一種發(fā)酵生產(chǎn)唾液酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種發(fā)酵生產(chǎn)唾液酸的方法，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明是將種子液加入到含有滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，通過補(bǔ)加流加液和過氧化氫溶液的方式連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)含有聚唾液酸的發(fā)酵液，再通過離心分離、乙醇沉淀、過濾的方式獲取精制聚唾液酸，再對(duì)聚唾液酸進(jìn)行酸解和結(jié)晶，最后洗滌凍干后獲得唾液酸粉末。利用本發(fā)明所提供的方法生產(chǎn)聚唾液酸的產(chǎn)量可達(dá)12.96g/L，較目前已報(bào)道的聚唾液酸的最大含量提高了87.28％，聚唾液酸的水解率為95％，純化后唾液酸的含量達(dá)到10.01g/L，純度達(dá)到94.80％，適于產(chǎn)業(yè)化推廣應(yīng)用。
【專利說明】一種發(fā)酵生產(chǎn)唾液酸的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)唾液酸的方法，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。 技術(shù)背景
[0002] 唾液酸（Sialic acids)是一族神經(jīng)氨酸的衍生物，最常見的是N-乙酰神經(jīng)氨酸 (N-acetylneuraminic acid，NANA)，通常以低聚糖，糖脂或者糖蛋白的形式存在。唾液酸的 主要食物來源是母乳，在牛奶、雞蛋和奶酪中也存在唾液酸。近年來，唾液酸及其衍生物在 食品、保健品和醫(yī)藥上的應(yīng)用有著日益廣闊的發(fā)展前景，尤其是在嬰幼兒配方奶粉中的應(yīng) 用，研究發(fā)現(xiàn)，可以通過飲食補(bǔ)充外源性唾液酸以增加腦部唾液酸的含量。這也預(yù)示著在嬰 兒奶粉，特別是針對(duì)早產(chǎn)兒的嬰兒奶粉中添加唾液酸將有效地促進(jìn)他們的神經(jīng)系統(tǒng)和大腦 的發(fā)育，同時(shí)進(jìn)一步影響他們?cè)谏L(zhǎng)發(fā)育早期的智力發(fā)育，并且在抗炎、抗病毒、抗癌、抗識(shí) 別等方面起著十分重要的作用。
[0003] 近年來，科學(xué)家已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其具有許多重要的生物學(xué)功能，隨著研究的深入，其應(yīng)用 領(lǐng)域也越來越廣泛，但唾液酸的國(guó)際市場(chǎng)價(jià)格較高，國(guó)內(nèi)也沒有公開成型的大規(guī)模生產(chǎn)方 法，因此生產(chǎn)高產(chǎn)量的唾液酸成為人們急需解決的問題。目前，除了微生物發(fā)酵法產(chǎn)唾液酸 夕卜，還有化學(xué)合成法、酶合成法、天然產(chǎn)物提取法，但化學(xué)合成法反應(yīng)條件苛刻，收率低，酶 法合成原料要求高，價(jià)格較為昂貴，而且唾液酸醛縮酶不易獲得，限制了生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大， 唾液酸在天然原料中含量比較低，而且組成成分遠(yuǎn)比發(fā)酵液中復(fù)雜，分離提純過程復(fù)雜?，F(xiàn) 有文獻(xiàn)報(bào)道的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)終產(chǎn)物唾液酸因所用的菌株不同，終產(chǎn)物的產(chǎn)量也不同， 1990年，Camino等利用Escherichia coli K92發(fā)酵生產(chǎn)聚唾液酸，產(chǎn)量為0. 45g/L ; 1998 年，郭良棟等，用Escherichia coli C-8發(fā)酵生產(chǎn)聚唾液酸，產(chǎn)量為1. 200g/L ;2008年， Bastian等利用Escherichia coli K1進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)聚唾液酸的產(chǎn)量為1. 600g/ L ;2009年，張琦等，用Escherichia coli K235-WXJ4合成聚唾液酸達(dá)到6. 638g/L，純度 為99. 71 % ;2011年，劉金龍等用Escherichia coli CCTCC M208088合成聚唾液酸量達(dá)到 6. 92g/L，純度達(dá)到 99. 9%。
