本發(fā)明涉及制備發(fā)酵液的方法，特別是基于活化液體發(fā)酵制備發(fā)酵飲料的方法。

背景技術：

紅茶菌是一種具有琥珀黃色和柔和的酸蘋果酒味道的液體飲料。紅茶菌由含茶液體通過紅茶菌″蘑菇″發(fā)酵制成。術語″紅茶菌″在不同的文化和語言中的同義詞包括comboucha，cajnyjkvas(俄羅斯)，克瓦斯，(德國)，kargasoktee(德國)，komboecha-drank(荷蘭)，kombuchakwass(德國)，茶啤酒，茶蘋果酒(英語)。紅茶菌具有抗菌性能，并含有葡糖酸，維生素b1，b2，b3，b6，b12，葉酸，和乳酸d(+)等營養(yǎng)素。紅茶菌對健康的益處在東亞，東歐和俄羅斯為世世代代所知和享用。在亞洲和俄羅斯，紅茶菌的治療效果得到測試，并作為天然的治療手段使用。近年來紅茶菌在美國流行，商業(yè)化生產的紅茶菌飲料在全國各地隨處可見。

紅茶菌″蘑菇″是指一種蘑菇狀的共生纖維素體，主要成份含酵母菌(yeast)，醋酸桿菌(acetobacter)，葡萄糖酸桿菌(glucobacter)，和時有少量的乳酸菌(lactobacillusbulgaricum)。從紅茶菌中分離出的細菌包括木醋酸桿菌(acetobacterxylinum)，擬木醋酸桿菌(acetobacterxylinoides)，葡萄糖酸桿菌(bacteriumgluconicum)，產酮醋酸桿菌(acetobacterketogenum)，弱氧化醋酸桿菌(acetobactersuboxydans)，葡萄糖醋酸桿菌(gluconobacterliquefaciens)，醋化醋酸桿菌(acetobacteraceti)，和巴氏醋酸桿菌(acetobacterpasteurianus)，其中，木醋酸桿菌最為重要。此外，從紅茶菌中也分離出酵母，包括釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)，不顯酵母(saccharomycesinconspicus)，路德類酵母(saccharomycodesludwigii)，粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)，熱帶假絲酵母(candidatropicans)，克魯斯假絲酵母(candidacrusei)，漢遜德巴利酵母(debaryomyceshansenii)，酒香酵母(brettanyomyces)，克勒克酵母(kloeckera)，和拜耳接合酵母(zygosaccharomycesbailii)。

常規(guī)發(fā)酵方法制備紅茶菌的過程中，一種或多種乳酸菌和酵母菌株在發(fā)酵液中形成共生關系。在發(fā)酵初始階段，酵母菌將糖分解為葡萄糖和果糖，并進一步將其發(fā)酵為乙醇；這些發(fā)酵產物供給培養(yǎng)液中的醋酸桿菌使其大量繁殖。然后醋酸桿菌氧化葡萄糖和果糖分別生成葡糖酸和乙酸，同時氧化乙醇生成乙酸。研究表明由酵母菌產生的乙醇刺激醋酸桿菌生長以產生更多的乙酸纖維素膜和乙酸，而乙酸反過來刺激酵母菌生成更多乙醇。乙酸和乙醇的存在保護醋酸桿菌和酵母菌使得它們不被其它微生物污染。此外，由醋酸桿菌產生的乙酸纖維素膜形成蘑菇狀體浮在發(fā)酵液體頂部，對酵母菌和醋酸桿菌提供物理支持，使其更好地暴露接觸發(fā)酵所需的空氣中的氧氣。

