專利名稱：一種融合蛋白及其融合蛋白表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種融合蛋白及融合蛋白表達(dá)載體，尤其涉及包含人源性柯薩奇病毒-腺病毒受體胞外區(qū)與人IgGl的Fe段的融合蛋白。
背景技術(shù)：
柯薩奇病毒(Coxsackieenterovirus),屬小 RNA 病毒科(Picornavirus),為正鏈RNA腸道病毒(Enterovirus)。常引起小兒腹瀉，能導(dǎo)致無菌性腦膜炎、流行性胸痛、心肌炎、心包炎、手足口病等多種疾病,妊娠期感染可引起非麻痹性脊髓灰質(zhì)炎性病變,并致胎兒宮內(nèi)感染和致畸。目前發(fā)現(xiàn)，柯薩奇B組病毒(Coxsackie B enterovirus, CVB)常引發(fā)小兒病毒性心肌炎(Viral Myocarditis, VMC)，是小兒及青少年VMC最常見的病原體，約占各種病毒所致心肌炎的50 %。腺病毒(adenovirus, Ad)是一類無包膜雙鏈 DNA(double-stranded DNA, dsDNA)病毒,歸屬于哺乳動物腺病毒屬。在自然界中分布較廣，是引起上下呼吸道和眼部疾患的常見病原體；同時可引起人體扁桃體、腺樣體和其它淋巴組織的隱性持續(xù)性感染；此外，腺病毒也是病毒性心肌炎的常見病原體?？滤_奇病、腺病毒的傳染性強(qiáng)，尤其是在人口密集的地方，對免疫力低下的患者(如老年人、骨髓移植患者、白血病、艾滋病患者等)，通過飛沫和接觸傳染，在同一時期可造成區(qū)域性流行或暴發(fā)流行?？滤_奇病毒分為A和B兩類，共30多個血清型；腺病毒可分為A F 6個亞屬，共51個血清型，目前尚無柯薩奇病毒/腺病毒有效疫苗用于預(yù)防，針對其特異性藥物還有待開發(fā)。因此，從新的角度研制安全、可靠的防治柯薩奇病毒/腺病毒的新型藥物十分必要。近年來,一些學(xué)者提出了 “病毒受體陷講療法”(virus receptor trap therapy)這一概念，所謂“病毒受體陷阱療法”是指利用外源性的可溶性病毒受體來結(jié)合病毒，從而阻斷病毒與靶細(xì)胞膜上的受體結(jié)合及隨后的病毒內(nèi)吞。由于外源性受體分子與細(xì)胞膜上的受體分子有相同或非常相似的空間結(jié)構(gòu)，因此，多次、大劑量使用將不存在機(jī)體的免疫反應(yīng)等問題。病毒受體陷阱療法拓展了病毒性疾病的治療策略，可成為急性病毒血癥期的一個新的有效治療手段。研究表明，柯薩奇病毒和腺病毒通過與細(xì)胞表面的柯薩奇病毒/腺病毒受體(Coxsackie virus and adenovirus receptor,CAR)特異性地結(jié)合完成感染最初的吸附過程，隨后通過五鄰體蛋白上的精-甘-天門冬氨酸(RGD)序列與細(xì)胞表面的整合素α Y β3和α Υ β 5結(jié)合經(jīng)過胞飲作用使病毒進(jìn)入細(xì)胞從而完成內(nèi)化過程。因此，CAR是絕大部分柯薩奇病毒和腺病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的關(guān)鍵。目前，CAR的基礎(chǔ)性研究已非常深入。研究表明，CAR是分子量為46KD的跨膜糖蛋白，編碼人源CAR(hCAR)的基因已明確定位于染色體21q 11. 2上，包含7個外顯子，365個氨基酸，分3個結(jié)構(gòu)域。①胞外域含兩個Ig結(jié)構(gòu)域(I. 2)，Ad通過纖維頂球的三聚體結(jié)構(gòu)與Igl結(jié)構(gòu)域結(jié)合。②跨膜段含22個氨基酸，對細(xì)胞間相互作用起穩(wěn)定調(diào)節(jié)作用。③胞內(nèi)域含107個氨基酸，其中前兩位Cys殘基可能是翻譯后脂化修飾位點(diǎn)，此外，胞內(nèi)域可能還存在Tyr磷酸化位點(diǎn)?；谶@些已有的基礎(chǔ)性研究，如果通過基因工程方法，獲得CAR的胞外區(qū)蛋白(extracellular region of CAR, exCAR),用于Ad的“受體陷講療法”,將能有效的阻止絕大部分型別的腺病毒對人體細(xì)胞的感染。目前，在“病毒性疾病的受體陷阱療法”這一領(lǐng)域已有一些探索性研究，但僅停留在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動物模型研究的初步階段。究其原因，最主要的是活性蛋白的高效表達(dá)問題。