融合表達離子通道蛋白及運輸?shù)鞍椎姆椒捌涫褂玫牡鞍灼瑪嗟闹谱鞣椒?br> 【專利摘要】本發(fā)明提供了用于融合表達離子通道蛋白及運輸?shù)鞍椎牡鞍灼?，其特征在于：為一種Bril蛋白片段或與該片段序列同源性大于90％的蛋白；或為一種T4L蛋白片段或與該片段序列同源性大于90％的蛋白。本發(fā)明還通過嘗試在離子通道蛋白及運輸?shù)鞍椎腘-末端、C-末端或膜內環(huán)區(qū)插入BRIL，和T4L等融合蛋白片段構建融合蛋白表達質粒，從而改進其體外穩(wěn)定性及可結晶性。成功得到穩(wěn)定性好，表達量高，并可結晶的離子通道及運輸?shù)鞍住?br> 【專利說明】融合表達離子通道蛋白及運輸?shù)鞍椎姆椒捌涫褂玫牡鞍?片斷

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領域，更具體地，本發(fā)明涉及一種融合表達離子通道蛋白及 運輸?shù)鞍椎姆椒捌涫褂玫牡鞍灼瑪唷?br>
【背景技術】
[0002] 離子通道蛋白（Ion channel)是一種成孔蛋白，它通過允許某種特定類型的離子 依靠電化學梯度穿過該通道，來幫助細胞建立和控制質膜間的微弱電壓壓差。這些離子通 道存在于所有細胞的細胞膜上。離子通道按離子分可以分為氯離子通道族，鉀離子通道族， 鈉離子通道族，鈣離子通道族，質子通道族和泛離子通道族
[0003] 運輸?shù)鞍祝╰ransport protein)，能選擇性地使非自由擴散的小分子物質透過質 膜。運輸?shù)鞍啄軌蚴共蝗苡谥慕^大多數(shù)代謝上重要的分子和無機離子，可以有效地進出 活細胞，而且有精細的控制機制，使其在細胞內外達到適度的濃度梯度，形成一定的膜電位 差。運輸?shù)鞍赘鶕?jù)作用方式分成三類：載體蛋白（carrier protein)、通道蛋白（channel protein)、離子泵（ion pump)。
[0004] 由于電壓激活的通道是神經(jīng)沖動的基礎，而傳輸激活的通道則負責觸突之間的信 號傳導，因此離子通道及運輸?shù)鞍自谏窠?jīng)系統(tǒng)里面扮演著極為重要的角色。事實上大多數(shù) 生物的攻擊性或者防御性神經(jīng)毒素，都是通過調整通道的傳導性以及動力學特征，來達到 關閉或者麻痹系統(tǒng)的目的的。此外，離子通道及運輸?shù)鞍讓τ谏婕凹毎锌焖僮兓拇罅?生物學過程也是一個關鍵結構。例如心肌、骨骼肌以及平滑肌的肌肉收縮過程，向上皮傳輸 營養(yǎng)物質和離子，T細胞的激活，以及胰臟beta細胞釋放胰島素的過程。在研究新型藥物 的時候，離子通道及運輸?shù)鞍资且粋€非常常見的研究目標。
[0005] 由于離子通道及運輸?shù)鞍自隗w內具有重要的生理功能，對離子通道及運輸?shù)鞍椎?結構和功能研究一直是一個很重要的研究熱點和難點。然而，天然的離子通道及運輸?shù)鞍?在體外并不穩(wěn)定，很難得到高純度的穩(wěn)定的離子通道及運輸?shù)鞍住?br> [0006] 近年來，有多個研究小組報道了從原核表達系統(tǒng)中純化得到不同種屬的離子通道 蛋白并得到相應的晶體結構。目前的研究主要集中在對來源于原核生物的離子通道及運輸 蛋白，國內外鮮有對人源性的離子通道及運輸?shù)鞍子羞^表達純化和結晶的報道。其主要原 因是因為離子通道蛋白和運輸?shù)鞍卓扇苄院懿睿€(wěn)定性比較低，難以通過體外重組表達得 到大量的穩(wěn)定蛋白用于研究。本發(fā)明提供了一種融合表達離子通道及運輸?shù)鞍椎姆椒?，?應用于解決包括人源性離子通道蛋白和運輸?shù)鞍椎捏w外穩(wěn)定高表達問題。


【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明旨在克服上述缺陷，解決離子通道及運輸?shù)鞍自隗w外重組表達所遇到的問 題，為離子通道及運輸?shù)鞍椎捏w外表達純化，蛋白結晶提供技術平臺，為離子通道及運輸?shù)?白的結構研究和靶向離子通道及運輸?shù)鞍椎乃幬镅邪l(fā)打下基礎。
[0008] 本發(fā)明提供了一種應用BRIL或T4L蛋白片段進行離子通道蛋白及運輸?shù)鞍兹诤?表達的新方法。
[0009] 具體地，本發(fā)明提供了用于融合表達離子通道蛋白及運輸?shù)鞍椎牡鞍灼?，其?征在于：為一種Bril蛋白片段（氨基酸序列23-128,蛋白號：P0ABE7)或與該片段序列同源 性大于90%的蛋白；或為一種T4L蛋白片段（氨基酸序列2-161，蛋白號：P00720)或與該 片段序列同源性大于90 %的蛋白。
[0010] 其中，上述Bril蛋白片段或與該片段序列同源性大于90%的蛋白的氨基酸序列 如SEQ ID N0. 1.1所示；上述T4L蛋白片段或與該片段序列同源性大于90%的蛋白的氨基 酸序列如SEQ ID NO. 1. 2所示。
[0011] 此外，本發(fā)明還提供了上述Bril蛋白片段或與該片段序列同源性大于90%的蛋 白的編碼基因序列如SEQ ID N0. 2.1所示；上述T4L蛋白片段或與該片段序列同源性大于 90%的蛋白的編碼基因序列如SEQ ID N0. 2. 2所示。
[0012] 另外，本發(fā)明還提供了融合表達離子通道蛋白及運輸?shù)鞍椎姆椒ǎ涮卣髟谟冢簩?上述蛋白片段的氨基酸序列插入到離子通道蛋白或運輸?shù)鞍椎腘-末端、C-末端或者膜內 環(huán)區(qū)構建融合蛋白。
[0013] 優(yōu)選地，采用ASIC(酸敏感離子通道）及GLUT1 (葡萄糖轉運蛋白）。
[0014] 具體地，本發(fā)明提供了含序列如SEQ ID NO. 1. 1，和序列如SEQ ID NO. 1. 2所示的 離子通道融合表達蛋白在ASIC(酸敏感離子通道）及GLUT1(葡萄糖轉運蛋白）的應用，即 把上述BRIL，和T4L等蛋白片段插入到ASIC (酸離子通道）及GLUT1 (葡萄糖轉運蛋白） 的不同區(qū)域（N-末端，C-末端或者膜內環(huán)區(qū)）構建融合蛋白。
[0015] 進一步地說，即、將上述Bril蛋白片段與ASIC進行融合表達，得到的融合白蛋氨 基酸序列如SEQ ID NO. 3. 1所示；或將上述T4L蛋白片段與ASIC進行融合表達，得到的融 合白蛋氨基酸序列如SEQ ID N0. 3. 2所示。
[0016] 以及，采用上述Bril蛋白片段構建的ASIC融合表達質粒，其蛋白序列如SEQ ID NO. 4. 1所示；或采用上述T4L蛋白片段構建的ASIC融合表達質粒，其蛋白序列如SEQ ID Ν0· 4· 2 所示。
[0017] 另外，本發(fā)明還將上述Bril蛋白片段與GLUT1進行融合表達，得到的融合白蛋氨 基酸序列如SEQ ID N0. 3. 3所示；或將上述T4L蛋白片段與GLUT1進行融合表達，得到的融 合白蛋氨基酸序列如SEQ ID N0. 3. 4所示。
[0018] 以及，采用上述Bril蛋白片段構建的GLUT1融合表達質粒，其蛋白序列如SEQ ID NO. 4. 3所示；或采用上述T4L蛋白片段構建的GLUT1融合表達質粒，其蛋白序列如SEQ ID Ν0· 4· 4 所示。
[0019] 另外，本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)上述人源性ASIC (酸離子通道）融合表達質?？梢栽诶ハx細 胞（如：SF9、SF21、HiFive等）中表達，人源性GLUT1 (葡萄糖轉運蛋白）融合表達質粒在 哺乳細胞（如：293，CH0等）中表達。
[0020] 將上述中 SEQ ID N0. 4. 1、SEQ ID N0. 4. 2、SEQ ID N0. 4. 3、SEQ ID N0. 4. 4 所示 的基因序列的構建到表達載體如：pFastBacl，PcDNA3. 1，PET21b等上進行蛋白質表達。
[0021] 本發(fā)明的作用和效果:
[0022] 出于提高離子通道蛋白及運輸?shù)鞍卓扇鼙磉_，及蛋白的穩(wěn)定性考慮，本發(fā)明通過 對目標離子通道及運輸?shù)鞍走M行獨特的改造，即、通過嘗試在離子通道蛋白及運輸?shù)鞍椎?N-末端、C-末端或膜內環(huán)區(qū)插入BRIL，和T4L等融合蛋白片段構建融合蛋白表達質粒，從 而改進其體外穩(wěn)定性及可結晶性。成功得到穩(wěn)定性好，表達量高，并可結晶的離子通道及運 輸?shù)啊?br> [0023] 這類蛋白是非常重要的藥物作用靶標蛋白，對這類蛋白的結構研究將有助于未來 靶向離子通道及運輸?shù)鞍椎乃幬锏难芯颗c開發(fā)。值得指出的是，根據(jù)本發(fā)明提供的方法，可 廣泛適用于各種離子通道及運輸?shù)鞍椎难芯俊?br> [0024] 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明構建的融合蛋白既可以在昆蟲細胞中表達，也可以在酵母中 和哺乳動物細胞等細胞中進行表達，具有廣泛的應用范圍。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 附圖1、兩種ASIC1融合蛋白純化后的電泳檢測圖；
[0026] 其中，左圖為T4L-ASIC融合蛋白；右圖為BRIL-ASIC1融合蛋白。
[0027] 附圖2、兩種ASIC1融合蛋白的UPLC檢測圖譜；
[0028] 其中，左圖為T4L-ASIC融合蛋白；右圖為BRIL-ASIC1融合蛋白。
[0029] 附圖3、兩種GLUT1融合蛋白純化后的電泳檢測圖；
[0030] 其中，左圖為T4L-GLUT1融合蛋白；右圖為BRIL-GLUT1融合蛋白。
[0031] 附圖4、兩種GLUT1融合蛋白純化后的電泳檢測圖；
[0032] 其中，左圖為T4L-GLUT1融合蛋白；右圖為BRIL-GLUT1融合蛋白。

【具體實施方式】
[0033] 本領域的技術人員能采用本領域熟知的方法能用于構建含BRIL，和T4L等蛋白片 段的離子通道蛋白及運輸?shù)鞍兹诤媳磉_質粒，這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技 術、體內重組技術等，所構建的離子通道蛋白及運輸?shù)鞍兹诤媳磉_基因序列可以有效地連 接到不同表達載體的適當啟動子上，以指導mRNA合成。
[0034] 構建好的質?？梢杂帽绢I域技術人員熟知的常規(guī)技術轉染或轉化到細胞，如可以 用Bac-to-Bac技術把含融合表達基因的PFastBac載體轉化到SF9細胞中進行表達，轉化 后細胞的培養(yǎng)和病毒的收集和傳代等方法均為本領域技術人員所熟知的常規(guī)技術。
[0035] 實施例1
[0036] ASIC1 (酸敏感通道蛋白）融合蛋白的基因合成
[0037] 化學合成
[0038] BRIL蛋白片段（氨基酸序列如SEQ ID NO. 1. 1所示）、核苷酸模板（SEQ ID NO. 2. 1)
[0039] (5 ' GCTGATCTGGAAGACAATTGGGAAACTCTGAACGACAATCTCAAGGTGATCGAGAAGGCTGACAA TGCTGCACAAGTCAAAGACGCTCTGACCAAGATGAGGGCAGCAGCCCTGGACGCTCAGAAGGCCACTCCACCTAAG CTCGAGGACAAGAGCCCAGATAGCCCTGAAATGAAAGACTTTCGGCATGGATTCGACATTCTGGTGGGACAGATT GATGATGCACTCAAGCTGGCCAATGAAGGGAAAGTCAAGGAAGCACAAGCAGCCGCTGAGCAGCTGAAGACCACC CGGAATGCATACATTCAGAAGTACCTG3'），正向引物為：（5'CCCACCATCGGGCGCGGATCCATGCATCACCA TCATCACCACCATCACGCTGATCTGGAAGACAATTGG3 '），反向引物為：（5 ' CCCCTGAAAGTACAGGITTTCC AGGTACTTCTGAATGTATGC3'），用PCR反應獲得BRIL蛋白片段基因。