常規(guī)發(fā)酵過程制備紅茶菌取決于酵母菌和細菌在培養(yǎng)液中的組合，產出紅茶菌的味道，質量和內容在不同批次中有所不同。產品質量的不穩(wěn)定性阻礙了工業(yè)化大規(guī)模生產紅茶菌。此外，常規(guī)使用酵母菌和細菌的組合的發(fā)酵過程一般需約7天至2周，使大規(guī)模生產變得更加困難。紅茶菌蘑菇體在發(fā)酵過程中生長并用于進一步的培養(yǎng)制備，最終失效即在數(shù)月內無法產出具有相同的味道和質量的發(fā)酵飲料，因此需要不斷由新的培養(yǎng)物補充。此外，紅茶菌發(fā)酵飲料可能會有強烈的醋酸或酒精味而阻止了一些消費者的飲用和享受。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種制備發(fā)酵液的方法。本發(fā)明方法提供的發(fā)酵液飲料具有一致的和更好的風味和有益的效果。本發(fā)明的方法安全，快速，高效，并且適合大規(guī)模工業(yè)化生產。

本發(fā)明制備發(fā)酵液的過程包括以下步驟：分離并選擇一個合適的細菌菌株的菌落，制備含有該菌落的活化培養(yǎng)物的種子液，將種子液在大規(guī)模液體培養(yǎng)液中培養(yǎng)得到發(fā)酵液。合適的菌株為醋酸桿菌(acetobacter)或葡糖桿菌(gluconobacter)屬內的物種。種子液的制備是通過在斜面固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌落，隨后通過多級活化液體培養(yǎng)。多級活化液體培養(yǎng)包含有小規(guī)?；罨后w培養(yǎng)的初始階段和至少一級的放大比例活化液體培養(yǎng)。最初的小規(guī)?；罨后w培養(yǎng)和每級放大比例的活化液體培養(yǎng)各自在有氧和連續(xù)空氣通風的條件下攪拌進行約18小時至約24小時。種子液選自放大比例的活化液體培養(yǎng)液，選擇標準基于豐富和芳香的水果味道和氣味，培養(yǎng)物的ph值在培養(yǎng)期結束時降到約2.5至2.8。此外，在放大比例活化液體培養(yǎng)結束時，od640值為約0.15至0.20。大規(guī)模液體培養(yǎng)在有氧和連續(xù)空氣通風的條件下攪拌進行，時間少于約30小時，在ph值達到約2.6至2.8時培養(yǎng)結束。此外，在大規(guī)模液體培養(yǎng)結束時，發(fā)酵液的od640值達到約0.10至0.13。

在本發(fā)明制備發(fā)酵液的過程中挑選和培養(yǎng)合適的菌株，在約28℃至約30℃下水平培養(yǎng)板上培養(yǎng)約48小時至72小時，ph值約6.0至6.5的條件下生長和選擇菌落。

在本發(fā)明制備發(fā)酵液的過程可進一步包括在選擇菌落之前，在固體培養(yǎng)基上活化保藏的細菌菌株。該固體培養(yǎng)基含有b族維生素，培養(yǎng)在約28℃至約30℃下，約6.0至6.5的起始ph值下的斜面上進行，時間約24小時至48小時。

在本發(fā)明制備發(fā)酵液的過程中菌落的斜面培養(yǎng)在含有b族維生素的固體培養(yǎng)基上進行，ph值為約6.0至6.5，在約28℃至30℃下進行約48小時。

在本發(fā)明制備發(fā)酵液的過程中所述多級活化液體培養(yǎng)制備種子液包括小規(guī)模活化液體培養(yǎng)的初始階段，和接下來的至少一級的放大比例活化液體培養(yǎng)。初始階段的小規(guī)模活化液體培養(yǎng)在小型容器中進行，溫度為約28℃至約30℃，ph值約6.0至6.5；放大比例活化液體培養(yǎng)在中等規(guī)模的種子液制備罐中進行，溫度約28℃至30℃，ph值約4.8至5.2，液體培養(yǎng)基中含有茶萃取液。