目前的相關(guān)研究一是采用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)能獲得較高產(chǎn)量的表達(dá)蛋白，但其蛋白表達(dá)形式多為包涵體，難以獲得大量可溶性活性蛋白；二是采用細(xì)胞真核表達(dá)系統(tǒng)，如CHO細(xì)胞和293T細(xì)胞等，此類表達(dá)系統(tǒng)能解決表達(dá)蛋白的正確折疊和糖基化問題，但其產(chǎn)量很低，成本極高，大量制備極為困難。所以，“病毒受體陷阱療法”將來應(yīng)用人體治療，實(shí)現(xiàn)的關(guān)鍵是能生產(chǎn)制備大量可純化的具有高生物活性的病毒受體或其亞單位。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種融合蛋白及融合蛋白的表達(dá)載體。 本發(fā)明所述的融合蛋白，包含人源性柯薩奇病毒-腺病毒受體胞外區(qū)與人IgGl的Fe段。所述人源性柯薩奇病毒-腺病毒受體胞外區(qū)的基因序列其序列如SEQ IDNO 1所
/Jn ο所述人IgGl的Fe段的基因序列其序列如SEQ ID NO 2所示。所述融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO :3所示，其氨基酸序列如SEQ IDNO :4所
/Jn ο本發(fā)明所述的融合蛋白可用于制備治療柯薩奇病毒和/或腺病毒的藥物。本發(fā)明提供的融合蛋白表達(dá)載體，包含上述的融合蛋白基因序列和pPIC3. 5K質(zhì)粒基因序列。其中所述融合蛋白基因序列如SEQ ID N0:2所不。本發(fā)明還提供一種宿主菌，其含有上述的融合蛋白表達(dá)載體。本發(fā)明將人源性柯薩奇病毒-腺病毒受體胞外區(qū)(extracelIularCoxsackievirusand adenovirus receptor, exCAR)基因編碼序列與人IgGl的Fe段基因編碼序列根據(jù)畢赤酵母遺傳密碼偏嗜性進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，對框連接而成為融合蛋白eXCAR:Fc編碼基因，該融合蛋白既具有與柯薩奇病毒/腺病毒的高結(jié)合力，又能利用抗體Fe端與吞噬細(xì)胞的Fe受體結(jié)合，加速對結(jié)合病毒的吞噬和清除效率。利用畢赤酵母pPIC3. 5K/GS115表達(dá)系統(tǒng)，完成融合蛋白eXCAR:Fc的高效可溶性表達(dá)，獲得大量可純化的且具有高生物活性的可溶性exCAR:Fe蛋白。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是一種成熟的真核表達(dá)系統(tǒng)，具有強(qiáng)啟動子可嚴(yán)格調(diào)控目的蛋白的表達(dá)；并可對表達(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后的加工和修飾，從而使表達(dá)出的蛋白具有生物活性。此外，其營養(yǎng)要求低，生長快，培養(yǎng)基廉價，便于工業(yè)化生產(chǎn)及高密度發(fā)酵培養(yǎng)。本發(fā)明選擇了畢赤酵母PPIC3. 5K/GS115表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的蛋白，以實(shí)現(xiàn)目的蛋白具有與天然蛋白相似生物學(xué)活性的可溶性、高效表達(dá)。所述融合蛋白能與柯薩奇病毒/腺病毒產(chǎn)生高親和力的結(jié)合，阻止柯薩奇病毒/腺病毒對機(jī)體細(xì)胞特別是表達(dá)CAR的細(xì)胞如心肌細(xì)胞的感染，本融合蛋白可用于柯薩奇病毒和/或腺病毒感染性疾病的治療。本發(fā)明將人源性柯薩奇病毒/腺病毒受體的胞外區(qū)與IgGl的Fe段構(gòu)建為融合蛋白，使融合蛋白即具有與病毒的高結(jié)合力，又能有效地與吞噬細(xì)胞膜上的抗體Fe受體結(jié)合，介導(dǎo)吞噬細(xì)胞對病毒的吞噬殺傷，能加速病毒在體內(nèi)的清除效率。為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特舉較佳實(shí)施例，并配合附圖，作詳細(xì)說明如下。


