專利名稱：生物活化的診斷成像造影劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于磁共振成像(MRI)和光學(xué)成像的改進(jìn)的診斷藥劑。這些藥劑使得可以在組織內(nèi)靈敏地檢測特異性生物學(xué)活性。本發(fā)明也涉及包含這些藥劑的藥物組合物，并涉及使用所說的藥劑和包含這些藥劑的組合物的方法。
背景技術(shù)：
診斷成像技術(shù)，如MRI,X-射線成像，核放射性藥物成像，紫外/可見/紅外光成像和超聲波成像，用于醫(yī)學(xué)診斷已有許多年。
一般用于造影的材料包括有機(jī)分子，金屬離子，鹽或螯合物，粒子(特別是鐵粒子)或標(biāo)記的肽，蛋白質(zhì)，聚合物或脂質(zhì)體。在施用之后，這些藥劑在代謝和/或排泄之前可以在整個身體區(qū)室中非特異性地擴(kuò)散；這些藥劑一般被稱為非特異性藥劑。此外，這些藥劑可以具有對一特殊身體區(qū)室，細(xì)胞，器官或組織部分的親和性；這些藥劑可以被稱作靶向造影劑。
造影劑-增強(qiáng)的診斷成像過程合乎需要地增加正常和病理組織之間的差異，以這種方式提供兩種基本類別的信息1)檢測數(shù)據(jù)。這包括確定成像組織中是否存在異常和其存在的程度所必需的數(shù)據(jù)。提供這一類信息的能力指的是成像方法的＂靈敏度＂。
2)鑒別診斷數(shù)據(jù)。這包括精確鑒別所存在的異常的類型所必需的數(shù)據(jù)。提供這一類信息的能力指的是成像方法的＂特異性＂。特異性對進(jìn)行患者疾病的精確預(yù)測和制定治療計劃是必需的。例如，雖然當(dāng)前的方法可以是能夠檢測腫瘤的，但它們一般不足以確定腫瘤是良性的還是惡性的，腫瘤是否有可能轉(zhuǎn)移，腫瘤是否在對治療有反應(yīng)。這樣的確診需要一些組織的特定生化狀態(tài)的知識。
已經(jīng)提出許多產(chǎn)生靶向造影劑的方法。美國專利4,880,008(本文一并參考)描述了MRI造影劑，當(dāng)它們非共價地結(jié)合到血清蛋白質(zhì)(如人類血清白蛋白)上時，顯示出更高的信號或馳豫度。對于這一類藥劑，馳豫度與結(jié)合到蛋白質(zhì)上的造影劑的百分比有關(guān)，并且典型地是高出用未結(jié)合蛋白質(zhì)的藥劑所觀察到的5到10倍。在共同-未決美國申請08/382,317(1995年2月1日中請，本文一并參考)中，將血液半衰期延長部分(“BHEMs”)添加到蛋白質(zhì)-結(jié)合造影劑上。相對于沒有BHEM的藥劑而言，所形成的藥劑在血液中顯示出提高的或改變的信號一段更長的時間，這使得這些材料對血管成像尤其有用。
美國專利4,899,755(本文一并參考)描述了MRI造影劑，其優(yōu)先由正常的肝細(xì)胞吸收，導(dǎo)致正常和異常肝組織之間差異的提高。
另一個靶向方法基于造影劑與蛋白質(zhì)，抗體或其它生物分子的綴合，已知后者與細(xì)胞表面受體，胞內(nèi)受體，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其它生化成分相互作用。參見，例如，美國專利5,171,563。然而，這樣的靶向通常包括在綴合藥劑和生化靶之間的一對一相互作用，所說的靶常常以比較低的濃度(經(jīng)常為納摩爾級)存在。因而，利用這一方法在一種特殊的組織中積累的靶向造影劑分子的數(shù)量是有限的。對于成像方式(其中，為了檢測，常常需要有效濃度(例如，＞1μM)的藥劑分子，例如MRI和光學(xué)成像)，這種“一對一的”方法一般太不靈敏，以致于不能使用。
對組織的生化狀態(tài)成像的嘗試包括放射性藥物的應(yīng)用，其中，某些成像劑保留在特定的組織中。例如，發(fā)射正電子的18F-標(biāo)記的氟脫氧葡萄糖通過被動擴(kuò)散被運(yùn)輸至腦中，在那里它是磷酸化的，并且保留在腦組織內(nèi)，導(dǎo)致葡萄糖代謝的出現(xiàn)(參見M.Blau，核醫(yī)學(xué)學(xué)研討會，Vol.ⅩⅤ,No.4(10月),1985)。同樣，報道锝-99m標(biāo)記的硝基咪唑優(yōu)先保持在局部缺血的心臟中(參見Y.-W.Chan等，核醫(yī)學(xué)會第41屆年會論文集，6月5日-6月8日，1994年，核醫(yī)學(xué)雜志(1994),35卷，摘要號65,p.18P)。然而，在這些情況下，來源于放射性藥物的信號保持恒定(即，每一種放射性同位素有特征性的不變的衰變和所發(fā)射的粒子的能量)，并且不受生物修飾或在組織中的優(yōu)先保持的影響。可以用這一技術(shù)獲得的信息的特異性與靈敏度是有限的。
仍然需要具有改進(jìn)的特異性和靈敏度的造影劑。具體地說，仍然需要靶向MRI和光學(xué)造影成像劑，它們在對特異性生物活性的存在的響應(yīng)(在診斷這些生物活性的存在上有用)上，顯示出足夠的信號增強(qiáng)或信號改變。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于在組織內(nèi)靈敏地檢測特異性生物學(xué)活性的新的改進(jìn)的診斷MRI和光學(xué)成像劑，和其藥學(xué)上可接受的衍生物。所說的成像劑是在特異性的生物學(xué)活性存在下體內(nèi)被生物活化的前藥造影劑。在生物學(xué)活性是催化活性(例如，來源于酶活性)時，對每一單位的生物活性物質(zhì)而言，產(chǎn)生大量的活化造影劑分子。與前藥比較，成像劑的生物活化的形式顯示出對一種或多種蛋白質(zhì)的增加的結(jié)合親和性，在結(jié)合親和性方面這一變化引起成像劑信號特征的可檢測的改變。這一可檢測的信號變化增加含有靶向生物學(xué)活性的組織和不含有該活性的組織之間的信號(或圖象)差異，這樣，其反映靶向生物學(xué)活性的存在。
本發(fā)明的一個目的是提供一些新的化合物，它們在MRI和光學(xué)成像中作為造影劑有用。本發(fā)明的另一個目的是提供包含這些化合物的藥物組合物。本發(fā)明的還一個目的是提供在MRI和光學(xué)成像中利用這些化合物和包含它們的組合物的方法。
發(fā)明詳述為了能更充分地理解本文所描述的本發(fā)明，給出以下詳細(xì)描述。
在本發(fā)明的新的前藥的設(shè)計中需要牢記三點(diǎn)1)在它們的結(jié)構(gòu)中它們必須具有一個或多個特異性部位，其能夠在體內(nèi)被特異性生物學(xué)活性修飾；2)由這一生物學(xué)活性產(chǎn)生的成像劑的修飾的形式必須比前藥更大程度地結(jié)合到一種或多種蛋白質(zhì)上；和3)當(dāng)它結(jié)合到蛋白質(zhì)上時，成像劑的信號特征必須改變。
對于本發(fā)明，正常和異常的組織之間的成像差異一般要求一種組織中的生物學(xué)活性高于另一種組織中的生物學(xué)活性。如果異常組織比正常組織表達(dá)更大濃度的生物學(xué)活性，則異常組織將比正常組織把更多前藥造影劑轉(zhuǎn)化成活化的形式(只要類似的濃度的前藥在兩種組織中存在)。在特定的例子中，在由活化的造影劑引起的增加的蛋白質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生更強(qiáng)的信號時，生物學(xué)活性的存在導(dǎo)致成像(或信號)作為＂熱點(diǎn)＂檢測。相反，如果異常組織表達(dá)更少的生物學(xué)活性，則異常組織將具有生物活化的造影劑的較低的濃度。在這種情況下，如果由活化的造影劑引起的增加的蛋白質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生更強(qiáng)的信號，則生物學(xué)活性的存在導(dǎo)致圖象(或信號)作為＂冷點(diǎn)＂檢測。Ⅰ．定義以下列出的是用于描述本發(fā)明的術(shù)語的定義。除非由其它說明，這些定義在本說明書全文中適用于所說的術(shù)語。
術(shù)語＂脂肪族基團(tuán)＂在本文中單獨(dú)使用或作為另一個基團(tuán)的一部分使用時指取代或未取代的線型和/或支鏈的，飽和或不飽和的碳?xì)浠衔锘鶊F(tuán)，包括鏈烯基，炔基，環(huán)烷基和環(huán)烯基碳?xì)浠衔锘鶊F(tuán)。
術(shù)語＂烷基＂在本文中單獨(dú)使用或作為另一個基團(tuán)的一部分使用時指取代或未取代的線型和/或支鏈飽和碳?xì)浠衔锘鶊F(tuán)。
術(shù)語＂烷氧基＂或＂烷硫基＂分別指由氧鍵(-O-)或硫鍵(-S-)結(jié)合的以上描述的烷基基團(tuán)。本文所使用的術(shù)語＂烷羰基＂指由羰基基團(tuán)結(jié)合的烷基基團(tuán)。本文所使用的術(shù)語＂烷羰氧基＂指由羰基基團(tuán)結(jié)合的烷基基團(tuán)，其依次由氧鍵結(jié)合。
術(shù)語＂鏈烯基＂在本文中單獨(dú)使用或作為另一個基團(tuán)的一部分使用時指取代或未取代的線型和/或支鏈的，鏈中包含至少一個碳-碳雙鍵的碳?xì)浠衔锘鶊F(tuán)。
術(shù)語＂炔基＂在本文中單獨(dú)使用或作為另一個基團(tuán)的一部分使用時指取代或未取代的線型和/或支鏈的，鏈中包含至少一個碳-碳三鍵的碳?xì)浠衔锘鶊F(tuán)。
術(shù)語＂環(huán)烷基＂在本文中單獨(dú)使用或作為另一個基團(tuán)的一部分使用時指取代或未取代的環(huán)狀碳?xì)浠衔锃h(huán)系。
術(shù)語＂環(huán)烯基＂在本文中單獨(dú)使用或作為另一個基團(tuán)的一部分使用時指如上對環(huán)烷基所描述的那些取代或未取代的基團(tuán)，還包括構(gòu)成特定的不飽和環(huán)的碳-碳雙鍵。
術(shù)語＂芳基＂在本文中單獨(dú)使用或作為另一個基團(tuán)的一部分使用時指取代或未取代的同環(huán)的芳香族基團(tuán)。
術(shù)語＂雜環(huán)＂在本文中單獨(dú)使用或作為另一個基團(tuán)的一部分使用時指取代或未取代的具有至少一個雜原子的完全飽和或不飽和芳香族或非-芳香族環(huán)基團(tuán)。
術(shù)語＂?；⒃诒疚闹袉为?dú)使用或作為另一個基團(tuán)的一部分使用時指由從有機(jī)羧酸的-COOH基團(tuán)除去羥基基團(tuán)所形成的部分。
術(shù)語＂生物學(xué)活性＂包括pH值改變、氧化還原電勢、活性種類(例如自由基)的濃度、或者可以促進(jìn)前藥中一個或多個鍵的修飾或切割的酶或生物分子(包括RNA酶)的存在或水平。＂生物學(xué)活性＂可以包括同時或依次造成前藥修飾的兩種或多種類型的生物分子。對前藥可以出現(xiàn)一種以上的生物修飾(例如，酶促切割，隨后是簡單的水解或脫羧)。Ⅱ．前藥結(jié)構(gòu)本發(fā)明的前藥必須包含三個結(jié)構(gòu)域圖象-增強(qiáng)(或信號產(chǎn)生)部分(“IEM”)，修飾部位(“MS”)和蛋白質(zhì)結(jié)合部分(PBM)。