在本發(fā)明制備發(fā)酵液的過程中培養(yǎng)體積在各級放大規(guī)模活化液體培養(yǎng)的階段放大了約20倍。

在本發(fā)明制備發(fā)酵液的過程中大規(guī)模液體培養(yǎng)在溫度約28℃至30℃，通風速率約0.5v/v/m，和起始ph值為約4.8至5.2的條件下進行。

在本發(fā)明制備發(fā)酵液的過程中，每級放大活化液體培養(yǎng)和大規(guī)模液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基中含有茶萃取液，并且可以進一步包含中草藥成分，例如枸杞子，黃芪，人參，或山楂。在本發(fā)明制備發(fā)酵液的過程中每級放大活化液體培養(yǎng)和大規(guī)模液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基中也可以含中草藥成分，包括枸杞子，黃芪，人參，或山楂。

在本發(fā)明制備發(fā)酵液的過程中每級放大活化液體培養(yǎng)和大規(guī)模液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基中所述糖源可以高達培養(yǎng)液體積的約10％，糖源為葡萄糖，蔗糖，或蜂蜜，并可含果糖。

本發(fā)明制備發(fā)酵液飲料的過程進一步包括通過過濾從發(fā)酵液中除去細菌菌株的工序。

本發(fā)明制備發(fā)酵液飲料的過程進一步包括調節(jié)所述發(fā)酵液飲料的酸度，風味和質地來制備該發(fā)酵飲料的工序。

另外，本發(fā)明提供由該方法制成的發(fā)酵液和補品飲料。

此外，本發(fā)明的方法可以進一步包括干燥所述發(fā)酵液以制備干燥物質的步驟。此外，本發(fā)明提供一種膳食補充劑，其包含由所述方法制得的干燥物質。

附圖說明

圖1為流程圖，描述了本發(fā)明活化液體培養(yǎng)的一個實施例中通常生產發(fā)酵液飲料的過程和發(fā)酵生產之前和之后的準備和生產過程。

圖2為流程圖，描述了保存和激活保留細菌菌株的菌落用于制備本發(fā)明的種子液。

具體實施方式

本發(fā)明的生產過程被稱為″活化發(fā)酵″或″活化培養(yǎng)，″是一個獨一無二的深層發(fā)酵的過程，其中細菌菌株經過精心篩選，通過在燒瓶/搖床，種子罐，和發(fā)酵罐中的逐級擴大培養(yǎng)，以確保最終發(fā)酵液產品的質量和均一。在活化發(fā)酵的過程中，微生物菌體由于連續(xù)的通風和攪拌，均勻地分布在培養(yǎng)液中，使其充分利用溶解在培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物。整個培養(yǎng)液為均勻的培養(yǎng)液，具有良好的傳熱性，與傳統(tǒng)的靜態(tài)過程制備紅茶菌含有蘑菇狀纖維素體漂浮在液體的頂部形成對比。在本發(fā)明中，所有的菌體充分參與合成代謝，從而加快發(fā)酵速度，比常規(guī)方法制造紅茶菌的效率更高。在本發(fā)明的發(fā)酵過程中，液體頂部沒有紅茶菌蘑菇，整個培養(yǎng)液不斷被攪拌通氣來制備液體。

發(fā)酵容器可被密封以減少來自其它細菌的污染。此外，該過程操作和管理方便并且可以連續(xù)進行。一但選擇和制備合適的種子液，大規(guī)模發(fā)酵過程需要不超過30小時。在最后的發(fā)酵液中含有大量的活性培養(yǎng)物細菌并保持充裕的青蘋果香味和酶活性。