[0040] 參考人類基因密碼子，化學合成ASICI核苷酸模板（5'ATGGAACTGAAGGCCGAGGAGGA GGAGGTGGGTGGCGTCCAGCCGGTGAGCATCCAGGCCTTCGCCAGCAGCTCCACACTGCACGGCCTGGCCCACATCT TCTCCTACGAGCGCCTGTCTCTGAAGCGCGCACTGTGGGCCCTGTGCTTCCTGGGCTCCCTGGCTGTGCTGCTGTGT GTGTGCACGGAGCGCGTGCAGTACTACTTCCACTACCACCATGTCACCAAGCTCGACGAGGTGGCTGCCTCTCAGCT TACCTTCCCTGCTGTCACGCTGTGCAACCTCAACGAGTTCCGCTTTAGCCAAGTCTCCAAGAATGACCTGTATCATG CTGGCGAGCTGCTGGCCCTGCTCAACAACAGGTATGAGATACCAGACACACAGATGGCAGATGAAAAGCAGCTGGAG ATACTGCAGGACAAAGCCAACTTCCGCAGCTTCAAACCCAAACCCTTCAACATGCGCGAGTTCTACGACCGCGCTGG CCACGACATTCGCGACATGCTGCTCTCCTGCCACTTCCGCGGCGAGGTCTGCAGCGCTGAAGACTTCAAGGTGGTCT TCACACGCTATGGAAAGTGCTACACGTTCAACTCCGGCCGCGATGGCCGCCCGCGCCTGAAGACCATGAAGGGTGGC ACGGGCAATGGCCTGGAAATCATGCTGGACATCCAGCAGGACGAGTACCTGCCTGTGTGGGGCGAGACTGACGAGAC GTCCTTCGAAGCAGGCATCAAAGTGCAGATCCATAGTCAGGATGAACCTCCTTTCATCGACCAGCTGGGCTTTGGCG TGGCCCCAGGCTTCCAGACCTTTGTGGCCTGCCAGGAGCAGCGCCTCATCTACCTGCCCCCACCCTGGGGCACCTGC AAAGCTGTTACCATGGACTCCGATTTGGATTTCTTCGACTCCTACAGCATCACTGCCTGCCGCATCGACTGTGAGAC GCGCTACCTGGTGGAGAACTGCAACTGCCGCATGGTGCACATGCCAGGCGATGCCCCATACTGTACTCCAGAGCAGT ACAAGGAGTGTGCAGATCCTGCTCTGGACTTCCTGGTGGAAAAGGACCAGGAGTACTGCGTGTGTGAAATGCCTTGC AACCTGACCCGCTATGGCAAAGAGCTGTCCATGGTCAAGATCCCCAGCAAAGCCTCAGCCAAGTACCTGGCCAAGAA GTTCAACAAATCTGAGCAATACATAGGCGAGAACATCCTGGTGCTGGACATTTTCTTTGAAGTCCTCAACTATGAGA CCATTGAACAGAAGAAGGCCTATGAGATTGCAGGCCTCCTGGGTGACATCGGCGGCCAGATGGGCCTGTTCATCGGC GCCAGCATCCTCACGGTGCTGGAGCTCTTTGACTACGCCTACGAGGTCATTAAGCACAAGCTGTGCCGCCGCGGAAA ATGCCAGAAGGAGGCCAAAAGGAGCAGTGCGGACAAGGGCGTGGCCCTCAGCCTGGACGACGTCAAAAGACACAACC CGTGCGAGAGCCTTCGCGGCCACCCTGCCGGCATGACATACGCTGCCAACATCCTGCCTCACCATCCGGCCCGCGGC ACGTTCGAGGACTTTACCTGCTGA3 '），正向引物（5 ' GAAAACCTGTACTTTCAGGGGTCCACACTGCACGGCCT GGCCCACA3'），反向引物（5, CTTGGTACCGCATGCCTCGAGTTACTTGTGCTTAATGACCTCGTAG3'），用 PCR 反應獲得基因 ASICI (25-464)。正向引物（5'CCCACCATCGGGCGCGGATCCATGCATCACCATCA TCACCACCATCACGAAAACCTGTACTTTCAG3 '），反向引物（5 ' CTTGGTACCGCATGCCTCGAGTTACTTGTGC TTAATGACCTCGTAG3'），用 PCR 反應獲得基因 8*His-BRIL(23-128)-TEV-ASICI (25-464)。參 照以上原理進行基因合成，正向引物引入限制性酶切位點BamHI，反向引物引入限制性酶切 位點Xhol和終止密碼子。
[0041] T4L蛋白（氨基酸如序列表1. 2所示）其核苷酸模板如序列表2. 2所示
[0042] (5, AACATCTTCGAGATGCTCCGTATCGACGAGGGCCTCAGGTTGAAGATCTATAAGGACACAGAGGGC TATTACACCATCGGTATTGGTCATCTCTTGACTAAGTCGCCTTCACTTAACGCAGCAAAATCCGAACTGGACAAGGC CATCGGTCGCAATACAAATGGTGTCATTACTAAGGACGAAGCTGAAAAGCTCTTCAACCAGGACGTTGATGCAGCTG TTCGCGGAATCCTGCGCAACGCAAAGCTCAAGCCGGTTTACGATTCTTTGGACGCCGTTCGCCGTGCGGCCTTGATT AACATGGTGTTTCAGATGGGTGAAACCGGAGTTGCAGGATTTACCAACTCGCTGAGGATGCTGCAACAAAAGAGATG GGACGAAGCCGCTGTGAATCTCGCCAAATCTAGGTGGTACAACCAGACACCCAATCGTGCGAAGAGAGTGATAACTA CATTCCGCACCGGTACTTGGGACGCATAT
[0043] 3'），正向引物為：（5' CCCACCATCGGGCGCGGATCCATGCATCACCATCATCACCACCATCACAAC ATCTTCGAGATGCTCCGT3'），反向引物為：（5, CCCCTGAAAGTACAGGITTTCATATGCGTCCCAAGTACCGG TG3'），用PCR反應獲得T4L蛋白片段基因。
[0044] 參考人類基因密碼子，化學合成ASICI核苷酸模板（5'ATGGAACTGAAGGCCGAGGAGGA GGAGGTGGGTGGCGTCCAGCCGGTGAGCATCCAGGCCTTCGCCAGCAGCTCCACACTGCACGGCCTGGCCCACATCT TCTCCTACGAGCGCCTGTCTCTGAAGCGCGCACTGTGGGCCCTGTGCTTCCTGGGCTCCCTGGCTGTGCTGCTGTGT GTGTGCACGGAGCGCGTGCAGTACTACTTCCACTACCACCATGTCACCAAGCTCGACGAGGTGGCTGCCTCTCAGCT TACCTTCCCTGCTGTCACGCTGTGCAACCTCAACGAGTTCCGCTTTAGCCAAGTCTCCAAGAATGACCTGTATCATG CTGGCGAGCTGCTGGCCCTGCTCAACAACAGGTATGAGATACCAGACACACAGATGGCAGATGAAAAGCAGCTGGAG ATACTGCAGGACAAAGCCAACTTCCGCAGCTTCAAACCCAAACCCTTCAACATGCGCGAGTTCTACGACCGCGCTGG CCACGACATTCGCGACATGCTGCTCTCCTGCCACTTCCGCGGCGAGGTCTGCAGCGCTGAAGACTTCAAGGTGGTCT TCACACGCTATGGAAAGTGCTACACGTTCAACTCCGGCCGCGATGGCCGCCCGCGCCTGAAGACCATGAAGGGTGGC ACGGGCAATGGCCTGGAAATCATGCTGGACATCCAGCAGGACGAGTACCTGCCTGTGTGGGGCGAGACTGACGAGAC GTCCTTCGAAGCAGGCATCAAAGTGCAGATCCATAGTCAGGATGAACCTCCTTTCATCGACCAGCTGGGCTTTGGCG TGGCCCCAGGCTTCCAGACCTTTGTGGCCTGCCAGGAGCAGCGCCTCATCTACCTGCCCCCACCCTGGGGCACCTGC AAAGCTGTTACCATGGACTCCGATTTGGATTTCTTCGACTCCTACAGCATCACTGCCTGCCGCATCGACTGTGAGAC GCGCTACCTGGTGGAGAACTGCAACTGCCGCATGGTGCACATGCCAGGCGATGCCCCATACTGTACTCCAGAGCAGT ACAAGGAGTGTGCAGATCCTGCTCTGGACTTCCTGGTGGAAAAGGACCAGGAGTACTGCGTGTGTGAAATGCCTTGC AACCTGACCCGCTATGGCAAAGAGCTGTCCATGGTCAAGATCCCCAGCAAAGCCTCAGCCAAGTACCTGGCCAAGAA GTTCAACAAATCTGAGCAATACATAGGCGAGAACATCCTGGTGCTGGACATTTTCTTTGAAGTCCTCAACTATGAGA CCATTGAACAGAAGAAGGCCTATGAGATTGCAGGCCTCCTGGGTGACATCGGCGGCCAGATGGGCCTGTTCATCGGC GCCAGCATCCTCACGGTGCTGGAGCTCTTTGACTACGCCTACGAGGTCATTAAGCACAAGCTGTGCCGCCGCGGAAA ATGCCAGAAGGAGGCCAAAAGGAGCAGTGCGGACAAGGGCGTGGCCCTCAGCCTGGACGACGTCAAAAGACACAACC CGTGCGAGAGCCTTCGCGGCCACCCTGCCGGCATGACATACGCTGCCAACATCCTGCCTCACCATCCGGCCCGCGGC ACGTTCGAGGACTTTACCTGCTGA3 '），正向引物（5 ' GAAAACCTGTACTTTCAGGGGTCCACACTGCACGGCCT GGCCCACA3'），反向引物（5, CTTGGTACCGCATGCCTCGAGTTACTTGTGCTTAATGACCTCGTAG3'），用 PCR 反應獲得基因 ASICI (25-464)。正向引物（5'CCCACCATCGGGCGCGGATCCATGCATCACCATCA TCACCACCATCACGAAAACCTGTACTTTCAG3 '），反向引物（5 ' CTTGGTACCGCATGCCTCGAGTTACTTGTGC TTAATGACCTCGTAG3'），用 PCR 反應獲得基因 8*His-T4L(2-161)-TEV-ASICI (25-464)。參照 以上原理進行基因合成，正向引物引入限制性酶切位點BamHI，反向引物引入限制性酶切位 點Xhol和終止密碼子。
[0045] PCR 反應條件：在 50 μ L 反應體系中（PCR Buffer, 1. 5mM MgS04, 200 μ M dNTPs)加 入擴增引物各〇. 2μΜ。充分混勻后開始PCR循環(huán)：94°C變性5分鐘，94°C變性30秒，55°C退 火30秒，68°C延伸2分鐘，共進行30個循環(huán)，最后在68°C保溫10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)1. 2% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收后用于克隆。
[0046] 實施例2
[0047] ASIC1 (酸敏感通道蛋白）融合蛋白的質粒構建
[0048] 將實施例1中獲得的PCR片段與經(jīng)過限制性內切酶EcoRI和Xhol雙酶切的載體 pFastBacl(購自Invitrogen)進行連接。連接產(chǎn)物轉化于感受態(tài)大腸桿菌DH5a中，體 積不應超過感受態(tài)細胞的10 %，輕輕旋轉幾次混勻內容物，冰浴30分鐘，將管放入42°C水 浴，定時60秒熱休克，快速將管轉移到冰浴120秒，使細胞冷卻，每管加入400 μ 1 LB培養(yǎng) 基，37°C緩搖60分鐘，使細菌復蘇并表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因，低速離心2分 鐘，去上清，留約100 μ 1培養(yǎng)基在離心管內，重懸菌體，用玻璃鋪菌器將菌液在瓊脂板上鋪 勻。將平板倒置于37°C恒溫培養(yǎng)箱，12-16小時后可出現(xiàn)菌落。涂板后挑取陽性克隆進行 鑒定。
[0049] 實施例3
[0050] ASIC1 (酸敏感通道蛋白）融合蛋白的表達
[0051] 將實施例2中獲得的重組質粒轉化至DHlOBac E. coli感受態(tài)細胞中，體積不應該 超過感受態(tài)細胞的5%，輕輕旋轉幾次混勻內容物。冰浴30分鐘；將管放入42°C水浴，定時 90秒熱休克；快速將管轉移到冰浴120秒，使細胞冷卻；每管加入800ulLB培養(yǎng)基，37°C，緩 搖4小時，使細菌復蘇并表達質粒編碼的抗生素標記基因；用玻璃鋪菌器將30ul菌液在抗 性瓊脂板上鋪勻；將平板倒置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中，30-48小時后可出現(xiàn)藍白斑菌落；挑取 陽性白斑單菌落接入5ml抗性LB，緩搖12-16h，取菌液進行PCR鑒定，結果顯示桿粒重組正 確。將重組桿粒經(jīng)轉染試劑轉染到昆蟲細胞中，4-5天后收取細胞上清液作為第一代桿狀病 毒。用第一代桿狀病毒感染昆蟲細胞72小時后，獲得第二代病毒，用于組合多肽的表達；使 用第二代病毒1: 1〇〇體積比感染密度為2xl(T6/ml的昆蟲細胞sf9,繼續(xù)培養(yǎng)72小時后，離 心收細胞，PBS洗一遍細胞。
[0052] 實施例4
[0053] ASIC1 (酸敏感通道蛋白）融合蛋白的純化
