專利名稱：：豆醬中生物胺的分離和液相色譜柱柱前衍生化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物胺的分離和衍生化方法，尤其涉及從豆醬中分離生物胺以及將生物胺液相色譜柱柱前衍生化的方法，屬于生物胺的分離和檢測(cè)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：豆醬中的生物胺主要是通過(guò)其中存在的微生物所產(chǎn)生的氨基酸脫羧酶的脫羧作用而生成的。生物胺的產(chǎn)生需要3方面的條件存在生成生物胺的前體物質(zhì)-游離氨基酸；具有可使氨基酸發(fā)生脫羧反應(yīng)的條件；適宜微生物生長(zhǎng)的環(huán)境。豆醬發(fā)酵過(guò)程中由于微生物作用生成的生物胺有組胺、腐胺、尸胺、色胺、酪胺、e-苯乙胺、精胺和亞精胺等。生物胺中如N-亞硝胺被認(rèn)為是致癌物質(zhì)，目前已有關(guān)于高生物胺含量的豆類產(chǎn)品的報(bào)道。韓國(guó)豆醬含鹽量很高(大約12%或者更高)，很可能會(huì)導(dǎo)致高血壓和腎臟疾病，因此需采用低鹽發(fā)酵技術(shù)，但低鹽條件比高鹽條件更適合于微生物的生長(zhǎng)，在低鹽發(fā)酵過(guò)程中很可能會(huì)產(chǎn)生更多的生物胺。在豆醬發(fā)酵過(guò)程中采用照射技術(shù)可以阻止微生物的生長(zhǎng)，從而有效抑制生物胺的形成。豆醬自然發(fā)酵過(guò)程中，涉及微生物的種類很多，豆醬中生物胺的形成與微生物有密切關(guān)系，但并非所有種類的微生物都會(huì)產(chǎn)生氨基酸脫羧酶，生成生物胺。豆醬發(fā)酵過(guò)程主要包括細(xì)菌、酵母菌、霉菌，這些微生物都有可能與生物胺的形成有關(guān)。不同微生物分解蛋白的能力不同，一般真菌比細(xì)菌易分解蛋白質(zhì)。細(xì)菌中能分解蛋白質(zhì)的有變形桿菌、梭菌、芽孢菌、假單胞菌和小球菌等，它們只有在大量繁殖時(shí)才可以形成蛋白酶。微生物產(chǎn)生蛋白酶，分解蛋白質(zhì)形成各種短肽，然后在肽酶作用下生成氨基酸，游離氨基酸是影響生物胺形成的重要因素之一，它對(duì)豆醬中生物胺的形成具有重要作用。大豆的蛋白質(zhì)含量較高，在豆醬發(fā)酵過(guò)程中，隨發(fā)酵時(shí)間的增加，越來(lái)越多的蛋白質(zhì)被降解，游離氨基酸、肽分子的含量隨之增加，這些物質(zhì)均可作為微生物所產(chǎn)生的脫羧酶的催化反應(yīng)底物，從而生成各種生物胺。由于多數(shù)微生物的生長(zhǎng)受溫度影響很大，在適于微生物生長(zhǎng)的溫度時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量生物胺。低溫下產(chǎn)胺菌生長(zhǎng)緩慢，導(dǎo)致食品中生物胺含量較低。貯存溫度越高，生物胺含量增加速度越快。由于生物胺具有潛在的毒性，因此豆醬中生物胺的生成必須引起高度重視。分析檢測(cè)樣品中的生物胺時(shí)，首先是要把生物胺從基質(zhì)中提取出來(lái)。生物胺的提取一般選用酸性介質(zhì)或有機(jī)相介質(zhì)。酸性介質(zhì)一般有鹽酸、高氯酸和三氯乙酸；有機(jī)相介質(zhì)如甲醇、丙酮、乙腈、二氯甲烷等，還有用乙腈-高氯酸、二氯甲烷-高氯酸等混合液作為生物胺的提取介質(zhì)。肉類、水產(chǎn)品及植物性食品中生物胺的提取，一般采用濃度為0.10.5mol/L的鹽酸、0.40.6mol/L的高氯酸或56%的三氯乙酸等酸性介質(zhì)提取，由于在這些樣品中5%的三氯乙酸對(duì)蛋白質(zhì)的沉淀效果好于鹽酸，因此提取蛋白含量較高樣品中的生物胺時(shí)，三氯乙酸的使用較多。但對(duì)于奶酪中生物胺的提取一般采用0.lmol/L鹽酸效果較好。