如圖1所示，發(fā)酵過程始于合適的細菌菌株。本發(fā)明中使用的細菌菌株從醋桿菌和葡糖桿菌屬的單一物種中選擇。具體物種主要包括，醋化醋酸桿菌(acetobacteraceti)，木醋酸桿菌(acetobacterxylinum)，氧化醋酸桿菌(acetobactersuboxydans)，葡萄糖醋酸桿菌cerinus(gluconobactercerinus)，和該兩個屬內的其它物種。合適的細菌菌株被預先選擇，分離，培養(yǎng)，或處理。優(yōu)選地，所選擇的菌株必須擁有以下特征：發(fā)酵周期短和代謝產物豐富，以生產具有很高的營養(yǎng)價值和豐富的味道的發(fā)酵飲料。選擇合適的細菌菌株作為發(fā)酵過程的起點是非常重要的。一旦理想的細菌菌株，通常是從醋桿菌和葡糖桿菌屬內的單一物種中被選擇，接下來，就容易調整和優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)的生長條件，以實現(xiàn)具有一致的風味和口感的產品。

細菌菌株的保存工藝為本領域已知的技術。常規(guī)方法包括在沙或粘土中儲存，在斜面培養(yǎng)基上用石蠟密封存儲，或存儲在已被使用的甘油中。現(xiàn)代科技的方法還包括真空干燥冷凍和液氮低溫貯存。優(yōu)選地，該菌株被保存在-20℃真空干燥冷凍，可保存約4至5年。如圖2所示，用于生產的細菌菌株可以由石蠟和甘油密封保存2至3年，而車間生產和實驗室使用的細菌菌株可在4°下斜面培養(yǎng)基上保存2至3個月。

如圖1所示，如有需要，存儲在冰箱中的菌株可被激活。在斜面固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)該細菌菌株。該固體培養(yǎng)基包含b族維生素，在約28℃至約30℃下和約6.0至6.5的起始ph下進行培養(yǎng)，時間約24小時至48小時。

接著，從激活的細菌菌株或從任何其他來源的菌株中選擇菌落，在約28℃至約30℃下在約6.0至6.5的起始ph下的平板上進行培養(yǎng)，時間約48小時至72小時。然后選擇在固體培養(yǎng)基上生長的菌落進行進一步制備，該菌落通常包含醋桿菌屬或葡糖桿菌屬的單一物種的細菌菌株，偶爾可能含有兩個或多個物種。

用于制備發(fā)酵飲料的過程可包括在多級活化液體培養(yǎng)制備種子液之前，在斜面固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)從平板培養(yǎng)所選菌落。斜面培養(yǎng)為保存和繁殖細菌菌株世代的主要手段。斜面培養(yǎng)可以被視作制備用作工業(yè)生產的種子液的起點。所述培養(yǎng)可在各種尺寸的試管斜面或燒瓶中進行。為了優(yōu)化生長和工業(yè)化生產，優(yōu)選使用已培養(yǎng)了約24小時至48小時的新鮮細菌菌株而需避免一直在斜面培養(yǎng)的舊菌株。斜面培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基含b族維生素，并在約28℃至約30℃下和約6.0至6.5的ph下進行培養(yǎng)，時間約48小時。

接下來，將斜面培養(yǎng)的細菌用無菌水從斜面洗下并加入到合適的燒瓶中并放置在搖床底座上進行活化液體培養(yǎng)，播種量為約1％至5％。優(yōu)選地，該燒瓶包含100毫升液體培養(yǎng)基和1％體積百分比的含有合適細菌菌株的無菌水用于初始培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度是約28℃至約30℃，搖床速度優(yōu)選設定為轉速約180rpm至210rpm進行約24小時，ph值為約6.0至約6.5。

接著，通過多級活化液體發(fā)酵制備適合大規(guī)模工業(yè)化生產的種子液。多級活化液體培養(yǎng)中的每級培養(yǎng)放大了上一級的培養(yǎng)液的培養(yǎng)體積，每一級培養(yǎng)使用大約1％至10％的含細菌菌株的來自上一個活化液體培養(yǎng)的培養(yǎng)液。優(yōu)選地，對于最初的小規(guī)模液體培養(yǎng)，接種量為之前的液體培養(yǎng)的培養(yǎng)液的約1％至5％，并且更優(yōu)選為1％。在接下來的放大比例的和大規(guī)模的培養(yǎng)液中，優(yōu)選地，接種量為之前的液體培養(yǎng)的培養(yǎng)液的約5％，使得活性培養(yǎng)以約20倍的規(guī)模擴大培養(yǎng)。每級多級活化液體培養(yǎng)中的培養(yǎng)階段被控制為約24小時或更少的時間周期，在有氧及連續(xù)空氣通風和攪拌的條件下進行。