預(yù)期本發(fā)明的前藥能也包含連接功能域的一種生理相容的接頭部分(L)。一般來說，L對造影劑的蛋白質(zhì)結(jié)合或圖象提高功能沒有明顯貢獻(xiàn)。在某些情況下，L的存在優(yōu)選地是基于合成上的考慮。在其它情況下，L可以有利于在MS上的生物學(xué)活性操作。L的例子包括線型的，支鏈的或環(huán)狀的烷基，芳基，醚，多羥基，多醚，多胺，雜環(huán)，肽，類胨或其它生理相容的共價連接物。
生物活化本發(fā)明的造影劑的優(yōu)選的方法包括在MS上酶促切割前藥(例如經(jīng)酯酶，蛋白酶，磷酸酶等)。在這種情況下，本發(fā)明的前藥還包含掩蔽部分(MM)。MM＂掩蔽＂(或降低)前藥對在待成像的所需組織內(nèi)的蛋白質(zhì)的結(jié)合；一旦MM在MS上被切除，所述藥劑的增加的結(jié)合親和性就得以表達(dá)。在這種情況下，生物學(xué)活性靶或底物(例如，酰胺鍵)被定義為前藥的MS。生物活化的這一特殊方法導(dǎo)致物理分離至少兩個分子片段，一個包含IEM和PBM，另一個包含MM。
本發(fā)明的化合物的結(jié)構(gòu)域相互可以排列在各種位置上。當(dāng)這些結(jié)構(gòu)域在它們之間沒有任何特定界限存在(例如，MS可以是IEM的一部分)時，將它們在概念上作為單獨(dú)的分子單位是方便的。例如，包括下列結(jié)構(gòu)(1)IEM-[(PBM)m-[(MS)n-(MM)o]p]q
其中m,n,o,p和q每一個相同或不同；q,n,m和p可以大于或等于1，但不是0,o可以大于或等于0。一般q,m,n和p小于5。最常見的是m,n,p和q是1,o是0或1。
如本文所使用的，本發(fā)明的化合物被定義為包括其藥學(xué)上可接受的衍生物。＂藥學(xué)上可接受的衍生物＂意指本發(fā)明的化合物的任何藥學(xué)上可接受的鹽，酯，酯的鹽或其它衍生物，在施用到接受者后，它們能夠提供(直接或間接)本發(fā)明的化合物或抑制活性的代謝物或其殘基。特別有利的衍生物是這樣一些，當(dāng)這些化合物施用到哺乳動物中時，它們增加本發(fā)明的化合物的生物利用度(例如，使得通過口頭施用的化合物更易吸收進(jìn)血液)，或者，相對于母體種類，它們增強(qiáng)母體化合物向生物區(qū)室(例如，腦或淋巴系統(tǒng))的送遞。
本發(fā)明的化合物的藥學(xué)上可接受的鹽包括那些來源于藥學(xué)上可接受的無機(jī)和有機(jī)酸和堿的鹽。合適的酸的例子包括鹽酸，氫溴酸，硫酸，硝酸，高氯酸，富馬酸，順丁烯二酸，磷酸，乙醇酸，乳酸，水楊酸，琥珀酸，甲苯-對-磺酸，酒石酸，醋酸，檸檬酸，甲磺酸，乙磺酸，甲酸，苯甲酸，丙二酸，萘-2-磺酸和苯磺酸。其它酸，如草酸，當(dāng)本身不是藥學(xué)上可接受的時，可以用于制備在獲得本發(fā)明的化合物及其藥學(xué)上可接受的加成鹽中作為中間體有用的鹽。
來源于適當(dāng)?shù)膲A的鹽包括堿金屬(例如，鈉)，堿土金屬(例如，鎂)，銨以及N-(C1-4烷基)4+鹽。
本發(fā)明的化合物含有一個或多個不對稱碳原子，因此其以外消旋體和外消旋混合物，單個對映體，非對映體混合物以及單個非對映體出現(xiàn)。這些化合物的所有這樣的異構(gòu)體形式明顯地包括在本發(fā)明中。每一個產(chǎn)生立體異構(gòu)的碳可以具有R或S構(gòu)型。雖然在本申請中所例舉的特定化合物可以用一種特定的立體化學(xué)構(gòu)型描述，但也可以預(yù)見在任何給定的手性中心具有相反的立體化學(xué)的化合物或它們的混合物。
由本發(fā)明所預(yù)見的取代基組合和變體僅僅是導(dǎo)致形成穩(wěn)定的化合物的那些。如本文所使用的術(shù)語＂穩(wěn)定＂指這樣一些化合物，這些化合物具有足以允許制造的穩(wěn)定性，并且其在對用于本文詳細(xì)描述的目的(例如，哺乳動物的治療和預(yù)防性施用或在親和性層析應(yīng)用中)足夠的時間內(nèi)保持化合物的完整性。典型地，這樣的化合物在40℃或更低的溫度下，在缺乏水分或其它化學(xué)反應(yīng)條件時穩(wěn)定至少一周。
本發(fā)明的化合物可以以來源于無機(jī)或有機(jī)酸的鹽的形式使用。包括在這些酸加成鹽中的是，例如，下列鹽醋酸鹽，己二酸鹽，藻酸鹽，天冬氨酸鹽，苯甲酸鹽，苯磺酸鹽，硫酸氫鹽，丁酸鹽，檸檬酸鹽，樟腦氨酸鹽，樟腦磺酸鹽，環(huán)戊烷丙酸鹽，二葡糖酸鹽，十二烷基硫酸鹽，乙磺酸鹽，延胡索酸鹽，葡萄糖庚酸鹽，甘油磷酸鹽，半硫酸鹽，庚酸鹽，己酸鹽，氫氯化物，氫溴化物，氫碘化物，2-羥基乙磺酸鹽，乳酸鹽，馬來酸鹽，甲磺酸鹽，2-萘磺酸鹽，煙酸鹽，草酸鹽，雙羥萘酸鹽，果膠酯酸鹽，過二硫酸鹽，3-苯基丙酸鹽，苦味酸鹽，新戊酸鹽，丙酸鹽，丁二酸鹽，酒石酸鹽，硫氰酸鹽，甲苯磺酸鹽和十一酸鹽。
本發(fā)明也預(yù)見本文所公開的化合物的任何含堿性氮的基團(tuán)的季銨化。堿性氮可以與任何本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的試劑季銨化，例如，低級烷基鹵化物，如甲基，乙基，丙基和丁基氯化物，溴化物以及碘化物；二烷基硫酸鹽包括二甲基，二乙基，二丁基和二戊基硫酸鹽；長鏈鹵化物如癸基，月桂基，肉豆蔻基和硬脂酰氯化物，溴化物以及碘化物；和芳烷基鹵化物包括芐基和苯乙基溴化物。由這樣的季銨化可以獲得可由水或油溶解或者可由水或油分散的產(chǎn)品。
應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的化合物可以通過附加適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)基團(tuán)被修飾以增強(qiáng)其選擇性生物學(xué)性質(zhì)。這樣的修飾在本領(lǐng)域是已知的，包括增加生物性滲透到給定的生物區(qū)室(例如，血液，淋巴系統(tǒng)，中樞神經(jīng)系統(tǒng))，增加口服可利用度，增加溶解性使得可以經(jīng)注射施用，改變代謝和改變排泄速率的那些。
應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的化合物在溶液中，在藥物組合物中和體內(nèi)可以采用各種構(gòu)象和離子形式。雖然本發(fā)明的特定的化合物以特定構(gòu)象和離子形式在本文中描述，但是，這些化合物的其它構(gòu)象以及離子形式是由這些描述預(yù)見和包含的。
以下給出了IEM,PBM,MM,MS部分的進(jìn)一步詳細(xì)的描述。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的化合物通過選擇本文教導(dǎo)的部分的各種結(jié)構(gòu)，并將它們摻入到最終的化合物中來獲得。A．圖象增強(qiáng)部分(IEM)IEM可以是在成像中提供信號或差別的任何化學(xué)品或物質(zhì)。當(dāng)本發(fā)明的造影劑結(jié)合到蛋白質(zhì)上時，IEM信號特征上有改變，這種改變是可由外部檢測器檢測的。對于光學(xué)成像，其可以是在吸收、反射、熒光方面的變化，在它吸收峰數(shù)量上的增加或減少，或在它們的最大波長方面的變化，或者由外部檢測相應(yīng)于結(jié)合的IEM的任何其它變化。同樣地，對于MRI，其可以是在水質(zhì)子(1/T1或1/T2)或任何其它鄰近核的誘導(dǎo)馳豫速率方面的變化，或一個或多個峰的位移，或在IEM或PBM結(jié)合部位中的核出現(xiàn)的峰的NMR光譜中的信號強(qiáng)度方面的改變。
對本申請而言，＂MRI＂應(yīng)理解為包括磁共振光譜學(xué)技術(shù)。由磁共振光譜學(xué)產(chǎn)生的信號一般以化學(xué)位移(δ，以ppm為單位)的形式代替三維成像提供信息。一個特定的核的化學(xué)位移與它的化學(xué)環(huán)境有關(guān)。當(dāng)前藥是生物活化的時，在前藥之內(nèi)的核的化學(xué)位移將發(fā)生改變。
IEM可以包括有機(jī)分子，金屬離子，鹽或螯合物，簇狀體，粒子(特別是鐵粒子)或標(biāo)記的肽，蛋白質(zhì)，聚合物或脂質(zhì)體。對于紫外/可見/紅外/熒光光(光學(xué))成像，IEM也可以是任何有機(jī)或無機(jī)染料。特別有用的無機(jī)染料包括發(fā)光金屬復(fù)合體，如Eu(Ⅲ),Tb(Ⅲ)和其它鑭系離子(原子序數(shù)57-71)的那些。參見W.Dew.Horrocks & M.Albin,Progr.Inorg.Chem.(1984),31,pp.1-104。
一個特別有用的IEM是由一個或多個復(fù)合到一個或多個金屬離子上的環(huán)狀或非環(huán)狀有機(jī)螯合劑組成的一種藥學(xué)上可接受的金屬螯合化合物。光學(xué)成像的優(yōu)選的金屬離子包括具有原子序數(shù)13,21-34,39-42,44-50或57-83的那些。MRI的優(yōu)選的順磁金屬離子包括具有原子序數(shù)21-29,42,44或57-83的那些。
如果IEM是金屬螯合物，在成像劑通過體內(nèi)(包括組織，此處它能被生物修飾)期間金屬螯合物不應(yīng)該解離至任何顯著的程度。游離金屬離子的明顯釋放可以導(dǎo)致MRI或光學(xué)信號的大的改變，但也可以伴隨出現(xiàn)毒性，這將只是在病理組織中可接受的。優(yōu)選的是，生物活化不明顯地危害螯合物的穩(wěn)定性，以便金屬復(fù)合物可以保持完整并被排泄。對于動力學(xué)不穩(wěn)定性低的復(fù)合體，高的熱力學(xué)穩(wěn)定性(形成常數(shù)優(yōu)選地至少1015M-1，更優(yōu)選地至少1020M-1)是合乎需要的，以便最大限度地減少解離和它的伴隨毒性。對于動力學(xué)不穩(wěn)定性相對較高的復(fù)合體，解離可被最大限度地減少，具有較低的形成常數(shù)，即，優(yōu)選地10M-1或更大。
已知配位復(fù)合體的形成常數(shù)一般地不到1060，并且更典型地在1015至1040的范圍內(nèi)。具有合適的形成常數(shù)的配位復(fù)合體包括鐵腸桿菌素(形成常數(shù)1052;W.R.Harris等，美國化學(xué)會雜志(1981),103,p.2667)，鐵MECAMS(形成常數(shù)1041;W.R.Harris等，美國化學(xué)會雜志(1979),101,p.2213)，釓二亞乙基三胺五乙酸(＂DTPA＂)(形成常數(shù)1022.46;D.L.Wright等，分析化學(xué)(1965),37,pp.884-892)，釓(1,4,7,10-四氮雜環(huán)十四烯1,4,7,10-四乙酸(＂DOTA＂)(形成常數(shù)1025.3;K.Kumar等，無機(jī)化學(xué)(1993),32,pp.587-593)，釓DTPA-BMA(形成常數(shù)1016.9;W.P.Cacheris等，磁共振成像(1990),8pp.467-481)和釓EDTA(形成常數(shù)1017.3;D.L.Wright等，分析化學(xué)(1965)37,pp.884-892)。釓DTPA,DOTA,和DTPA-BMA的制劑被臨床用作MRI造影劑。