食品基質(zhì)成分比較復(fù)雜，常含有蛋白質(zhì)、游離氨基酸、脂肪、糖類、多酚類化合物和一些其他成分等。這些成分的存在會(huì)影響生物胺的有效分離和準(zhǔn)確定性定量，同時(shí)也會(huì)降低檢測(cè)設(shè)備的靈敏度，具有堵塞色譜柱的危險(xiǎn)。因此應(yīng)用高效液相色譜法檢測(cè)生物胺時(shí)，在衍生化前還需對(duì)基質(zhì)復(fù)雜的食物樣品中生物胺的提取液進(jìn)行凈化處理。生物胺的凈化方法目前主要有兩種一種是采用固相萃取(SPE)法；另一種是采用有機(jī)溶劑的液-液萃取法。目前凈化生物胺的固相萃取方法主要采用SPEC18柱和強(qiáng)陰離子交換(SAX)柱。spe(:18柱屬于非極性柱，能夠除去非極性物質(zhì)。含生物胺的液體無(wú)需處理就可直接過(guò)(:18柱，多酚和非極性物質(zhì)被保留在柱上，達(dá)到凈化生物胺的目的。SAX柱是強(qiáng)陰離子交換柱，陰離子物質(zhì)可被除去，同時(shí)還可起到濃縮和脫色的作用。SAX柱的凈化效果比SPE(:18柱好。過(guò)SAX柱時(shí)樣品提取液的pH是影響凈化效果的關(guān)鍵因素，將液體食品或提取液的pH調(diào)到8(使多酚和氨基酸呈陰離子態(tài))，樣品經(jīng)過(guò)柱后，陽(yáng)離子狀態(tài)的生物胺保留在柱上。液-液萃取是采用一種有機(jī)溶劑或幾種混合有機(jī)溶劑萃取出樣品中的生物胺，從而達(dá)到凈化的目的。這一方法雖然操作步驟較繁瑣，但可以得到較高的靈敏度。液-液萃取的基本步驟是樣品提取液先用鹽進(jìn)行飽和處理，然后調(diào)PH至堿性，最后用有機(jī)溶劑(正丁醇，正丁醇-氯仿)萃取。其中飽和所用鹽的種類、溶液的pH和有機(jī)溶劑的選擇是影響液_液萃取效果的重要因素。鹽可以促使生物胺進(jìn)入有機(jī)相，但Na2C03會(huì)改變?nèi)芤旱膒H，所以一般選用NaCl作為飽和用鹽。pH影響部分生物胺的萃取效率，研究認(rèn)為pHll.5時(shí)生物胺回收率最高。液-液萃取中，利用三氯乙酸提取比利用HCl提取生物胺時(shí)對(duì)pH的要求更嚴(yán)格。正丁醇萃取時(shí)，組胺、酪胺的回收效果較好，但腐胺、尸胺、精胺和亞精胺的回收率較低。正丁醇-氯仿(i:l，v/V)比正丁醇容易蒸干，但在處理奶類制品時(shí)會(huì)產(chǎn)生難于分離的膠體。所以，處理乳制品時(shí)一般采用正丁醇為萃取溶劑，其他種類食品則采用正丁醇-氯仿(1:1，v/v)為萃取溶劑。由于凈化方法繁瑣，也有研究者對(duì)液體樣品(如葡萄酒)或食品生物胺提取液僅用濾膜(0.220.45iim)處理，然后衍生化或直接進(jìn)樣(自動(dòng)衍生)。常用的柱前衍生劑有丹磺酰氯、鄰苯二甲醛、二硝基苯甲酰氯和熒光胺等，也有研究用9-芴基甲基-氯甲酸酯和苯基異硫氰酸鹽作為生物胺的衍生劑。選擇衍生劑時(shí)，要以衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性好、雜質(zhì)少、衍生過(guò)程簡(jiǎn)單為原則，但所有衍生試劑都有一定的局限性。二硝基苯甲酰氯衍生物和苯基異硫氰酸鹽衍生物不具備熒光特性，不能用熒光檢測(cè)器檢測(cè)，只能紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，其方法靈敏度低于其他衍生試劑。9-芴基甲基-氯甲酸酯衍生物具有熒光特性，靈敏度、穩(wěn)定性都很好，但它產(chǎn)生從單胺到多胺的多重產(chǎn)物，在檢測(cè)基質(zhì)復(fù)雜的樣品和多種混合標(biāo)準(zhǔn)物時(shí)干擾嚴(yán)重；鄰苯二甲醛的優(yōu)點(diǎn)是能與初級(jí)胺在幾分鐘內(nèi)反應(yīng)生成較強(qiáng)的熒光物質(zhì)，因衍生所需時(shí)間短，容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，一般的柱前、柱后衍生均采用鄰苯二甲醛試劑；但鄰苯二甲醛衍生物不穩(wěn)定，衍生后不允許凈化，并且對(duì)衍生條件有嚴(yán)格的要求，為避免干擾，增加靈敏度，以鄰苯二甲醛為衍生劑時(shí)，需加入2-巰基乙醇。