多級活化液體培養(yǎng)可進一步包括相同的培養(yǎng)條件下連續(xù)進行的一級或多級液體培養(yǎng)，并且每級液體培養(yǎng)的培養(yǎng)體積比上一級的培養(yǎng)體積放大進行。例如，第一級液體培養(yǎng)在種子罐中進行，體積為50ml至100ml的液體培養(yǎng)基，而第二級液體培養(yǎng)在500ml至1000ml的種子罐中進行。兩級培養(yǎng)均在約28℃至30℃的溫度和約4.8至5.2的ph值下進行，時間為約18小時至24小時。

放大比例的活化液體發(fā)酵在中等規(guī)模的種子液制備罐中進行，該步驟對于選擇和制備有效的種子液用于大規(guī)?；罨l(fā)酵十分重要。那些在制藥，食品和酶學工業(yè)常規(guī)使用的發(fā)酵罐可用于該目的?，F(xiàn)代發(fā)酵罐通常配備有自動控制和連續(xù)發(fā)酵設備，提高了產品的產量和質量。放大比例的活化液體培養(yǎng)包括相同的培養(yǎng)條件下連續(xù)進行的一級或多級液體發(fā)酵過程，并且每一級液體發(fā)酵對比緊接上一級的液體發(fā)酵，其培養(yǎng)體積放大進行。液體培養(yǎng)基中含有茶的提取液，在約28℃至30℃的溫度下和約4.8至5.2的ph值的液體培養(yǎng)基中進行。在該制備種子液的階段，茶提取液被加入到液體培養(yǎng)基中，有效的細菌菌株是基于所得到的發(fā)酵液體的味道和顏色來進行選擇。

通過連續(xù)的活化液體培養(yǎng)和選擇，本發(fā)明提供了篩選來自單個物種的最有效的細菌菌落的方法，即能在約24小時至30小時內完成發(fā)酵，得到口感豐富和營養(yǎng)益處高的發(fā)酵產物。本發(fā)明的關鍵是選擇合適的細菌菌株，隨后制備有效的種子液用于大規(guī)模生產。種子液必須不含有其它污染的細菌，僅含有所選擇的菌株，具有高發(fā)酵效率和淡黃色，發(fā)酵液為半透明并含有豐富的水果香味和味道。種子液從放大比例的活化液體培養(yǎng)結束時取得。優(yōu)選在放大比例的活化液體發(fā)酵液中，640nm的光密度(od)達到約和ph減小到約2.5至2.8的范圍時結束發(fā)酵。精心準備的種子液在擴大規(guī)模的發(fā)酵結束時發(fā)酵液有著豐富的水果香味和口感。

以od值作為細菌在發(fā)酵液體中濃度的標識的原理和測試程序為本領域已知技術。在本發(fā)明中，od值由可設定在420-660納米波長的分光光度計測試。測試波長必須標準化并根據(jù)被測試材料的需要專門調整。不同細菌菌株可能具有不同的最大吸收波長。在本發(fā)明的實施例中，波長640nm用于測試od值。