圖I是重組工程菌pPIC3. 5K-exCAR/DH5 α的PCR鑒定結(jié)果，其中Μ泳道DNAmarker ;1、2泳道exCAR PCR陰性對照;3、4、5泳道exCAR PCR鑒定結(jié)果； 圖2 是重組質(zhì)粒 pPIC3. 5K_exCAR:Fc PCR鑒定結(jié)果，其中M泳道DNAmarker ;1、3泳道exCAR PCR結(jié)果；2泳道exCAR PCR陰性對照；4泳道exCAR:Fe PCR陰性對照；5泳道exCAR:Fe PCR結(jié)果；6泳道Fc PCR結(jié)果；7泳道Fc PCR陰性對照；圖3是重組質(zhì)粒pPIC3. 5K-exCAR:Fc/SnaB I、Not I雙酶切后電泳圖；其中M泳道DNA marker ；1泳道陽性重組質(zhì)粒pPIC3. 5K_exCAR:Fc/SnaB I、Not I雙酶切，可見切出約 1350bp DNA 條帶；2 泳道pPIC3. 5K/SnaB I、Not I 雙酶切；圖4是重組質(zhì)粒pPIC3. 5K-exCAR:FC測序圖譜(結(jié)果部分截圖)，圖中標(biāo)注起始密碼和SnaB I酶切位點(diǎn)；圖5是陽性轉(zhuǎn)化子pPIC3. 5K_exCAR:Fc/GS115PCR鑒定圖，其中M泳道DNAmarker ；1泳道pPIC3. 5K/GS115基因組DNA采用酵母陽性轉(zhuǎn)化子鑒定引物擴(kuò)增結(jié)果；2泳道pPIC3. 5K-exCAR:FC/GS115基因組DNA采用酵母陽性轉(zhuǎn)化子鑒定引物擴(kuò)增結(jié)果；3，6泳道exCAR:Fc PCR陰性對照；4泳道pPIC3. 5K/GS115基因組DNA采用exCAR:Fe上下游引物擴(kuò)增結(jié)果；5泳道pPIC3. 5K-exCAR:Fc/GS115基因組DNA采用exCAR:Fe上下游引物擴(kuò)增結(jié)果；圖6是exCAR:Fe蛋白的表達(dá)情況，其中M泳道蛋白Marker ；1, 2泳道PPIC3. 5K/GS115空載體菌經(jīng)甲醇誘導(dǎo)96h后表達(dá)蛋白；3，4泳道pPIC3. 5K_exCAR:Fc/GSl 15經(jīng)甲醇誘導(dǎo)96h后表達(dá)蛋白；圖7是exCAR:Fe蛋白純化情況,其中M泳道蛋白Marker ；1, 2泳道exCAR:Fc經(jīng)ProteinA親和層析及凝膠層析純化后結(jié)果；3,4泳道exCAR:Fc經(jīng)ProteinA親和層析純化后結(jié)果；圖8 是 exCAR:Fc 蛋白 Western-blot 結(jié)果圖，其中M泳道蛋白 Marker (170,130,95，72，55，43，34，26，17，IOKDa) ； I 泳道pPIC3. 5K/GS115 表達(dá)蛋白與一抗孵育結(jié)果；2 泳道pPIC3. 5K-exCAR:Fc/GS115表達(dá)蛋白與一抗孵育結(jié)果；圖9A至圖9C分別是是eXCAR:Fc蛋白阻斷前、BSA對照組、阻斷后的阻斷腺病毒adEasy-Ι株感染Hela細(xì)胞結(jié)果圖，其中圖9A:100M0I adEasy-1株感染Hela細(xì)胞48h圖；圖9B :終濃度2ug/ml BSA對照阻斷adEasy-Ι株感染Hela細(xì)胞48h ;圖9C :終濃度2ug/mlexCAR:Fe蛋白阻斷adEasy-Ι株感染Hela細(xì)胞48h圖；圖10是exCAR:Fe蛋白質(zhì)N端測序結(jié)果；
圖11是exCAR:Fc蛋白阻斷CoxB3病毒感染Hela細(xì)胞MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式一、材料與方法(一 )菌株、質(zhì)粒、病毒株和細(xì)胞株大腸桿菌DH5a由本實(shí)驗(yàn)室保存；畢赤酵母(Pichia pastoris)表達(dá)質(zhì)粒pPIC3. 5K、菌株 GS115 及 pPIC3. 5K/GS115 購自美國 Invitrogen 公司；腺病毒 adEasy-Ι 株由重慶醫(yī)科大學(xué)兒科醫(yī)院分子診斷室黃軼博士惠贈；柯薩奇病毒(CoxB3病毒)m株購自中科院武漢病毒所；Hela細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存。
( 二)主要試劑
KOD plus Taq DNA聚合酶及PCR試劑日本TOYOBO公司 Ligation high日本 TOYOBO 公司
SnaB I日本Takara公司EcoR I日本Takara公司
Not I日本Takara公司
Sal IId 本 Takara 公司
DL2000 DNAMarker天根生物有限公司
質(zhì)粒提取試劑盒北京博人泰克生物公司
凝膠回收試劑盒北京博大泰克生物公司
EB美國Amresco分裝
瓊脂糖美國BBI
酵母粉英國Oxoid
胰蛋白胨英國Oxoid
YNB北京鼎國
瓊脂成都天泰牛物公司
SDS美國BBI
DTT上海生工
生物素上海生工
蝸牛酶北京鼎國
D-山梨醇北京鼎國