丹磺酰氯衍生反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，但產(chǎn)物穩(wěn)定，于暗處4t:保存一個(gè)月?lián)p失不超過(guò)10%。檢測(cè)靈敏度也較高，柱前、柱后衍生均可使用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是對(duì)現(xiàn)有的從豆醬中分離生物胺的方法以及生物胺的液相色譜柱柱前衍生化方法的各種工藝或條件進(jìn)行優(yōu)化和篩選，得到一套完整的從豆醬中分離生物胺的方法以及生物胺的液相色譜柱柱前衍生化方法，該方法具有分離效率高、衍生化效果高等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的豆醬中生物胺的分離和液相色譜柱柱前衍生化方法，包括以下步驟(l)向豆醬中加入三氯乙酸溶液，均質(zhì)，離心，收集上清液；(2)向上清液中加入正己烷，振蕩，靜止分層后取出下層三氯乙酸相，備用；(3)向三氯乙酸相中加入Na0H溶液，再加入NaHC03溶液緩沖，混合丹磺酰氯丙酮溶液進(jìn)行衍生化反應(yīng)；(4)氨水去除丹磺酰氯終止反應(yīng)，得到衍生液；衍生液過(guò)濾，即得。優(yōu)選的，步驟(1)中向豆醬中加入1.5倍豆醬質(zhì)量的5%三氯乙酸溶液；所述的均質(zhì)優(yōu)選為在lOOOOr/min轉(zhuǎn)速下均質(zhì)3min;所述的離心優(yōu)選為在3500r/min轉(zhuǎn)速下離心5min;優(yōu)選的，步驟(2)中向上清液中加入等體積的正己烷；步驟(3)中向三氯乙酸相中加入2mol/LNaOH溶液，其中三氯乙酸相與2mol/LNaOH溶液的體積比為5:1;再接著加入飽和NaHC03溶液進(jìn)行緩沖，其中，飽和NaHC03溶液與三氯乙酸相的體積比為3:10;步驟(3)中所述的衍生條件優(yōu)選為衍生劑丹磺酰氯丙酮溶液用量為三氯乙酸相體積的1.5倍、衍生時(shí)間為40min，衍生溫度為40°C。步驟(4)中加入0.5倍初始體積的氨水去除丹磺酰氯終止反應(yīng)，最后用乙腈定容至25倍初始體積；衍生處理后用0.22iim的微孔濾膜過(guò)濾，用于液相色譜分析檢測(cè)。本發(fā)明分離方法處理過(guò)程簡(jiǎn)單，采用微量的三氯乙酸_正己烷的液_液萃取凈化法消耗試劑少，并且避免了轉(zhuǎn)移時(shí)所造成的分析物損失。經(jīng)本發(fā)明分離凈化后可達(dá)到檢測(cè)要求，譜圖雜峰干擾少且待測(cè)物損失小，生物胺的回收率均可達(dá)到80%以上。本發(fā)明采用丹磺酰氯做為衍生劑，確定了衍生生物胺的最佳條件，丹磺酰氯衍生產(chǎn)物穩(wěn)定，檢測(cè)靈敏度高。圖1空白豆醬樣品(a)和加標(biāo)豆醬樣品(b)的HPLC-DAD色譜圖。圖2空白豆醬樣品(a)和加標(biāo)豆醬樣品(b)的HPLC-FLD色譜圖。圖3丹磺酰氯用量對(duì)生物胺衍生效果的影響。圖4時(shí)間對(duì)生物胺衍生效果的影響。圖5溫度對(duì)生物胺衍生效果的影響。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1稱取東北地區(qū)自然發(fā)酵黃豆醬4g于離心管中，加6mL的5%三氯乙酸溶液，10000r/min，均質(zhì)3min。均質(zhì)后3500r/min離心5min。收集上清液，殘?jiān)?mL5%的三氯乙酸重復(fù)提取1次，合并提取液，再加入6mL正己烷除去脂類雜質(zhì)，劇烈振蕩后靜止分層，棄去正己烷層，再加入6mL正己烷重復(fù)操作1次，分層后取出下層三氯乙酸相。