毒性也是復(fù)合物開放配位位點(diǎn)的數(shù)量的函數(shù)。配位位點(diǎn)越少，一般螯合劑釋放順磁物質(zhì)的趨勢越低.因此，優(yōu)選地，復(fù)合物含有兩個，一個或零個開放配位位點(diǎn)。一般來說，兩個以上的開放位點(diǎn)的存在將通過體內(nèi)釋放金屬離子不可接受地增加毒性。
為了有效地提高M(jìn)RI成像，復(fù)合物優(yōu)選地是能夠提高水質(zhì)子或其它成像或光譜核的1/T1(縱向或自旋-點(diǎn)陣)和/或1/T2(橫向或自旋-自旋)的弛豫速率，包括在其它生物分子上的或注射生物標(biāo)記上的質(zhì)子，P-31,C-13,Na-23或F-19。弛豫性R1和R2分別被定義為每mM金屬離子增加1/T1和/或1/T2的能力；單位是mM-1s-1。對于臨床MRI的最普通的形式，水質(zhì)子MRI，當(dāng)結(jié)合至螯合配體上的順磁離子仍然有一個或多個水交換的開放配位位點(diǎn)時，馳豫性是最佳的。參見S.M.Rocklage等＂在磁共振中的造影劑＂，磁共振成像，第二版，第1卷，第14章(1992),Mosby-Year Book公司；R.B.Lauffer，化學(xué)評論(1987),87,pp.901-927。
除經(jīng)由偶極-偶極相互作用增加組織核的1/T1和/或1/T2外，MRI劑可以影響兩個其它磁性性質(zhì)，并且因此是臨床上有用的1)．鐵粒子或高磁化率的金屬螯合物，特別是Dy,Gd或Ho的螯合物，可以通過產(chǎn)生顯微鏡下的磁化率梯度來改變組織的MRI信號強(qiáng)度。參見，Villringer等，磁共振方法(1988),6,pp.164-174。就這一應(yīng)用而言，在螯合物上不需要任何開放的配位位點(diǎn)。
2)．鐵粒子或金屬螯合物也可以用來變換水質(zhì)子或其它成像或光譜核的共振頻率，包括在其所結(jié)合的注射藥劑或蛋白質(zhì)上的質(zhì)子，P-31,C-13,Na-23或F-19。在這里，取決于核與所使用的策略，可以使用零至三個開放配位位點(diǎn)。
優(yōu)選的順磁金屬選自下組Gd(Ⅲ),Fe(Ⅲ),Mn(Ⅱ)和Mn(Ⅲ),Cr(Ⅲ),Cu(Ⅱ),Dy(Ⅲ),Tb(Ⅲ),Ho(Ⅲ),Er(Ⅲ)和Eu(Ⅲ)。最優(yōu)選的是Gd(Ⅲ)。
有機(jī)螯合配體應(yīng)該是生理相容的。螯合配體的分子大小應(yīng)該與順磁金屬的大小相容。這樣，釓(Ⅲ)(其具有0.938A的晶體離子半徑)比鐵(Ⅲ)(其具有0.64A的晶體離子半徑)需要更大的螯合配體。
許多MRI藥劑的合適的螯合配體是本領(lǐng)域已知的。這些也可以用于金屬螯合物的其它生物成像形式。對于MRI成像，優(yōu)選的IEM包括
本領(lǐng)域已知在某些應(yīng)用中，其它金屬可以替代Gd3+。
也可以預(yù)期的是，IEM可以包括藥學(xué)上可接受的鹽。本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的鹽包括來源于無機(jī)或有機(jī)酸和堿的那些。其中所包括的酸加成鹽如下醋酸鹽、己二酸鹽、海藻酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環(huán)丙烷-丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、延胡索酸鹽、葡萄糖庚酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、已酸鹽、氫氯化物、氫溴化物、氫碘化物、2-羥基乙磺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、草酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酯酸鹽、過二硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、丁二酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽和十一酸鹽。堿加成鹽包括銨鹽，堿金屬鹽(如鈉和鉀鹽)，堿土金屬鹽(如鈣，鎂和鋅鹽)，與有機(jī)堿的鹽(如二環(huán)己基胺鹽，N-甲基。-D-葡糖胺)和與氨基酸(如精氨酸，賴氨酸等)的鹽。并且，含堿性氮的基團(tuán)可以由低級烷基鹵化物(如甲基，乙基，丙基和丁基氯化物，溴化物以及碘化物)，二烷基硫酸鹽(如二甲基，二乙基，二丁基和二戊基硫酸鹽)，長鏈鹵化物(如癸基，月桂基，肉豆蔻基和硬脂?；然?，溴化物以及碘化物)，芳烷基鹵化物(如芐基和苯乙基溴化物等)之類的試劑季銨化。由此獲得水或油可溶性或可分散性產(chǎn)物。優(yōu)選的IEM鹽是N-甲基-D-葡糖胺，鈣和鈉鹽。B．蛋白質(zhì)結(jié)合部分(PBM)本發(fā)明的造影劑的PBM對藥劑與一種或多種在包含生物學(xué)活性的組織內(nèi)的蛋白質(zhì)的結(jié)合有貢獻(xiàn)。這一非共價結(jié)合應(yīng)該足夠緊密，PBM的結(jié)合部位的總數(shù)量應(yīng)該足夠大，以便在具有靶向生物學(xué)活性的不同的水平的組織之間產(chǎn)生差異。
合適的PBM的例子包括藥物，親脂或兩親性有機(jī)分子，卟啉，受體配體，類固醇，脂質(zhì)，激素，肽，蛋白質(zhì)，寡核苷酸(DNA,RNA或其化學(xué)修飾的形式)，抗體(包括單克隆抗體和遺傳工程改造過的形式或其片段)或其它生物分子或已知在包含成像所需的生物學(xué)活性的組織中結(jié)合一種或多種蛋白質(zhì)的物質(zhì)。
優(yōu)選的PBM是在血漿中可逆地結(jié)合蛋白質(zhì)，間質(zhì)間隙(細(xì)胞之間的液體)或胞內(nèi)間隙的那些。雖然可以使用結(jié)合蛋白質(zhì)的任何生物分子或物質(zhì)時，但最有用是結(jié)合以高濃度存在的或具有生物分子或物質(zhì)的大量結(jié)合部位的蛋白質(zhì)的那些。這提供臨時“捕集”大量的由生物學(xué)活性催化產(chǎn)生的修飾劑的能力。結(jié)合的可逆性質(zhì)增加了藥劑最終被排泄(成像劑的一種十分理想的性質(zhì))的可能性。
優(yōu)選的蛋白質(zhì)的例子是人血清白蛋白(HSA)(在血漿中0.7mM，在間質(zhì)間隙中更低的濃度)；脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP；也稱為Z-蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)A)，(在肝，腎，心臟和其它組織的初級細(xì)胞中約0.1mM)；谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST，也被稱為配體蛋白),(在肝，腎，心臟和其它組織的初級細(xì)胞中約0.1mM);α1-酸性糖蛋白(AAG,MW 41,000)(0.55g-1.4g/L)和脂蛋白(在動脈粥樣斑塊中濃縮的)。其它優(yōu)選的例子包括胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白(膠原，層粘連蛋白，彈性蛋白，纖連蛋白，巢蛋白，玻連蛋白)，淀粉狀蛋白(包括阿耳茨海默氏病的β-2淀粉狀蛋白(A4))，蠟樣質(zhì)(或脂褐質(zhì))和糖蛋白(例如，骨粘連蛋白，腱生蛋白和血小板反應(yīng)蛋白)。
荷正電的造影劑或包含堿性PBM的造影劑的一種更優(yōu)選的蛋白質(zhì)是α1-酸性糖蛋白(AAG)。這一陽性急相蛋白的血漿水平明顯地隨疾病的狀態(tài)變化。例如，在炎性刺激后，AAG的濃度增加兩至四倍，并且AAG的血漿水平已說明為神經(jīng)膠質(zhì)瘤，轉(zhuǎn)移性乳腺癌和其它癌癥，新生期感染和慢性疼痛的預(yù)后的輔助指標(biāo)。提高的水平在動脈粥樣硬化，Chron's病，心肌梗塞，腎炎和細(xì)菌，病毒和手術(shù)后感染中觀察到。結(jié)合AAG的配體包括許多堿性藥物，如普萘洛爾(Ka=11.3x105)，丙咪嗪(Ka=2.4x105)和氯丙嗪(Ka=35.4x105)，因此它們可以用作為PBM。
HSA,FABP和GST的配體是更加優(yōu)選的PBM，由于這些物質(zhì)趨于中性，具有部分帶負(fù)電荷的基團(tuán)(例如，酯，酰胺或酮羰基氧)；一般來說，這樣的化合物比帶正電荷的分子毒性較小。對于設(shè)計來結(jié)合FABP或GST的活化的藥劑，模仿天然配體(如棕櫚酸)的疏水長鏈PBM或含有環(huán)的PBM(例如吲哚花青綠)是優(yōu)選的。
在這三種蛋白質(zhì)中，HSA是高度優(yōu)選的，因為HSA配體，不同于FABP和GST配體，在結(jié)合之前不需要任何胞內(nèi)攝取。不需要任何胞內(nèi)攝取HSA配體，因為HSA以足夠的量存在于許多胞外的液體環(huán)境中，包括血漿，正常和癌變組織的間質(zhì)間隙，滑液，腦脊髓液和炎性或膿腫液體。在許多病理組織(如，腫瘤，炎癥，動脈粥樣斑塊或動脈粥樣硬化的動脈壁)中，毛細(xì)管是滲漏的，甚至導(dǎo)致更高的局部HSA水平。
為什么HSA是高度優(yōu)選的另一個理由是每一個蛋白質(zhì)分子具有大量配體結(jié)合部位。參見U.Kragh-Hansen，藥理學(xué)評論(1981),33,pp.17-53;X.M.He等，自然(1992),358,pp.209-215;D.C.Carter，蛋白質(zhì)化學(xué)進(jìn)展(1994),45,pp.153-203。
在美國專利4,880,008和美國專利申請08/382,317(1995年2月1日申請)中討論了合適的PBM的設(shè)計。對結(jié)合HSA，各種疏水或兩親性物質(zhì)都可以起PBM的作用。這些物質(zhì)包括但不限于脂肪族基團(tuán)，烷氧基或烷硫基，烷羰基，烷羰氧基，芳基或雜環(huán)基，這些基團(tuán)具有1至60個碳和選擇性的一個或多個氮，氧，硫，鹵素，脂肪族，酰胺，酯，氨磺酰，?；撬猁}，磷酸鹽，羥基或有機(jī)金屬取代基。此外，PBM可以是包含疏水氨基酸殘基和/或有或沒有疏水或親水末端基團(tuán)的取代基的肽。
將親脂基團(tuán)添加進(jìn)造影劑很可能減少藥劑的溶解性。為了保持造影劑的有效溶解性在臨床有效劑量水平上或更高，優(yōu)選地可以將一個或多個氫鍵合基團(tuán)(氧，氮，等)摻加進(jìn)PBM。
