本發(fā)明涉及一種較大范圍，具體是一種解淀粉芽孢桿菌抗菌脂肽、海藻酸鈉復(fù)合涂膜抑制花生黃曲霉污染的方法。

背景技術(shù)：

花生又名長(zhǎng)生果，也稱(chēng)落花生，我國(guó)是世界花生生產(chǎn)和消費(fèi)最多的國(guó)家之一，種植面積僅次于油菜，列第二位，占油料作物種植總面積的四分之一強(qiáng)，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。我國(guó)花生因品質(zhì)優(yōu)良，在國(guó)際市場(chǎng)上享有良好的聲譽(yù)，是世界第一大出口國(guó)，花生及其制品年出口量在60-75萬(wàn)噸，創(chuàng)匯7億多美元，主要銷(xiāo)往歐洲、東南亞、日本和中東等120多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，占世界花生市場(chǎng)份額的40％，是當(dāng)前我國(guó)糧油類(lèi)商品中為數(shù)不多的在國(guó)際上有競(jìng)爭(zhēng)力的商品之一。

黃曲霉毒素是世界衛(wèi)生組織(WHO)確認(rèn)的目前人類(lèi)已知的最強(qiáng)致癌物，是由黃曲霉菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，花生因其富含蛋白質(zhì)和脂肪，因此花生是最容易受黃曲霉菌侵染和黃曲霉毒素污染的作物之一。近幾年，由于歐盟、日本等國(guó)提高花生黃曲霉毒素等的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，花生安全問(wèn)題成為制約出口的瓶頸。更為嚴(yán)重的是，我國(guó)絕大部分花生在國(guó)內(nèi)消費(fèi)，嚴(yán)重威脅了國(guó)內(nèi)消費(fèi)者的健康，這些成為影響我國(guó)花生產(chǎn)業(yè)長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展的限制因素。

花生后熟期較長(zhǎng)，在花生儲(chǔ)藏過(guò)程中，因蛋白質(zhì)、碳水化合物等親水物質(zhì)易吸水而發(fā)熱，更有利于黃曲霉的生長(zhǎng)和產(chǎn)毒，我國(guó)每年因在儲(chǔ)藏環(huán)節(jié)造成的花生黃曲霉毒素污染造成的產(chǎn)品損失達(dá)20％以上，最高甚至達(dá)40％以上的浪費(fèi)。并且黃曲霉毒素性質(zhì)穩(wěn)定，極難分解，被污染的人畜不能食用的花生釋放到環(huán)境中，又對(duì)環(huán)境造成二次污染。因此，如何在花生儲(chǔ)藏環(huán)節(jié)預(yù)防或者控制黃曲霉毒素污染顯得尤為緊迫和必要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種解淀粉芽孢桿菌抗菌脂肽、海藻酸鈉復(fù)合涂膜抑制花生黃曲霉污染的方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問(wèn)題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種解淀粉芽孢桿菌抗菌脂肽、海藻酸鈉復(fù)合涂膜抑制花生黃曲霉污染的方法，包括以下步驟：

第一步：以解淀粉芽孢桿菌Zn01為菌種，依次通過(guò)種子培養(yǎng)、擴(kuò)大培養(yǎng)和發(fā)酵生產(chǎn)獲得發(fā)酵液；

第二步：取第一步中獲得的發(fā)酵液400ml，用6mol/L HCL調(diào)節(jié)至PH＝2.0，4℃靜置過(guò)夜，利用10000r/min離心20min后沉淀用甲醇溶解、抽濾、濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干燥，用PBS緩沖液(0.02mol/L，PH7.2)定容至400ml,得抗菌脂肽粗提物，其抗菌效價(jià)約為5.0×10⁵IU/L；

第三步：稱(chēng)取40g分析純海藻酸鈉于錐形瓶中，溶于1L去離子水中，加熱至完全溶解，以總質(zhì)量份數(shù)0.4％的添加量加入到第二步的抗菌脂肽粗提液中，制備出抗菌脂肽-海藻酸鈉復(fù)合涂膜液；

