觸，再接上旋蒸儀，調(diào)整溫度50℃，轉(zhuǎn)速120rpm，常壓旋轉(zhuǎn)水化0.5h，形成脂質(zhì)體乳濁液。將乳濁液倒入燒杯中，放入超聲清洗機(jī)內(nèi)，開啟100％功率超聲15min后取出，得到脂質(zhì)體溶液；將得到的得到脂質(zhì)體溶液加壓經(jīng)過(guò)0.45μm微孔濾膜后，置于4℃環(huán)境中保存。

應(yīng)用透射電子顯微鏡對(duì)櫻桃酵素脂質(zhì)體進(jìn)行形貌表征，如圖1所示，納米脂質(zhì)體呈球形，可見脂質(zhì)體粒徑在80-100nm之間。經(jīng)動(dòng)態(tài)光散射系統(tǒng)測(cè)量平均粒徑100nm，見圖4。

實(shí)施例2

稱量2g安琪酵母，3g植物乳桿菌，2g奧爾蘭醋桿菌，分別溶于10ml櫻桃汁中，25℃恒溫水浴攪拌40min，以活化菌株，安琪酵母菌數(shù)大于1-2×10⁹個(gè)/g，植物乳桿菌菌數(shù)大于2×10⁸個(gè)/g，奧爾蘭醋桿菌菌數(shù)大于2×10⁸個(gè)/g；將5.5kg櫻桃洗凈晾干對(duì)半切開去核去蒂，裝入洗凈滅菌的8l廣口瓶中，將櫻桃和2kg白砂糖反復(fù)堆疊幾層裝至瓶中75％處，加入1.2l無(wú)菌水；將上述活化后的三種菌液加入到瓶中，于30℃恒溫通風(fēng)干燥環(huán)境中密封保存；

每日觀察一次確保未染菌，17天后取出瓶中產(chǎn)物過(guò)濾收集發(fā)酵液。將發(fā)酵液經(jīng)干冰-水和35℃溫水浸泡循環(huán)反復(fù)凍融四次后加壓過(guò)0.45μm微孔濾膜。置于冰箱4℃保存。

將40mg大豆卵磷脂(購(gòu)自沈陽(yáng)天峰生物制藥有限公司)、4mg豆甾醇(購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司)、3mg聚乙二醇(購(gòu)自天津市光復(fù)化工研究所)，溶解于4ml無(wú)水乙醇中。接上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，調(diào)節(jié)溫度60℃，轉(zhuǎn)速80rpm，開啟真空旋蒸1.5h，除去無(wú)水乙醇，瓶壁出現(xiàn)脂質(zhì)薄膜。

取6ml櫻桃酵素溶液作為水化液，倒入燒瓶中與脂質(zhì)薄膜充分接觸，再接上旋蒸儀，調(diào)整溫度40℃，轉(zhuǎn)速50rpm，常壓旋轉(zhuǎn)水化2h，形成脂質(zhì)體乳濁液。將乳濁液倒入燒杯中，放入超聲清洗機(jī)內(nèi)，開啟100％功率超聲30min后取出，得到脂質(zhì)體溶液；將得到的得到脂質(zhì)體溶液加壓經(jīng)過(guò)0.45μm微孔濾膜后，在-20℃冷凍保存。

應(yīng)用透射電子顯微鏡對(duì)櫻桃酵素脂質(zhì)體進(jìn)行形貌表征，如圖2所示，納米脂質(zhì)體呈球形，可見脂質(zhì)體粒徑在70-110nm之間。經(jīng)動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量平均粒徑125nm，見圖5。

實(shí)施例3

稱量2g安琪酵母，4g植物乳桿菌，1.5g奧爾蘭醋桿菌，分別溶于10ml櫻桃汁中，30℃恒溫水浴攪拌20min，以活化菌株，安琪酵母菌數(shù)大于1-2×10⁹個(gè)/g，植物乳桿菌菌數(shù)大于2×10⁸個(gè)/g，奧爾蘭醋桿菌菌數(shù)大于2×10⁸個(gè)/g；將5.5kg櫻桃洗凈晾干對(duì)半切開去核去蒂，裝入洗凈滅菌的8l廣口瓶中，將櫻桃和5kg白砂糖反復(fù)堆疊幾層裝至瓶中70％處，加入1.3l無(wú)菌水；將上述活化后的三種菌液加入到瓶中，于32℃恒溫通風(fēng)干燥環(huán)境中密封保存；