[0054] 用 100ml 預冷的裂解液（25mM Tris ρΗ8· 0, 10mM MgCl2, 20mMKCl)重懸 1L 細胞到 l〇〇m中，用勻漿器在冰上進行勻漿，勻漿后用超速離心機離心45分鐘，去掉上清，重復洗滌 步驟3次，再用高鹽溶液重復洗滌步驟三次，提取好的細胞膜用加甘油的裂解液溶解并用 液氮進行速凍，儲存在-80C冰箱。在冰上融化解凍細胞膜，放置30分鐘后按照每升細胞 膜加入100ml溶膜緩沖液比例加入溶膜緩沖液，并繼續(xù)在冰上放置過夜溶膜，用超速離心 機在100, 000g離心力下離心1小時，棄掉沉淀，上清與lml用平衡緩沖液平衡好的Talon IMAC resin -起孵育過夜，次日，棄上清，加入適量平衡緩沖液重懸填料，將填料轉移到自 流柱里。依次用沖洗緩沖液 1 (25mMTris ρΗ8· 0 ;150mMNaCl ;0· 05% DDM ;5mMMgCl2)洗 10個 柱體積，沖洗緩沖液 2(25mMTris pH8. 0 ;150mMNaCl ;0. 05% DDM ;5mM MgCl2 ; 25mM Imid) 洗 10 個柱體積，沖洗緩沖液 3(25mMTris pH8. 0 ;150mMNaCl ;0· 05% DDM ;5mM MgCl2 ;50mM Imid)洗5個柱體積，然后用5個柱體積的洗脫緩（25mMTris pH8. 0 ;150mMNaCl ;0. 05% DDM;5mM MgCl2;250mM Imid)沖液洗脫目的蛋白，純化后得到的目的蛋白保存在-80°C，圖 1位三種融合蛋白的電泳檢測結果。
[0055] 從得率來看，經(jīng)純化后3種膜蛋白的得率都超過lmg/L細胞，具有較高的產(chǎn)率。
[0056] 實施例5
[0057] 發(fā)明融合ASIC1 (離子通道蛋白）蛋白均一性檢測
[0058] 采用Waters公司的Acquity Η-Class Bio UPLC系統(tǒng)進行檢測，檢測所用柱子 為S印ax SEC250分子篩柱，上樣前先用平衡緩沖液（25mMTris pH8. 0 ;150mMNaCl ;0. 05% DDM ;5mM MgCl2)洗柱子至基線沒有太大變化止，然后將待檢測的樣品加入專用的96孔板中 上樣，積分處理采用儀器自帶的軟件。
[0059] 按照上述方法對三種融合蛋白分別進行了檢測，結果如圖2所示，三種融合蛋白 均一性都很好，能夠檢測到融合蛋白單體峰，且單體占蛋白樣品的大部分。
[0060] 實施例6
[0061] GLUT1 (葡萄糖轉運蛋白）融合蛋白的基因合成
[0062] T4L蛋白（氨基酸如序列表1. 2所示）其核苷酸模板如序列表2. 2所示
[0063] (5, AACATCTTCGAGATGCTCCGTATCGACGAGGGCCTCAGGTTGAAGATCTATAAGGACACAGAGGGC TATTACACCATCGGTATTGGTCATCTCTTGACTAAGTCGCCTTCACTTAACGCAGCAAAATCCGAACTGGACAAGGC CATCGGTCGCAATACAAATGGTGTCATTACTAAGGACGAAGCTGAAAAGCTCTTCAACCAGGACGTTGATGCAGCTG TTCGCGGAATCCTGCGCAACGCAAAGCTCAAGCCGGTTTACGATTCTTTGGACGCCGTTCGCCGTGCGGCCTTGATT AACATGGTGTTTCAGATGGGTGAAACCGGAGTTGCAGGATTTACCAACTCGCTGAGGATGCTGCAACAAAAGAGATG GGACGAAGCCGCTGTGAATCTCGCCAAATCTAGGTGGTACAACCAGACACCCAATCGTGCGAAGAGAGTGATAACTA CATTCCGCACCGGTACTTGGGACGCATAT
[0064] 3'），正向引物為：（5' CCCGTTTCTGCTAGCAAGCTTACCATGAACATCTTCGAGATGCTCCGTAT C3'），反向引物為：（5, CAGCTTCTTGCTGCTGGGCTCCATATATGCGTCCCAAGTACCGGTGC3'），用 PCR 反應獲得T4L蛋白片段基因。
[0065] 參考人類基因密碼子，化學合成GLUT1模板（5' ATGGAGCCCAGCAGCAAGAAGCTGACGG GTCGCCTCATGCTGGCCGTGGGAGGAGCAGTGCTTGGCTCCCTGCAGTTTGGCTACAACACTGGAGTCATCAATGCC CCCCAGAAGGTGATCGAGGAGTTCTACAACCAGACATGGGTCCACCGCTATGGGGAGAGCATCCTGCCCACCACGCT CACCACGCTCTGGTCCCTCTCAGTGGCCATCTTTTCTGTTGGGGGCATGATTGGCTCCTTCTCTGTGGGCCTTTTCG TTAACCGCTTTGGCCGGCGGAATTCAATGCTGATGATGAACCTGCTGGCCTTCGTGTCCGCCGTGCTCATGGGCTTC TCGAAACTGGGCAAGTCCTTTGAGATGCTGATCCTGGGCCGCTTCATCATCGGTGTGTACTGCGGCCTGACCACAGG CTTCGTGCCCATGTATGTGGGTGAAGTGTCACCCACAGCCCTTCGTGGGGCCCTGGGCACCCTGCACCAGCTGGGCA TCGTCGTCGGCATCCTCATCGCCCAGGTGTTCGGCCTGGACTCCATCATGGGCAACAAGGACCTGTGGCCCCTGCTG CTGAGCATCATCTTCATCCCGGCCCTGCTGCAGTGCATCGTGCTGCCCTTCTGCCCCGAGAGTCCCCGCTTCCTGCT CATCAACCGCAACGAGGAGAACCGGGCCAAGAGTGTGCTAAAGAAGCTGCGCGGGACAGCTGACGTGACCCATGACC TGCAGGAGATGAAGGAAGAGAGTCGGCAGATGATGCGGGAGAAGAAGGTCACCATCCTGGAGCTGTTCCGCTCCCCC GCCTACCGCCAGCCCATCCTCATCGCTGTGGTGCTGCAGCTGTCCCAGCAGCTGTCTGGCATCAACGCTGTCTTCTA TTACTCCACGAGCATCTTCGAGAAGGCGGGGGTGCAGCAGCCTGTGTATGCCACCATTGGCTCCGGTATCGTCAACA CGGCCTTCACTGTCGTGTCGCTGTTTGTGGTGGAGCGAGCAGGCCGGCGGACCCTGCACCTCATAGGCCTCGCTGGC ATGGCGGGTTGTGCCATACTCATGACCATCGCGCTAGCACTGCTGGAGCAGCTACCCTGGATGTCCTATCTGAGCAT CGTGGCCATCTTTGGCTTTGTGGCCTTCTTTGAAGTGGGTCCTGGCCCCATCCCATGGTTCATCGTGGCTGAACTCT TCAGCCAGGGTCCACGTCCAGCTGCCATTGCCGTTGCAGGCTTCTCCAACTGGACCTCAAATTTCATTGTGGGCATG TGCTTCCAGTATGTGGAGCAACTGTGTGGTCCCTACGTCTTCATCATCTTCACTGTGCTCCTGGTTCTGTTCTTCAT CTTCACCTACTTCAAAGTTCCTGAGACTAAAGGCCGGACCTTCGATGAGATCGCTTCCGGCTTCCGGCAGGGGGGAG CCAGCCAAAGTGACAAGACACCCGAGGAGCTGTTCCATCCCCTGGGGGCTGATTCCCAAGTGTGA3'），正向引物 (5, ATGGAGCCCAGCAGCAAGAAGCTG3'），反向引物（5, ATGATGGTGGTGATGGTGGTGATGGTGGTGTGTC TTGTCACTTTGGCTGGCTC3'），用 PCR 反應獲得基因 GLUT1 (1-478)。正向引物（5'CCCGTTTCTGC TAGCAAGCTTACCATGAACATCTTCGAGATGCTCCGTATC3 '），反向引物（5 ' GGTCGAGGTCGGGGGATCCTTA ATGATGGTGGTGATGGTGGTGATG3'），用 PCR 反應獲得基因 T4L-GLUT1 (l-478)-10*His。參照以 上原理進行基因合成，正向引物引入限制性酶切位點Hindlll，反向引物引入限制性酶切位 點BamHI和終止密碼子。
[0066] BRIL蛋白片段（氨基酸序列如序列表1. 1所示）核苷酸模板（序列表2. 1)
[0067] (5, GCTGATCTGGAAGACAATTGGGAAACTCTGAACGACAATCTCAAGGTGATCGAGAAGGCTGACAA TGCTGCACAAGTCAAAGACGCTCTGACCAAGATGAGGGCAGCAGCCCTGGACGCTCAGAAGGCCACTCCACCTAAG CTCGAGGACAAGAGCCCAGATAGCCCTGAAATGAAAGACTTTCGGCATGGATTCGACATTCTGGTGGGACAGATT GATGATGCACTCAAGCTGGCCAATGAAGGGAAAGTCAAGGAAGCACAAGCAGCCGCTGAGCAGCTGAAGACCACC CGGAATGCATACATTCAGAAGTACCTG3'），正向引物為：（5' GCTGATCTGGAAGACAATTGGGAAAC3'）， 反向引物為：（5, CAGGTACTTCTGAATGTATGCATTC'），用PCR反應獲得BRIL蛋白片段基因。
[0068] 參考人類基因密碼子，化學合成GLUT1核苷酸模板（5'ATGGAGCCCAGCAGCAAGAAGCT GACGGGTCGCCTCATGCTGGCCGTGGGAGGAGCAGTGCTTGGCTCCCTGCAGTTTGGCTACAACACTGGAGTCATCA ATGCCCCCCAGAAGGTGATCGAGGAGTTCTACAACCAGACATGGGTCCACCGCTATGGGGAGAGCATCCTGCCCACC ACGCTCACCACGCTCTGGTCCCTCTCAGTGGCCATCTTTTCTGTTGGGGGCATGATTGGCTCCTTCTCTGTGGGCCT TTTCGTTAACCGCTTTGGCCGGCGGAATTCAATGCTGATGATGAACCTGCTGGCCTTCGTGTCCGCCGTGCTCATGG GCTTCTCGAAACTGGGCAAGTCCTTTGAGATGCTGATCCTGGGCCGCTTCATCATCGGTGTGTACTGCGGCCTGACC ACAGGCTTCGTGCCCATGTATGTGGGTGAAGTGTCACCCACAGCCCTTCGTGGGGCCCTGGGCACCCTGCACCAGCT GGGCATCGTCGTCGGCATCCTCATCGCCCAGGTGTTCGGCCTGGACTCCATCATGGGCAACAAGGACCTGTGGCCCC TGCTGCTGAGCATCATCTTCATCCCGGCCCTGCTGCAGTGCATCGTGCTGCCCTTCTGCCCCGAGAGTCCCCGCTTC CTGCTCATCAACCGCAACGAGGAGAACCGGGCCAAGAGTGTGCTAAAGAAGCTGCGCGGGACAGCTGACGTGACCCA TGACCTGCAGGAGATGAAGGAAGAGAGTCGGCAGATGATGCGGGAGAAGAAGGTCACCATCCTGGAGCTGTTCCGCT CCCCCGCCTACCGCCAGCCCATCCTCATCGCTGTGGTGCTGCAGCTGTCCCAGCAGCTGTCTGGCATCAACGCTGTC TTCTATTACTCCACGAGCATCTTCGAGAAGGCGGGGGTGCAGCAGCCTGTGTATGCCACCATTGGCTCCGGTATCGT CAACACGGCCTTCACTGTCGTGTCGCTGTTTGTGGTGGAGCGAGCAGGCCGGCGGACCCTGCACCTCATAGGCCTCG CTGGCATGGCGGGTTGTGCCATACTCATGACCATCGCGCTAGCACTGCTGGAGCAGCTACCCTGGATGTCCTATCTG AGCATCGTGGCCATCTTTGGCTTTGTGGCCTTCTTTGAAGTGGGTCCTGGCCCCATCCCATGGTTCATCGTGGCTGA ACTCTTCAGCCAGGGTCCACGTCCAGCTGCCATTGCCGTTGCAGGCTTCTCCAACTGGACCTCAAATTTCATTGTGG GCATGTGCTTCCAGTATGTGGAGCAACTGTGTGGTCCCTACGTCTTCATCATCTTCACTGTGCTCCTGGTTCTGTTC TTCATCTTCACCTACTTCAAAGTTCCTGAGACTAAAGGCCGGACCTTCGATGAGATCGCTTCCGGCTTCCGGCAGGG GGGAGCCAGCCAAAGTGACAAGACACCCGAGGAGCTGTTCCATCCCCTGGGGGCTGATTCCCAAGTGTGA
[0069] 3，），正向引物（5，CCCGTTTCTGCTAGCAAGCTTACCATGGAGCCCAGCAGCAAGAAGCTG3，）， 反向引物（5 ' GTTTCCCAATTGTCTTCCAGATCAGCCTTGGCCCGGTTCTCCTCGTTG3 '），用 PCR 反應獲得 基因 GLUTl(l-225),正向引物（5'GAATGCATACATTCAGAAGTACCTGGAGAAGAAGGTCACCATCCTGGA GC3 '），反向引物（5 ' ATGATGGTGGTGATGGTGGTGATGGTGGTGCACTTGGGAATCAGCCCCCA3 '），用 PCR 反應獲得基因 GLUTl(254-492)。正向引物（5, CCCGTTTCTGCTAGCAAGCTTACCATGGAGCCCAGCA GCAAGAAGCTG3'），反向引物（5, GGTCGAGGTCGGGGGATCCTTAATGATGGTGGTGATGGTGGTGATG3'）， 用 PCR 反應獲得基因 GLUT1 (1-225) -BRIL (130-233) -TEV-GLUT1 (254-492) -10*His。參照以 上原理進行基因合成，正向引物引入限制性酶切位點Hindlll，反向引物引入限制性酶切位 點BamHI和終止密碼子。