第四步：在具有攪拌功能的密閉容器中，用噴霧裝置將抗菌脂肽-海藻酸鈉復(fù)合涂膜液均勻噴施于花生表面，復(fù)合涂膜液與花生最佳混合比例為20μl/g，在花生表面形成抗菌脂肽-海藻酸鈉復(fù)合涂膜，50℃低溫烘干或自然晾曬至花生水分10.0％以下，常溫保存。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述第一步中的種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基為：胰蛋白胨10.0g/L,葡萄糖2.0g/L，牛心粉5.0g/L，氯化鈉5.0g/L，磷酸二氫鈉2.5g/L，PH7.2。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述第一步中發(fā)酵獲得發(fā)酵液的發(fā)酵培養(yǎng)基為：黃豆粉20g/L、玉米淀粉15g/L、葡萄糖3.0g/L、碳酸鈣1.5g/L、磷酸二氫鉀2.5g/L、硫酸亞鐵0.6g/L，初始PH7.2，在發(fā)酵生產(chǎn)中按體積比5％接種解淀粉芽孢桿菌Zn01，50L發(fā)酵罐液體深層發(fā)酵48h，發(fā)酵工藝參數(shù)為：初始PH7.2，溫度37℃，轉(zhuǎn)速180r/min,通氣量50L/min，罐壓0.1Mpa。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明針對(duì)花生在儲(chǔ)藏環(huán)節(jié)黃曲霉毒素污染控制困難、成本高、浪費(fèi)嚴(yán)重等問(wèn)題，利用分離、篩選的花生黃曲霉高效拮抗菌株Zn01及其有效拮抗物質(zhì)抗菌脂肽，結(jié)合復(fù)合涂膜技術(shù)，通過(guò)在花生表面覆蓋抗黃曲霉復(fù)合涂膜的方法抑制黃曲霉生長(zhǎng)，進(jìn)而減少黃曲霉毒素污染，是一種制備方便、方法簡(jiǎn)單、成本低廉、環(huán)境友好、易于推廣的技術(shù)方法。能有效解決花生在儲(chǔ)藏環(huán)節(jié)黃曲霉毒素污染控制困難、成本高、浪費(fèi)嚴(yán)重等問(wèn)題，能快速實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。

附圖說(shuō)明

圖1為未使用本發(fā)明情況下的黃曲霉生長(zhǎng)狀況示意圖。

圖2為使用本發(fā)明處理后黃曲霉生長(zhǎng)狀況的示意圖。

圖3為實(shí)施例1中接種高產(chǎn)毒黃曲霉進(jìn)行對(duì)抗實(shí)驗(yàn)條件下施用和未施用抗菌復(fù)合涂膜效果對(duì)比圖。

圖4為實(shí)施例2中接種高產(chǎn)毒黃曲霉進(jìn)行對(duì)抗實(shí)驗(yàn)條件下施用和未施用抗菌復(fù)合涂膜效果對(duì)比圖。

圖5為實(shí)施例3中以20μl/g施用抗菌復(fù)合涂膜的花生在接種高產(chǎn)毒黃曲霉進(jìn)行對(duì)抗實(shí)驗(yàn)條件下施用效果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本專(zhuān)利的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說(shuō)明。

一種解淀粉芽孢桿菌抗菌脂肽、海藻酸鈉復(fù)合涂膜抑制花生黃曲霉污染的方法，包括以下步驟：

第一步：以解淀粉芽孢桿菌Zn01為菌種，依次通過(guò)種子培養(yǎng)、擴(kuò)大培養(yǎng)和發(fā)酵生產(chǎn)獲得發(fā)酵液；種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基為：胰蛋白胨10.0g/L,葡萄糖2.0g/L，牛心粉5.0g/L，氯化鈉5.0g/L，磷酸二氫鈉2.5g/L，PH7.2；發(fā)酵獲得發(fā)酵液的發(fā)酵培養(yǎng)基為：黃豆粉20g/L、玉米淀粉15g/L、葡萄糖3.0g/L、碳酸鈣1.5g/L、磷酸二氫鉀2.5g/L、硫酸亞鐵0.6g/L，初始PH7.2，在發(fā)酵生產(chǎn)中按體積比5％接種解淀粉芽孢桿菌Zn01，50L發(fā)酵罐液體深層發(fā)酵48h，發(fā)酵工藝參數(shù)為：初始PH7.2，溫度37℃，轉(zhuǎn)速180r/min,通氣量50L/min，罐壓0.1Mpa；