雖然純粹的脂肪族基團(tuán)可以用作PBM，但這些不如混合的脂肪族-芳香族基團(tuán)或純粹的芳基基團(tuán)那樣理想。尤其是在負(fù)電荷連接到長的和可變的脂肪族基團(tuán)的末端上時，造影劑容易破壞膜蛋白和脂質(zhì)之間的相互作用。這可以增加藥劑的毒性。這樣優(yōu)選的是PBM含有至少一個芳環(huán)。
在用于組織增強(qiáng)的HSA-結(jié)合的MRI藥劑的情況下，對造影劑而言，優(yōu)選地是含有兩個或多個親脂基團(tuán)，以便在結(jié)合到蛋白質(zhì)上時完全固定藥劑。這些基團(tuán)可以在一個PBM上或作為兩個或多個連接到造影劑上的分離的化學(xué)基團(tuán)。由于它們的龐大的性質(zhì)和剛性，高度更優(yōu)越的是，兩個或多個基團(tuán)每一個都含有芳環(huán)，具有兩個或多個以剛性非平面取向排列的環(huán)。
適于摻入本發(fā)明的前藥造影劑的優(yōu)選的PBM包括下列結(jié)構(gòu)
其中R包含脂肪族基團(tuán)和/或至少一個芳環(huán)或包含含有疏水氨基酸殘基和/或有或沒有疏水或親水末端基團(tuán)的取代基的肽。
磁共振現(xiàn)象是復(fù)雜的和不同的順磁材料把MRI信號改變成各種程度。參見R.B.Lauffer，化學(xué)評論(1987),87,pp.901-927。造影劑釋放水質(zhì)子的能力和由此影響MRI成像的能力的定量測定由其弛豫活性提供。弛豫活性取決于依賴溶液中順磁金屬離子濃度的水質(zhì)子信號強(qiáng)度。弛豫活性被定義為每單位時間誘導(dǎo)的T1或T2弛豫(R1或R2以mM-1秒-1為單位)，在藥劑的濃度以微摩爾(mM)表示時。
釓復(fù)合物的物理性質(zhì)影響造影劑的弛豫活性。結(jié)合到釓復(fù)合物上的水分子的數(shù)量，水分子與本體溶液的交換率，七個未配對電子的弛豫時間和溶液中造影劑的旋轉(zhuǎn)翻滾時間(稱為旋轉(zhuǎn)相關(guān)時間)都對全面觀察的弛豫活性有影響。在這些物理性質(zhì)方面的改變可以顯著地改變弛豫活性。例如，把小分子量的釓螯合物結(jié)合到大的高分子上減緩旋轉(zhuǎn)翻滾時間，并且提高弛豫增強(qiáng)3-10倍。造影劑結(jié)合到蛋白質(zhì)上導(dǎo)致順磁離子和水質(zhì)子之間的磁性統(tǒng)計漲落，發(fā)生在與拉莫爾頻率相同的時標(biāo)上，產(chǎn)生最有效的縱向(T1)弛豫可能性和最高可能性的弛豫活性。這樣，MRI造影劑對大的高分子(如蛋白質(zhì))的非共價結(jié)合是增加MRI信號的有效方法。圖象差別在具有不同水平的非共價結(jié)合的活化劑的區(qū)域之間產(chǎn)生。
對產(chǎn)生正常和異常組織之間的生物活性-相關(guān)差別而言，應(yīng)該存在前藥的蛋白質(zhì)-結(jié)合親和性和生物活化藥劑的蛋白質(zhì)-結(jié)合親和性之間的實質(zhì)上的區(qū)別。前藥結(jié)合親和性為活化的藥劑的結(jié)合親和性的80％或更低是合乎需要的。例如，如果活化的藥劑在生理相關(guān)條件下是90％結(jié)合到含有生物學(xué)活性的組織內(nèi)的蛋白質(zhì)上的(即對MRI和光學(xué)成像，在血漿中造影劑濃度為0.01-10mM)，則前藥在相同的條件下應(yīng)該是72％或更少結(jié)合的。優(yōu)選的是，前藥顯示出活化的藥劑的結(jié)合親和性的50％或更低，更優(yōu)選地是40％或更低，更優(yōu)選地是30％或更低，更優(yōu)選地是20％或更低，最優(yōu)選地是10％或更低。
在MRI中，在正常和異常組織之間的生物活性-相關(guān)差別可以以水質(zhì)子的誘導(dǎo)的弛豫率(1/T1或1/T2)或弛豫活性R1和R2上的改變表示。在本發(fā)明中，前藥弛豫活性R1合乎需要的是生物活化的藥劑的R1的80％或更低。優(yōu)選的前藥弛豫活性R1是生物活化的藥劑的馳豫活性R1的50％或更低，更優(yōu)選的是20％或更低，最優(yōu)選地是10％或更低。
造影劑的蛋白質(zhì)結(jié)合可以采用緩沖液中生理相關(guān)蛋白質(zhì)濃度經(jīng)平衡透析或超濾體外估價。參見，G.N.Rolinson和R.Sutherland，英國藥物化療雜志(1965),25,p638(超濾)；D.Glick，生物化學(xué)分析方法(1956),3,p.265(平衡透析)。在本申請中提出的蛋白質(zhì)結(jié)合測定是利用在磷酸鹽緩沖鹽水(0.15 NaCl,10mM磷酸鹽，pH7.4)中的4.5％(w/w)人血清白蛋白經(jīng)超濾測定。優(yōu)選地至少10％，更優(yōu)選地至少50％，更優(yōu)選地至少80％，最優(yōu)選地至少95％的活化的蛋白質(zhì)-結(jié)合造影劑在生理相關(guān)條件下結(jié)合到蛋白質(zhì)上。在本申請中，造影劑對HSA的百分結(jié)合測定具有約+/-5％的誤差?？梢砸砸环N類似的方式評估結(jié)合到其它蛋白質(zhì)或血清上的蛋白質(zhì)。
通過在HSA的存在下測定弛豫活性-結(jié)合(R1-結(jié)合)可以估價藥劑已被調(diào)節(jié)到最大弛豫活性的程度。這需要測定游離螯合物的弛豫活性(R1-游離)以及弛豫活性(R1-觀察)和藥劑在4.5％HSA中的百分結(jié)合。R1-觀察是R1-游離和R1-結(jié)合的摩爾份數(shù)權(quán)重平均R1-觀察=(游離組分*R1-游離)+(結(jié)合組分*R1-結(jié)合)因此R1-結(jié)合=[R1-觀察-(游離組分*R1-游離)]/結(jié)合組分也可以在理論上評價配體的蛋白質(zhì)結(jié)合。對于配體的一個普通類別，對HSA和其它蛋白質(zhì)的結(jié)合親和性一般地由PBM的疏水性所增加。取代基(如PBM)的疏水性的理論估價可以通過利用取代基的Hanschπ常數(shù)計算PBM自身對log辛醇-水(或辛醇緩沖液)分配系數(shù)(logp)的貢獻(xiàn)獲得。參見A.Leo和C.Hansch,＂分配系數(shù)和它們的用途＂化學(xué)評論，71,pp.525-616(1971);K.C.Chu,＂結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系的定量分析＂Burger＇s醫(yī)學(xué)化學(xué)，第一部分，pp.393-418，(第4版1980)。結(jié)合親和性將隨著對logp貢獻(xiàn)的增加而增加。例如，對于在脂肪族基團(tuán)上的取代基，可以使用下列π常數(shù)
基團(tuán) π-脂肪族CH30.50苯基 2.15對于在芳基基團(tuán)上的取代基，可以使用下列π常數(shù)基團(tuán) π-脂肪族CH30.56CH2CH31.02苯基 1.96C(CH3)31.98這樣，連接到IEM上的對甲基苯甲基基團(tuán)的logp貢獻(xiàn)將采用下式計算(對-CH2-基團(tuán)，采用π-脂肪族CH3的值計算)logp貢獻(xiàn)=0.50+2.15+0.56=3.21連接到IEM上的對-[4-(叔-丁基)-苯基]苯甲基基團(tuán)的logp貢獻(xiàn)將采用下式計算(對-CH2-基團(tuán)，采用π-脂肪族CH3的值計算)logp貢獻(xiàn)=0.56+2.15+2.15+1.98=6.84在對HSA的結(jié)合中，需要最小logp貢獻(xiàn)2(等同于四個CH3基團(tuán)或一個苯環(huán))來獲得明顯的結(jié)合。優(yōu)選的是logp貢獻(xiàn)4或更多。更優(yōu)選的是logp貢獻(xiàn)6或更多。
在光學(xué)成像中，本發(fā)明需要在非蛋白結(jié)合前藥和生物活化的蛋白質(zhì)結(jié)合的造影劑的光學(xué)性質(zhì)之間有可測定的差別。例如吲哚花青綠的最大吸收在結(jié)合到血漿或血液中的蛋白質(zhì)上后從770-780移動到790-805nm。這一差別用于通過成像或檢測蛋白質(zhì)-結(jié)合的活化的光學(xué)成像劑來檢測生物學(xué)活性。如同在MRI的情況下一樣，對光學(xué)藥劑的生物活化的前藥的利用增加藥劑的特異性。C．修飾部位(MS)在前藥上的修飾部位(MS)結(jié)構(gòu)域由成像所需的特定生物學(xué)活性改變。這一改變(其是生物轉(zhuǎn)化(酶促或其它方式)，如鍵切割，鍵形成，氧化，還原或質(zhì)子化/脫質(zhì)子)導(dǎo)致產(chǎn)生生物活化的藥劑。MS可以是IEM或PBM固有的一部分(只要它不反向影響它們各自的功能)或者它可以構(gòu)成一個單獨(dú)的取代基。本領(lǐng)域技術(shù)人員會清楚可以由生物學(xué)活性改變的MS的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
優(yōu)選的MS是能夠在體內(nèi)被酶改變的那些。對修飾本發(fā)明的前藥有用的酶是在哺乳動物或感染性微生物(細(xì)菌，酵母，病毒，等等)中表達(dá)的那些，其促進(jìn)前藥中一個或多個鍵的修飾或切割。酶分子和它們相關(guān)的體內(nèi)抑制劑的表達(dá)對組織類型或其狀況十分敏感。高度優(yōu)選的修飾部位是由酶改變的那些，所說的酶在患者中具有提高的水平或活性，這些患者患有炎癥性疾病，傳染病，癌，粥樣硬化，血栓癥，心肌梗塞，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，骨關(guān)節(jié)炎，子宮內(nèi)膜異位，牙周疾病，自身免疫疾病等。在酶促生物學(xué)活性的情況下，MS化學(xué)結(jié)構(gòu)將與酶的天然或最佳底物的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。天然或最佳底物是公知的，并且在文獻(xiàn)中有描述或可以用標(biāo)準(zhǔn)的生化技術(shù)確定。
優(yōu)選的修飾部位包括被EC類別的稱為水解酶的酶(EC 3.1.*.*到EC3.99.*.*)切割的那些。這些修飾部位包括在適當(dāng)?shù)拿缸饔孟卤凰馇懈畹奶?氧，碳-氮，磷-氧，碳-碳以及其它鍵。更優(yōu)選的修飾部位包括磷-氧鍵，其由被稱為磷酸酯酶的酶(EC.3.1.3.*，類，水解酶；亞類，酯酶；亞-亞類，磷酸單酯酶)切割。特定的磷酸酶和它們的常用名的例子在以下表1中列出。
表Ⅰ
