本發(fā)明涉及食品加工領(lǐng)域，特別涉及一種具有降血糖和通便功能的桑椹微生物復(fù)合制劑的制備方法。

背景技術(shù)：

桑椹是桑樹的成熟果實(shí)，果肉多汁、滋味甘美，是水果中的珍品。自古以來就作為水果和中藥材應(yīng)用，藥食兼用，營養(yǎng)豐富，被譽(yù)為“第三代水果”，現(xiàn)已被國家衛(wèi)生部列入“既是食品又是藥品”的名單。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為，桑椹味甘，性寒，入肝、脾、腎三經(jīng)，具有生津止渴、補(bǔ)肝益腎、滋陰補(bǔ)血、明目安神、利五臟、去風(fēng)濕、解酒等功效，可用于消渴、水腫脹滿、血虛腸燥、便秘、失眠健忘等，長期食用桑椹可以延年益壽。

桑椹中的多羥基生物堿和酚類物質(zhì)已證實(shí)是良好的降血糖功能因子，但是桑椹屬漿果類水果，其含有較高含量的碳水化合物，從而限制了其在糖尿病食品中的廣泛應(yīng)用。

到目前為止，還未發(fā)現(xiàn)有將酵母和益生菌結(jié)合發(fā)酵，從而能將桑椹中的碳水化合物完全降解，且能實(shí)現(xiàn)通便功能的桑椹微生物復(fù)合制劑，并將該復(fù)合制劑用作降血糖和具有通便功能食品的基料的相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷或不足，本發(fā)明的目的在于提供一種具有降血糖和通便功能的桑椹微生物復(fù)合制劑的制備方法。

本發(fā)明采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的：

一種具有降血糖和通便功能的桑椹微生物復(fù)合制劑的制備方法，包括以下步驟：

a）取新鮮桑椹，進(jìn)行膠體磨濕法超微粉碎，滅菌后，得到桑椹全漿；

b）將得到的桑椹全漿接種益生菌進(jìn)行發(fā)酵，得到益生菌活菌數(shù)為10⁷~10⁸CFU/mL的桑椹發(fā)酵原液；

c）將得到的桑椹發(fā)酵原液再接種酵母菌，同時(shí)進(jìn)行酵母和益生菌發(fā)酵，得到益生菌活菌數(shù)為10⁸~10⁹CFU/mL的桑椹發(fā)酵液；

d）將得到的桑椹發(fā)酵液進(jìn)行噴霧冷凍干燥，益生菌活菌數(shù)達(dá)到10⁶~10⁷CFU/g的低糖型桑椹微生物復(fù)合制劑。

其中，步驟a）中，所述膠體磨濕法超微粉碎的工藝為：膠體磨縫隙大小為5~25μm，研磨2~5次，單位處理量3000~5000g/min。

其中，步驟a）中，所述滅菌的工藝為：在溫度121℃，高壓蒸汽滅菌30min。

其中，步驟b）中，所述益生菌為腸膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides，所述發(fā)酵的工藝為：益生菌的接種量為2~5×10⁶CFU/mL，發(fā)酵時(shí)間72~96h，發(fā)酵溫度25~35℃，發(fā)酵pH5.5~6.5。

其中，步驟c）中，所述酵母為釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae；所述益生菌為腸膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides；所述發(fā)酵的工藝為：酵母的接種量為10⁵~10⁶CFU/mL，發(fā)酵時(shí)間10~15h，發(fā)酵溫度30~35℃，發(fā)酵pH5.5~6.5。

其中，步驟d）中，所述噴霧冷凍干燥的工藝為：干燥溫度為-40~-30℃，干燥時(shí)間為15~20h。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下有益效果：

1）本發(fā)明通過采用特定的酵母和特定的益生菌進(jìn)行結(jié)合發(fā)酵，能將桑椹中的碳水化合物完全降解并對(duì)其降血糖功能因子進(jìn)行富集，從而適宜作為降血糖食品基料進(jìn)行開發(fā)；同時(shí)結(jié)合益生菌對(duì)維持人體腸道、生殖系統(tǒng)微生態(tài)平衡所產(chǎn)生的健康功效和發(fā)揮有益作用的活性，利用益生菌的攝入改善人體腸胃功能、治療消化功能紊亂，腸吸收不良及感染性疾病等，從而增強(qiáng)桑椹微生物復(fù)合制劑的通便功能。