第二步：取第一步中獲得的發(fā)酵液400ml，用6mol/L HCL調(diào)節(jié)至PH＝2.0，4℃靜置過(guò)夜，利用10000r/min離心20min后沉淀用甲醇溶解、抽濾、濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干燥，用PBS緩沖液(0.02mol/L，PH7.2)定容至400ml,得抗菌脂肽粗提物，其抗菌效價(jià)約為5.0×10⁵IU/L；經(jīng)發(fā)酵液拮抗物質(zhì)活性分析，發(fā)酵液中主要活性物質(zhì)是抗菌脂肽，其他如脂肪、蛋白、多糖等均無(wú)抑菌活性或抑菌活性非常弱，此抗菌脂肽粗提液不再分離、提純只為實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用時(shí)降低成本、簡(jiǎn)化操作考慮；

第三步：稱(chēng)取40g分析純海藻酸鈉于錐形瓶中，溶于1L去離子水中，加熱至完全溶解，以總質(zhì)量份數(shù)0.4％的添加量加入到第二步的抗菌脂肽粗提液中，制備出抗菌脂肽-海藻酸鈉復(fù)合涂膜液；

第四步：在具有攪拌功能的密閉容器中，用噴霧裝置將抗菌脂肽-海藻酸鈉復(fù)合涂膜液均勻噴施于花生表面，復(fù)合涂膜液與花生最佳混合比例為20μl/g，在花生表面形成抗菌脂肽-海藻酸鈉復(fù)合涂膜，50℃低溫烘干或自然晾曬至花生水分10.0％以下，常溫保存。

本發(fā)明從河南一地耕作良好花生種植田土壤中分離鑒定出一株對(duì)花生產(chǎn)毒黃曲霉具有優(yōu)異拮抗性能的解淀粉芽孢桿菌，單位內(nèi)部命名為Zn01。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該菌對(duì)花生產(chǎn)毒黃曲霉的抑菌活性物質(zhì)主要為抗菌脂肽，并且為胞外產(chǎn)物。發(fā)明人利用該菌株對(duì)花生產(chǎn)毒黃曲霉的高抗特性，利用復(fù)合涂膜技術(shù)，在花生儲(chǔ)藏環(huán)節(jié)進(jìn)行了實(shí)際應(yīng)用效果實(shí)驗(yàn)。

實(shí)施例1

花生不同水分含量下抗菌脂肽-海藻酸鈉復(fù)合涂膜儲(chǔ)藏應(yīng)用：

將解淀粉芽孢桿菌Zn01菌株復(fù)蘇活化，依次通過(guò)種子培養(yǎng)、擴(kuò)大培養(yǎng)和發(fā)酵生產(chǎn)獲得發(fā)酵液，發(fā)酵液分別經(jīng)酸沉、離心、過(guò)濾、除菌、復(fù)溶等，制取解淀粉芽孢桿菌抗菌脂肽進(jìn)一步粗提物。以0.4％的質(zhì)量分?jǐn)?shù)加入海藻酸鈉，制成抗菌脂肽-海藻酸鈉復(fù)合涂膜液，以20μl/g的量噴施于花生表面覆蓋成膜，分別于50℃低溫烘干至不同水分含量，常溫儲(chǔ)藏，觀察產(chǎn)毒黃曲霉在花生中的生長(zhǎng)、產(chǎn)毒以及抗菌復(fù)合涂膜對(duì)其抑制情況。

結(jié)果:本發(fā)明抗菌脂肽-海藻酸鈉復(fù)合涂膜能顯著抑制不同含水量的花生產(chǎn)毒黃曲霉生長(zhǎng)及產(chǎn)毒，與未施用復(fù)合抗菌涂膜的花生相比，該復(fù)合抗菌涂膜對(duì)花生黃曲霉的產(chǎn)毒抑制差異顯著。在接種高產(chǎn)毒黃曲霉進(jìn)行對(duì)抗實(shí)驗(yàn)條件下施用和未施用抗菌復(fù)合涂膜效果見(jiàn)附圖3。

實(shí)施例2

施用抗菌脂肽-海藻酸鈉復(fù)合涂膜花生在不同儲(chǔ)藏溫度下的應(yīng)用：

將解淀粉芽孢桿菌Zn01菌株復(fù)蘇活化，依次通過(guò)種子培養(yǎng)、擴(kuò)大培養(yǎng)和發(fā)酵生產(chǎn)獲得發(fā)酵液，發(fā)酵液分別經(jīng)酸沉、離心、過(guò)濾、除菌、復(fù)溶等，制取解淀粉芽孢桿菌抗菌脂肽進(jìn)一步粗提物。以0.4％的質(zhì)量分?jǐn)?shù)加入海藻酸鈉，制成抗菌脂肽-海藻酸鈉復(fù)合涂膜液，以20μl/g的量噴施于花生表面覆蓋成膜，分別于50℃低溫烘干至15％水分含量，不同溫度儲(chǔ)藏，觀察產(chǎn)毒黃曲霉在花生中的生長(zhǎng)、產(chǎn)毒以及抗菌復(fù)合涂膜對(duì)其抑制情況。