磷-氧MS部位的特定的例子是包含在前藥MRI造影劑1中的那些。這樣的磷酸單-酯衍生物被堿性磷酸酶迅速水解，產(chǎn)生產(chǎn)物醇(或酚)與磷酸鹽(PO42-)。在這一特定的情況下，磷酸單-酯前藥1結(jié)合HSA不如結(jié)合其酶促裂解產(chǎn)物(相應(yīng)的醇)強(qiáng)烈。作用于磷-氧MS部位的酶的臨床相關(guān)性由酸性磷酸酶的情況所例證，其在前列腺癌患者中具有提高的水平，幾十年來已廣泛地用于診斷，分段和監(jiān)測前列腺癌。
其它優(yōu)選的修飾部位包括由硫酸酯酶(EC 3.1.6.*；類，水解酶；亞類，酯酶；亞-亞類，硫酸酯酶)切割的那些，該酶切割硫-氧鍵。類固醇硫酸酯酶活性在乳腺腫瘤中特別高，并且在腫瘤中起到調(diào)節(jié)雌激素形成的作用。能夠改變硫酸鹽MS部位的硫酸酯酶和它們的EC編號列在以下表2中。
表Ⅱ
高度優(yōu)選的MS是由被稱為蛋白酶的水解酶亞類(EC3.4.*.*)水解的碳-氮肽鍵。這些酶水解酰胺鍵，形成兩種切割產(chǎn)物，胺和羧酸，其中之一保持連接到生物活化的藥劑上。MS設(shè)計來模仿待成像的特異性酶促活性天然或最佳肽底物。
尤其優(yōu)選的碳-氮肽MS是由絲氨酸蛋白酶(EC3.4.21.*；類，水解酶；亞類，肽酶，亞-亞類，絲氨酸內(nèi)肽酶)水解的那些。絲氨酸蛋白酶活性已經(jīng)與原發(fā)性乳腺癌，導(dǎo)致乳腺癌轉(zhuǎn)移的腫瘤發(fā)展，肺癌患者的凝固活化，胰腺癌，嚴(yán)重的胰腺炎和前列腺癌相聯(lián)系。對前列腺癌的診斷劑有用的MS是由前列腺-特異性抗原(PSA)改變的MS，一種前列腺組織專性產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶糖蛋白(30-34 kDa)。PSA顯示出肽酶胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的典型的酶促活性，同時它的生理底物表現(xiàn)出是高分子量生殖泡蛋白質(zhì)(HMM-SV-蛋白質(zhì))。PSA對監(jiān)測治療來說特別有用，特別是前列腺切除術(shù)，因為在切除前列腺后它的存在減少至幾乎為零。前列腺切除術(shù)后，PSA緩慢升高，表明不是所有的前列腺都被切除或者存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，并且產(chǎn)生抗原。PSA的濃度也與腫瘤負(fù)擔(dān)或潛在的惡性病變成比例，并且作為對治療的響應(yīng)迅速改變。特定的絲氨酸蛋白酶和它們的常用名在以下表Ⅲ中列出。
表Ⅲ
優(yōu)選的MS是由基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)(EC*3.4.24.*，亞類，肽酶；亞-亞類，金屬內(nèi)肽酶)改變的那些，該酶在胞外間隙，造影劑容易進(jìn)入的組織區(qū)室中顯示出高的生物學(xué)活性。此外，MMP活性由許多疾病改變。在不同的程度上，MMP家族的成員與下列疾病相聯(lián)系癌癥(特別是在轉(zhuǎn)移之前胞外基質(zhì)的降解中)，粥樣硬化(特別是在導(dǎo)致疝，血栓形成和心肌梗塞或不穩(wěn)定的心絞痛的動脈粥樣斑塊的纖維性帽的降解中)，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎(破壞軟骨聚集蛋白聚糖和膠原)，牙周疾病，發(fā)炎，自身免疫疾病，器官移植排斥，潰瘍(角膜的，表皮的和胃的)，硬皮馬勃屬病，大皰性表皮松解，子宮內(nèi)膜異位，腎疾病和骨疾病。特定的金屬蛋白酶和它們的常用名在以下表Ⅳ中列出。
表Ⅳ
在靶向生物學(xué)活性是由MMP-1(一種在某些炎癥疾病中提高的基質(zhì)金屬蛋白酶)表達(dá)的酶促活性的情況下，優(yōu)選的MS是連接氨基酸甘氨酸(Gly)與異亮氨酸(Ile)的碳-氮酰胺鍵。包含Gly-Ile酰胺鍵MS部位的前藥的例子是前藥化合物2。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚的是，其它類型的MS(例如酯，醚)被適當(dāng)?shù)陌忻杆?，如分類為酯?EC3.1.*.*)或者醚水解酶(EC3.3.*.*)的那些，并且基于靶酶的化學(xué)知識，可以將最佳的MS摻加進(jìn)前藥。
在某些情況下，理想的是，修飾部位的改變之后，接著一個第二化學(xué)反應(yīng)，以產(chǎn)生活化的造影劑。對設(shè)計來結(jié)合HSA的那些藥劑，中性或帶負(fù)電荷的PBM優(yōu)于帶正電荷的PBM(參見美國專利4,880,008)。這樣，對活化結(jié)合HSA的造影劑尤其優(yōu)選的方法是第二化學(xué)反應(yīng)，其將帶正電荷的MS切割殘基轉(zhuǎn)化為中性的或帶負(fù)電荷的基團(tuán)。這增加了藥劑的疏水性(增加logP)，并且傾向于增加HSA結(jié)合。D．掩蔽部分(MM)當(dāng)存在于本發(fā)明的前藥中時，MM在生物活化時從前藥切割下來。MM可以是任何有機(jī)或無機(jī)部分，當(dāng)其在適當(dāng)?shù)奈恢脫饺氲角八幹袝r，與生物活化的造影劑相比，減少前藥的蛋白質(zhì)結(jié)合親和性。
合適的MM的例子包括聚乙二醇，葡聚糖，透明質(zhì)酸或改變PBM表面電荷或疏水性的其它物質(zhì)。這樣的材料已廣泛地用來在血液中阻止大分子量物質(zhì)(例如，聚合物，蛋白質(zhì)或脂質(zhì)體)與細(xì)胞表面的相互作用。例如，連接到脂質(zhì)體上的聚乙二醇(PEG)阻止細(xì)胞攝取進(jìn)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，導(dǎo)致脂質(zhì)體遲長的循環(huán)。參見D.Paphadjopoulos等，國家科學(xué)院院報(1991),88,pp.11460-11464；T.M.Allen等，生物化學(xué)生物物理學(xué)報(1991),1066,pp.29-36。
對于低分子量(＜5000道爾頓)前藥造影劑，親水和/或荷電基團(tuán)可以同樣地被利用。這樣的基團(tuán)可以正確地位于MM/接頭內(nèi)，以便它們有效地掩蔽蛋白質(zhì)結(jié)合，生物活化后被釋放，由此使得增加待表達(dá)的IEM/PBM的結(jié)合能力。對于設(shè)計來在生物活化后結(jié)合血清蛋白質(zhì)(如HSA)的造影劑，親水和/或荷電基團(tuán)如羥基，胺(或銨)，季銨，某些氨基酸(尤其是賴氨酸，精氨酸，和組氨酸)，亞砜，磷酸鹽，硫酸鹽，羧酸鹽，碳水化合物，糖和金屬螯合物(以單一或多種構(gòu)型)代表潛在有效的MM。
影響HSA結(jié)合親和性的親水和/或荷電基團(tuán)的例子在本領(lǐng)域中有描述。碘化的X-射線造影劑的HSA結(jié)合由羥基的合理取代與羧酸鹽基團(tuán)的消去所掩蔽。例如，X-射線造影劑膽影酸以高親和性(大于98％)結(jié)合到HSA上，而對應(yīng)的中性碘化X-射線造影劑(其經(jīng)修飾含有許多親水羥基基團(tuán))以低的親和性(小于1％)結(jié)合到HSA上。參見放射性造影劑，M.Sovak編，Springer-Verlag，紐約(1984)，第1章＂X-射線造影介質(zhì)＂，pp.23-125。同樣地，當(dāng)親水羥基基團(tuán)的數(shù)量增加時，發(fā)現(xiàn)一系列膽汁酸衍生物的HSA結(jié)合親和性降低。這樣，石膽酸(結(jié)合常數(shù)=2.0×105)比鵝脫氧膽酸(結(jié)合常數(shù)=5.5×104)結(jié)合更緊密，并且比膽酸(結(jié)合常數(shù)=0.3×104)結(jié)合更緊密。參見Roda等，脂質(zhì)研究雜志(1982),23,pp.490-495。
適當(dāng)位置的伯，仲或叔胺已經(jīng)顯示出降低某些抗生素的HSA結(jié)合親和性(與缺乏這一功能的類似藥物相比)。這一作用由一些新抗生素(依諾沙星和NY-198)的所報道的數(shù)據(jù)說明。參見E.Okezaki等，藥物代謝和處置(1988),16,pp.865-74。與缺乏胺基團(tuán)的類似物米洛沙星(fb=0.86)和萘啶酮酸(fb=0.71)比較，這些結(jié)合到HSA上的化合物的分?jǐn)?shù)(fb)分別被報道為0.35和0.28。
這樣，在本發(fā)明的優(yōu)選的前藥中，IEM包括Gd3+的DTPA,DOTA,DTPA-BMA或HP-DO3A螯合物；PBM包含下列結(jié)構(gòu)中一個或多個
其中R包含脂肪族基團(tuán)和/或至少一個芳環(huán)，或者包含含有疏水氨基酸殘基和/或有或沒有疏水或親水末端基團(tuán)的取代基的肽；和MS包含能夠在體內(nèi)被水解酶改變的鍵。
優(yōu)選地，MS是能夠在體內(nèi)被磷酸酶水解的磷-氧鍵或能夠在體內(nèi)被金屬蛋白酶或絲氨酸蛋白酶水解的酰胺鍵。本文所確定的釓復(fù)合物1，釓復(fù)合物2和釓復(fù)合物10是優(yōu)選的前藥的例子。Ⅲ．合成本發(fā)明的化合物可以利用常規(guī)技術(shù)合成。有利地，這些化合物方便地從容易獲得的起始材料合成。許多起始材料是市售的，例如，從Aldrich化學(xué)公司，密爾沃基，WI獲得。雖然用于本發(fā)明的化合物的合成的方法是有機(jī)合成領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知道的，提出下列一般性方法以說明這些合成。這些方法不應(yīng)該被看作以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
在文獻(xiàn)中描述了DTPA和DOTA螯合劑的合成，這些螯合劑是由用于將所形成的螯合物共價連接到蛋白質(zhì)上的有機(jī)取代基修飾的，所說的蛋白質(zhì)包括單克隆抗體。例如，1-(對-異硫氰酸基芐基)DTPA由市售的對-硝基苯基丙氨酸甲酯(Aldrich化學(xué)公司)與乙二胺反應(yīng)，隨后用硼烷還原形成三胺來制備。用溴乙酸的烷基化后還原(H2/Pd-C)，與硫光氣反應(yīng)給出異硫氰酸鹽。參見M.W.Brechbiel等，無機(jī)化學(xué)(1986),25,pp.2772-2781。也已經(jīng)報道了其中DTPA碳骨架已經(jīng)由衍生自賴氨酸的氨丁基所取代的螯合劑。參見J.P.L.Cox等，化學(xué)學(xué)會雜志Perkin報告書I(1990),pp.2567-2576。也已經(jīng)描述了經(jīng)由對-硝基苯基丙氨酸的雙烷基化合成乙酸基取代的DTPA分子的方法。參見M.A.Williams等，有機(jī)化學(xué)雜志(1993),58,pp.1151-1158。同樣地，功能化的大環(huán)DOTA分子已經(jīng)從氨基酸開始和用標(biāo)準(zhǔn)的環(huán)化技術(shù)制備，所說的技術(shù)包括Richman-Atkins甲苯磺酸酯化學(xué)(J.P.L.Cox等，化學(xué)學(xué)會雜志Perkin報告書I(1990),pp.2567-2576)或高-稀釋環(huán)形成(T.J.McMurry等，生物綴合物化學(xué)(1992),pp.108-117。
