本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及土壤營養(yǎng)元素調(diào)控和微生物固體發(fā)酵技術(shù)，具體為一種活化紅壤磷素的微生物菌劑及其制作方法。
背景技術(shù)：
在我國南方，磷素供應(yīng)不足是林木生長突出且具有普遍性的問題。及時(shí)補(bǔ)充磷素，不僅可以促進(jìn)林木的生長，而且可以提高苗木的抗逆性和抗病性。由于紅壤對磷素有強(qiáng)烈的固定作用，施入土壤中的可溶性磷肥大部分很快發(fā)生專性吸附和化學(xué)沉淀而被固定，以難溶性的磷酸鹽形式在土壤中積累，植物難以吸收利用。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國有74％的土壤耕層全磷含量很高，但土壤中95％以上的磷為無益磷，當(dāng)季作物的磷肥利用率僅為10％-25％。因此，通過生物途徑來提高紅壤磷素的利用率越來越引起人們的重視。
解磷微生物是指一類能將難溶性磷轉(zhuǎn)化為植物可吸收利用的可溶性磷的微生物。有研究表明，篩選獲得的解磷微生物大多出現(xiàn)在植物根際土壤中，根際解磷微生物與根系具有相互的促進(jìn)作用。目前，關(guān)于根際解磷微生物的研究較多，有解磷細(xì)菌、解磷真菌和解磷放線菌，但較少將其開發(fā)成菌劑，而是直接將菌株應(yīng)用于生產(chǎn)。解磷微生物直接用于生產(chǎn)中，菌種活性會大打折扣，難以在土著微生物集中的群落中生存。利用合適的吸附載體將解磷微生物制備成溶磷菌劑，不僅可以保持菌種的活性，而且可以與有機(jī)肥搭配，直接施放到林地中。
土壤磷素活化技術(shù)主要包括化學(xué)方法和生物學(xué)方法兩種?；瘜W(xué)類主要利用有機(jī)酸和無機(jī)酸活化土壤磷，如中國發(fā)明專利(公開號cn100408653c)公開了尿囊素和生化黃腐酸相結(jié)合專利技術(shù)。中國發(fā)明專利(授權(quán)公告號cn1061964c)公開了一種用于活化根際土壤磷并有增產(chǎn)作用的菌劑，該方法使用輕質(zhì)碳酸鈣作為吸附劑，吸附具有磷活化能力的假單胞菌來制備。其制備工藝中的液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方：玉米粉2-4％、豆餅粉1-2％、氯化鈣0.1-0.3％、硫酸銨0.4-0.6％、硝酸鈉0.1-0.3％、磷酸氫二鈉0.2-0.4％、氯化鋅0.1-0.2％、麥芽汁2-4％、余量為水，調(diào)節(jié)ph7.2-7.5。發(fā)酵后用輕質(zhì)碳酸鈣吸附，然后烘干，粉碎包裝，既得。然而該菌劑的液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方復(fù)雜，操作繁瑣。目前已經(jīng)發(fā)表的解磷細(xì)菌主要有芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、埃希氏菌屬、歐文氏菌屬、土壤桿菌屬、沙雷氏菌屬、黃桿菌屬、腸細(xì)菌屬、微球菌屬、固氮菌屬、沙門氏菌屬、色桿菌屬、產(chǎn)堿菌屬、節(jié)細(xì)菌屬、硫氧化菌屬和多硫桿菌屬等。但尚未見有采用采用高嶺土與伯克氏菌配合制成的活化菌劑并用于林地紅壤磷素的相關(guān)報(bào)導(dǎo)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種具有較強(qiáng)的磷活化能力、活性穩(wěn)定且工藝簡單的林地紅壤磷素活化菌劑。
本發(fā)明以如下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題：
本發(fā)明一種林地紅壤磷素活化菌劑，該菌劑是采用高嶺土拌合伯克氏菌制成。
所述伯克氏菌采用濃度為1×108cfu/ml的菌懸液，高嶺土與菌懸液的配比為：高嶺土:菌懸液＝1kg:10-100ml。
所述配制好的菌劑粉碎過60目篩后制得粉劑菌劑，菌劑中伯克氏菌的有效活菌數(shù)為1×106cfu/g。
所述濃度為1×108cfu/ml的菌懸液的制備方法是：將伯克氏菌的原菌種接種至lb液體培養(yǎng)基中，在37℃條件下培養(yǎng)24-36h，后接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中35℃，轉(zhuǎn)速200rpm下培養(yǎng)24-36h，即制得菌懸液。
所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基由以下重量百分比的原料混合制成：麥芽汁2-4％、豆餅粉2-4％，余量為水，調(diào)節(jié)ph至7.2-7.4，配制后于121℃高壓滅菌20min；將經(jīng)lb液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后的原菌液投入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，原菌液的用量為液體發(fā)酵培養(yǎng)基(v/v)的1％。
本發(fā)明林地紅壤磷素活化菌劑具有如下有益效果：
1)能高效活化林地紅壤磷素、活性穩(wěn)定且工藝簡單，能實(shí)現(xiàn)林地紅壤有效磷的補(bǔ)充，促進(jìn)林木的生長。
2)解磷性能強(qiáng)，對難溶性鈣磷和鐵磷均具有較強(qiáng)的溶解能力，溶磷量分別為205和180μg/ml。與不添加溶磷菌劑相比，有效磷含量顯著增加，差異顯著。
3)制備工藝簡便，成本低。
具體實(shí)施方式
下面對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的描述：
本案發(fā)明人通過大量菌株分離和實(shí)驗(yàn)篩選，獲得了對難溶性鈣磷溶解量為205μg/ml，難溶性鐵磷溶解量為180μg/ml、活性穩(wěn)定的解磷微生物菌株，該菌株屬于伯克氏菌屬，對其菌株的dna進(jìn)行了初步鑒定，它的活性成分包括burkholderiaphenazinium。