結(jié)果:本發(fā)明抗菌脂肽-海藻酸鈉復(fù)合涂膜在不同溫度下均能能顯著抑制花生產(chǎn)毒黃曲霉生長(zhǎng)及產(chǎn)毒，與未施用復(fù)合抗菌涂膜的花生相比，該復(fù)合抗菌涂膜對(duì)花生黃曲霉的產(chǎn)毒抑制差異顯著，施用抗菌復(fù)合涂膜的花生可以在常溫下儲(chǔ)藏。在接種高產(chǎn)毒黃曲霉進(jìn)行對(duì)抗實(shí)驗(yàn)條件下施用和未施用抗菌復(fù)合涂膜效果見(jiàn)附圖4。

實(shí)施例3

噴灑不同量抗菌脂肽-海藻酸鈉復(fù)合涂膜液成膜在花生常溫儲(chǔ)藏中的應(yīng)用：

將解淀粉芽孢桿菌Zn01菌株復(fù)蘇活化，依次通過(guò)種子培養(yǎng)、擴(kuò)大培養(yǎng)和發(fā)酵生產(chǎn)獲得發(fā)酵液，發(fā)酵液分別經(jīng)酸沉、離心、過(guò)濾、除菌、復(fù)溶等，制取解淀粉芽孢桿菌抗菌脂肽進(jìn)一步粗提物。以0.4％的質(zhì)量分?jǐn)?shù)加入海藻酸鈉，制成抗菌脂肽-海藻酸鈉復(fù)合涂膜液，分別以1μl/g、5μl/g、10μl/gμl/g、20μl/g、50μl/g、100μl/g的量噴施于花生表面覆蓋成膜，分別于50℃低溫烘干至15％水分含量，常溫儲(chǔ)藏，觀察產(chǎn)毒黃曲霉在花生中的生長(zhǎng)、產(chǎn)毒以及抗菌復(fù)合涂膜對(duì)其抑制情況。

結(jié)果:本發(fā)明抗菌脂肽-海藻酸鈉復(fù)合涂膜在20μl/g噴灑量下能顯著抑制花生產(chǎn)毒黃曲霉生長(zhǎng)及產(chǎn)毒，隨著噴施量的增加，該復(fù)合抗菌涂膜對(duì)花生黃曲霉的產(chǎn)毒抑制差異不再顯著。以20μl/g施用抗菌復(fù)合涂膜的花生在接種高產(chǎn)毒黃曲霉進(jìn)行對(duì)抗實(shí)驗(yàn)條件下施用效果見(jiàn)附圖5。

實(shí)施例4

以解淀粉芽孢桿菌抗菌脂肽進(jìn)一步粗提液-海藻酸鈉復(fù)合抗菌涂膜在花生常溫儲(chǔ)藏中的應(yīng)用：

將解淀粉芽孢桿菌Zn01菌株復(fù)蘇活化，依次通過(guò)種子培養(yǎng)、擴(kuò)大培養(yǎng)和發(fā)酵生產(chǎn)獲得發(fā)酵液，取發(fā)酵液400ml,用6mol/L HCL調(diào)節(jié)至PH2.0，4℃靜置過(guò)夜，10000r/min離心20min，沉淀用甲醇溶解，抽濾，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干燥，用PBS緩沖液(0.02mol/L，PH7.2)定容至400ml,得抗菌脂肽進(jìn)一步粗提物。以0.4％的質(zhì)量分?jǐn)?shù)加入海藻酸鈉，制成抗菌脂肽-海藻酸鈉復(fù)合涂膜液，以20μl/g的量噴施于花生表面覆蓋成膜，50℃低溫烘干至水分含量10％以下，常溫儲(chǔ)藏3個(gè)月，用國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)花生中黃曲霉毒素含量，觀察產(chǎn)毒黃曲霉在花生中的生長(zhǎng)、產(chǎn)毒以及抗菌復(fù)合涂膜對(duì)其抑制情況。