隨后，大規(guī)模發(fā)酵在有氧和連續(xù)空氣通風和攪拌的條件下進行，發(fā)酵時間控制在小于約30小時，優(yōu)選約24小時。加入到液體發(fā)酵培養(yǎng)中的種子液體積是大規(guī)模發(fā)酵液體培養(yǎng)的總體積的約3％至10％體積百分比，優(yōu)選大約5％體積百分比。大規(guī)模發(fā)酵在含茶萃取液的液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)溫度為約28℃至30℃，空氣通風率為約0.5v/v/m，液體培養(yǎng)起始ph值約4.8至5.2。在大規(guī)模發(fā)酵結束時，發(fā)酵液的ph值降到約2.6至2.8，od640細菌濁度為大約在大規(guī)模培養(yǎng)結束時，發(fā)酵液應保有充足水果芳香和種子液的氣味。

進一步地，大規(guī)模發(fā)酵可以多級進行。例如，大規(guī)模發(fā)酵可分2級進行，其中第一級在一個1噸的發(fā)酵罐中進行，第二級在20噸的發(fā)酵罐中進行。

在本發(fā)明制備發(fā)酵飲料的工藝中，用于制造發(fā)酵飲料的茶葉的來源和品種不限，特別是，茶樹camelliasinensis或者camelliasinensisvar.assamica的品種均可。所有品種的綠茶，半發(fā)酵茶，紅茶，熏紅茶，黃茶，黑茶，白茶，植物或水果的草藥茶，浸漬物，均可使用為制造發(fā)酵飲料的原料，優(yōu)選地由綠茶的茶葉萃取液和水準備。當細菌在發(fā)酵液培養(yǎng)基中生長繁殖，該茶提取物提供了微量礦物質和營養(yǎng)素以促進細菌生長，這是糖和其它碳源所不能供給的益處。加入茶萃取液為優(yōu)化細菌生長所必需。茶萃取液在常規(guī)使用的工業(yè)設備中以約1克茶：25毫升水的比率在水中浸泡兩次，將兩次的溶液混合，使最終比為1克左右茶：50毫升水而制成。對茶葉的質量沒有嚴格的要求，質量較次級的茶也可以使用。優(yōu)選地，使用綠茶。種子發(fā)酵罐中所用的茶萃取液的量較高，每100升液體培養(yǎng)基使用25升茶萃取液(約500克干燥的茶萃取液)，而在大規(guī)模發(fā)酵罐中，每100升液體培養(yǎng)基使用10升茶萃取液(約200克干燥的茶萃取液)。

此外，茶萃取液可以由在傳統(tǒng)中醫(yī)中通常使用的草藥補充或替代，如枸杞，黃芪，人參，山楂等，以制備滋補飲料。這些草藥可以常見的水萃取物或干草藥的形式添加。

在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，糖源作為養(yǎng)料來源需要供給細菌生長。已知糖源包括葡萄糖，蔗糖或蜂蜜，可以加入到培養(yǎng)液中。此外，各種水果可加入以提供糖源。在培養(yǎng)液中的糖含量高達約10％的體積百分比。

進一步地，本發(fā)明用于制備發(fā)酵飲料的方法包括通過過濾從發(fā)酵液中除去細菌菌株的工序。由于發(fā)酵液中含大量細菌菌落，這些菌落含有益于人體的豐富蛋白質。然而為了保持發(fā)酵飲料穩(wěn)定和儲存安全，有必要停止生產結束后的進一步發(fā)酵和穩(wěn)定飲料酸度。因此，將細菌從發(fā)酵飲料中除去以保留飲料中的酶活性和風味，保存期可長達一年。優(yōu)選地將細菌通過低溫過濾從發(fā)酵飲料中除去。例如庫諾有限公司的zetas系列過濾器可被用作預濾器，0.5μzetaporer過濾膜被用于次級過濾，得到無細菌的發(fā)酵飲料。發(fā)酵飲料經過過濾除去細菌，具有非常淺及微黃半透明的琥珀色和新鮮的青蘋果香味。