[0070] 實施例7
[0071] 本發(fā)明GLUT1 (葡萄糖轉運蛋白）的表達
[0072] 將實施案例4中l(wèi)mg GLUT1質粒溶解于50ml Opti-MEM培養(yǎng)集中，混勻·并與 3ml PEI (lmg/ml)溶于500pti-MEM培養(yǎng)集中，混勻，室溫孵育15分鐘后加入到1L細胞密度 為1. 2xl06cells/ml293F細胞中。37°C，5% C02培養(yǎng)72小時，收細胞沉淀。
[0073] 實施例8
[0074] 發(fā)明GLUT1 (運輸?shù)鞍祝┑募兓?br> [0075] 用 20ml 預冷的裂解液（50mM Tris ρΗ7· 5, 200mM NaCl, 5% glycerol)重懸 300mL 細胞到20mL中，用勻漿器在冰上進行勻漿，勻漿后用超速離心機離心50分鐘，去掉上清，重 復洗滌步驟3次，再用高鹽溶液（50mM Tris pH7. 5, 1M NaCl，5% glycerol)重復洗滌步驟 兩次。提取好的細胞膜按照每300mL細胞加入20mL溶膜緩沖液比例加入溶膜緩沖液（50mM Tris ρΗ7· 5, 200mM NaCl，5% glycerol，1% DDM)，用勻漿器在冰上進行勻漿，并用磁力攪 拌器在4°C過夜攪拌溶膜，用超速離心機在100, 000g離心力下離心1小時，棄掉沉淀，上清 與 lmL 用平衡緩沖液（50mM Tris pH7.5,200mM NaCl，5% glycerol，0.05%DDM)平衡好 的Talon IMAC resin -起孵育3hrs，棄上清，加入適量平衡緩沖液重懸填料，將填料轉移 到自流柱里。依次用沖洗緩沖液 l(250mM Tris pH7.5,200mM NaCl，5%glycerol，0.05% DDM)洗 10 個柱體積，沖洗緩沖液 2(50mM Tris pH7.5,200mM NaCl，5%glycerol，0.05% DDM，20mM imidazole)洗 10 個柱體積，沖洗緩沖液 3(50mM Tris pH7.5,200mM NaCl，5% glycerol，0. 05% DDM, 50mM imidazole)洗5個柱體積，然后用5個柱體積的洗脫緩（50mM Tris ρΗ7· 5, 200mM NaCl, 5% glycerol，0.05% DDM，250mM imidazole)沖液洗脫目的蛋白， 純化后得到的目的蛋白濃縮至400uL保存在-80°C。圖3位三種融合蛋白的電泳檢測結果。
[0076] 從得率來看，經(jīng)純化后2種GLUT1融合蛋白的得率都超過0. 5mg/L細胞，具有較高 的產(chǎn)率。
[0077] 實施例9
[0078] 發(fā)明GLUT1 (葡萄糖轉運蛋白）融合蛋白均一性檢測
[0079] 采用Waters公司的Acquity Η-Class Bio UPLC系統(tǒng)進行檢測，檢測所用柱子 為S印ax SEC250分子篩柱，上樣前先用平衡緩沖液（25mMTris pH8. 0 ;150mMNaCl ;0. 05% DDM ;5mM MgCl2)洗柱子至基線沒有太大變化止，然后將待檢測的樣品加入專用的96孔板中 上樣，積分處理采用儀器自帶的軟件。
[0080] 按照上述方法對三種融合蛋白分別進行了檢測，結果如圖4所示，2種GLUT1融合 蛋白的均一性都很好，能夠檢測到融合蛋白單體峰，且單體占蛋白樣品的大部分。
[0081] 序列表 SEQUEIs'CE LIST!KG <110> 維亞生物科技I上海）有跟公司 <120> ?合表途?予通道蛋# JJtlt蛋自購方*及其使用縫蚤由爲斷 <130> 2U14 <160> 38 <!?0> Patentln version 3,3 <2H)> 1 <211> 1116 <2I2> PRT <21i> BIUL 蛋白 <m> i Ain k$p Leu Clu Asp Axn Trp Clu Tlir Lou Asn Asp Asn Leu Lys VnI 1 5 10 15 lie Glu Lfs Ala Asp Asji Ala Ala Gin Vil Lfi Asp ila L參? Thr Lys 20 25 30 iei Arg Alt Ala Ala Leu Asp Alt Gin Lyi Alt Thr Pro Pro Lys leu 35 40 45 Glu Asp Lys Scr Pru Asp Scr Pro GIu Mci Lyn Asp fhc Arg His Clly 58 55 60 Flic Asp 11c Leu VaI (Hy Gin lie Asp ：\$p Ala Leu lys Leu Ah Asn
[0082] 65 7β 75 80 Ghi Gly Lys hi Lys Gii義 Ala CUn Ala Ala Ahi Giu ()1ιι ixu Lys Tlu 85 90 95 Thr Arp Asn Ala Tyr lie Gin Lys Tyr Leu 1關 ?5 <210> 2 <211> 160 <212> PRT <213> T4L 蛋白 <40β> 2 Asn lie Phe Glu Met Leu Arg lie Asp Giu Gly Leu Arg Leu Lys lie 15 10 15 Tyr Lys Asp Thr Glu Gly Tyr Tyr Thr lie- C]y I le Gly His Leu Leu 20 25 30 Thr Lys Ser Pro Ser Leu Asn Ala Ala Lys Ser Glu Leu Asp Lys Ala 35 40 45 lie Cly Arg Asn Thr Asn Gly Val lie Thr Lys Asp Glu Ala Glu Lys 50 55 m Leu Phe Asa Gin Asp Val Asp Ala Ai翁 V魏1 Arg Cly lie Leu Arg Asn 65 70 75 80
[0083] Ala Lys Leu Lys Pro Val Tyr Asp Ser Leu Asp Ala Val Arg Arg Ala 85 90 95 Ala Leu lie Asn Met Val Phe Gin Met Gly Glu Thr Gly Val Ala Gly 100 105 110 Fhc Thr Asn Scr Leu Arg Mei Leu Gin Gin Lys Arg Trp Asp Glu Ala 115 120 125 Ala Val Asn Leu Ala Lys Ser Arg Trp Tyr Asn Gin Thr Pro Asn Arg 130 135 140 Ala Lys Arg Val lie Thr Thr Phc Arg Thr Cly Thr Trp Asp Ala Tyr 145 150 155 160 <210〉 3 <211〉 318 <212> DKA <213> BRIL 蛋白 <400> 3 gctgatcigg aagacaattg ggaaactctg aacgacaaic tcaaggtgai cgagaaggci 60 gacaalgctg cacaagicaa agacgcicig accaagaiga gggeageage cciggacgci 120 cagaaggcca ctccacctaa gcicgaggac aagagcccag atagccctga aatgaaagac 180 tiicggcaig galicgacai iciggtggga cagaiigatg atgcacicaa gctggccaal 240
[0084] gaagggaaag icaaggaagc acaagcagcc gcigagcagc tgaagaccac ccggaaigca iacaitcaga agiaccig 318 <210> 4 <211> 徹 <212> m：\ <2〗3> m蛋白 <棚> 4 mcaici icg aga igciccg iuicgacgag ggcctxaggi igiiagalcui luaggacucii 60 paggficla 11 acacca tcp5g ialigjua.1 i ciciigacui agicgcclic nciimc^cn 120 geawateeg awtggaeaa ggeeateggt egMataeaa atggtgleat taetwggae 181) gaagotgaaa agetetteaa scaggaegtt gatgsigstg tlegcggaat eelgogeaae 240 gcaaagcica agccggi1ia cgaiiciiig gacgccgiic gccgigcggc ciigaitaac 3M atggtgilie agaigggiga aaccggagii gcaggaiiu-i ocaaciogct gaggaigoig 360 cuactuuiuga gaigggacga a gc cgc i g t g a a t c i c gcca aa ixtaggig gtacaaccag 4211 aGaceaiau， gigcgaagag Hgigalaacrl aeal iccgcu ccrgglacug ggacgcalai 48(1 <2H)> 5 <21 J> 562 <212> PRT <2i3> ASICI蛋白與臟IL蛋命_?表達 <_> 5 Met His ils His His His Ills His Bis Ala Asp Leu Clu Asp Asn Trp
[0085] 15 ΙΟ 15 Glu Thr Leu Asn Asp Asji Leu Lys VaJ He Cilu Lys Ala Asp Asn Ala 20 25 30 Ala Oln Val Lys Asp Ala Leu Thr Lys Me! htf, Ata Ala Ala Leu Asp BS 40 45 Ala filn Lys Ala Tlir Pro Pro Lys Leu Ciu Asp Lys Scr Pro Asp Scr 50 55 60 Pro Clu Met Lys Asp Phe Arg HiJ Gly PM Asp 1? Leu Val Gly Gin 65 70 75 80 lie Asp Asp Ala Leu Lys Leu Ala Asn Clu fily Lys Val Lys (ilu Ala 85 90 95 (;ln 41a Ala Ala Glu (Πη Lys Thr llir Arg Asn Ala Tyr lie (;ln 100 IttS 110 Lys Tyr Leu Glu Asn Leu Tyr Phe Gin Gly Ser Thr Leu IHs G1 y Leu 115 120 125 Ala His lie Phe Ser Tyr C!ly Arg Ley Scr leu Lys Arg Ala Leu Trp 130 135 14tt Ala Leu Cys Phe Leu Cly Ser Leu Ala Val Lou Leu Cys Val Cys 丁hr
[0086] 145 150 155 160 Glu Arg Val Gin Ijr Tyr Phe lis Tji His His ￥al Thr Lys Leu Asp 165 170 175 Glu Val Ala A1 a Scr Gin Leu 丁hr Phc Pro A1 a Va1 丁hr Leu Cys Asn 180 185 190 Leu Asn Glu Phe Arg Phe Ser Gin fal Ser Lys Am Asp Leu Tyr His 195 200 20S Ms Giy Glu Leu Lw Ala Leu L_ Asn Asn Arg Tyr Glu lie Pro Asp 210 215 220 Tlir Gin Mcl Ala Asp Glu Lys Gin Leu Glu I Ic Leu Gin Asp Lys Aia 225 230 235 240 Asn Phc Arg Scr Phc Lys Pro l.ys Pro Phc Asn Met Arg Glu Phc Tyr 245 250 255 Asp Arg Ala Gly His Asp lie Arg Asp Mei Leu Leu Scr Cys His Phc 260 265 270 Arg Gly Glu ￥al Cjs Ser Ala 6Iu Asp Ph? Lys Val Vtl Phe Thr Arg 275 280 285 Tyr Gly Lys Cys Tyr Thr Phc Asn Scr Gly Arg Asp Gly Arg Pro Arg