結(jié)果：此抗菌復(fù)合涂膜能顯著抑制產(chǎn)毒黃曲霉生長(zhǎng)及產(chǎn)毒，經(jīng)檢測(cè)儲(chǔ)藏3個(gè)月后花生中黃曲霉毒素B₁含量小于5μg/kg，滿(mǎn)足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求。

實(shí)施例5

以解淀粉芽孢桿菌抗菌脂肽粗提液-海藻酸鈉復(fù)合抗菌涂膜在花生常溫儲(chǔ)藏中的應(yīng)用：

將解淀粉芽孢桿菌Zn01菌株復(fù)蘇活化，依次通過(guò)種子培養(yǎng)、擴(kuò)大培養(yǎng)和發(fā)酵生產(chǎn)獲得發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)微濾去除菌體后得抗菌脂肽粗提液(經(jīng)發(fā)酵液拮抗物質(zhì)活性分析，發(fā)酵液中主要活性物質(zhì)是抗菌脂肽，其他如脂肪、蛋白、多糖等均無(wú)抑菌活性或抑菌活性非常弱，此抗菌脂肽粗提液不再分離、提純只為實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用時(shí)降低成本、簡(jiǎn)化操作考慮)。以0.4％的質(zhì)量分?jǐn)?shù)加入海藻酸鈉，制成抗菌脂肽-海藻酸鈉復(fù)合涂膜液，以20μl/g的量噴施于花生表面覆蓋成膜，50℃低溫烘干至水分含量10％以下，常溫儲(chǔ)藏3個(gè)月，用國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)花生中黃曲霉毒素含量，觀察產(chǎn)毒黃曲霉在花生中的生長(zhǎng)、產(chǎn)毒以及抗菌復(fù)合涂膜對(duì)其抑制情況。

結(jié)果：此抗菌復(fù)合涂膜能顯著抑制產(chǎn)毒黃曲霉生長(zhǎng)及產(chǎn)毒，經(jīng)檢測(cè)儲(chǔ)藏3個(gè)月后花生中黃曲霉毒素B₁含量小于5μg/kg，滿(mǎn)足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求。

基于花生黃曲霉污染的天然屬性，以及防治一種污染又不帶入新的污染的原則，生物防治的方法成為現(xiàn)在的研究熱點(diǎn)。本發(fā)明所指抗菌脂肽是經(jīng)微生物生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生的生物界中廣泛存在的一類(lèi)具有抗菌活性小肽，是兩性分子，常帶正電荷。在抗菌的同時(shí)對(duì)環(huán)境友好，并且抗逆性強(qiáng)，屬生態(tài)友好型、環(huán)境友好型生態(tài)制劑。

本發(fā)明所指涂膜法是將環(huán)境友好型涂膜劑以噴霧的方法，在花生表面形成一層抗性涂膜，既能顯著抑制黃曲霉生長(zhǎng)和產(chǎn)毒，又能抑制花生呼吸作用，并且此復(fù)合抗菌涂膜對(duì)花生儲(chǔ)藏溫度和水分含量工作范圍寬，能有效抑制黃曲霉生長(zhǎng)和產(chǎn)毒，具有環(huán)保、高效、造價(jià)低、易于推廣等優(yōu)點(diǎn)。能有效解決花生在儲(chǔ)藏環(huán)節(jié)黃曲霉毒素污染控制困難、成本高、浪費(fèi)嚴(yán)重等問(wèn)題，能快速實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。

本發(fā)明針對(duì)花生在儲(chǔ)藏環(huán)節(jié)黃曲霉毒素污染控制困難、成本高、浪費(fèi)嚴(yán)重等問(wèn)題，利用分離、篩選的花生黃曲霉高效拮抗菌株Zn01及其有效拮抗物質(zhì)抗菌脂肽，結(jié)合復(fù)合涂膜技術(shù)，通過(guò)在花生表面覆蓋抗黃曲霉復(fù)合涂膜的方法抑制黃曲霉生長(zhǎng)，進(jìn)而減少黃曲霉毒素污染，是一種制備方便、方法簡(jiǎn)單、成本低廉、環(huán)境友好、易于推廣的技術(shù)方法。

上面對(duì)本專(zhuān)利的較佳實(shí)施方式作了詳細(xì)說(shuō)明，但是本專(zhuān)利并不限于上述實(shí)施方式，在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所具備的知識(shí)范圍內(nèi)，還可以在不脫離本專(zhuān)利宗旨的前提下做出各種變化。