每日觀察一次確保未染菌，20天后取出瓶中產(chǎn)物過(guò)濾收集發(fā)酵液。將發(fā)酵液經(jīng)干冰-水和溫水浸泡循環(huán)反復(fù)凍融五次后加壓過(guò)0.45μm微孔濾膜。置于冰箱4℃保存。

將60mg大豆卵磷脂(購(gòu)自沈陽(yáng)天峰生物制藥有限公司)、7mg豆甾醇(購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司)、8mg聚乙二醇(購(gòu)自天津市光復(fù)化工研究所)，溶解于6ml無(wú)水乙醇中。接上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，調(diào)節(jié)溫度50℃，轉(zhuǎn)速70rpm，開啟真空旋蒸2.5h，除去無(wú)水乙醇，瓶壁出現(xiàn)脂質(zhì)薄膜。

以15ml櫻桃酵素溶液作為水化液，倒入燒瓶中與脂質(zhì)薄膜充分接觸，再接上旋蒸儀，調(diào)整溫度50℃，轉(zhuǎn)速120rpm，常壓旋轉(zhuǎn)水化1.5h，形成脂質(zhì)體乳濁液。將乳濁液倒入燒杯中，放入細(xì)胞破碎儀內(nèi)，將探頭插入液面下，在冰浴環(huán)境下，開啟探頭超聲，功率450w，工作5s/間歇5s超聲15min后取出，得到脂質(zhì)體溶液；將得到的得到脂質(zhì)體溶液加壓經(jīng)過(guò)0.45μm微孔濾膜后，置于4℃環(huán)境中保存。

應(yīng)用透射電子顯微鏡對(duì)櫻桃酵素脂質(zhì)體進(jìn)行形貌表征，如圖3所示，納米脂質(zhì)體呈球形，可見脂質(zhì)體粒徑在100-150nm之間。經(jīng)動(dòng)態(tài)光散射系統(tǒng)測(cè)量平均粒徑115nm，見圖6。

實(shí)施例4

稱量4g安琪酵母，6g植物乳桿菌，2g奧爾蘭醋桿菌，分別溶于10ml櫻桃汁中，28℃恒溫水浴攪拌25min，以活化菌株，安琪酵母菌數(shù)大于1-2×10⁹個(gè)/g，植物乳桿菌菌數(shù)大于2×10⁸個(gè)/g，奧爾蘭醋桿菌菌數(shù)大于2×10⁸個(gè)/g；將6kg櫻桃洗凈晾干對(duì)半切開去核去蒂，裝入洗凈滅菌的8l廣口瓶中，將櫻桃和6kg白砂糖反復(fù)堆疊幾層裝至瓶中70％處，加入1.4l無(wú)菌水；將上述活化后的三種菌液加入到瓶中，于30℃恒溫通風(fēng)干燥環(huán)境中密封保存；

每日觀察一次確保未染菌，16天后取出瓶中產(chǎn)物過(guò)濾收集發(fā)酵液。將發(fā)酵液經(jīng)干冰-水和35℃溫水浸泡反復(fù)循環(huán)凍融五次后加壓過(guò)0.45μm微孔濾膜。置于冰箱4℃保存。

將49mg大豆卵磷脂(購(gòu)自沈陽(yáng)天峰生物制藥有限公司)、4mg豆甾醇(購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司)、4mg聚乙二醇(購(gòu)自天津市光復(fù)化工研究所)，溶解于4ml無(wú)水乙醇中。接上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，調(diào)節(jié)溫度30℃，轉(zhuǎn)速80rpm，開啟真空旋蒸2.5h，除去無(wú)水乙醇，瓶壁出現(xiàn)脂質(zhì)薄膜。

取8ml櫻桃酵素溶液作為水化液，倒入燒瓶中與脂質(zhì)薄膜充分接觸，再接上旋蒸儀，調(diào)整溫度45℃，轉(zhuǎn)速112rpm，常壓旋轉(zhuǎn)水化1.5h，形成脂質(zhì)體乳濁液。將乳濁液倒入燒杯中，放入超聲清洗機(jī)內(nèi)，開啟100％功率超聲20min后取出，得到脂質(zhì)體溶液；將得到的得到脂質(zhì)體溶液加壓經(jīng)過(guò)0.45μm微孔濾膜后，置于4℃環(huán)境中保存。