[0004] 聚唾液酸經(jīng)過酸水解后可得到唾液酸，再經(jīng)過分離提純才能得到純度較高的唾液 酸。目前已報(bào)道的相關(guān)文獻(xiàn)幾乎都是檢測(cè)的聚唾液酸的含量，最大產(chǎn)量為6. 92g/L，沒有進(jìn) 一步的水解，或是水解后直接提純唾液酸，并沒有報(bào)道唾液酸的含量。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)唾液酸的方法，該方法顯著提高了 唾液酸的產(chǎn)量，所采取的技術(shù)方案如下：
[0006] -種發(fā)酵生產(chǎn)唾液酸的方法，是將種子液加入到含有滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐 中，通過補(bǔ)加流加液和過氧化氫溶液的方式連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)含有聚唾液酸的發(fā)酵液，再通過 離心分離、乙醇沉淀、過濾的方式獲取精制聚唾液酸，再對(duì)聚唾液酸進(jìn)行酸解和結(jié)晶，最終 洗滌凍干后獲得唾液酸粉末。
[0007] 所述方法的步驟如下：
[0008] 1)發(fā)酵液的制備：將種子液和丙酮酸鈉加入到含有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，發(fā)酵 過程中補(bǔ)加過氧化氫溶液和流加液，并不斷攪拌，發(fā)酵結(jié)束后獲得發(fā)酵液；
[0009] 2)聚唾液酸的提?。弘x心分離步驟1)所得發(fā)酵液，收集上清液并用乙醇溶液沉 淀，離心干燥沉淀物后，再用去離子水復(fù)溶，過濾除去不溶物，再次加入乙醇溶液沉淀，離心 后凍干沉淀，獲得精制聚唾液酸；
[0010] 3)聚唾液酸的酸解：利用鹽酸酸解步驟2)所得精致聚唾液酸，再向水解溶液中加 入冰乙酸結(jié)晶，再用冰乙酸洗滌結(jié)晶后，真空干燥獲得唾液酸。
[0011] 所述方法步驟1)所述種子液制備方法是，從大腸桿菌K235甘油菌中，取100 μ L 接種到5mL種子培養(yǎng)基中，37°C，恒溫培養(yǎng)12h，按2%的接種量將培養(yǎng)好的菌液再接種到含 100mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，37°C，250r/min搖床培養(yǎng)12h，按2%的接種量再次接 至IJ 100mL種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)8?10h，培養(yǎng)結(jié)束后獲得發(fā)酵種子液；
[0012] 所述種子培養(yǎng)基含有5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，3g/L牛肉膏，ρΗ7· 2-7. 4 ;
[0013] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為25g/L山梨醇，2.5g/L硫酸銨，1.5g/L酵母提取物， 2. 5g/L磷酸氫二鉀，0. 9g/L無(wú)水硫酸鎂，0. 002g/L無(wú)水硫酸銅，pH7. 6-8. 0,其余成分為蒸 餾水；
[0014] 所述流加液含有307. 17g/L山梨醇，30. 65g/L硫酸銨，ρΗ7· 6-8. 0。
[0015] 所述方法步驟1)所述丙酮酸鈉的添加量為4. 14g/L發(fā)酵培養(yǎng)基；所述補(bǔ)加過氧化 氫溶液是分別在發(fā)酵5、10、15、20h時(shí)按0. 4015、0. 8025、1. 605、1. 605mL/L發(fā)酵培養(yǎng)基的添 加量補(bǔ)加；所述補(bǔ)加流加液是在發(fā)酵8h時(shí)按50ml/L發(fā)酵培養(yǎng)基的添加量補(bǔ)加。
[0016] 所述方法步驟1)所述發(fā)酵，發(fā)酵溫度為37°C，發(fā)酵時(shí)間40h，PH7. 78,通氣量IV/ V · min ;所攪拌發(fā)酵12h前，攪拌速度為400r/min，發(fā)酵12h后，攪拌速度為600r/min。