[0087] 290 295 300 Leu Lys Thr Met Lys Gly Gly Tlir Giy Asn Gly Lou GIu lie Met Leu 305 310 315 320 Asp 1 Ic Gin Gin Asp GIu Tyr Leu Pro Val Trp Gly Glu Thr Asp Glu 325 330 335 Thr Scr Phe Glu Ala Gly He Lys Val (Un Ho His Scr (tin Asp filu 340 345 350 Pro Pro Phe lie Asp Gin Leu GIj Phe Gly ￥al Alt Pro Gly Phe Gin 355 360 365 Tlir Phe Va 1 Ala Cys Gin C1 u Gin Arg Leu I Ic Tyr Leu Pro Pro Pro 370 375 380 Trp (rly Tor Cys Lys Ala Val Thr Mci Asp Scr Asp Leu Asp Phe Phe 3§5 390 395 400 Asp Scr Tyr Scr Uc 丁hr Ala Cys Arg lie Asp Cys Glu Thr Arg 丁yr 405 410 415 hm Vtl Glu Asn Cys Asn Cys Arg Met ￥al His Mat Pro Crly Asp Ala 420 425 430 Pro Tyr Cys Tbr Pro Giu Gin Tfr Lys Glu Cys Alt Asp Pw Ala Lmi
[0088] 435 440 445 Asp Phc Leu Val (ilu Lys Asp Gin Glu Tyr Cys Cys Cllu Mel Pro 450 455 4611 Cys Asn Leu Thr Arg Tyr Giy Lys Glu Leu Scr Met Va] Lys lie Pro 465 470 475 480 Scr l.-ys A1 a Scr Ala Lys Tyr [,cn Alu l.ys Lys Phc Asn Lys Scr Ghs 485 490 495 GIe Tyr IIc Giy Glu Asn lie Leu Va] Leu Asp 1lo Phc Phc Glu Val 500 505 510 Leu Asn Tyr Clu Thr lie Olu Cln Lys Lys Ala Tyr Glu IJc Ala fily 515 520 525 Leu Leu Gly Asp lie GJy (；ly Gin Mel CHy Leu Phc lie Gly Ala Scr 530 535 540 lie Leu Thr Va1 Leu Glu Leu Phc Asp Tyr Ala Tyr Glu Val Ilc Lys 545 550 555 560 Hs Lys <210> 6
[0089] <211> 616 <212> PRT <213> ASICI蛋臺與了禮融合表達 <400> 6 Met His His His His His Ills His His Asn lie Phe Glu Mci Leu Arg 1 5 10 15 i!c Asp Glu Gly Leu Arg Leu Lys lie Tyr Lys Asp Thr Glu Gly Tyr 20 25 30 Tyr Thr lie Gly lie Gly His Leu Leu Thr Lys Ser Pro Ser Leu Asn 35 40 45 Ala Wa Lys Ser Glu Leu Asp Lys Ala lie Gly Arg Asn Hu Asn Giy 50 55 60· Val lie Thr Lys Asp Glu Ala Glu Lys Leu Phe Asn Gin Asp Val Asp 65 70 75 80 Λ1 a Ala Val Arg Gly 11c I.cu Arg Asn Ala Lys Leu i.ys Pro Val Tyr 85 90 95. Asp Ser Leu Asp Ala Val Arg Arg Ala Ala Leu lie Asn Met Val Phe 100 105 110 Gin Mci Gly Glu Thr Gly Val Ala Gly Phe Thr Asn Scr Leu Arg Mci 115 120 125
[0090] Leu Gin Gin Lys Arg frp Asp Glu Ala Alt Vai km Leu Ala Lys Ser 130 135 140 Arg Trp Tyr Asn Gin Thr Pro Asn Arg Ala Lys Arg Val lie Thr Tin 145 150 155 160 Ptie Arg Thr Gly Thr Trp Asp Ala Tyr Glu Asn Leu Tyr Phe Gin Giy 165 170 175 Scr Thr Leu Ilis Gly Leu Ala IHs lie Phe Ser Tyr Glu Arg Leu Ser 180 185 190 Leu Lys Arg Ala Leu Trp Ala Leu Cys Phe Leu Gly Scr Leu Ala Val 195 200 205 Leu Leu Cys \'al Cys Thr C;lu Arg Val (;ln Tyr Tyr Phe His Tyr llis 210 215 220 If is Val Thr Lys Leu Asp Glu Val Ala Ala Scr Gin Leu Thr Fhc Fro 225 230 235 240 A1 a Va1 Thr Leu Cys Asn Leu Asn Giu Phe Arg Phe Ser Gin Val Scr 245 250 255 Lys Asn Asp Leu TTyr IIis Ala Gly Glu lx? Leu Ala Leu Leu Asn Asn 260 265 270
[0091] Arg Tyr Glu lie Pro Asp flir Gin Met Alt Asp GIu Lys Gin Leu Glu 275 280 285 I]〇 Leu (;】n Asp Lys Ala Asn Phc Arg Scr Phc Lys Pro Lys Pro Phc 290 295 300 Asn Met Arg Glu Phc Tyx Asp Arg Ala Gly llis Asp lie Arg Asp Met 305 310 315 320 Leu Leu Scr Cys llis Fhe Arg Gly Glu Val Cvs Scr Ala Glu Asp Phc 325 m) 335 Lys ￥al ￥al Phe Thr Arg Tyr Gly Lys Cys Tyr Thr Phe Asn Ser Gly 340 345 350 Arg Asp Gly Arg Pro Arg Leu Lys Thr Met Lys Gly Gly Thr Gly Asn 355 360 365 Gly Leu Glu lie Mci Leu Asp lie Gin Gin Asp Glu Tyr Leu Pro Val 370 375 380 Trp Gly Glu Thr Asp Glu Thr Ser Phe Glu Ala Gly He Lys Val 61a 385 390 395 400 lie His Ser Gin Asp Glu Pro Pro Phe He Asp Gin Leu Glj· Phe Cily 405 410 415
[0092] Val Ala Pro Gly Pile Gin Thr Phe Val Ala Cys Gin Glu Gin Arg Leu 420 425 430 He Tyr Leu Pro Pro Pro Trp CHy Thr Cys Lys Ala Val Thr Met Asp 435 440 445 Scr Asp Leu Asp Phe Phe Asp Scr Tyr Scr He Thr A1 a Cys Arg lie 450 455 460 Asp Cys Glu Thr Arg Tyr Leu Val Ghi Asn Cys .Asn Cys Arg Mci Val 465 470 475 480 I!is Mel Pro Gly Asp Ala Pro Tyr Cys Thr Pro Glu Gin Tyr Lys Glu 485 490 495 Cys Ala Asp Pro Ala Leu Asp Phe Leu Va1 Glu Lys Asp Gin Glu Tyr 500 505 510 Cys Val Cys Glu Mci Pro Cys Asn Leu Thr Arg Tvr Gly Lys Glu Leu 515 520 525 Ser Met Val Lys lie Pro Ser Lys Ala Ser Ala Lys Tyr Leu Ala Lys 530 535 540 Lys Phe Asn Lys Ser Glu Gin Tyr 11e Gly Glu Asn lie Leu Val Leu 545 550 555 560
[0093] Asp 1le Phc Phc GIu Val Leu Asn Tyr Glu Thr lie GIu Gin Lys Lys 565 570 575 AI a Tyr Ciu 11 c Ala (i I y Leu Leu Civ Asp lie (? I y Gi y fiI n Met G1 y 580 585 590 Leu Phc He (?ly Ala Scr ilc Leu Thr Val Leu Ghi Ley Phc Asp Tyr 595 600 605 Ala Tyr Glu Val lie Lys llis Lys 610 615 <2!0> 7 <211> 1689 <212> DNA <213> ASIC1蛋白與BML融合蛋白 <400> 7 atgeaicacc a tealcaeca ccaicacgci gaiciggaag acaaliggga aactcigaac 60 gacaatctca aggtgatcga gaaggctgac aatgctgcac aagtcaaaga cgctctgacc 120 aagatgaggg cagcagccci ggacgcicag aaggccacic cacciaagct cgaggacaag 180 agcccagala gcccigaaai gaaagacili cggcaiggal ic+gacai.lei. ggigggacag 240 atigatgaLg cacicaagci ggccaalgaa gggaaagtca aggaagcaca agcagccgct 300 gagcagctga agaccacccg gaalgcatac aitcagaagl acctggaaaa cciglaciu 360
[0094] caggggtcca cacigcacgg cctggcccac afc?!cfcct acgagcgcci gtclclgaag 420 cgcgcacigt gggccctgtg citxcigggc iccciggcig igcigcigig igigtgcacg 480 gagcgcglgc aglaciact t ccaclaccac ca Iglc-acca agclcgficga gglggcigcc 540 tctcagclta ccliccctgc igtcacgcig igcaaccica acgagliccg cillagccaa 600 glctccuagu aigacctgta icnlgciggc gagcigcigg cccigc-icaa aiaengguil 660 gagaiaccag acacacagat ggcagalgaa gcagcigg agaiacigca ggacaaagcc 720 aacticcgca gcticaaacc caaaccctic aacaigcgcg iigUcuicga ccgcgciggc 780 cacgacattc gcgacatgci gctcicctgc caeUecgeg gcgagglctg cagcgcigaa 840 gacticaagg iggtcucac acgciatgga aagigciaca cgiicaacic cggccgcgat 900 ggccgcccgc gcctgaagac catgaagggi ggcacgggca atggccigga aateaigclg 960 gacateeage aggacgagta eetgeetgLg tggggegaga etgaegagae gteettegaa 1020 gcaggcatca aagtgcagat cc-ataglcag gatgaacc-tc ctttcatcga c-cagctgggc 1080 tttggcgtgg cccoaggctt ccagaccttf gtggcctgcc aggagcagcg cctcatctac 1140 cigcccccac ectggggcac cigcaaagct guaecaigg aciccgaiu ggaiitcuc 1200 gactcctaca gcaicactgc cigccgcaic gaciglgaga cgcgciacct ggtggagaac 1260 tgcaactgcc gcatggtgca catgccaggc gatgccccat aotgtaetcc agagcagtac 1320 aaggagtgtg cagatcctge tctggactto etggtggaaa aggaceagga gtactgcgtg 1380 tgtgaaitgc cttgcaacct gacccictat igcaaigage tgtccatigt caagatcccc 1440