將10mg的丹磺酰氯溶于lmL的丙酮中，新鮮制備并避光保存。將200iiL、2mol/L的NaOH溶液加入至lmL樣品溶液中，然后加300iiL的飽和NaHC03溶液緩沖。加入1.5mL的丹磺酰氯溶液，將混合后的溶液放入40°C恒溫箱保溫處理40min之后，加入100yL的氨水去除丹磺酰氯終止反應(yīng)，最后用乙腈定容至5mL。衍生處理后用0.22iim的有機(jī)濾膜過(guò)濾用于分析檢測(cè)生物胺(檢測(cè)方法及檢測(cè)結(jié)果見試驗(yàn)例1)。實(shí)施例2稱取研磨細(xì)碎后東北地區(qū)產(chǎn)豆瓣醬6g于離心管中，加12mL的5%三氯乙酸溶液，10000r/min，均質(zhì)3min。均質(zhì)后3500r/min離心5min。收集上清液，殘?jiān)?2mL5%的三氯乙酸重復(fù)提取1次，合并提取液，再加入12mL正己烷除去脂類雜質(zhì)，劇烈振蕩后靜止分層，棄去正己烷層，再加入12mL正己烷重復(fù)操作l次，分層后取出下層三氯乙酸相。將10mg的丹磺酰氯溶于lmL的丙酮中，新鮮制備并避光保存。將400iiL、2mol/L的NaOH溶液加入至2mL樣品溶液中，然后加600iiL的飽和NaHC03溶液緩沖。加入3mL的丹磺酰氯溶液，將混合后的溶液放入40°C恒溫箱保溫處理40min之后，加入200yL的氨水去除丹磺酰氯終止反應(yīng)，最后用乙腈定容至10mL。衍生處理后用0.22ym的有機(jī)濾膜過(guò)濾用于分析檢測(cè)生物胺(檢測(cè)方法及檢測(cè)結(jié)果見試驗(yàn)例1)。實(shí)施例3稱取工業(yè)化生產(chǎn)的調(diào)味黃豆醬10g于離心管中，加15mL的5X三氯乙酸溶液，10000r/min，均質(zhì)3min。均質(zhì)后3500r/min離心5min。收集上清液，殘?jiān)?5mL5%的三氯乙酸重復(fù)提取1次，合并提取液，再加入15mL正己烷除去脂類雜質(zhì)，劇烈振蕩后靜止分層，棄去正己烷層，再加入15mL正己烷重復(fù)操作l次，分層后取出下層三氯乙酸相。將10mg的丹磺酰氯溶于lmL的丙酮中，新鮮制備并避光保存。將200iiL、2mol/L的NaOH溶液加入至lmL樣品溶液中，然后加300iiL的飽和NaHC03溶液緩沖。加入1.5mL的丹磺酰氯溶液，將混合后的溶液放入40°C恒溫箱保溫處理40min之后，加入100yL的氨水去除丹磺酰氯終止反應(yīng)，最后用乙腈定容至5mL。衍生處理后用0.22iim的有機(jī)濾膜過(guò)濾用于分析檢測(cè)生物胺(檢測(cè)方法及檢測(cè)結(jié)果見試驗(yàn)例1)。試驗(yàn)例1HPLC-DAD和HPLC-FLD方法檢測(cè)生物胺的回收率、精密度和檢測(cè)限1、柱前衍生(1)丹磺酰氯溶液配制將10mg的丹磺酰氯溶于lmL的丙酮中，新鮮制備并避光保存。(2)衍生步驟將200iiL、2mol/L的NaOH溶液加入至lmL標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品溶液中，然后加300iiL的飽和NaHC03溶液緩沖。加入1.5mL的丹磺酰氯溶液，將混合后的溶液放入4(TC恒溫箱保溫處理40min之后，加入100yL的氨水去除丹磺酰氯終止反應(yīng)，最后用乙腈定容至5mL。衍生處理后用0.22iim的有機(jī)濾膜過(guò)濾，用于分析檢測(cè)。