[0017] 所述方法步驟2)所述乙醇溶液，第一次沉淀乙醇濃度為75%，添加量為3倍體積 上清液，第二次沉淀乙醇溶液濃度為95%，添加量為3倍體積濾液；所述離心，離心發(fā)酵液 轉(zhuǎn)速為8000r/min，離心時(shí)間10min，離心乙醇沉淀液轉(zhuǎn)速為10000r/min，離心時(shí)間10min。
[0018] 所述方法步驟3)所述酸解是85°C下，用0. 1M鹽酸酸解2%的聚唾液酸溶液，酸解 時(shí)間2h。
[0019] 所述方法步驟3)所述冰乙酸結(jié)晶，冰乙酸添加量為5倍體積的唾液酸單體溶液， 結(jié)晶溫度為4°C，結(jié)晶時(shí)間3d。
[0020] 所述方法的具體步驟為：
[0021] 1)將67. 6mL種子液加入到已滅菌的含有2L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，同時(shí)加入 8.188丙酮酸鈉，并分別在發(fā)酵5、10、15、2011后補(bǔ)加0.803、1.605、3.210、3.2101^的過氧化 氫溶液，在發(fā)酵8h后補(bǔ)加100mL滅菌流加液，發(fā)酵12h前攪拌速度為400r/min，12h后攪拌 速度為600r/min，pH7. 78,在37°C下發(fā)酵40h后，獲得發(fā)酵液；
[0022] 2)將步驟1)所得發(fā)酵液在8000r/min轉(zhuǎn)速下離心10min，去除菌體，收集上清液， 向上清液中加入3倍體積的75%的乙醇，100001'/1^11下離心101^11，分離沉淀物并真空干 燥，再將干燥物溶于10倍質(zhì)量的去離子水中，用1. 5%硅藻土助濾劑過濾，向?yàn)V液中加入3 倍體積的95%的乙醇溶液，10000r/min下離心lOmin，凍干沉淀物，獲得精制聚唾液酸；
[0023] 3)將步驟2)所得精制聚唾液酸配制成2%的溶液，用0. lmol/L鹽酸，85°C下酸 解2h，得到唾液酸酸解溶液，向唾液酸酸解溶液中加入5倍體積的冰乙酸，4°C下靜置，結(jié)晶 3d，再將晶槳抽濾除去冰乙酸，得到唾液酸晶體，再用5倍質(zhì)量的冰乙酸洗滌體積，最后將 晶體在50°C下真空干燥4h，得到唾液酸粉末。
[0024] 本發(fā)明所用發(fā)酵的原始菌株為Escherichia coli K235(ATCC13027)。本發(fā)明的有 益效果：
[0025] 本發(fā)明利用原始菌株Escherichia coli K235(ATCC13027)生產(chǎn)聚唾液酸的產(chǎn)量 為12. 96g/L，較目前已報(bào)道的聚唾液酸的最大含量提高了 87. 28%，聚唾液酸的水解率為 95%，純化后唾液酸的含量達(dá)到10. 01g/L，純度達(dá)到94. 80%。本發(fā)明所生產(chǎn)的聚唾液酸的 產(chǎn)量具有明顯的優(yōu)勢(shì)，為其在食品、保健、醫(yī)藥上日益廣闊的應(yīng)用前景提供了有利的條件。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1為實(shí)施例1碳源優(yōu)化發(fā)酵過程中菌體的吸光度；
[0027] (A1，山梨醇濃度30g/L ;A2,山梨醇濃度40g/L ;A3,山梨醇濃度50g/L)。
[0028] 圖2為實(shí)施例1碳源優(yōu)化發(fā)酵過程中殘留山梨醇的質(zhì)量濃度；
[0029] (A1，山梨醇濃度30g/L ;A2,山梨醇濃度40g/L ;A3,山梨醇濃度50g/L)。
[0030] 圖3為實(shí)施例1碳源優(yōu)化發(fā)酵過程中唾液酸的質(zhì)量濃度；
[0031] (A1，山梨醇濃度30g/L ;A2,山梨醇濃度40g/L ;A3,山梨醇濃度50g/L)。
[0032] 圖4為實(shí)施例1無(wú)機(jī)氮源含量確定發(fā)酵過程中菌體的吸光度；
[0033] (B1，硫酸銨濃度3g/L ;B2,硫酸銨濃度4g/L ;B3,硫酸銨濃度5g/L)。
[0034] 圖5為實(shí)施例1無(wú)機(jī)氮源含量確定發(fā)酵過程中硫酸銨的質(zhì)量濃度；
[0035] (B1，硫酸銨濃度3g/L ;B2,硫酸銨濃度4g/L ;B3,硫酸銨濃度5g/L)。
[0036] 圖6為實(shí)施例1無(wú)機(jī)氮源含量確定發(fā)酵過程中唾液酸的質(zhì)量濃度；
[0037] (B1，硫酸銨濃度3g/L ;B2,硫酸銨濃度4g/L ;B3,硫酸銨濃度5g/L)。