[0095] agCAiageot eagccaagta cctggceaag Mgttcaaca tatctgtgca ttacataggc 1500 gagaacalee tggtgctgga ca H 11cU l gnagicclc.i acin LgHgac t ig?ac?g 156(1 aagaaggcci algaga t tgc aggcctcctg ggigacatcg gcggccagal gggcctgt tc 1620 aicggcgcca gcatcctcac ggigclggag ctctugact acgcciacga ggtcatlaag 1680 cac.aagiaa 1689 <210> 8 <21l> 1851 <212> DNA <2]3> ASICI蛋白與了4L融合蛋白 <400> S aigcatcacc aicaicacca ccfUCiHcaat: a let legaga tgctccgtat egaegaggge 60 cicaggiiga agatciaiaa ggacacagag ggciauaca ccatcggiat iggicaicic 120 ttgactaagt cgccttcact taacgcagca aaatccgaac iggacaaggc catcggtcgc 180 aaiacaaatg gigicaiiac iaaggacgaa gcigaaaagc telicaacca ggacgiIga1 240 gcagctgitc gcggaatccl gcgcaacgca aagcicaagc cggtttacga ltelttggac 300 gccgttcgcc gtgeggeett gattaacatg gtgttteaga tgggtgaaac eggagttgea 360 ggatttacca actcgctgag gatgetgesa caaiagigst gggsegsage cgctgtgaat 420 eicgccaaai ciaggtggia caaccagaca eccaategtg egatgagagt gataaciaca 410 ttccgcaccg gtacttggga egeatatgaa aacctgtact ttcaggggtc cacactgcac 540 ggcciggccc acatcttcic ctacgagcgc eigtctciga agcgcgcact gtgggccctg 6_
[0096] tgcticclgg gciccctggc Igigcigcig iglglgigca cggagcgcgi gcagiaeuic 660 Uccaciacc accaiglcac caagcicgac gaggiggcig ccicicagci iaccucccl 720 gclgicacgc tglgcaacci c-aacgagtic cgei?lagcc t-mgiciccm gtmigaeeig 780 ta teal gelg gcgagctgci ggccclgcic aacaacaggi algagaiacc agacacacag 840 aiggcagaig aaaagcagct ggagaiycig caggacaaag ccaacliccg cagcucaaa 900 ccmmmci teaacatgog cgagttctao gacegcgctg gccaegactt togcgacatg 960 cigcictcci gccacitccg cggcgaftgic igcagcgcig aagaciicaa ggiggicnc 1020 acacgciafg gaaagtgcta c-acgttcaac fx-cggccgcg aiggccgcc-c gcgc-ctgaag 1080 accaLgaagg gtggcauggg uaaigguclg gaaaicaigc tggacatcca gcaggacgag 1140 taccigcctg tgiggggcga gactgacgag acgicciicg aagcaggcai caaagigcag 1200 atccatagtc aggatgaacc tcctttcatc gaccagctgg gciiiggcgi ggccccaggc 1260 ttccagacct ttgtggcetg ceaggagcag cgectcatct aoctgoecce aecctggggc 1320 acctgcaaag ctgttaccat ggac-tccgat tiggatltet tcgactccta c-agcatc-act 1380 gcclgccgca tcgacigtga gacgcgciac ctggtggaga acigcaacig ccgcatggtg 1440 cacaIgccag gcgatgcccc aiacigtaci ccagagcagt acaaggagig igcagalcct 1500 gctctggact tcctggtgga aaaggaccag gagtaotgeg tgtgtgaaat gccttgcaac 1560 ctgacccgct atggcaaaga gctgtecatg gtoaagatcc eoageaaagc ctoagccaag 1620 lacclggcca agaagtlcaa caaalctgag caalacatag gcgagaacal cciggigctg 1680
[0097] gacatcitct iigaagicct caactatgag acca t tgaac agaagaaggc ciatgagait 1740 gcaggcctcc igggtgaca t cggcgaccag algggcclgl tcatcggcgc cagcaicclc 18?0 acggtgcigg agetctiigu clacgcciae gaggtcaitu agcacaagia a 1851 <2H)> 9 <lll> 580 <212> PIT <213> GLUT1蛋白與WUL融合表達 <400> 9 Met Gin Pro Scr Scr l,ys I.ys Leu Thr Gly Arg l.cu Mel Leu Ala Val 15 10 15 Gly Gly Ala Val Leu Gly Scr Leu Gin Phe Gly Tyr Asn 丁hr Gly Ya! 20 25 30 He Asn Ala Pro Gin Lys Val He Glu Glu Phe Tyr Asn Gin Thr Trp 35 4〇 45 al His Arg Tyr Clj Glu Scr lie Leu rro Thr flir Leu Thr Thr Leu 50 55 60 Trp Ser Leu Ser Val Alt He Phe Ser ￥al Gly Gly Met He Gly Ser 65 70 75 80 Phe Ser Val Gly Leu Phe Val Asn Arg Phe Gly Arg Arg Asn Ser Met
[0098] 85 m 95 Leu Me I Mci Asu Leu Leu Ala Pile Val Scr Ala ￥a 1 Leu Met Oly Phe 100 105 1HI Scr Lys Leu Cly Lys Scr Phe (ilu Mei Leu lie Leu C1 y Arg Phe lie 115 120 125 lie (Hy Val ITyr (Jys fily Leu Thr Tlir Gly Phe Val Pro Mel 丁yr Val 130 135 140 Gly Gin ￥ai Ser Pro Thr Ala Leu Arg Oly Ala Leu Giy Tlir hm His 145 150 155 160 Gin Leu Gly He Val Va 1 Gly lie Leu lie Ala Gin Vai Phe 01 y Leu 165 m 175 Asp Scr 11 c Mel (?Iy Asn Lys Asp Leu Trp Pro Leu Leu [,cu Scr 11c m) 185 Iffl lie Pile He Pro Ala Leu Leu Gin Cys lie Val Leu Pro Phe Cys Pro 195 200 205 61u Ser Pro Arg Phe hm Lm He Asn Arg Asn Glu (Hu hsn Arg Ala 210 215 220 Lys Ala Asp Leu Clu Asp Asn Trp Gin Thr Leu Asm Asp Asn Lc-υ Lys
[0099] 225 230 235 240 Val Me (ila Ly s A hi Asp \sn ΛI h Ala Gin Vul Lys Λ s p Λ1 n Leu Thr 9-0 2?$ Lys Mel Arg Ala Ala Ala Leu Asp Ala Gin Lys Ala Thr Pro Pro Lys 260 265 270 Leu G1 u Asp Lys Ser Pro Asp Ser Pro (j 1 u Met Lys Asp Phe 4rg His 275 280 285 Glj Phe Asp lie Leu fal Gly Gla lie Asp Asp Ala Leu Lys Leu Ala 290 295 300 Asn Clu Gly Lys Val Lys (;!υ Ala C1 n Ala Ala Ala Glu Cln Leu Lys 305 310 315 320 Thr Thr Arg Asn Ala Tyr He Gin Lys Tyr Leu Glu Lys Lys Val Thr 325 330 335 lie Leu Glu Leu Phc Arg Scr Pro A1 a Tyr Arg Gin Pro lie Leu lie 340 345 350 Ala Val Val Leu Cln Leu Scr Gln Gin Leu Ser Gly He Asn Ala Val 355 360 365 Phe Tyr Tyr Ser Thr Ser lie Plie Glu Lys Ala Gly fal Gin 61n Pro
[0100] 37i 375 38β Val Tyr Ala Tin lie GJy Scr Gly He Vai Asti Thr Ala Phe Thr Va) 385 39? 395 400 Vul Scr Lou Phe Val VyJ Glu Arp Ala C1 y Arg Arg Thr Leu IIis Leu 405 410 415 lie Gly Leu Ala Gly Met Ala Gly Cys Ala lie Leu Met Thr lie Ala 420 425 430 Leu Ala Lw Leu Glu Gift L_ Pro Trp Sar Tyr Leu Ssr lie Val 435 440 445 Ala lie Phe Gly Phe Val Ala Phe Phe Glu Va1 Gly Pro Gly Pro lie 450 455 460 Pro Trp Phe I Ic Val Ala (Mu Leu Phe Scr <?ln (Sly Pro Arg Pro Ala 465 470 475 480 Ala He AUi Va 1 Ala Gly Phe Scr Asn Trp Thr Scr Asn Phe i!c Val 485 490 495 Gly Met Cys Phe <iln Tyr Val Glu Glii Lau Cyi Gly Pro Tyr Vil Phe 500 505 510 lie J 1c Phe Thr Va 1 Leu Leu Val Leu Phe Pile I Ic Phe Thr Tyr Phe-
[0101] 515 520 525 Lys Val Pro Glu Thr Lys Gly Arg Tlir Phc Asp Glu 1 lo Ala Scr Gly 530 535 540 Phc Arg Ciln (ily GIy Ala Scr Gin Scr Asp Lys Thr Pro Glu Clu Leu 545 550 555 560 Pile His Pro Leu Gly Ala Asp Ser Gin fai His Bis His His His His 565 570 575 His His His His 580 <210> 10 <21l> 649 <212> PRT <213> GLCT1蛋白與T4L ?合表達 <400> 10 Met Asn lie Phe Glu Met Leu Arg lie Asp Glu G1y Leu Arg Leu Lys 15 10 15 Tyr Lys Asp Thr Glu Gly Trr 取 Tlr lie Gly ile Gly Bis Leu 20 25 30 Leu Thr Lys Ser Pro Ser Leu Asn Ala Ala Lys Ser Giu Leu Asp Lys 35 40 45