實(shí)施例5

稱量3g安琪酵母，8g植物乳桿菌，3g奧爾蘭醋桿菌，分別溶于10ml櫻桃汁中，30℃恒溫水浴攪拌25min，以活化菌株，安琪酵母菌數(shù)大于1-2×10⁹個(gè)/g，植物乳桿菌菌數(shù)大于2×10⁸個(gè)/g，奧爾蘭醋桿菌菌數(shù)大于2×10⁸個(gè)/g；將6.5kg櫻桃洗凈晾干對(duì)半切開去核去蒂，裝入洗凈滅菌的8l廣口瓶中，將櫻桃和3kg白砂糖反復(fù)堆疊幾層裝至瓶中75％處，加入1.2l無(wú)菌水；將上述活化后的三種菌液加入到瓶中，于32℃恒溫通風(fēng)干燥環(huán)境中密封保存；

每日觀察一次確保未染菌，19天后取出瓶中產(chǎn)物過(guò)濾收集發(fā)酵液。將發(fā)酵液經(jīng)干冰-水和35℃溫水浸泡循環(huán)反復(fù)凍融四次后加壓過(guò)0.45μm微孔濾膜。置于冰箱4℃保存。

將58mg大豆卵磷脂(購(gòu)自沈陽(yáng)天峰生物制藥有限公司)、6mg豆甾醇(購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司)、5mg聚乙二醇(購(gòu)自天津市光復(fù)化工研究所)，溶解于4ml無(wú)水乙醇中。接上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，調(diào)節(jié)溫度55℃，轉(zhuǎn)速70rpm，開啟真空旋蒸3.5h，除去無(wú)水乙醇，瓶壁出現(xiàn)脂質(zhì)薄膜。

取13ml櫻桃酵素溶液作為水化液，倒入燒瓶中與脂質(zhì)薄膜充分接觸，再接上旋蒸儀，調(diào)整溫度43℃，轉(zhuǎn)速76rpm，常壓旋轉(zhuǎn)水化1h，形成脂質(zhì)體乳濁液。將乳濁液倒入燒杯中，放入細(xì)胞破碎儀內(nèi)，將探頭插入液面下，在冰浴環(huán)境下，開啟探頭超聲，功率600w，工作2s/間歇3s超聲7min后取出，得到脂質(zhì)體溶液；將得到的得到脂質(zhì)體溶液加壓經(jīng)過(guò)0.45μm微孔濾膜后，在-20℃冷凍保存。

實(shí)施例6

稱量5g安琪酵母，7g植物乳桿菌，3g奧爾蘭醋桿菌，分別溶于10ml櫻桃汁中，23℃恒溫水浴攪拌40min，以活化菌株，安琪酵母菌數(shù)大于1-2×10⁹個(gè)/g，植物乳桿菌菌數(shù)大于2×10⁸個(gè)/g，奧爾蘭醋桿菌菌數(shù)大于2×10⁸個(gè)/g；將7kg櫻桃洗凈晾干對(duì)半切開去核去蒂，裝入洗凈滅菌的8l廣口瓶中，將櫻桃和4kg白砂糖反復(fù)堆疊幾層裝至瓶中75％處，加入1.5l無(wú)菌水；將上述活化后的三種菌液加入到瓶中，于32℃恒溫通風(fēng)干燥環(huán)境中密封保存；

每日觀察一次確保未染菌，16天后取出瓶中產(chǎn)物過(guò)濾收集發(fā)酵液。將發(fā)酵液經(jīng)干冰-水和溫水浸泡循環(huán)反復(fù)凍融五次后加壓過(guò)0.45μm微孔濾膜。置于冰箱4℃保存。

將53mg大豆卵磷脂(購(gòu)自沈陽(yáng)天峰生物制藥有限公司)、6mg豆甾醇(購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司)、5mg聚乙二醇(購(gòu)自天津市光復(fù)化工研究所)，溶解于6ml無(wú)水乙醇中。接上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，調(diào)節(jié)溫度48℃，轉(zhuǎn)速64rpm，開啟真空旋蒸2.5h，除去無(wú)水乙醇，瓶壁出現(xiàn)脂質(zhì)薄膜。

以11ml櫻桃酵素溶液作為水化液，倒入燒瓶中與脂質(zhì)薄膜充分接觸，再接上旋蒸儀，調(diào)整溫度42℃，轉(zhuǎn)速110rpm，常壓旋轉(zhuǎn)水化1.3h，形成脂質(zhì)體乳濁液。將乳濁液倒入燒杯中，放入細(xì)胞破碎儀內(nèi)，將探頭插入液面下，在冰浴環(huán)境下，開啟探頭超聲，功率550w，工作4s/間歇2s超聲10min后取出，得到脂質(zhì)體溶液；將得到的得到脂質(zhì)體溶液加壓經(jīng)過(guò)0.45μm微孔濾膜后，置于4℃環(huán)境中保存。