[0038] 圖7為攪拌速度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響；
[0039] (a，同攪拌速率對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響；b，不同攪拌速率下菌體的比生長(zhǎng)速率）。
[0040] 圖8為攪拌速度對(duì)唾液酸產(chǎn)量的影響；
[0041] (a，不同攪拌速率對(duì)終產(chǎn)物唾液酸產(chǎn)量的影響；b，不同攪拌速率下終產(chǎn)物唾液酸 的比合成速率）。
[0042] 圖9為各因素交互作用對(duì)菌體發(fā)酵產(chǎn)唾液酸的影響的響應(yīng)面圖和等高線圖。
[0043] 圖10為唾液酸高效液相色譜檢測(cè)圖；
[0044] (a，唾液酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的高效液相色譜圖；b，唾液酸樣品的高效液相色譜圖）。
[0045] 圖11為發(fā)酵液中提取并純化后的唾液酸紅外光譜圖。

【具體實(shí)施方式】
[0046] 本發(fā)明提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)唾液酸的方法，該方法可大幅提高唾液酸的產(chǎn)量，為 唾液酸在食品、保健、醫(yī)藥等方面的應(yīng)用提供支持。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說 明，但本發(fā)明不受實(shí)施例的限制。
[0047] 實(shí)施例1發(fā)酵培養(yǎng)基碳氮源的優(yōu)化
[0048] 1.發(fā)酵培養(yǎng)基碳源含量的確定
[0049] 用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)碳源山梨醇的三種含量（30、40、50g/L)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確定合適的碳 源含量，分別命名為A1、A2、A3,發(fā)酵培養(yǎng)基中其他成分及含量為：磷酸氫二鉀2. 5g/L、硫酸 銨 5g/L、酵母提取物 1. 2g/L、硫酸鎂 0· 9g/L、硫酸銅 0· 002g/L，ρΗ8· 0 (121°C，15min 滅菌）。
[0050] 500mL三口燒瓶培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子液按接種量4% (v/v)接入裝有300mL發(fā)酵 培養(yǎng)基的500mL三口燒瓶中培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速250r/min，溫度37°C，培養(yǎng)40h，定時(shí)取樣，測(cè)得 山梨醇的質(zhì)量濃度和在425nm處的菌體吸光度及唾液酸的質(zhì)量濃度，用便攜式pH計(jì)實(shí)時(shí)監(jiān) 測(cè)，并用4mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)發(fā)酵液中的pH，使之保持在7. 6?8. 0。
[0051] 放大培養(yǎng)：3. 7L發(fā)酵罐裝液量為2L，接種量4%，發(fā)酵溫度37°C，攪拌轉(zhuǎn)速250r/ min，ρΗ8· 0,通氣量 1 (V/V · min)，培養(yǎng) 40h。
[0052] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1-3所示。圖1為發(fā)酵過程中菌體的吸光度，圖2為發(fā)酵過程中殘 山梨醇的質(zhì)量濃度，圖3為發(fā)酵過程中唾液酸的質(zhì)量濃度。從圖1-3可以看出，發(fā)酵結(jié)束 時(shí)，A2組菌體吸光度最大，殘山梨醇的含量約為15g/L，唾液酸的含量最高為1. 35g/L，因此 選擇A2組山梨醇40g/L為發(fā)酵培養(yǎng)基碳源含量。
[0053] 2.發(fā)酵培養(yǎng)基無(wú)機(jī)氮源含量的確定
[0054] 在上步優(yōu)化的碳源含量的基礎(chǔ)上，對(duì)無(wú)機(jī)氮源硫酸銨的含量（3、4、5g/L)進(jìn)行單 因素實(shí)驗(yàn)，確定合適的氮源含量，分別命名為Bl、B2、B3,發(fā)酵培養(yǎng)基中其他成分及含量為： 山梨醇40g/L、磷酸氫二鉀2. 5g/L、酵母提取物1. 2g/L、硫酸鎂0. 9g/L、硫酸銅0. 002g/L、 ρΗ8· 0 (121°C，15min 滅菌）。