[0102] Ala lie Gly Arg Asn Thr Asn Gly Val lie Thr Lys Asp Glu Ala Glu 50 55 60 Lys Leu Phe Asn Gin Asp Val Asp Ala Alt Val Arg Gly lie Leu Arg 65 70 75 80 Asn Ala Lys Leu Lys Pro Val Tyr Asp Ser Leu Asp Ala Val Arg Arg 85 90 95 Ala Ala Leu lie Asn Met Val Phc Gin Met Gly Glu Thr Gly Val Ala 100 105 110 Gly Phe Thr Asn Ser Leu Arg Met Leu Gin Gin Lys Arg Trp Asp Glu 115 120 125 Ala Ala Val Asn Leu Ala Lys Scr Arg Trp Tyr Asn (iln Thr Pro Asn 130 135 140 Arg Ala Lys Arg Val lie Thr Thr Phe Arg Thr Gly Thr Trp Asp Ala 145 150 155 160 Tyr Mci Glu Pro Scr Scr Lys Lys Leu Thr Gly Arc Leu Met Leu Ala 165 170 175 Val Gly Gly Ala Val Leu Gly Ser Leu Gin Phe Gly Tyr Asn Thr Gly 180 185 190
[0103] Val lie Asn Ala Pro Gin Lys Val lie Glu Giu Phe Tyr Asn Gin Thr 195 200 205 Trp Val His Arg Tyr Gly Glu Ser lie Leu Pro Thr Thr Leu Thr Thr 210 215 220 Leu Trp Scr Leu Scr Val Ala 11c Phc Scr Val Gly Gly Met lie Gly 225 230 235 240 Scr Fhe Ser Val G1y Leu Phc Va] Asn Arg Fhe (?1y Arg Arg Asn Scr 245 250 255 Met Leu Met Met Asn Leu Leu Ala Phe Val Ser Ala Val Leu Met Gly 260 265 270 Phe Ser Lys Leu Gly Lys Ser Phe Glu Met Leu lie Leu Gly Arg Phe 275 280 285 lie lie Gly Val Tyr Cys Gly Leu Thr Thr Gly Phc Val Pro Mcl Tyr 290 295 300 Val Gly Glu Val Ser Pro Thr Ala Leu Arg GIv Ala Leu Gly Thr Leu 305 310 315 320 His Gin Leu Gly lie val Val Gly lie Leu lie Ala Gin ￥al Phe Gly 325 330 335
[0104] Leu Asp Ser He Met C!y Am Lys Asp Leu Trp Ριυ Leu Leu Leu Ser 340 345 350 lie lie Phe lie Pro Ala Leu Leu Gin Cys He Val Leu Pro Phe Cys 355 360 365 Pro Glu Ser Pro Arg Phe Leu Leu He Asn Arg Asn Glu Glu Asn Arg 370 375 380 Ala Lys Ser Val Leu Lys Lys Leu Arg Gly Tlir Ala Asp Val Thr His 385 390 395 400 Asp Leu Gin Glu Met Lys Glu Glu Ser Arg Gin Met Mel Arg Glu Lys 405 410 415 Lys Val Thr lie Leu Glu Leu Phe Arg Ser Pro Ala Tyr Arg Gin Pro 420 425 430 He Leu He Ala Va 1 Va 1 Leu Gin Leu Ser Cln Gin Leu Ser Gly lie 435 440 445 Ass Aia Vai Phe Tyr Tyr Ser Thr Ser lie Phe Glu Lys Ala Gly Val 450 455 460 Gin Gin Pro ￥al Tyr Ala Thr lie Gly Ser Gly He ￥al Asn Thr Ala 465 470 475 4M
[0105] Phe Tlir Val Val Scr Leu Pile Val Val 6Iu Arg Ala Giy Arg Arg Tlir 485 490 495 Leu His Leu I】c (;]y Leu Ala Gly Mel AU ffly Cys Ala lie Leu Mcl 500 505 510 Tlir lie A1 a Leu Ala Leu Leu Ghi Gin Leu Pro Trp Mel Ser Tyr Leu 515 520 525 Scr He Val Ala lie Fhe (ily Phe Val Ala Flic Fhc Glu Val Gly Pro 530 535 540 Gly Pro lie Pro Trp Phe lie Val Ala Glu Leu Phe Scr Gin Gly Pro 545 550 555 560 Arg Pro Ala Ala He Ala Val Ala Gly Phe Ser Asn Tip Tin Ser Asn 565 570 575 Phe lie Val Gly Met Cys Phe Gin Tyr Val Glu Gin Leu Cys Gly Pro 580 585 590 jr Val Phe lie lie rhe Thr Val Leu Leu Val Leu Phe Phe lie rhe 595 600 605 Thr Tyr Phe Lys Val Pro Glu Thr Lys Giy Arg Thr Phe Asp Glu He 610 615 620
[0106] Ala Scr Gly Phc Arg GIe Gly G1y Ala Scr Gin Scr Asp Lys Thr His 625 630 635 640 His His llis ills llis IHk Ills His llis 645 <210> 11 <211> 1743 <212> m <213> GLUT1蛋白與BML融合表達 <400> 11 alggagccca gcagcaagaa gcigacgggi cgcclcatgc iggccgiggg aggagcagig 60 ctlggciccc igcagi Ugg ciacaacaci ggagtcaica a igcccccca gaaggigaic 120 gaggagtict acaaccagac atgggiccac cgciaigggg agagcatcci gcccaccacg 180 clcaccacgc ictggiccci ctcagiggcc atciiuclg ugggggcai gaiiggcicc 240 uctctgigg gccuttcgi iaaccgci11 ggccggcgga attcaatgci gaigaigaac 300 ctgctggcct tcgtgtccgc cgtgetcatg ggcttetcga aactgggcaa gtcctttgag 360 atgcigatcc igggccgctt cateategg? gtgiacigcg gccigaccac aggetiegig 420 cccalgiatg igggigaagt gicacccaca gcccttcgig gggccciggg cacccigcac 480 cageigggea Icgicglcgg caiccicaic gcccagglgt leggedgga cieaUcaig 540 ggcaacaagg acctgtggcc ccigctgcig agcaicatci icatcccggc cctgcigcag _
[0107] tgcatcgtgc tgcccf tclg ccccgagag! ccccgcf fee tgc.icalcaa ccgcmtcgag 660 gagaaccggg ccaaggciga iciggaagac aaiLgggaaa cicigaacga caaicicaag 720 IcgagH aggclgacaa Igclgcacaa gicaaagacg eld gaccaa gH I gagggea 780 gcygcccigg acgcicagaa ggccaclcca cclaagcicg aggacaagag cccagy iage 840 ccigaaulgu aagaciticg gcnlggaiic gacnlicigg iggguc-agai igaigaiigca 900 cicaagclgg ccaatgaagg gaaaglcaag giiagcacaag cagccgciga gcagctgaag 960 accacccgga atgcaiacal icagaagiac- cigigagaaga uggicaecat cciggagcig 1020 ticcgctccc ccgcciaccg ccagcccaic cieategcig iggtgclgca gcigicccag 1080 cagcigicig gcatcaacgc igtciicui laciccacga gcaicucga gaaggcgggg 1140 gigeageage ctgtgtaigc caecatigge tccggialcg icaacacggc citcaciglc 1200 gigtegeigt itgiggtgga gegageagge eggcggae^c tgcacetcat iggcctegcL 1260 ggc-atggcgg gttgtgc-cat ac-tc-atgacc alcgcgctag cactgctgga gcagctacc-c 1320 tggaigtcct atetgageat cgtggccato tttggctltg tggeettett tgaagtgggt 1380 cciggcccca tcccaiggu catcgiggct gaactcuca gceagggiec acgiccagct 1440 gccaltgccg ttgcaggcit ciccaacigg accicaaali tcaiigiggg catgtgcttc 1500 cagtatgtgg igcaactgtg tggtccctac gtcticatca tcttcactgt gctcctggti 1560 ctgttcttca tet_eeta ettcaaagtt ectgagacta aaggeeggae ettegatgag 1620 aicgciiccg gciiccggca ggggggagcc agccaaagig acaagacacc egaggageig 1680
[0108] ilccaicccc igggggclga ucccaagig caccaccalc accaccaica ccaccalcai 174B taa 1743 <210> 12 <211> 1950 <212> RKA <213> GUm蛋白與T4L融合表達 <棚> 12 algaacalci icgaga igci eegulegac gagggeciCct ggi ig腿gxt i clalaaggac 60 aeagaggict attacaecat cggtattgft eatetcttga ctmgtcgm 12β gcagcaaaat ccgaacigga caaggccaic ggicgcaala caaaiggigi cailaclaag 180 gacgaagclg aaaagc-Lcl t caaccaggac gilgalgcag cigilcgcgg aaicctgcgc 24D aacgcaaagc tc-aagc-cggt uacgattci ttggacgccg ttcgccgtgc ggccugatt 300 aacaiggigl ticagatggg igaaaccgga gtigcaggai tiaccaaclc gcigaggatg 3.60 etgeaacaaa agagatggga cgaagocgct gtgaatctog ccaaatctag gtggtaoaao 420 cagacaccca atcgtgcgaa gagagtgata actacaticc gcaccggtac ttgggacgca 480 lauiggagc ccagcagcaa gaagcigacg ggtcgccica ige.igge-egi gggaggagca 540 gtgcttggct ccctgcagtt tggctacaac actggagtca tcaatgcccc ccagaaggtg 600 atcgaggagt Ictacaacca gacatggglc caccgctatg gggagagcat cctgcccacc 660 acgcicacca cgcictggtc ccicicagig gccaictut cigiiggggg caigaiiggc 720 tccttctctg tgggccttli cgttaaccgc tttggccggc ggaattcaat gctgaigatg 780