本發(fā)明林地紅壤磷素活化菌劑的制備方法是：
采用濃度為1×108cfu/ml的伯克氏菌菌懸液與高嶺土拌合制成菌劑，高嶺土與菌懸液的配比為：高嶺土:菌懸液＝1kg:10-100ml，即1ml菌液拌合10～100g高嶺土。將配制好的菌劑粉碎過60目篩后制得粉劑菌劑，菌劑中伯克氏菌的有效活菌數(shù)為1×106cfu/g。
所述濃度為1×108cfu/ml的伯克氏菌菌懸液的制備方法是：
將伯克氏菌的原菌種接種至lb液體培養(yǎng)基中，在37℃條件下培養(yǎng)24-36h，后接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中擴(kuò)繁，培養(yǎng)溫度35℃，轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)24-36h，即制得菌懸液。
所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基由以下重量百分比的原料混合制成：麥芽汁2-4％、豆餅粉2-4％，余量為水，調(diào)節(jié)ph至7.2-7.4，配制后于121℃高壓滅菌20min；將經(jīng)lb液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后的原菌液投入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，原菌液的用量為液體發(fā)酵培養(yǎng)基(v/v)的1％。其它操作均按微生物液體發(fā)酵要求進(jìn)行常規(guī)滅菌。
本發(fā)明通過將培養(yǎng)獲得的伯克氏菌發(fā)酵菌液經(jīng)高嶺土吸附，然后拌合均勻，粉碎包裝制得本發(fā)明產(chǎn)品粉劑菌劑。
上述lb液體培養(yǎng)基可以采用現(xiàn)有技術(shù)配制。
本發(fā)明實(shí)例采用的lb液體培養(yǎng)基的配方(以容量1000ml為基數(shù))：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉5g，加蒸餾水至1000ml，調(diào)節(jié)ph至7.2-7.4。培養(yǎng)溫度37℃，進(jìn)入三角瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為24-36h。
以下通過優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，然而本發(fā)明范圍不僅僅限于下列實(shí)施例。凡是不背離本發(fā)明構(gòu)思的改變或等同替代均包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
實(shí)施例1：
原料配方：含1×108cfu/ml的伯克氏菌菌懸液100ml，高嶺土1kg。
制備方法：取液體發(fā)酵后的伯克氏菌菌懸液，濃度達(dá)到1×108cfu/ml后與高嶺土拌合，拌合均勻后，經(jīng)粉碎過60目篩后，計(jì)量包裝，并經(jīng)稀釋涂板分析確保有效活菌數(shù)為1×106cfu/g后即得到本發(fā)明粉劑菌劑成品。
本實(shí)例采用的伯克氏菌菌懸液的制備方法是：
將伯克氏菌的原菌種接種至lb液體培養(yǎng)基中，在37℃條件下培養(yǎng)24h，后接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中擴(kuò)繁，培養(yǎng)溫度35℃，轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)24h，即制得原菌液。
所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基由以下重量百分比的原料混合制成：麥芽汁4％、豆餅粉4％，余量為水，調(diào)節(jié)ph至7.2，配制后于121℃高壓滅菌20min；將經(jīng)lb液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后的原菌液投入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，原菌液的用量為液體發(fā)酵培養(yǎng)基(v/v)的1％。
將制備得到的粉劑菌劑在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行溶磷能力測定，無菌條件下，使用本發(fā)明成品10g裝入含100mllb培養(yǎng)基和0.5g磷酸鈣的250ml三角瓶中，35℃，180rpm下發(fā)酵3天，取發(fā)酵液5ml采用鉬銻抗比色法測定有效磷含量，有效磷含量為205μg/ml。使用本發(fā)明成品10g裝入含100mllb培養(yǎng)基和0.5g磷酸鐵的250ml三角瓶中，35℃，180rpm下發(fā)酵3天，取發(fā)酵液5ml采用鉬銻抗比色法測定有效磷含量，有效磷含量為180μg/ml。
實(shí)施例2：
原料配方：含1×108cfu/ml的伯克氏菌菌懸液50ml，高嶺土1kg。
制備方法：取液體發(fā)酵后的伯克氏菌菌懸液，濃度達(dá)到1×108cfu/ml后與高嶺土拌合，拌合均勻后，經(jīng)粉碎過60目篩后，計(jì)量包裝，并經(jīng)稀釋涂板分析確保有效活菌數(shù)為1×106cfu/g后即得本發(fā)明粉劑菌劑成品。
本實(shí)例采用的伯克氏菌菌懸液的制備方法是：
將伯克氏菌的原菌種接種至lb液體培養(yǎng)基中，在37℃條件下培養(yǎng)24h，后接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中擴(kuò)繁，培養(yǎng)溫度35℃，轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)36h，即制得原菌液。