[0055] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4-6所示，圖4為發(fā)酵過程中菌體的吸光度，圖5為發(fā)酵過程中硫酸 銨的質(zhì)量濃度，圖6為發(fā)酵過程中唾液酸的質(zhì)量濃度。從圖4可知，B2組菌體吸光度較大， 表明菌體生長(zhǎng)較其它兩組快，圖5中B2組殘硫酸銨的含量約為1. 3g/L，圖6中B2組唾液酸 的含量較高，因此選擇B2組硫酸銨4g/L為發(fā)酵培養(yǎng)基氮源含量。
[0056] 3.響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)確定碳、氮源的最佳含量
[0057] 將獲得的山梨醇和硫酸銨的含量分別為40g/L和4g/L及有機(jī)氮源酵母提取物 1. 2g/L，利用Design-Expert7. 0軟件對(duì)山梨醇40?45g/L、硫酸銨3. 8?4. 3g/L及有機(jī)氮 源酵母提取物1?1. 5g/L，三因素進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵40h后，分別測(cè)唾液酸的含量，選擇 能使唾液酸含量較高的碳、氮源含量作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳、氮源，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果為下表：
[0058] 表IDesign-Expert軟件設(shè)計(jì)的17組實(shí)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0059]

【權(quán)利要求】
1. 一種發(fā)酵生產(chǎn)唾液酸的方法，其特征在于，是將種子液加入到含有滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基 的發(fā)酵罐中，通過補(bǔ)加流加液和過氧化氫溶液的方式連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)含有聚唾液酸的發(fā)酵 液，再通過離心分離、乙醇沉淀、過濾的方式獲取精制聚唾液酸，再對(duì)聚唾液酸進(jìn)行酸解和 結(jié)晶，最終洗滌凍干后獲得唾液酸粉末。
2. 權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟如下： 1) 發(fā)酵液的制備：將種子液和丙酮酸鈉加入到含有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，發(fā)酵過程 中補(bǔ)加過氧化氫溶液和流加液，并不斷攪拌，發(fā)酵結(jié)束后獲得發(fā)酵液； 2) 聚唾液酸的提取：離心分離步驟1)所得發(fā)酵液，收集上清液并用乙醇溶液沉淀，離 心干燥沉淀物后，再用去離子水復(fù)溶，過濾除去不溶物，再次加入乙醇溶液沉淀，離心后凍 干沉淀，獲得精制聚唾液酸； 3) 聚唾液酸的酸解：利用鹽酸酸解步驟2)所得精致聚唾液酸，再向水解溶液中加入冰 乙酸結(jié)晶，再用冰乙酸洗滌結(jié)晶后，真空干燥獲得唾液酸。
3. 權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，步驟1)所述種子液，制備方法是從大腸桿菌 K235甘油菌中，取100 μ L接種到5mL種子培養(yǎng)基中，37°C，恒溫培養(yǎng)12h，按2%的接種量將 培養(yǎng)好的菌液再接種到含l〇〇mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，37°C，250r/min搖床培養(yǎng) 12h，按2%的接種量再次接到100mL種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)8?10h，培養(yǎng)結(jié)束后獲得發(fā)酵種子 液； 所述種子培養(yǎng)基含有5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，3g/L牛肉膏，pH7. 2-7. 4 ; 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為25g/L山梨醇，2. 5g/L硫酸銨，1. 5g/L酵母提取物，2. 5g/L磷 酸氫二鉀，0. 9g/L無(wú)水硫酸鎂，0. 002g/L無(wú)水硫酸銅，pH7. 6-8. 0,其余成分為蒸餾水； 所述流加液含有307. 17g/L山梨醇，30. 65g/L硫酸銨，pH7. 6-8. 0。