[0109] aaccigclgg ccltcgtglc cgccgigctc aigggciicl cgaaaciggg caagiccut 840 gagalgciga tcctgggccg ciicaicaic ggigigiaci gcggccigac cacaggciic 900 gigcccnigi atglgggtga agtglcaccc ac-Hgcccitc glggggccct ggge-acccig 960 aiceagelgg gc-a teg Leg t cggcaiccic aicgcct-ai*g igi icggcci ggaciccaic 1020 ai-gggcaaca aggacclgig gccccigcig dgagea!ca lei icaiccc ggcccigclg 1080 caglgcaicg tgcigcccii etgocecgag agteowg€t iccigcicai caaccgcaac 1140 gaggagaficc gggccaagag igigciaang aagcigcgcg ggacagciga egigacecal 1200 gacclgcagg agatgaagga agagagiegg aigalgalgc gggagaagaa gglcaccalc 1260 ClggagGLgl IGCgClCCCC CgCCiclCCgC CrlgCCClilCC iCHicgclgi ggigctgcag ? 320 clgicccagc agciglcigg caic-?acgcl |U c 11 c 1 a ? l acLcc^cgag ualciiciuig 1 380 aaggeggggg tgcagcagcc tgtgtatgcc aceattgget ccggiatcgt caacacggco 1440 ttcaeigtcg tgtcgctgtt tgtggtggag egageaggee ggcggaecct geaceicati 1500 ggccicgcig gcaiggcggg i tgigecaici cicaigacca icgcgc-iagc acigciggag 1560 cagctaccct ggatgiccla ielgagcaic giggccalcl tiggeiligi ggccilcilt 1620 gaaglgggic ciggccccai c-ccaigglic aiegiggeig anciclic^ig ccagggiccci 1680 cgtccagctg ccailgccgi igcaggctic tccaactgga- ccicaaail1 caligtgggc 1740 aigigciicc agiatgtgga gcuacigigi ggicc-ciacg icucalcai, c-iicac-tgig 1800 cicciggtlc tgttcilcat c-?icacclac licaaagiic cigagaciaa aggccggacc 1860
[0110] ttcgitgiga tcgcltocgg cttccggcag gggggageca gccasagtga caagacactc 1920 caecaicacc accatcacca ccatcaitaa 1950 <210> 13 <211〉 69 <212> DNA <213> fj物 <400> 13 cccaccatcg ggegeggate catgcatcac catcatcacc accatcacgc tgatctggaa 60 gacaa tIgg 69 <210〉 14 <211> 42 <212> 臟 <213> 引# <400> 14 cccctgaaag lacaggt111 ccaggiacti cigaatgiat gc 42 <210> 15 <211> 46 <212> DNA <213>引物 <400> 15 gaaaacctgt actttcaggg gtccacactg cacggcctgg cccaca 46 <21()> 16
[0111] <211> 46 <212> IWA <213>引物 <400> 16 cu gguccg eaigccicga gi lac it gig oi laaigacc icgt ag 46 <2I0> 17 <211> 66 <212> WA <213> 麵 <400> 17 cccaccaLcg ggegcggale caLgcaLcac caicaicacc accalcacga aaaccigmc 60 ? i. l cag ?6 <210> 18 <2]l> 46 <212〉_.4 <213>引物 <400> 18 cuggiaccg caigccicga gi taciigig cl iaa igucc tcgiag 4ti <2HI> 19 <211> 69 <212> _A <213> 51* <_> 19 cccticca leg ggcgcgga It* ealgcalxae caicaicacc aeea 〖caeaa calcl iegag 60
[0112] atgetccgt 69 <21l)> 20 <211〉 43 <212> mk <213>引物 <400> 20 ccccigaaag tacaggtlit caiaigcgtc ccaagiaccg gig 43 <210> 2t <2il> 46 <212> imh <213〉引物 <4(J0> 21 gaaaaccigt aclitcaggg glccacactg cacggccigg cccaca 46 <210> 22 <2U> 46 <212> QU <213>引物 <400> 22 ctlggiaccg caigcclcga giincuglg cttaaigacc icglag 46 <210> 23 <211> 66 <212> 腸 <213>引物 <400> 23
[0113] ccetcctteg ggegcggtte cacgettetc citcatcaec ftceaceaega aateetgtte 60 iticag M <210> 24 <211> 46 <2J2> DMA <213> f_ <400> 24 citggtaeeg oaigceicga gtiaoitgig ciimigmc tcgtag 46 <210〉 25 <21I> 51 <212> DN'A <213>引物 <_> 25 cccgtttctg ctagcaagct taccatgaac atcttcgaga tgctccgtat c 51 <210> 26 <211> 4? <212> WA <213> fl# <400> 26 cagcttcttg ctgctgggct ccatatatgc gtcccaagta ccggtgc 47 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213>引物
[0114] <_0> 27 alggagccca gcagcaagaa gctg 24 <210> 28 <211> 53 <212> Wk <2]3>引物 <4m> 21 aigytggtgg tgatggtggt gatggtggtg tgtcttgtcs sttlggetgg etc 53 <210> 29 <211> 51 <212> 腦 <213>引物 <棚> 29 cccgtilcig ctagcaagci taccatgaac aiclicgaga tgctccgial c 51 <210> 30 <21i> 46 <212> DM <213>引物 <400> 30 ggtcgaggic gggggaicct laaigaiggi ggigaigglg gigaig 46 <210> 31 <211> 26 <212> 腦 <213>引物
[0115] <400> 31 gctgaictgg aagacaattg ggaaac 26 <2I0> 32 <211> 25 <212> DNA <2I3> 引物 <400> 32 cagglact ic tgaaip.taig ca t ic 25 <210> 33 <211> 48 <212> DNA <213>引物 <400> 33 cccgtticig ciagcaagci taccaiggag cccagcagca agaagctg 48 <210> 34 <211> 48 <212> DKA <213>引物 <400> 34 glttcccaat tgtcttccag aicagcctig gcccgglLcl cctcgttg 48 <210> 35 <211> 50 <212> 腦 <213>引物
[0116] <400> 35 gaalgcaiac attcagaagt acctggagaa gaagglcacc atcctggagc 50 <210〉 36 <211> 50 <212> DNA <213>引物 <400> 36 Higatggtgg igatggiggt gatggiggig cactigggaa tcagccccca 50 <210> 37 <211> 48 <212> DNA <213>引物 <400> 37 cccgittctg ciagcaagci taccaiggag cccagcagca agaagcig 48 <210> 38 <2U> 46 <212> DNA <213>引物 <400> 38 ggicgaggtc gggggaicci taatgatggt ggtgatggtg gtgatg 46
【權利要求】
1. 用于融合表達離子通道蛋白及運輸?shù)鞍椎牡鞍灼?，其特征在于? 為一種Bril蛋白片段或與該片段序列同源性大于90%的蛋白；或 為一種T4L蛋白片段或與該片段序列同源性大于90%的蛋白。
2. 如權利要求1所述的用于融合表達離子通道蛋白及運輸?shù)鞍椎牡鞍灼危涮卣髟?于：所述Bril蛋白片段或與該片段序列同源性大于90%的蛋白，其氨基酸序列和編碼基因 序列分別如SEQ ID NO. 1. 1和SEQ ID NO. 2. 1所示； 所述T4L蛋白片段或與該片段序列同源性大于90%的蛋白，其氨基酸序列和編碼基因 序列分別如SEQ ID NO. 1. 2和SEQ ID NO. 2. 2所示。
3. 融合表達離子通道蛋白及運輸?shù)鞍椎姆椒ǎ涮卣髟谟冢簩⑷鐧嗬?或所述的 蛋白片段的氨基酸序列插入到離子通道蛋白或運輸?shù)鞍椎腘-末端、C-末端或者膜內環(huán)區(qū) 構建融合蛋白。
4. 如權利要求3所述的融合表達離子通道蛋白及運輸?shù)鞍椎姆椒ǎ涮卣髟谟冢?將所述Bri 1蛋白片段與ASIC1進行融合表達，得到的融合白蛋氨基酸序列如SEQ ID NO. 3. 1所示；或 將所述T4L蛋白片段與ASIC1進行融合表達，得到的融合白蛋氨基酸序列如SEQ ID NO. 3. 2 所示。
5. 如權利要求3所述的融合表達離子通道蛋白及運輸?shù)鞍椎姆椒?，其特征在于?采用所述Bril基因構建的ASIC1融合表達質粒，其基因序列如SEQ ID NO. 4. 1所示； 或 采用所述T4L基因構建的ASIC1融合表達質粒，其基因序列如SEQ ID NO. 4. 2所示。
6. 如權利要求3所述的融合表達離子通道蛋白及運輸?shù)鞍椎姆椒ǎ涮卣髟谟冢?所述Bril蛋白片段與GLUT1進行融合表達，得到的融合白蛋氨基酸序列如SEQ ID NO. 3. 3所示；或 所述T4L蛋白片段與GLUT1進行融合表達，得到的融合白蛋氨基酸序列如SEQ ID NO. 3. 4 所示。
7. 如權利要求3所述的融合表達離子通道蛋白及運輸?shù)鞍椎姆椒?，其特征在于?采用所述Bril基因構建的GLUT1融合表達質粒，其基因序列如SEQ ID NO. 4. 3所示； 或 采用所述T4L基因構建的GLUT1融合表達質粒，其基因序列如SEQ ID NO. 4. 4所示。
8. 如權利要求5或7所述的融合表達質粒，其特征在于：可以在昆蟲細胞中表達或在 哺乳細胞中表達。
9. 如權利要求5所述的融合表達離子通道蛋白及運輸?shù)鞍椎姆椒?，其特征在于?將權利要求5中SEQ ID NO. 4. 1或SEQ ID NO. 4. 2所示的基因序列的構建到表達載體 pFastBacl，PcDNA3. 1，PET21b上進行不同表達系統(tǒng)的蛋白質表達。
10. 如權利要求7所述的融合表達離子通道蛋白及運輸?shù)鞍椎姆椒?，其特征在于?將權利要求7中SEQ ID NO. 4. 3或SEQ ID NO. 4. 4所示的基因序列的構建到表達載體 pFastBacl，PcDNA3. 1，PET21b上進行不同表達系統(tǒng)蛋白質表達。
【文檔編號】C12N15/85GK104151401SQ201410247582
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年6月5日 優(yōu)先權日:2014年6月5日
【發(fā)明者】錢冬明, 蔡建華, 胡亮, 王萍, 王黎榮, 俞小波, 王丹晶, 曾秀紅, 毛晨, 任德林 申請人:維亞生物科技(上海)有限公司