包含親脂芐基取代基的肝膽管MRI造影劑的合成在美國專利4,899,755中描述。包含PBM和血液半衰期延長部分的MRI造影劑在美國申請08/382,317(申請日1995年2月1日)中描述。該申請描述了通過磷酸二酯鍵合成連接到PBM上的DTPA螯合劑的方法以及合成-些多用途中間體的方法，這些中間體包括碳酸鹽羥甲基二亞乙基三胺(化合物3)和1-羥甲基-DTPA-五-叔-丁基酯(化合物4)(方案1)。
用于制備前藥造影劑的其它的多用途合成中間體包括l-對-羥苯甲基-二亞乙基三胺(化合物6)。參見Schumhmann-Giampieri,G.Radiology(1992),183,pp.59-64。通過用叔-丁基溴乙酸酯烷基化(方案1)，化合物6轉(zhuǎn)化為l-(對-羥苯甲基)-DTPA-五-叔-丁基酯，化合物7方案1合成中間體
氨基甲酸酯5或五-叔-丁基酯中間體4和7在單個步驟中由PBM基團(tuán)衍生化，所說的PBM基團(tuán)摻入所需的功能結(jié)構(gòu)域(MS,MM,L)以及本領(lǐng)域已知的與羥基或苯酚基形成共價鍵的官能團(tuán)，例如，醚通過烷基鹵化物與醇反應(yīng)形成或二乙基重氮基二羧酸酯(DEAD)與仲醇的催化反應(yīng)形成。參見J.March，高級有機(jī)化學(xué)，第三版，John Wiley和Sons(1995),p.1161，其它適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)和共價鍵。此外，MS以及可有可無的MM和/或L結(jié)構(gòu)域以逐步方式添加至PBM上。例如，包含反應(yīng)性烷基鹵化物和第二適當(dāng)保護(hù)的反應(yīng)性基團(tuán)(例如，羥基或羧基)的PBM經(jīng)由醚鍵形成偶聯(lián)到DTPA-五-叔-丁基酯上。對反應(yīng)性基團(tuán)進(jìn)行瞬時保護(hù)可以用本領(lǐng)域已知的方法完成。參見，例如，Greene,T.W.和Wuts,P.G.M.，有機(jī)合成中的保護(hù)基，第二版_1991 John Wiley和Sons,Inc.,New York,NY pp.10-276。然后，使第二反應(yīng)性基團(tuán)脫保護(hù)，并修飾以添加所需的MS或MS和MM兩者。采用酸(HCl或TFA)使叔-丁基酯保護(hù)基最后脫保護(hù)產(chǎn)生五酸的游離配體，然后，其與釓(Ⅲ)和堿反應(yīng)，以形成釓復(fù)合物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，以上的合成方案不是用來包括可以合成本申請中所描述和要求的化合物的所有方法的全部內(nèi)容。其它方法對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是明顯的。Ⅳ．改進(jìn)的造影劑的用途可預(yù)期的是可以制備藥物組合物，其包含本發(fā)明的任何前藥或其藥學(xué)上可接受的鹽，以及任何藥學(xué)上可接受的載體，佐劑或賦形劑。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體，佐劑或賦形劑”指可以與本發(fā)明的化合物一道施用于患者而不破壞它們的活性的載體或佐劑，這些載體或佐劑在以足以傳送有效量的藥劑的劑量施用時，是非毒性的?？梢杂糜诒景l(fā)明的藥物組合物的藥學(xué)上可接受的載體，佐劑及賦形劑包括但不限于，離子交換劑，氧化鋁，硬脂酸鋁，卵磷脂，血清蛋白(如人類血清白蛋白)，緩沖物質(zhì)(如磷酸鹽)，甘氨酸，山梨酸，山梨酸鉀，TRIS(三(羥甲基)氨基-甲烷)，飽和的蔬菜脂肪酸的偏甘油酯混合物，水，鹽或電解質(zhì)，例如魚精蛋白硫酸鹽，磷酸氫二鈉，磷酸氫鉀，氯化鈉，鋅鹽，膠體硅石，三硅酸鎂，聚乙烯吡咯烷酮，基于纖維素的物質(zhì)，聚乙二醇，羧甲基纖維素鈉，聚丙烯酸酯，蠟，聚亞乙基-聚氧亞丙基-嵌段聚合物，聚乙二醇和羊毛脂肪。
按照本發(fā)明，所說的藥物組合物可以是無菌可注射的制劑的形式，例如無菌可注射的含水或含油懸浮液?？梢园凑毡绢I(lǐng)域已知的技術(shù)用合適的分散或潤濕劑和懸浮劑配制這一懸液。無菌可注射的制劑也可以是在非毒性腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射的溶液或懸液，例如為在1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的載體與溶劑是水，Ringer’s溶液和等滲氯化鈉溶液。此外，無菌的固定油通常用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為此目的，任何溫和的固定油都可以使用，包括合成的單-或二-甘油酯。脂肪酸(如油酸)以及它的甘油酯的衍生物在可注射的制劑中有用，其是天然藥學(xué)上可接受的油，如橄欖油或蓖麻油，尤其是它們的聚氧乙基化的形式。這些油溶液或懸液也可以含有長鏈醇稀釋劑或分散劑。
在某些情況下，依據(jù)注射的劑量與速率，血漿蛋白質(zhì)上的結(jié)合部位可以用前藥和活化的藥劑飽和。這導(dǎo)致蛋白質(zhì)-結(jié)合藥劑的降低的分?jǐn)?shù)，并且可以危害藥劑的半衰期或耐受性以及有效性。在這些情況下，與無菌白蛋白或血漿替換溶液一起注射前藥是合乎需要的。此外，可以使用含有造影劑的裝置/注射器，并且把它與抽入到注射器的血液相混合，然后再注射進(jìn)患者。
本發(fā)明的前藥化合物與藥物組合物可以經(jīng)口頭，腸胃外，吸入噴射，局部，直腸，鼻，頰，陰道施用，或經(jīng)由包含常規(guī)非毒性藥學(xué)上可接受的載體，佐劑和賦形劑的劑量制劑的植入貯槽施用。本文所使用的術(shù)語＂腸胃外＂包括皮下，靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，關(guān)節(jié)內(nèi)，滑液內(nèi)，胸骨內(nèi)，鞘內(nèi)，肝內(nèi)，傷口內(nèi)和顱內(nèi)注射或輸注技術(shù)。
當(dāng)口頭施用時，本發(fā)明的藥物組合物可以以任何口頭可接受的劑量形式施用，包括但不限于，膠囊，片劑，含水的懸液或溶液。在供口頭使用的片劑的情況下，一般利用的載體包括乳糖和玉米淀粉。典型地也添加潤滑劑(如硬脂酸鎂)。對于以膠囊形式口頭施用，有用的稀釋劑包括乳糖和干燥玉米淀粉。當(dāng)含水懸液對口頭施用是所需的時，將活性組分與乳化和懸浮劑組合。如果需要，也可以添加某些甜味劑，香味劑或著色劑。
此外，當(dāng)以直腸施用的栓劑形式施用時，本發(fā)明的藥物組合物可以通過把藥劑與合適的非刺激性賦形劑混合來制備，該賦形劑在室溫下是固體但在直腸溫度下是液體，因此會在直腸中熔化，釋放藥物。這樣的材料包括可可油，蜂蠟和聚乙二醇。
如前所指出的，本發(fā)明的藥物組合物也可以局部施用，尤其是在治療靶包括由局部施用容易進(jìn)入的區(qū)域或器官時，包括眼睛，皮膚或較低的腸道。對每個這樣的區(qū)域或器官，合適的局部制劑是容易制備的。
對較低的腸道局部應(yīng)用可以以直腸栓劑制劑(參見上述)或以合適的灌腸劑制劑進(jìn)行。也可以使用局部經(jīng)皮的敷片。
對于局部應(yīng)用，所說的藥物組合物可以以合適的軟膏形式配制，其中含有懸浮或溶解在一種或多種載體中的活性成分。用于本發(fā)明的化合物局部施用的載體包括但不限于礦物油，液態(tài)凡士林，白凡士林，丙二醇，聚氧乙烯，聚氧丙烯化合物，乳化蠟和水。此外，該藥物組合物可以以合適的洗劑或乳膏形式配制，其中含有懸浮或溶解在一種或多種藥學(xué)上可接受的載體中的活性成分。合適的載體包括但不限于礦物油，脫水山梨醇一硬脂酸酯，聚山梨酸酯60，鯨蠟基酯蠟，cetearyl醇，2-辛基十二烷醇，芐基醇和水。
對眼科施用，該藥物組合物可以以等滲的pH調(diào)節(jié)的無菌鹽水配制成微粒化的懸液，或者優(yōu)選地，以等滲的pH調(diào)節(jié)的無菌鹽水配制成溶液，其中有或沒有防腐劑，如苯扎氯銨。此外，對于眼科使用，該藥物組合物可以以軟膏(如凡士林)配制。
對于鼻氣霧劑或吸入施用，本發(fā)明的藥物組合物按照藥物制劑技術(shù)領(lǐng)域已知的技術(shù)制備，并且可以用鹽水制備成溶液，使用芐醇或其它合適的防腐劑，提高生物利用度的吸收促進(jìn)劑，碳氟化合物和/或其它常規(guī)的加溶劑或分散劑。
可以與載體材料組合產(chǎn)生單劑形式的活性組分的量將隨所治療的宿主和特定的施用方式變化。一種典型的制劑含有約5％到約95％的活性化合物(w/w)。優(yōu)選地，這樣的制劑含有約20％到約80％的活性化合物。
對于靜脈內(nèi)和其它類型的施用，可接受的劑量范圍在0.001和1.0mmol/kg體重之間，活性組分化合物的優(yōu)選的劑量在0.001和0.5mmol/kg體重之間。更優(yōu)選的在0.01和0.1mmol/kg之間，活性組分化合物最優(yōu)選的劑量在0.02和0.05mmol/kg之間。
技術(shù)人員會清楚，比以上所述劑量較低或較高的劑量可能是所需的。對任何特定患者的特定用藥方案將取決于各種因素，包括所使用的特定的化合物的活性，年齡，體重，總的健康狀況，性別，飲食習(xí)慣，施用時間，排泄率，藥物配伍，以及主治醫(yī)生的判斷。
可以預(yù)期優(yōu)選的藥物組合物是包含本發(fā)明的優(yōu)選的前藥的那些。
為了本發(fā)明可以更好地得到理解，下列實施例僅用于描述目的，無意于以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在每個實施例中，HSA用作生物活化的造影劑結(jié)合的蛋白質(zhì)。實施例實施例Ⅰa釓復(fù)合物1的合成首先，在二乙基偶氮基二羧酸酯和三苯基膦存在下，使氨基甲酸酯5與4,4’-二羥基二苯基的單-(二烯丙基磷酸)的酯反應(yīng)，以形成醚(方案2)。在脫保護(hù)(TFA)和用溴-叔-丁基乙酸酯烷基化后，用鈀四(三苯基)膦使磷酸酯脫保護(hù)。用三氟乙酸水解叔-丁基酯。與GdCl3和氫氧化鈉反應(yīng)產(chǎn)生釓復(fù)合物1。
方案2Gd復(fù)合物1的合成
a)DEAD,PP3；b)TFA；c)BrCH2CO2tBu；d)Pd(Ph3p)4,n-BuNH2,HCO2H；e)TFA；f) GdCl3,NaOH實施例ⅠbGd復(fù)合物1的更優(yōu)選的合成首先，從對-溴苯酚三步制備硼酸13(方案2a)。將苯酚作為叔-丁基二甲基甲硅烷基醚進(jìn)行保護(hù)。以丁基鋰處理芳基溴化物產(chǎn)生芳基鋰。使芳基鋰與三異丙基硼酸酯反應(yīng)，然后采用溫和的酸性條件水解硼酸酯中間體，產(chǎn)生硼酸13。方案2a硼酸13的合成