4. 權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，步驟1)所述丙酮酸鈉的添加量為4. 14g/L發(fā)酵 培養(yǎng)基；所述補(bǔ)加過氧化氫溶液是分別在發(fā)酵5、10、15、20h時(shí)按0. 4015、0. 8025U. 605、 1. 605mL/L發(fā)酵培養(yǎng)基的添加量補(bǔ)加；所述補(bǔ)加流加液是在發(fā)酵8h時(shí)按50ml/L發(fā)酵培養(yǎng) 基的添加量補(bǔ)加。
5. 權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，步驟1)所述發(fā)酵，發(fā)酵溫度為37°C，發(fā)酵時(shí)間 40h，pH7. 78,通氣量1V/V · min ;所述攪拌，在發(fā)酵12h前，攪拌速度為400r/min，發(fā)酵12h 后，攪拌速度為600r/min。
6. 權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，步驟2)所述乙醇溶液，第一次沉淀乙醇濃度為 75 %，添加量為3倍體積上清液，第二次沉淀乙醇溶液濃度為95 %，添加量為3倍體積濾液； 所述離心，離心發(fā)酵液轉(zhuǎn)速為8000r/min，離心時(shí)間10min，離心乙醇沉淀液轉(zhuǎn)速為10000r/ min，離心時(shí)間10min。
7. 權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，步驟3)所述酸解是85°C下，用0. 1M鹽酸酸解 2%的聚唾液酸溶液，酸解時(shí)間2h。
8. 權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，步驟3)所述冰乙酸結(jié)晶，冰乙酸添加量為5倍體 積的唾液酸單體溶液，結(jié)晶溫度為4°C，結(jié)晶時(shí)間3d。
9. 權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，具體步驟為： 1)將67. 6mL種子液加入到已滅菌的含有2L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，同時(shí)加入8. 18g 丙酮酸鈉，并分別在發(fā)酵5、10、15、20h后補(bǔ)加0. 803、1. 605、3. 210、3. 210mL的過氧化氫溶 液，在發(fā)酵8h后補(bǔ)加 lOOmL滅菌流加液，發(fā)酵12h前攪拌速度為400r/min，12h后攪拌速度 為600r/min，pH7. 78,在37°C下發(fā)酵40h后，獲得發(fā)酵液； 2) 將步驟1)所得發(fā)酵液在8000r/min轉(zhuǎn)速下離心lOmin，去除菌體，收集上清液，向上 清液中加入3倍體積的75%的乙醇，1000〇1'/111；[11下離心1〇1]1；[11，分離沉淀物并真空干燥，再 將干燥物溶于10倍質(zhì)量的去離子水中，用1. 5%硅藻土助濾劑過濾，向?yàn)V液中加入3倍體積 的95%的乙醇溶液，100001'/1^11下離心101^11，凍干沉淀物，獲得精制聚唾液酸 ； 3) 將步驟2)所得精制聚唾液酸配制成2%的溶液，用0. lmol/L鹽酸，85°C下酸解2h， 得到唾液酸酸解溶液，向唾液酸酸解溶液中加入5倍體積的冰乙酸，4°C下靜置，結(jié)晶3d，再 將晶漿抽濾除去冰乙酸，得到唾液酸晶體，再用5倍質(zhì)量的冰乙酸洗滌晶體，最后將晶體在 50°C下真空干燥4h，得到唾液酸粉末。
【文檔編號(hào)】C12P19/26GK104046671SQ201410285753
【公開日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2014年6月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月24日
【發(fā)明者】劉麗波, 李春, 遲濤, 劉寧, 王敏, 梁婉婷, 祁昕 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)