一種采用hplc法測(cè)定桑葚藥材中檸檬酸含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及中藥質(zhì)量檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種HPLC法測(cè)定桑葚藥材中檸檬酸含 量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 桑椹，又名桑椹子、桑果、桑子、是?？粕賛ulberry (Morus alba L.)植物的果 實(shí)。本屬植物全球約有16種，分布于北溫帶、亞洲熱帶和非洲熱帶及美洲地區(qū)。我國(guó)約有 11種，分布于全國(guó)大部分地區(qū)，以江蘇、浙江等南方養(yǎng)蠶地區(qū)產(chǎn)量較大。1993年國(guó)家衛(wèi)生部 把桑椹列為"既是食品又是藥品"的農(nóng)產(chǎn)品之一。
[0003] 桑椹中含有豐富的糖類、有機(jī)酸、脂類、維生素、色素、非色素酚和礦物質(zhì)等成分。 目前，在桑椹營(yíng)養(yǎng)成分的研究的基礎(chǔ)上，國(guó)內(nèi)外對(duì)桑椹中功效成分的研究較多，主要集中在 桑椹色素、非色素酚、及多糖等成分上。檸檬酸是其中含量較高的有機(jī)酸，檸檬酸又名枸櫞 酸，易溶于水，其具廣泛的藥理作用：1)檸檬能防止心血管動(dòng)脈硬化并減少血液粘稠度；2) 中國(guó)中醫(yī)認(rèn)為，檸檬性溫、味苦、無(wú)毒，具有止渴生津、祛暑安胎、疏滯、健胃、止痛等功能利 尿，調(diào)劑血管通透性；3)檸檬酸熱量低，且具有很強(qiáng)的收縮性，因此有利于減少脂肪，是減 肥良藥；4)具有防止和消除皮膚色素沉著的作用；5)祛痰作用等。因此，建立起一種準(zhǔn)確測(cè) 量桑椹藥材中檸檬酸含量的方法對(duì)于桑葚藥材的質(zhì)量控制具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種采用HPLC方法測(cè)定桑葚藥材中檸檬酸含量的方法，包 括如下步驟：
[0005] (1)制備對(duì)照品溶液
[0006] 稱取檸檬酸對(duì)照品，加水制成濃度為1. 70-1. 73mg · ml 1的溶液，即得；
[0007] ⑵制備供試品溶液
[0008] 稱取桑葚藥材樣品，配制成濃度為15-25mg · ml 1的水溶液，即得；
[0009] (3)色譜條件
[0010] 色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相為0. 1 % -1. 0%的磷酸水溶 液；
[0011] ⑷測(cè)試
[0012] 所述測(cè)試包括兩步，第一步繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，包括如下步驟：將所述的對(duì)照品溶液稀 釋成濃度范圍為0. 1-2. Omg · mL 1的待測(cè)對(duì)照品溶液5-7個(gè)，按照上述色譜條件，分別測(cè)定 待測(cè)對(duì)照品溶液以及對(duì)照品溶液的峰面積，然后以峰面積為縱坐標(biāo)，檸檬酸的質(zhì)量濃度為 橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程；
[0013] 第二步測(cè)定供試品溶液，按照上述色譜條件，測(cè)定供試品溶液的峰面積，根據(jù)回歸 方程，得到供試品溶液的檸檬酸含量。
[0014] 作為本發(fā)明優(yōu)選的方案，所述的色譜條件為采用Kromasil C18 (250mmX4. 6mm， 5 μ m)色譜柱；流動(dòng)相為0. 6 %的磷酸水溶液。
[0015] 發(fā)明人考察了 1. 0%醋酸與0. 6%磷酸2種系統(tǒng)梯度洗脫及其不同流動(dòng)相比例，比 較的磷酸濃度有〇. 1 %，〇. 3 %，0. 6 %，I. 0 %水溶液。結(jié)果表明，各種流動(dòng)相中0. 6 %磷酸水 溶液系統(tǒng)為最佳，其圖譜上各個(gè)色譜峰的分離度較好，保留時(shí)間適中。
[0016] 作為本發(fā)明更加優(yōu)選的方案，所述的色譜條件還包括：采用紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng) 為 200-240nm，流速：0· 3-L 5ml · min S柱溫：25-40°C ;進(jìn)樣量 5-20 μ 1。
[0017] 作為本發(fā)明最優(yōu)選的方案，所述的色譜條件為：色譜柱為Kromasil (：18(25〇11111^4.6111111，5 4111);流動(dòng)相：0.6%的磷酸水溶液，檢測(cè)器：紫外，檢測(cè)波長(zhǎng) ：20911111， 流速：0· 5mL · min \ 柱溫：30°C，進(jìn)樣量 10 μ 1。
[0018] 發(fā)明人同時(shí)比較了不同柱溫與流速的影響，柱溫超過(guò)30°C分析時(shí)間縮短，但大多 數(shù)色譜峰分離度小或不能分開(kāi)；流速低于0. 5ml · min \分析時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，高于0. 5ml · min 1 大多數(shù)色譜峰分離度差。因此選擇便于控制的柱溫30°C與流速0. 5ml · min 1作為色譜條 件。
[0019] 作為本發(fā)明最優(yōu)選的方案，步驟（2)中，稱取桑葚藥材樣品之前，先將樣品粉末過(guò) 4號(hào)篩。