a)tBuMe2SiCl，咪唑，THF；b)nBuLi,-78℃,THF:c)(i-PrO)3B,THF然后H3O+中間體5和溴苯酚之間的Mitsunobu反應(yīng)給出醚14。用三氟乙酸脫保護(hù)三個BOC基團(tuán)，其后用叔-丁基溴乙酸酯烷基化三胺，給出五乙酸酯15。芳基溴化物15與硼酸13的四(三苯基膦)鈀-偶聯(lián)(Suzuki偶聯(lián))產(chǎn)生聯(lián)苯衍生物16。水解甲硅烷基醚和隨后磷酸化及堿水解所形成的磷酰基二氯產(chǎn)生單磷酸酯17。用三氟乙酸脫保護(hù)叔-丁基酯。與GdCl3和氫氧化鈉反應(yīng)，產(chǎn)生釓復(fù)合物1(方案2b)。方案2bGd復(fù)合物1的更優(yōu)選的合成
d)對-溴苯酚，DEAD,PPH3THF；e)TFA;f)BrCH2CO2tBu,i-Pr2NEt,DMF；g)13,(PPh3)4Pd,Na2CO3，甲苯，MeOH,H2O,Δ；h)POCl3,Et3N然后H2O/OH-；i)TFA；j)GdCL3,NaOH實施例Ⅱa釓復(fù)合物2的合成在二乙基偶氮基二羧酸酯和三苯基膦存在下，使氨基甲酸酯5與甲基-5-溴水楊酸酯反應(yīng)，形成溴芳基醚。溴芳基醚與苯基硼酸的四(三苯基膦)鈀-催化偶聯(lián)產(chǎn)生聯(lián)苯醚。用三氟乙酸水解叔-丁基氨基甲酸酯和隨后用叔-丁基溴乙酸酯烷基化產(chǎn)生聯(lián)苯醚取代的五-叔-丁基二亞乙基三胺五乙酸酯。在二噁烷中用1N NaOH水解甲基酯給出二苯基羧酸酯，在二甲基甲酰胺中采用二環(huán)己基碳二亞胺將其與肽片段H2N-gly-ile-arg(Boc)2-lys(Boc)-OtBu)偶聯(lián)。在6N HCl/二噁烷中的水解產(chǎn)生聯(lián)苯肽取代的二亞乙基三胺五乙酸。與GdCl3和堿反應(yīng)給出釓復(fù)合物2，其由反相HPLC純化(方案3a)。
方案3a釓復(fù)合物2的合成
a)甲基-5-溴水楊酸酯，DEAD,Pph3；b)ArB(OH)2,Na2CO3,(Ph3p)4Pd；c)TFA；d)BrCH2CO2tBu,iPr2NEt；e)NaOH,H2O/二噁烷；f) H2N-gly-ile-arg(boc)2-lys(boc)-OtBu,DCC；g)HCl/二噁烷；h)GdCl3，堿。實施例ⅡbGd復(fù)合物2的更優(yōu)選的合成在二乙基偶氮基二羧酸酯和三苯基膦存在下，使氨基甲酸酯5與甲基-5-溴水楊酸酯反應(yīng)，形成溴芳基醚。水解甲基酯，隨后在催化量的二甲氨基吡啶存在下用芐氯甲酸酯和三乙胺處理，產(chǎn)生芐基酯18。用三氟乙酸脫保護(hù)三個BOC基團(tuán)，隨后用叔-丁基溴乙酸酯烷基化，產(chǎn)生溴芳基醚取代的五-叔-丁基二亞乙基三胺五乙酸酯19。溴芳基醚與苯基硼酸的Suzuki偶聯(lián)給出聯(lián)苯醚。在鈀催化劑存在下氫解芐基酯，給出二苯基羧酸酯20。將20與甘氨酸芐基酯偶聯(lián)，接著氫解芐基酯，給出酰胺21。在DMF中用二環(huán)己基碳化二亞胺將21與保護(hù)的三肽H2N-Ile-Arg(BOC)2-Lys(BOC)-OtBu偶聯(lián)，隨后用TFA脫保護(hù)叔-丁基酯和BOC基團(tuán)，產(chǎn)生四肽22。在氫氧化鈉存在下與GdCl3反應(yīng)給出復(fù)合物2，其由反相HPLC純化(方案3b)。
方案3bGd復(fù)合物2更優(yōu)選的合成
a)甲基-5-溴水楊酸酯，DEAD,PPh3,THF;b)2N KOH(含水的)，MeOH;c)CICO2Bn,Et3N,DMAP,CH2C12;d)TFA;e)BrCH2CO2tBu,i-Pr2NEt,DMF;f)Ph-B(OH)2,(PPh3)4Pd,Na2CO3，甲苯，MeOH,H2O,Δ;g)H2,Pd,C,MeOH;h)H2NCH2CO2Bn,DCC,CH2Cl2;1)H2,Pd,C,MeOH;j)H2N-113-Arg(BOC)2-Lys(BOC)-OtBu,DCC,HOBt,DMF;k)TFA;i)GdCl3,NaOH。實施例Ⅲa前藥化合物1的活化如下所示，通過堿性磷酸酶活化前藥1。由MS(磷-氧鍵)的水解產(chǎn)生的活化造影劑8以0.1mM的濃度結(jié)合到HSA上，具有比前藥1更大的親和性。增加的相關(guān)性由T1的縮短引起，其在MRI成像中以信號強(qiáng)度增加檢測。
前藥化合物1的活化
實施例Ⅲb前藥化合物1更優(yōu)選的活化如實施例Ⅰb所述合成化合物1(參見實施例Ⅰb和Ⅲa)。通過水解MS(磷-氧鍵)的堿性磷酸酶活化前藥1(參見實施例Ⅲa，前藥1的活化)，形成活化的造影劑8。化合物8以0.1mM的濃度結(jié)合到HSA上，具有比前藥1更大的親和性，并具有較高的弛豫活性。高弛豫活性由T1的縮短引起，其在MRI成像中以信號強(qiáng)度增加檢測(參見以下表Ⅴ)表Ⅴ弛豫活性和對HSA的百分結(jié)合
在表Ⅴ中，縱向弛豫活性(R1)在20MHz和37℃，通過在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS,150mM NaCl,10mM磷酸鹽，pH=7.4)中或在包含4.5％人血清白蛋白(HSA)的PBS溶液中測定水質(zhì)子的濃度依賴性弛豫率(1/T1)而得到。通過超濾0.1mM螯合物，4.5％HSA溶液測定對HSA的百分結(jié)合。
在包含4.5％HSA的PBS緩沖液(pH7)中制備前藥1的溶液(0.3mM)。沒有觀察到20MHz質(zhì)子弛豫率1/T1隨時間的變化。將3單位的堿性磷酸酶(在磷酸鹽緩沖鹽水中底物0.1mM時，1單位每分鐘將1nmol對-硝基苯基磷酸酯轉(zhuǎn)化成對-硝基苯酚)加入到化合物1的4.5％HSA溶液中，并隨時間變化監(jiān)測1/T1。隨著1酶促轉(zhuǎn)化成8，觀察到溶液的1/T1發(fā)生改變(表Ⅵ)。一旦酶促活化1到8完成，則從時間0的1/T1的變化是2.86秒-1，其相當(dāng)于在24％的信號強(qiáng)度方面近似預(yù)期的增加。
表Ⅵ在20MHz前藥1的生物活化
制備包含化合物1和8(0.1-0.2mM)的4.5％HSA溶液。在15分鐘之后，在4.5％HSA溶液的1.0Tesla獲得初始T1-權(quán)重MRI掃描(FISP-3D,TR=60,TE=5,α=60)。在相同的濃度下，包含8的溶液的MRI掃描比包含1的溶液更明亮。將3單位的堿性磷酸酶添加到包含1的HSA溶液的一半中，獲得另外的T1-權(quán)重MRI掃描。在130分鐘之后，在相同的濃度下，包含1和堿性磷酸酶的溶液獲得含有8的溶液的96％的信號強(qiáng)度。在MRI掃描期間包含化合物1但不含堿性磷酸酶的溶液保持恒定的暗像。在把堿性磷酸酶添加至包含1的溶液中之后觀察到信號強(qiáng)度增加20％。
實施例Ⅳ釓復(fù)合物2的活化通過膠原酶(MMP-1)活化包含親水異亮氨酸-精氨酸-賴氨酸側(cè)鏈MM的前藥2。MS是碳-氮肽鍵，其由MMP-1選擇性地水解(gly-ile)。ile-arg-lysMM的釋放產(chǎn)生化合物9，其以比前藥2更高的對HSA的結(jié)合親和性為特征。在MRI中改變的信號使得生物學(xué)活性可以成像。
釓復(fù)合物2的活化
實施例Ⅴ釓復(fù)合物10的活化這一實施例也顯示第二化學(xué)反應(yīng)如何偶聯(lián)到主要生物活性-相關(guān)事件上。包含由三肽tmLys-tmLys-Arg(其中tmlys是Nε,Nε,Nε-三甲基賴氨酸)組成的MM的前藥10由絲氨酸蛋白酶活化。MS是Arg-Glu碳-氮肽鍵，其由絲氨酸蛋白酶酶促生物學(xué)活性所切割，以釋放掩蔽部分。給出中間體化合物11的酶促水解后接著與脂肪族或活化的酯(例如，R=對-硝基苯基)進(jìn)行第二化學(xué)反應(yīng)(分子內(nèi)環(huán)化)。其將11中帶正電荷的PBM部分轉(zhuǎn)化成更親脂更高度HSA-結(jié)合的中性內(nèi)酰胺衍生物12。前藥化合物10的活化
實施例Ⅵ前藥造影劑的施用通過本領(lǐng)域已知的和以上描述的化學(xué)和肽技術(shù)合成前藥化合物2(一種MMP底物)。制備在水中的pH7.0的制劑并滅菌。
將制劑靜脈內(nèi)注射進(jìn)懷疑患有一種或多種腫瘤的患者中。所使用的劑量是0.025mmol/kg。在注射后15分鐘之后，獲得懷疑含有腫瘤的身體區(qū)域的T1-權(quán)重MRI掃描。在影像上顯示更明亮的團(tuán)塊更可能是惡性腫瘤而不是良性腫瘤。
將相同的制劑靜脈內(nèi)注射進(jìn)懷疑在一個或多個關(guān)節(jié)患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者中。所使用的劑量是0.025mmol/kg。在注射后15分鐘之后，獲得懷疑含有關(guān)節(jié)炎的身體關(guān)節(jié)的T1-權(quán)重MRI掃描。在影像上顯示更明亮的關(guān)節(jié)更可能包含活動性炎癥。
將相同的制劑靜脈內(nèi)注射進(jìn)懷疑在一個或多個動脈患有動脈粥樣硬化的患者中。所使用的劑量是0.025mmol/kg。在注射后15分鐘之后，獲得動脈的T1-權(quán)重MRI掃描(橫截面掃描或MR血管造影術(shù))。增加明亮度的動脈粥樣斑塊很可能是不穩(wěn)定的斑塊，有可能破裂和引起動脈供應(yīng)的器官的局部缺血。
權(quán)利要求
1．一種磁共振成像或光學(xué)成像前藥造影劑，其對組織蛋白質(zhì)具有比造影劑的生物活化形式更低的親和性。
2．按照權(quán)利要求1的前藥造影劑，其包含a)影像-增強(qiáng)部分(IEM)；b)蛋白質(zhì)結(jié)合部分(PBM)；和c)修飾部位(MS)。
3．按照權(quán)利要求2的前藥造影劑，其中所說的IEM包括選自下組的一個成員有機(jī)分子，金屬離子，鹽和螯合物，聚集體，粒子，標(biāo)記的肽，標(biāo)記的蛋白質(zhì)，標(biāo)記的聚合物，標(biāo)記的脂質(zhì)體，有機(jī)染料和無機(jī)染料。
4．按照權(quán)利要求2的光學(xué)成像前藥造影劑，其中所說的IEM包括一種生理相容性螯合物，該螯合物包含至少一個環(huán)狀或非環(huán)狀的有機(jī)螯合劑，該螯合劑是復(fù)合到原子序數(shù)為13,21-34,39-42,44-50或57-83的一個或多個金屬離子上的。
5．按照權(quán)利要求2的前藥造影劑，其中所說的IEM包括發(fā)光金屬復(fù)合物。
6．按照權(quán)利要求2的前藥造影劑，其中所說的IEM包括高磁化率的鐵粒子或金屬螯合物。