2、高效液相色譜(HPLC)法檢測(cè)生物胺AgilentZORBAXXDB_C18柱(4.6mmX250mm，5iim);流動(dòng)相用0.Olmol/L的KH2P04(pH3.5)和甲醇進(jìn)行梯度洗脫，流速1.OmL/min，梯度洗脫程序見表1;分別采用二級(jí)6管陣列檢測(cè)器(DAD)和熒光檢測(cè)器(FLD)進(jìn)行測(cè)定紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm、熒光檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)(Ex)330nm、發(fā)射波長(zhǎng)(Em)465nm;進(jìn)樣量20yL;柱溫30°C。表1梯度洗脫程序<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>HPLC-DAD方法檢測(cè)生物胺的方法學(xué)驗(yàn)證方法的線性范圍在0.550mg/kg濃度范圍內(nèi)分別添加7種生物胺的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制濃度為0.5、l、5、25、50mg/kg的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述進(jìn)行衍生和檢測(cè)。根據(jù)7種生物胺的平均峰面積(y，n=5)與相應(yīng)生物胺的標(biāo)準(zhǔn)濃度(x，mg/kg)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)校正曲線，經(jīng)Agilent工作站軟件分析處理后，7種生物胺的線性回歸方程見表2。表27種生物胺的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)(R2)線性回歸方程R2y:themeanpeakareaof7BAs(n=5);x:massconcentrationsof7BAs(mg/kg).方法的回收率、精密度和檢出限選用不含7種待測(cè)組分的空白豆醬樣品，分別添加1、10和50mg/kg三個(gè)濃度水平的7種生物胺的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按建立的方法處理樣品，分析檢測(cè)并計(jì)算回收率和精密度，測(cè)得平均回收率(n=5)范圍在76.3110.2%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.39.1%?？瞻锥贯u樣品和加標(biāo)豆醬樣品如圖1。本試驗(yàn)在標(biāo)準(zhǔn)添加回收率試驗(yàn)的最低質(zhì)量濃度點(diǎn)0.5mg/kg，各種生物胺的信噪比(S/N)均大于IO，并且具有較好的回收率，故確定各生物胺的定量限為0.5mg/kg;以3倍信噪比(S/N)計(jì)算方法的檢出限，7種生物胺的回收率、精密度及檢出限見表3。表37種生物胺的添加回收率、精密度和檢出限(n=5)y=0.2709x+0.00930.9981y=0.2127x-0.00310.9984y=0.3571x+0.09750.9987y=0.3405x+0.06160.9988y=0.1316x-0.08050.9981y=0.2487x+0.01680.9992y=0.2381x+0.06350.9986胺胺胺胺乙胺精組酪腐尸4精g<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3檢出限信噪比為3HPLC-FLD方法檢測(cè)生物胺的方法學(xué)驗(yàn)證方法的線性范圍在0.150mg/kg濃度范圍內(nèi)分別添加7種生物胺的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制濃度為0.1、0.5、5、25、50mg/kg的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照建立的方法進(jìn)行衍生和檢測(cè)。