任選地，在本發(fā)明制備發(fā)酵飲料的工藝中，發(fā)酵液的酸度，風味和質感可調，以制得更為可口的發(fā)酵飲料。發(fā)酵過程依賴于微生物的繁殖和代謝。在發(fā)酵飲料的制造中，盡管嚴格控制生產參數(shù)，產品品質仍然可能不同，因其不同于化學品混合的飲料具有均勻的內容。為了使得飲品品質均一，發(fā)酵飲料可混合并調整風味，質地和酸度。不同批次或發(fā)酵罐的飲料產品可以混合，并根據(jù)消費者的口味進一步調整其甜度，酸度，濃度和香味。酸度可以略為稀釋調整到2％以保持飲料的微妙風味和香味。如果需要強烈的味道，可以添加某些天然香料添加劑，如天然草莓調味劑，來取悅消費者。無論用什么以混合和調整最終飲料產品，本產品總是基于天然釀造和發(fā)酵的飲料，與大多數(shù)的完全依賴于人工成分的混合物的市售飲料不同。此外，本發(fā)明的發(fā)酵飲料還可像酒一樣存儲老化。經過長時間的存儲，發(fā)酵飲料可獲得更豐富的風味和具有更高的品質和口感。

本發(fā)明進一步提供一種發(fā)酵液，種子液，和發(fā)酵飲料，均由本發(fā)明的方法工藝制成。發(fā)酵飲料可以被干燥制成干燥物質加入或用于各種膳食補充劑。本發(fā)明方法制備的發(fā)酵飲料，其味道，風味，和營養(yǎng)價值均優(yōu)于現(xiàn)有市售任何飲料。在發(fā)酵和繁殖過程中，微生物產生大量的代謝物，包括氨基酸，維生素，有機酸和酶，在保留充足風味和口感的同時對人體有益。

本發(fā)明通過下面的實施例進一步說明。所述實施例不限制本發(fā)明的范圍，作為本領域技術人員可以修改實施例而不脫離本發(fā)明的范圍。

實施例1活化細菌菌株

起始菌株或已保存在冰箱或冷凍干燥的細菌菌株在進一步培養(yǎng)和選擇單一菌落之前需要被激活。固體斜面培養(yǎng)基制備如下：在一個大容器中加熱溶解20.0克葡萄糖，10.0克酵母粉，3.0克牛肉膏，10.0克碳酸鈣，20毫克維生素族混合物和20.0克瓊脂于1000ml水中，天然的ph值為6.0至6.5；每個25毫升小試管中倒入4毫升至5毫升溶解的溶液；將試管用棉花密封和于120℃巴氏殺菌加熱30分鐘；趁熱放置試管有一個傾角，使該固體培養(yǎng)基的表面頂部形成斜面。細菌菌株用接種環(huán)接種于斜面上，并在保溫培養(yǎng)箱28℃至30℃下培養(yǎng)24至48小時。

實施例2純化和篩選單個菌落

平面固體培養(yǎng)基制備如下：在一個大容器中溶解20.0克葡萄糖，10.0克酵母粉，3.0克牛肉膏，10.0克碳酸鈣，20毫克維生素族混合物和20.0克瓊脂于1000ml水中，天然的ph值為6.0至6.5；每個500毫升燒瓶中倒入200毫升溶解的溶液；將燒瓶用棉花密封和巴氏殺菌30分鐘；殺均菌后溶液的溫度冷卻至50℃至60℃，并且傾倒20毫升溶液于直徑9cm的平板培養(yǎng)基上降溫形成固體平板培養(yǎng)基。

接下來，從實施例1中活化的細菌培養(yǎng)物中用接種環(huán)取得幾個細菌菌落，接種在平板上通過繪制分隔線分開的區(qū)域。平板培養(yǎng)在保溫培養(yǎng)箱溫度28℃至30℃下進行48至72小時。單菌落在固體培養(yǎng)基上生長并被挑選出用于進一步制備。