2）本發(fā)明采用膠體磨濕法超微粉碎制備得到桑椹全漿，能夠達(dá)到充分破碎，從而保證后期進(jìn)行微生物發(fā)酵能夠完全降解桑椹全漿中的葡萄糖和果糖。

3）本發(fā)明的桑椹微生物復(fù)合制劑，采用噴霧冷凍干燥，能夠有效保留益生菌的存活率、并有效地避免了桑椹中降血糖功能因子的變化，保障了產(chǎn)品的營養(yǎng)品質(zhì)，將其應(yīng)用到預(yù)防糖尿病的食品或保健食品中，能夠起到明顯降血糖功效。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施方式來進(jìn)一步說明本發(fā)明，以下實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受下述實(shí)施例的限制。

各項(xiàng)性能測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)或方法：

脫氧野尻霉素的測(cè)試方法：

桑椹全漿和0.05 mol/L鹽酸溶液以1:1（體積比）混合均勻，超聲30 min，8000 r/min離心10 min，取上清液，備用，進(jìn)行衍生化處理。

脫氧野尻霉素衍生化操作過程如下：取上清液140 μL于2 mL離心管中，加入0.4 mol/L硼酸鉀緩沖液（pH 8.5）169 μL，再加入5 mmol/L的衍生化試劑FMOC-Cl(溶于乙腈中)250 μL，混勻，25 ℃下恒溫反應(yīng)20 min，加入1 mol/L甘氨酸25 μL中和剩余的FMOC-Cl以終止反應(yīng)，再加1%（v/v）的醋酸66 μL，用超純水加至707 μL，最后于0.22 μm濾膜過濾，用于HPLC分析。

色譜條件為： ZORBAX SB-C18色譜柱（250×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為0.1 %醋酸，流動(dòng)相C為乙腈（40:60，v/v），等度洗脫25 min，進(jìn)樣量20 μL，流速1 mL/min，檢測(cè)器為DAD紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長254 nm，柱溫30 ℃。

多酚的測(cè)試方法：

采用福林酚比色法進(jìn)行測(cè)定。準(zhǔn)確稱取適量樣品，用60 %乙醇（pH 5.5）超聲提取27 min，離心，去上清液，重復(fù)提取三次，合并上清液，用60 %乙醇（pH 5.5）定容到50 mL，搖勻，4 ℃保存?zhèn)錅y(cè)。將提取液用蒸餾水稀釋到適宜濃度，在10 mL試管中分別加入1 mL稀釋樣品液，1 mL Folin-Ciocalteau試劑和2 mL 10 %碳酸鈉溶液，混勻，于25 ℃下避光反應(yīng)60 min后，測(cè)定OD（765 nm）值。以焦性沒食子酸（5、10、20、30、45mg/L）作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，采用外標(biāo)法測(cè)定多酚含量。

單糖（葡萄糖和果糖）降解率的測(cè)試方法：

將待測(cè)桑椹樣品用適量無水乙醇超聲提取30 min，8000 r/min下離心10 min，0.22 μm濾膜過濾后用于HPLC分析。色譜條件為：Shodex Asahipak NH2P-504E色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫30 ℃；蒸發(fā)光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，ELSD漂移管溫度為40 ℃；流動(dòng)相為75%乙腈，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。以葡萄糖（1、5、10、15、20、25 mg/mL）和果糖（1、5、10、15、20、25mg/mL）作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用外標(biāo)法定量分析單糖（葡萄糖和果糖）的含量。葡萄糖和果糖降解率計(jì)算公式如下：