根據(jù)7種生物胺的平均峰面積(y，n=5)與相應(yīng)生物胺的標(biāo)準(zhǔn)濃度(x，mg/kg)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)校正曲線，經(jīng)Agilent工作站軟件分析處理后，7種生物胺的線性回歸方程見表4。表47種生物胺的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)(R2)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>方法的回收率、精密度和檢出限選用不含7種待測(cè)組分的空白豆醬樣品，分別添加0.5、5和50mg/kg三個(gè)濃度水平的7種生物胺的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按建立的方法處理樣品，分析檢測(cè)并計(jì)算回收率和精密度，測(cè)得7種生物胺平均回收率(n=5)范圍在74.7105.1%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.19.7%。加標(biāo)豆醬樣品如圖2。本試驗(yàn)在標(biāo)準(zhǔn)添加回收率試驗(yàn)的最低質(zhì)量濃度點(diǎn)0.lmg/kg，各種生物胺的信噪比(S/N)均大于IO，并且具有較好的回收率，故確定各生物胺的定量限為0.lmg/kg;以3倍信噪比(S/N)計(jì)算方法的檢出限，7種生物胺的回收率、精密度及檢出限見表5。表57種生物胺的添加回收率、精密度和檢出限(n=5)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>3檢出限信噪比為3試驗(yàn)例2生物胺衍生條件的優(yōu)化試驗(yàn)在生物胺的衍生過(guò)程中，衍生劑的用量、衍生溫度、衍生時(shí)間等因素都會(huì)影響衍生反應(yīng)的進(jìn)行及衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性，從而影響檢測(cè)靈敏度。本試驗(yàn)采用丹磺酰氯做為衍生劑，對(duì)衍生條件進(jìn)行優(yōu)化，確定Dns-Cl衍生生物胺的最佳條件。1衍生劑用量的選擇衍生劑與生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積比(v/v，丹磺酰氯濃度10mg/mL)分別選擇0.5、1、1.5、2，其他條件不變，按上述方法進(jìn)行衍生和檢測(cè)。生物胺混標(biāo)濃度50mg/L。每組做3次平行試驗(yàn)，取3次測(cè)定生物胺標(biāo)準(zhǔn)品峰面積平均值表示生物胺的衍生效率，結(jié)果如圖3。圖3顯示，衍生劑用量超過(guò)樣液1.5倍以上后，生物胺的衍生效率不再提高，說(shuō)明此時(shí)衍生劑已經(jīng)飽和，沒有必要再增加衍生劑用量。因此，本試驗(yàn)確定利用Dns-Cl衍生時(shí)，衍生劑用量與樣品體積比為1.5時(shí)，可以達(dá)到理想的生物胺衍生效果。2、衍生時(shí)間的選擇生物胺衍生時(shí)間分別設(shè)定為20min、30min、40min、50min、60min，其他條件保持不變，按上述方法進(jìn)行衍生和檢測(cè)。生物胺混標(biāo)濃度為50mg/L。每組做3次平行試驗(yàn)，計(jì)算3次平行試驗(yàn)的平均值。結(jié)果如圖4。圖4顯示，生物胺衍生40min時(shí)，衍生效率達(dá)到最高值，繼續(xù)延長(zhǎng)衍生時(shí)間對(duì)衍生效率影響不大。因此本試驗(yàn)選擇40min作為最佳衍生時(shí)間。3、衍生溫度的選擇生物胺衍生溫度分別為室溫、3(TC、40°C、50°C、60°C，其他條件保持不變，按上述方法進(jìn)行衍生和測(cè)定。生物胺混標(biāo)濃度50mg/L。每組做3次平行試驗(yàn)，計(jì)算3次平行試驗(yàn)的平均值。結(jié)果如圖5。