7．按照權(quán)利要求2的前藥造影劑，其中所說的IEM包括一種藥學(xué)上可接受的金屬螯合物，該螯合物包含至少一個環(huán)狀或非環(huán)狀的有機(jī)螯合劑，該螯合劑是復(fù)合到原子序數(shù)為21-29,42,44或57-83的一個或多個順磁金屬離子上的。
8．按照權(quán)利要求7的前藥造影劑，其中所說的順磁金屬離子選自下組Gd(Ⅲ),Fe(Ⅲ),Mn(Ⅱ),Mn(Ⅲ),Cr(Ⅲ),Cu(Ⅱ),Dy(Ⅲ),Tb(Ⅲ),Ho(Ⅲ),Er(Ⅲ)和Eu(Ⅲ)。
9．按照權(quán)利要求8的前藥造影劑，其中所說的順磁金屬離子是Gd(Ⅲ)。
10．按照權(quán)利要求4或7的前藥造影劑，其中所說的金屬螯合物具有大于約1010M-1的形成常數(shù)。
11．按照權(quán)利要求10的前藥造影劑，其中所說的金屬螯合物具有大于約1015M-1的形成常數(shù)。
12．按照權(quán)利要求11的前藥造影劑，其中所說的金屬螯合物具有大于約1020M-1的形成常數(shù)。
13．按照權(quán)利要求9的前藥造影劑，其中所說的螯合劑選自下組DTPA,DOTA,DTPA-BMA和HP-DO3A。
14．按照權(quán)利要求2的前藥造影劑，其中所說的PBM選自藥物、親脂性和兩親性有機(jī)分子、卟啉、受體配體、類固醇、脂質(zhì)、激素、肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸和抗體。
15．按照權(quán)利要求2的前藥造影劑，其對一種以上的組織蛋白質(zhì)具有比造影劑的生物活化形式更低的親和性。
16．按照權(quán)利要求2的前藥造影劑，其對來源于血漿，組織的間質(zhì)間隙，滑液腦脊髓液，炎性液，膿腫液或胞內(nèi)間隙的蛋白質(zhì)具有比造影劑的生物活化形式更低的親和性。
17．按照權(quán)利要求16的前藥造影劑，其對選自下組的蛋白質(zhì)具有比造影劑的生物活化形式更低的親和性人血清白蛋白，脂肪酸結(jié)合蛋白，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，α1-酸性糖蛋白，脂蛋白，胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白，淀粉狀蛋白，蠟樣質(zhì)和糖蛋白。
18．按照權(quán)利要求17的前藥造影劑，其中所說的蛋白質(zhì)是α1-酸性糖蛋白。
19．按照權(quán)利要求17的前藥造影劑，其中所說的蛋白質(zhì)選自下組人血清白蛋白，脂肪酸結(jié)合蛋白和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶。
20．按照權(quán)利要求19的前藥造影劑，其中所說的蛋白質(zhì)是人血清白蛋白。
21．按照權(quán)利要求20的前藥造影劑，其中所說的生物活化的造影劑的PBM具有從約2.0-約7.0的logP貢獻(xiàn)。
22．按照權(quán)利要求20的前藥造影劑，其中所說的PBM具有至少4.0的logP貢獻(xiàn)。
23．按照權(quán)利要求20的前藥造影劑，其中所說的PBM具有至少6.0的logP貢獻(xiàn)。
24．按照權(quán)利要求20的前藥造影劑，其中在生理相關(guān)條件下，至少約10％的生物活化的造影劑結(jié)合到人血清白蛋白上。
25．按照權(quán)利要求20的前藥造影劑，其中在生理相關(guān)條件下，至少約50％的生物活化的造影劑結(jié)合到人血清白蛋白上。
26．按照權(quán)利要求20的前藥造影劑，其中在生理相關(guān)條件下，至少約80％的生物活化的造影劑結(jié)合到人血清白蛋白上。
27．按照權(quán)利要求20的前藥造影劑，其中在生理相關(guān)條件下，至少約95％的生物活化的造影劑結(jié)合到人血清白蛋白上。
28．按照權(quán)利要求20的前藥造影劑，其中所說的前藥對人血清白蛋白的結(jié)合親和性低于生物活化的藥劑的結(jié)合親和性的約80％。
29．按照權(quán)利要求20的前藥造影劑，其中所說的前藥對人血清白蛋白的結(jié)合親和性低于生物活化的藥劑的結(jié)合親和性的約50％。
30．按照權(quán)利要求20的前藥造影劑，其中所說的前藥對HSA的結(jié)合親和性低于生物活化的藥劑的結(jié)合親和性的約40％。
31．按照權(quán)利要求20的前藥造影劑，其中所說的前藥對HSA的結(jié)合親和性低于生物活化的藥劑的結(jié)合親和性的約20％。
32．按照權(quán)利要求20的前藥造影劑，其中所說的前藥對HSA的結(jié)合親和性低于生物活化的藥劑的結(jié)合親和性的約10％。
33．按照權(quán)利要求20的前藥造影劑，其中所說的前藥弛豫活性(R1)是生物活化的藥劑的弛豫活性(R1)的80％或更低。
34．按照權(quán)利要求20的前藥造影劑，其中所說的前藥弛豫活性(R1)是生物活化的藥劑的弛豫活性(R1)的50％或更低。
35．按照權(quán)利要求20的前藥造影劑，其中所說的前藥弛豫活性(R1)是生物活化的藥劑的弛豫活性(R1)的20％或更低。
36．按照權(quán)利要求20的前藥造影劑，其中所說的前藥弛豫活性(R1)是生物活化的藥劑的弛豫活性(R1)的10％或更低。
37．按照權(quán)利要求2的前藥造影劑，其中所說的PBM包含至少一個脂肪族基團(tuán)，烷氧基或烷硫基，烷羰基，烷羰氧基，芳基或雜環(huán)基，所說的芳基或雜環(huán)基具有1-60個碳和可有可無的一個或多個氮，氧，硫，鹵素，脂肪族，酰胺，酯，氨磺酰，酰基，磺酸基，磷酸基，羥基或有機(jī)金屬取代基。
38．按照權(quán)利要求37的前藥造影劑，其中所說的PBM包含至少一個芳環(huán)。
39．按照權(quán)利要求38的前藥造影劑，其中所說的PBM包含至少兩個芳環(huán)。
40．按照權(quán)利要求37的前藥造影劑，其包含兩個PBM。
41．按照權(quán)利要求40的前藥造影劑，其中所說的PBM每一個包含至少一個芳環(huán)。
42．按照權(quán)利要求37的前藥化合物，其中所說的PBM包含至少一種選自下組的結(jié)構(gòu)
其中R包含脂肪族基團(tuán)和/或至少一個芳環(huán)，或者包含含有疏水氨基酸殘基和/或有或沒有疏水或親水末端基團(tuán)的取代基的肽。
43．按照權(quán)利要求2的前藥造影劑，其中所說的MS是體內(nèi)能夠由酶改變的鍵。
44．按照權(quán)利要求43的前藥造影劑，其中所說的酶選自下組氧化還原酶，轉(zhuǎn)移酶，水解酶，裂合酶，異構(gòu)酶和連接酶。
45．按照權(quán)利要求43的前藥造影劑，其中所說的酶選自下組金屬蛋白酶，蛋白酶，絲氨酸蛋白酶，磷酸酶，磷脂酶，酯酶和硫酸酯酶。
46．按照權(quán)利要求43的前藥造影劑，其中所說的MS是體內(nèi)能夠由磷酸酶水解的磷-氧鍵。
47．按照權(quán)利要求43的前藥造影劑，其中所說的MS是體內(nèi)能夠由金屬蛋白酶或絲氨酸蛋白酶水解的酰胺鍵。
48．按照權(quán)利要求2的前藥造影劑，其還包含掩蔽部分(MM)。
49．按照權(quán)利要求48的前藥造影劑，其具有能夠由前藥的生物活化改變的電荷或疏水性。
50．按照權(quán)利要求48的前藥造影劑，其中所說的MM包含聚乙二醇。
51．按照權(quán)利要求48的前藥造影劑，其中所說的MM包含選自下組的親水和/或荷電基團(tuán)羥基，胺，銨，季胺，氨基酸，亞砜，磷酸鹽，硫酸鹽，羧酸鹽，碳水化合物，糖和金屬螯合物。
52．按照權(quán)利要求2的前藥造影劑，其具有由下式所代表的結(jié)構(gòu)IEM-[(PBM)m-[(MS)n-(MM)o]p]q其中m,n,o,p和q每一個相同或不同；q,n,m和p可以大于或等于1，但不是0,o可以大于或等于0。
53．按照權(quán)利要求2的前藥造影劑，其具有由下式所代表的結(jié)構(gòu)
其中m,n,o,p和q每一個相同或不同；q,n,m和p可以大于或等于1，但不是0,o可以大于或等于0。
54．按照權(quán)利要求2的前藥造影劑，其具有由下式所代表的結(jié)構(gòu)
其中m,n,o,p和q每一個相同或不同；q,n,m和p可以大于或等于1，但不是0,o可以大于或等于0。
55．按照權(quán)利要求1的前藥造影劑，其中所說的IEM包括Gd3+的DTPA,DOTA,DTPA-BMA或HP-DO3A螯合物；PBM包含至少一種選自下組的結(jié)構(gòu)
其中R包含脂肪族基團(tuán)和/或至少一個芳環(huán)，或者包含含有疏水氨基酸殘基和/或有或沒有疏水或親水末端基團(tuán)的取代基的肽；和MS包含能夠由水解酶體內(nèi)改變的鍵。
56．權(quán)利要求55的前藥造影劑，其中所說的MS是體內(nèi)能夠由磷酸酶水解的磷-氧鍵。
57．權(quán)利要求50的前藥化合物，其中所說的MS是體內(nèi)能夠由金屬蛋白酶或絲氨酸蛋白酶水解的酰胺鍵。
58．一種由以下結(jié)構(gòu)式表示的磁共振成像前藥造影劑
59．一種由以下結(jié)構(gòu)式表示的磁共振成像前藥造影劑
60．一種由以下結(jié)構(gòu)式表示的磁共振成像前藥造影劑
其中R是脂肪族或活化的酯。
61．一種藥物組合物，該組合物包含按照權(quán)利要求1的前藥造影劑和載體、佐劑或賦形劑。
62．按照權(quán)利要求61的藥物組合物，該組合物還包含一種游離的有機(jī)配體或其藥學(xué)上可接受的鹽。
63．一種用于MRI成像的方法，該方法包括施用診斷有效量的按照權(quán)利要求7的前藥造影劑的步驟。
64．一種用于紫外/可見/紅外光成像的方法，該方法包括施用診斷有效量的按照權(quán)利要求4的前藥造影劑的步驟。
65．一種用于MRI成像的方法，該方法包括施用診斷有效量的按照權(quán)利要求6的前藥造影劑的步驟。
66．一種用于傳送造影劑的方法，該方法包括施用按照權(quán)利要求1的前藥造影劑的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于磁共振成像和光學(xué)成像的改進(jìn)的診斷劑。更具體地說,本發(fā)明涉及MRI和光學(xué)成像劑,其使得可以在組織內(nèi)靈敏地檢測特異性生物學(xué)活性。這些藥劑是前藥造影劑,它們在特異性生物學(xué)活性存在下體內(nèi)被生物活化。本發(fā)明也涉及包含這些藥劑的藥物組合物,并涉及使用所說的藥劑和包含這些藥劑的組合物的方法。
文檔編號A61B5/055GK1215341SQ97193542
公開日1999年4月28日 申請日期1997年3月25日 優(yōu)先權(quán)日1996年4月1日
發(fā)明者R·B·拉富爾, T·J·麥克穆里, S·O·杜哈姆, D·M·斯考特, D·J·帕米利, S·杜馬斯 申請人:Epix醫(yī)學(xué)公司