益生菌活菌數(shù)的測(cè)試方法：

采用稀釋倒平板法，參考GB 4789.35-2010中乳酸菌菌落總數(shù)的測(cè)定方法。

實(shí)施例1

一種具有降血糖和通便功能的桑椹微生物復(fù)合制劑的制備方法，包括以下步驟：

a）取新鮮桑椹，進(jìn)行膠體磨濕法超微粉碎，所述膠體磨濕法超微粉碎的工藝為：膠體磨縫隙大小為15μm，研磨4次，單位處理量4000g/min，在溫度121℃，高壓蒸汽滅菌30min后，得到桑椹全漿；

b）將得到的桑椹全漿接種腸膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides在接種量為4×10⁶CFU/mL，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵pH6.0進(jìn)行發(fā)酵84h，得到益生菌活菌數(shù)為8.2×10⁷CFU/mL的桑椹發(fā)酵原液；

c）將得到的桑椹發(fā)酵原液再接種釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae，同時(shí)進(jìn)行酵母和腸膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides發(fā)酵，在酵母的接種量為10⁶CFU/mL，發(fā)酵溫度32℃，發(fā)酵pH6.0進(jìn)行發(fā)酵13h，得到益生菌活菌數(shù)為8.5×10⁸CFU/mL的桑椹發(fā)酵液；

d）將得到的桑椹發(fā)酵液在干燥溫度為-35℃進(jìn)行噴霧冷凍干燥17h，得到益生菌活菌數(shù)達(dá)到7.7×10⁶CFU/g的桑椹微生物復(fù)合制劑。

實(shí)施例2

一種具有降血糖和通便功能的桑椹微生物復(fù)合制劑的制備方法，包括以下步驟：

a）取新鮮桑椹，進(jìn)行膠體磨濕法超微粉碎，所述膠體磨濕法超微粉碎的工藝為：膠體磨縫隙大小為5μm，研磨5次，單位處理量5000g/min，在溫度121℃，高壓蒸汽滅菌30min后，得到桑椹全漿；

b）將得到的桑椹全漿接種腸膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides在接種量為2×10⁶CFU/mL，發(fā)酵溫度35℃，發(fā)酵pH6.5進(jìn)行發(fā)酵72h，得到益生菌活菌數(shù)為1.5×10⁷CFU/mL的桑椹發(fā)酵原液；

c）將得到的桑椹發(fā)酵原液再接種釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae，同時(shí)進(jìn)行酵母和腸膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides發(fā)酵，在酵母的接種量為10⁵CFU/mL，發(fā)酵溫度35℃，發(fā)酵pH6.5進(jìn)行發(fā)酵10h，得到益生菌活菌數(shù)為1.7×10⁸CFU/mL的桑椹發(fā)酵液；

d）將得到的桑椹發(fā)酵液在干燥溫度為-40℃進(jìn)行噴霧冷凍干燥15h，得到益生菌活菌數(shù)達(dá)到2.1×10⁶CFU/g的桑椹微生物復(fù)合制劑。

實(shí)施例3

一種具有降血糖和通便功能的桑椹微生物復(fù)合制劑的制備方法，包括以下步驟：

a）取新鮮桑椹，進(jìn)行膠體磨濕法超微粉碎，所述膠體磨濕法超微粉碎的工藝為：膠體磨縫隙大小為25μm，研磨2次，單位處理量3000g/min，在溫度121℃，高壓蒸汽滅菌30min后，得到桑椹全漿；

b）將得到的桑椹全漿接種腸膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides在接種量為5×10⁶CFU/mL，發(fā)酵溫度25℃，發(fā)酵pH5.5進(jìn)行發(fā)酵96h，得到益生菌活菌數(shù)為10⁸CFU/mL的桑椹發(fā)酵原液；

c）將得到的桑椹發(fā)酵原液再接種釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae，同時(shí)進(jìn)行酵母和腸膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides發(fā)酵，在酵母的接種量為10⁵CFU/mL，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵pH5.5進(jìn)行發(fā)酵15h，得到益生菌活菌數(shù)為10⁹CFU/mL的桑椹發(fā)酵液；

d）將得到的桑椹發(fā)酵液在干燥溫度為-30℃進(jìn)行噴霧冷凍干燥20h，得到益生菌活菌數(shù)達(dá)到8.5×10⁶CFU/g的桑椹微生物復(fù)合制劑。