圖5顯示，在本衍生方法中，酪胺、苯乙胺、組胺和腐胺從室溫到4(TC衍生效率變化較大，4(TC后繼續(xù)升溫對(duì)衍生效率影響不大；尸胺、精胺和亞精胺從室溫到6(TC范圍內(nèi)，衍生效率變化不大。室溫和3(TC衍生時(shí)，衍生液常有深淺不均的黃色，4(TC時(shí)黃色基本消失。因此，本試驗(yàn)選擇4(TC為生物胺丹磺酰氯衍生的最佳溫度。權(quán)利要求豆醬中生物胺的分離和液相色譜柱柱前衍生化方法，包括以下步驟(1)向豆醬中加入三氯乙酸溶液，均質(zhì)，離心，收集上清液；(2)向上清液中加入正己烷，振蕩，靜止分層后取出下層三氯乙酸相，備用；(3)向三氯乙酸相中加入NaOH溶液，再加入NaHCO3溶液緩沖，混合丹磺酰氯丙酮溶液進(jìn)行衍生化反應(yīng)；(4)氨水去除丹磺酰氯終止反應(yīng)，得到衍生液；衍生液過(guò)濾，即得。2.按照權(quán)利要求1所述的分離和液相色譜柱柱前衍生化方法，其特征在于步驟(1)中向豆醬中加入1.5倍豆醬質(zhì)量的5%三氯乙酸溶液。3.按照權(quán)利要求1所述的分離和液相色譜柱柱前衍生化方法，其特征在于步驟(1)中所述的均質(zhì)在以下條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)速10000r/min，均質(zhì)時(shí)間3min;所述的離心在以下條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)速3500r/min，離心時(shí)間5min。4.按照權(quán)利要求1所述的分離和液相色譜柱柱前衍生化方法，其特征在于步驟(2)中向上清液中加入等體積的正己烷。5.按照權(quán)利要求l所述的分離和液相色譜柱柱前衍生化方法，其特征在于步驟(3)中向三氯乙酸相中加入2mol/LNaOH溶液，其中三氯乙酸相與2mol/LNaOH溶液的體積比為5:1;再接著加入飽和NaHC03溶液進(jìn)行緩沖，其中，飽和NaHC03溶液與三氯乙酸相的體積比為3:10。6.按照權(quán)利要求1所述的分離和液相色譜柱柱前衍生化方法，其特征在于，步驟(3)中所述的衍生條件為衍生劑丹磺酰氯丙酮溶液用量為三氯乙酸相體積的1.5倍，衍生時(shí)間為40min，衍生溫度為40。C。7.按照權(quán)利要求1所述的分離和液相色譜柱柱前衍生化方法，其特征在于步驟(4)中加入0.5倍初始體積的氨水去除丹磺酰氯終止反應(yīng)，最后用乙腈定容至25倍初始體積。8.按照權(quán)利要求1所述的分離和液相色譜柱柱前衍生化方法，其特征在于衍生處理后用0.22iim的微孔濾膜過(guò)濾。全文摘要本發(fā)明公開了一種豆醬中生物胺的分離和液相色譜柱柱前衍生化方法，包括以下步驟(1)向豆醬中加入三氯乙酸溶液，均質(zhì)，離心，收集上清液；(2)向上清液中加入正己烷，振蕩，靜止分層后取出下層三氯乙酸相，備用；(3)向三氯乙酸相中加入NaOH溶液，再加入NaHCO3溶液緩沖，混合丹磺酰氯丙酮溶液進(jìn)行衍生；(4)氨水去除丹磺酰氯終止反應(yīng)，得到衍生液，過(guò)濾。本發(fā)明分離方法處理過(guò)程簡(jiǎn)單，消耗試劑少，避免了轉(zhuǎn)移時(shí)所造成的分析物損失。經(jīng)本發(fā)明分離凈化后可達(dá)到檢測(cè)要求，譜圖雜峰干擾少且待測(cè)物損失小，生物胺的回收率可達(dá)到80％以上。本發(fā)明方法確定了衍生生物胺的最佳條件，丹磺酰氯衍生產(chǎn)物穩(wěn)定，檢測(cè)靈敏度高。文檔編號(hào)G01N1/34GK101793642SQ20101011173公開日2010年8月4日申請(qǐng)日期2010年2月9日優(yōu)先權(quán)日2009年12月17日發(fā)明者江連洲,王鵬,程建軍,韓翠萍,魏冬旭申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)