[0020] 作為本發(fā)明最優(yōu)選的方案，步驟（2)中，將稱量好的桑葚藥品加入蒸餾水中，加熱 回流提取〇. 5-1. 5h，優(yōu)選為lh。
[0021] 發(fā)明人比較了用水作為溶劑超聲提取與用水作為溶劑加熱回流提取來(lái)進(jìn)行供試 品溶液制備的區(qū)別，結(jié)果表明，用水作為溶劑加熱回流提取得到的峰面積較大、峰個(gè)數(shù)較 多、分離度較好，所以選擇用加熱回流的方式提取。
[0022] 作為本發(fā)明優(yōu)選的方案，步驟（4)中，所述的待測(cè)對(duì)照品溶液的濃度分別為 0· 10320、0· 17200、0· 34400、0· 68800、L 37600mg · ml \ 據(jù)此測(cè)得的回歸方程為 y = 1278680X+1614,相關(guān)系數(shù)r為0. 9999,其線性關(guān)系良好。
[0023] 作為本發(fā)明最優(yōu)選的方案，本發(fā)明提高一種采用HPLC方法測(cè)定桑葚藥材中檸檬 酸含量的方法，包括如下步驟：
[0024] (1)制備對(duì)照品洛液
[0025] 稱取檸檬酸對(duì)照品，配制成濃度為17. 2000mg · ml 1的水溶液，超聲并搖勻，過(guò)濾， 取過(guò)濾液，即得對(duì)照品溶液；
[0026] (2)制備供試品溶液
[0027] 將桑葚藥品粉末過(guò)4號(hào)篩，配制成濃度為15-25mg · ml \優(yōu)選為2〇-22mg · ml 1的 水溶液，加熱回流提取lh，過(guò)濾，取過(guò)濾液，即得供試品溶液；
[0028] (3)色譜條件
[0029] 色譜柱為Kromasil C18 (250_X4. 6_，5 μ m);流動(dòng)相：0· 6 %的磷酸水溶液，檢 測(cè)器：紫外，檢測(cè)波長(zhǎng)：209nm，流速：0. 5mL · min \柱溫：30°C，進(jìn)樣量10 μ 1。
[0030] ⑷測(cè)試
[0031] 所述測(cè)試包括兩步，第一步繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，包括如下步驟：將所述的對(duì)照品溶液稀 釋成濃度分別為 〇· 1〇320、0· 17200、0· 34400、0· 68800、L 37600mg · ml 1的 5 個(gè)待測(cè)對(duì)照品 溶液，按照上述色譜條件，分別測(cè)定5個(gè)待測(cè)對(duì)照品溶液以及濃度為I. 72000mg · ml 1的對(duì) 照品溶液的峰面積，然后以峰面積為縱坐標(biāo)，檸檬酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得 到回歸方程y = 1278680x+1614,相關(guān)系數(shù)r為0. 9999。
[0032] 第二步測(cè)定供試品溶液，按照上述色譜條件，測(cè)定供試品溶液的峰面積，根據(jù)回歸 方程，得到供試品溶液的檸檬酸含量。
[0033] 本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和有益效果是：通過(guò)測(cè)定不同產(chǎn)地桑椹藥材中檸檬酸成分的含 量，表明該方法穩(wěn)定可靠，單用液相色譜儀即可，避開(kāi)了液相色譜與質(zhì)譜連用的限制，使檢 測(cè)簡(jiǎn)單化；由于桑椹藥材中的檸檬酸含量較高，且作用廣泛，可用于桑椹藥材的質(zhì)量控制。
【附圖說(shuō)明】
[0034] 圖1是檸檬酸對(duì)照品的色譜圖。
[0035] 圖2是江蘇產(chǎn)地供試品的色譜圖。
[0036] 圖1中檸檬酸的出峰時(shí)間為22. 369min ;
[0037] 圖2中檸檬酸的出峰時(shí)間為22. 477min。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0039] 本發(fā)明涉及到的儀器為：島津高效液相色譜儀（Prominence UFLC)，日本島津公 司；1/10萬(wàn)電子分析天平，型號(hào)ME235S，德國(guó)塞多利斯公司；電熱套（1000ml)，上?？莆鰧?shí) 驗(yàn)儀器廠；KQ-300DE數(shù)控超聲波發(fā)生器，昆山超聲儀器有限公司。
[0040] 本發(fā)明涉及到的藥品為：磷酸，AR級(jí)，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；水，自制；枸 櫞酸（批號(hào)111679-200401)對(duì)照品，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；桑椹藥材：安徽產(chǎn)地 (批號(hào) 20150412、20150415)，新疆藥材（批號(hào) 20150418、20150419、20150421)，較廣產(chǎn)地批 號(hào)（20150422)，河南產(chǎn)地（批號(hào)20150508)，江蘇產(chǎn)地（批號(hào)20150428)，四川產(chǎn)地（批號(hào) 20150502)，陜西產(chǎn)地（批號(hào)20150427)由陜西君碧莎制藥有限公司提供。
[0041] 實(shí)施例1
[0042] (1)色譜條件：色譜柱為Kromasil C18(250_X4. 6mm，5 μπι);流動(dòng)相：0· 6%