所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基由以下重量百分比的原料混合制成：麥芽汁2％、豆餅粉2％，余量為水，調(diào)節(jié)ph至7.2，配制后于121℃高壓滅菌20min；將經(jīng)lb液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后的原菌液投入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，原菌液的用量為液體發(fā)酵培養(yǎng)基(v/v)的1％。
將制備得到的粉劑菌劑在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行溶磷能力測定，無菌條件下，使用本成品10g裝入含100mllb培養(yǎng)基和0.5g磷酸鈣的250ml三角瓶中，35℃，180rpm下發(fā)酵3天，取發(fā)酵液5ml采用鉬銻抗比色法測定有效磷含量，有效磷含量為195μg/ml。使用本成品10g裝入含100mllb培養(yǎng)基和0.5g磷酸鐵的250ml三角瓶中，35℃，180rpm下發(fā)酵3天，取發(fā)酵液5ml采用鉬銻抗比色法測定有效磷含量，有效磷含量為176μg/ml。
實(shí)施例3：
原料配方：含1×108cfu/ml的伯克氏菌菌懸液菌懸液20ml，高嶺土1kg。
制備方法：取液體發(fā)酵后的菌懸液，濃度達(dá)到1×108cfu/ml后與高嶺土拌合，拌合均勻后，經(jīng)粉碎過60目篩后，計(jì)量包裝，并經(jīng)稀釋涂板分析確保有效活菌數(shù)為1×106cfu/g后即得本發(fā)明粉劑菌劑成品。
本實(shí)例采用的伯克氏菌菌懸液的制備方法是：
將伯克氏菌的原菌種接種至lb液體培養(yǎng)基中，在37℃條件下培養(yǎng)36h，后接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中擴(kuò)繁，培養(yǎng)溫度35℃，轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)36h，即制得原菌液。
所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基由以下重量百分比的原料混合制成：麥芽汁2％、豆餅粉4％，余量為水，調(diào)節(jié)ph至7.2，配制后于121℃高壓滅菌20min；將經(jīng)lb液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后的原菌液投入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，原菌液的用量為液體發(fā)酵培養(yǎng)基(v/v)的1％。
將制備得到的粉劑菌劑在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行溶磷能力測定，無菌條件下，使用本發(fā)明菌劑成品10g裝入含100mllb培養(yǎng)基和0.5g磷酸鈣的250ml三角瓶中，35℃，180rpm下發(fā)酵3天，取發(fā)酵液5ml采用鉬銻抗比色法測定有效磷含量，有效磷含量為125μg/ml。使用本發(fā)明菌劑成品10g裝入含100mllb培養(yǎng)基和0.5g磷酸鐵的250ml三角瓶中，35℃，180rpm下發(fā)酵3天，取發(fā)酵液5ml采用鉬銻抗比色法測定有效磷含量，有效磷含量為106μg/ml。
實(shí)施例4：
原料配方：含1×108cfu/ml的伯克氏菌菌懸液菌懸液10ml，高嶺土1kg。
制備方法：取液體發(fā)酵后的菌懸液，濃度達(dá)到1×108cfu/ml后與高嶺土拌合，拌合均勻后，經(jīng)粉碎過60目篩后，計(jì)量包裝，并經(jīng)稀釋涂板分析確保有效活菌數(shù)后為1×106cfu/g即得本發(fā)明粉劑菌劑成品。
本實(shí)例采用的伯克氏菌菌懸液的制備方法是：
將伯克氏菌的原菌種接種至lb液體培養(yǎng)基中，在37℃條件下培養(yǎng)24h，后接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中擴(kuò)繁，培養(yǎng)溫度35℃，轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)24h，即制得原菌液。
所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基由以下重量百分比的原料混合制成：麥芽汁4％、豆餅粉2％，余量為水，調(diào)節(jié)ph至7.2，配制后于121℃高壓滅菌20min；將經(jīng)lb液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后的原菌液投入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，原菌液的用量為液體發(fā)酵培養(yǎng)基(v/v)的1％。
將制備得到的粉劑菌劑在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行溶磷能力測定，無菌條件下，使用本發(fā)明菌劑成品10g裝入含100mllb培養(yǎng)基和0.5g磷酸鈣的250ml三角瓶中，35℃，180rpm下發(fā)酵3天，取發(fā)酵液5ml采用鉬銻抗比色法測定有效磷含量，有效磷含量為101μg/ml。使用本發(fā)明菌劑成品10g裝入含100mllb培養(yǎng)基和0.5g磷酸鐵的250ml三角瓶中，35℃，180rpm下發(fā)酵3天，取發(fā)酵液5ml采用鉬銻抗比色法測定有效磷含量，有效磷含量為78μg/ml。