實施例3斜面培養(yǎng)單一菌落

從實施例2得到的活性培養(yǎng)物的單一菌落進一步在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)。生長在平板培養(yǎng)基上的單一菌落被接種環(huán)取出接種在例1制備的斜面培養(yǎng)基上。周圍具有較大的透明圈的單一菌落為健康菌落，優(yōu)選使用。當細菌生長并產生酸，酸與介質中的碳酸鈣反應；由于碳酸鈣的減少，菌落周圍形成透明圈，表明其健康成長。

每個單一菌落接種在2至3個斜面培養(yǎng)基上，試管在保溫培養(yǎng)箱溫度28℃至30℃下培養(yǎng)約48小時。沒有污染的生長良好的單個菌落被保存在冰箱中以工供進一步使用。

實施例4多級搖床液體培養(yǎng)

液體培養(yǎng)基經由如下步驟制備：在容器中溶解20.0克葡萄糖，10.0克酵母粉，3.0克牛肉膏，1.0克kh2po3于1000ml水中，天然的ph值為6.0至6.5；將100毫升溶液加入500毫升三角瓶中；三角瓶用棉花密封并在溫度120℃下巴氏殺菌30分鐘。液體培養(yǎng)基冷卻下來即制備完畢。從例3的斜面培養(yǎng)的細菌菌落用5毫升無菌水洗滌，然后接種到500毫升三角燒瓶中100毫升的液體培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)基于溫度28℃至30℃，搖床搖速180rpm至210rpm進行發(fā)酵培養(yǎng)，時間約24小時，以得到適于制備種子液的活性培養(yǎng)菌落。

接著，取上述500毫升的叁角燒瓶其中1％的液體培養(yǎng)基，接種於1000毫升的叁角燒瓶其中包含200毫升的液體培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的製備與上述相同，只有放大比例跟體積不同，接著將該培養(yǎng)基置於溫度28℃至30℃，以搖床搖速180rpm至210rpm的條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)，時間約24小時。得到的活性培養(yǎng)菌落可用於種子液的製備。

實施例5種子罐液體培養(yǎng)發(fā)酵

液體培養(yǎng)基經由如下步驟制備：在消毒后的發(fā)酵罐中溶解3.0千克葡萄糖和6.5千克的蔗糖于75千克的無菌水中。發(fā)酵罐加熱至溫度100℃維持15分鐘。待溫度冷卻下來，在罐中加入25千克茶萃取液和900毫升食用酒精。例4的活性細菌培養(yǎng)液以1％的體積比加入到罐中。加入氫氧化鈉將ph值調到5.0±0.2。將培養(yǎng)罐于溫度28℃至30℃，搖床搖速57rpm進行發(fā)酵培養(yǎng)，時間約18小時至24小時。發(fā)酵條件為空氣通風并每分鐘通氣量達到大約0.5空氣體積/培養(yǎng)體積/分鐘(v/v/m)。在本階段結束時，細菌濁度od值為約0.150至0.200，ph值降到約2.5至2.8，并含有水果香味和豐富的口感。此時，種子液制備完畢。

實施例6大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)

液體培養(yǎng)基經由如下步驟制備：在消毒后的發(fā)酵罐中溶解1.0千克葡萄糖和11.0千克的蔗糖于80千克的無菌水中。發(fā)酵罐加熱至溫度100℃維持15分鐘。待溫度冷卻下來，在罐中加入10千克茶萃取液和450毫升食用酒精。例5的種子液以5％的體積比加入到罐中。加入氫氧化鈉將ph值調到5.0。將培養(yǎng)罐于溫度28℃至30℃，攪拌發(fā)酵培養(yǎng)，時間約24小時。發(fā)酵條件為空氣通風并每分鐘通氣量達到大約0.5v/v/m。在發(fā)酵結束時，細菌濁度od值(od640)為約0.10至0.13，ph值降到約2.6至2.8，并含有水果香味和豐富的口感，顏色為半透明淡黃色。此時，發(fā)酵飲料制備完畢。