對(duì)比例1：

步驟a）：采用現(xiàn)有方法的榨汁機(jī)機(jī)械破碎得到桑椹全漿；

其它同實(shí)施例1。

對(duì)比例2：

無步驟c），其它同實(shí)施例1。

對(duì)比例3：

步驟d），采用現(xiàn)有方法的熱泵干燥進(jìn)行干燥；

其它同實(shí)施例1。

表1 實(shí)施例1-3及對(duì)比例1-3制備得到的桑椹微生物復(fù)合制劑的性能指標(biāo)測(cè)試結(jié)果

評(píng)價(jià)實(shí)施例1-3及對(duì)比例1-3的桑椹微生物復(fù)合制劑的降血糖活性和通便功能

一、通過DM（diabetes mellitus，糖尿?。┬∈篌w內(nèi)試驗(yàn)評(píng)價(jià)制備得到實(shí)施例1-3及對(duì)比例1-3的桑椹微生物復(fù)合制劑的降血糖活性

通過對(duì)DM小鼠30天內(nèi)血糖變化觀察發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，前10天，各組DM小鼠血糖值均無明顯差異（P >0.05）；第20天時(shí)，桑椹微生物復(fù)合制劑各組和拜糖平組小鼠的血糖值均顯著降低（P <0.05），明顯低于模型組；第30 天實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各給藥組小鼠血糖水平均顯著低于模型組（P <0.05），其中，實(shí)施例1-3小鼠血糖水平下降要好于對(duì)比例1-3，但差異不顯著（P >0.05）。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過本發(fā)明所述方法制備得到的桑椹微生物復(fù)合制劑對(duì)鏈脲佐菌素（STZ）誘異的DM小鼠具有良好的降血糖作用。

表2

注:表中不同小寫字母表示兩者之間在0.05水平上有顯著差異。

二、通過小鼠排便試驗(yàn)評(píng)價(jià)制備得到實(shí)施例1-3及對(duì)比例1-3桑椹微生物復(fù)合制劑的通便功能。

（1）試驗(yàn)分組 試驗(yàn)分空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組（酚酞片，劑量為2.5 mg/(kg·bw)）、實(shí)施例1-3及對(duì)比例1-3（劑量為1g/(kg·bw)），每組10只小鼠。

（2）模型建立 每天灌胃1次，連續(xù)7d。第7天在禁食16 h后除空白對(duì)照組給蒸餾水外，每只小鼠灌胃給予模型劑復(fù)方地芬諾酯10 mg /(kg·bw)。

（3）指標(biāo)測(cè)定 給予模型劑30min后，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組給予墨汁糊20mL/(kg·bw)；實(shí)施例1-3及對(duì)比例1-3組給予用墨汁糊稀釋的桑椹微生物復(fù)合制劑。小鼠單籠放置，恢復(fù)飲食、飲水。給予墨汁糊后開始計(jì)時(shí)，連續(xù)6 h，記錄每只小鼠第一粒黑便排出時(shí)間、6 h排黑便粒數(shù)和黑便總重量。

表 3

通過對(duì)小鼠排便試驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，實(shí)施例1-3及對(duì)比例1-3桑椹微生物復(fù)合制劑組和陽性對(duì)照組小鼠的第一粒黑便排出時(shí)間延長及黑便總重量減輕明顯，差異顯著(P <0.05) ；與空白組和陽性對(duì)照組相比，實(shí)施例1-3及對(duì)比例1-3桑椹微生物復(fù)合制劑組小鼠的第一粒黑便排出時(shí)間延長及黑便總重量減輕不明顯 ( P >0.05)，說明桑椹微生物復(fù)合制劑排便功效與酚酞片相當(dāng)，且能顯著改善便秘模型組小鼠的通便情況，同時(shí)實(shí)施例1-3通便效果要好于對(duì)比例1-3桑椹微生物復(fù)合制劑組，但差異不顯著（P >0.05）。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過本發(fā)明所述方法制備得到的桑椹微生物復(fù)合制劑具有通便功能。