丙烯酰胺美國BBI
N,N'-亞甲雙丙烯酰胺加拿大BBI
過硫酸銨加拿人BBI
TEMED上海生丄
Tris加拿大BBI
Sephadex G-250美國 Amersham Pharmacia
DMEM/F12(DF)培養(yǎng)基HighClone

胎牛血清四季青生物有限公司
蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)天根生物有限公司
葡萄球菌A蛋白層析柱加拿大BBI公司
山羊抗人CAR抗體美國Santa公司
HRP-兔抗羊IgG中杉金橋公司(三)主要儀器設(shè)備
ISO 9001電子天平德國Sartorius公司
Milli-Q Elix純水器美國Millipore公司
PB-20 pH計(jì)德國 Sartorius公司
TH2大振幅恒溫?fù)u床江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠
DU800分光光度計(jì)美國Beckman公司
ERC-4型凈化工作臺藝思特凈化有限公司
PTC-100 PCR 儀美國MJ Research 公司
Gene Pulse 電轉(zhuǎn)化儀美國Bio-Rad公司
濕轉(zhuǎn)印儀美國Bio-Rad公司
DYY-II型電泳儀北京六一儀器廠
MDF-382E(N)超低溫冰箱日本Sanyo公司
Mini PROTEAN 3 cell電泳裝置美國Bio-Rad公司
Chemimager 5500凝膠成像儀美國Bio-Rad公司
PK-8B電熱恒溫水浴箱上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司
PYX-DHS-50x64S隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠
D-37520型低溫高速離心機(jī)德國Hemeus公司
TGL-16G型臺式離心機(jī)上海安享科學(xué)儀器廠
UltrasonicsVCX-750超聲儀美國 SonicsC02培養(yǎng)箱德國Heraeus公司
突光顯微鏡德國Leica(四)主要溶液及試劑配制I. LB液體培養(yǎng)基稱取胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，加800ml ddH20溶解，用NaOH調(diào)pH值至7.4，補(bǔ)加(1(1!120至10001111，高壓滅菌201^11，41保存?zhèn)溆?。配制含AMP培養(yǎng)基則在使用前加入終濃度為100 μ g/ml的AMP。2. LB固體培養(yǎng)基在LB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入終濃度為15g/L的瓊脂，高壓滅菌20min，傾倒平 板，凝固后用塑料袋封裝，4°C保存?zhèn)溆谩Ｅ渲坪珹MP培養(yǎng)基則需待溫度降至65°C后，加入終濃度為100 μ g/ml的AMP，搖勻后傾倒平板。3. 100mmol/L CaCl2 溶液稱取14. 7g CaCl2 · 2H20溶解于1000ml ddH20中，過濾除菌，4°C保存?zhèn)溆谩?4. TAE電泳緩沖液(50 X貯存液，pH約8. 5)稱取Tris 堿 242g, Na2EDTA · 2H20 37. 2g,加 Λ 57. Iml 冰乙酸，補(bǔ)加 ddH20 至1000ml，使用時稀釋50倍。5.1%瓊脂糖凝膠稱取Ig瓊脂糖，加入100ml I XTAE緩沖液中，用微波爐加熱溶解，待溫度降至65 C后，加入10mg/ml的ElB 10 μ 1，混勾后傾入|旲具中，插入梳子，凝固后使用。6. 10XD即20%葡萄糖(Dextrose)溶液。稱取200g葡萄糖溶于IL ddH20中，濾過除菌，4°C保存。7. 10XM即5%甲醇(Methanol)溶液。取5ml甲醇加入95ml ddH20中，濾過除菌，4°C保存。8. 10XGY即10%甘油(Glycerol)溶液。取IOOml甘油加至900ml ddH20中，15磅高壓滅菌 20min，4°C 保存。9. 10XYNB稱取34g YNB, IOOg硫酸銨，加ddH20溶至1L，加熱溶解，濾過除菌，4°C保存。10. 500X B即0. 02%的生物素(Biotin)溶液。稱取20mg生物素，溶于100ml ddH20中，濾過除菌，4 °C保存。11. IM磷酸鉀緩沖液(pH 6. 0)量取132ml IM K2HPO4,868ml IM KH2PO4, ρΗ6· O ±0. I (如 pH 需調(diào)，用磷酸或 KOH 調(diào)整)，高壓滅菌后，置4 °C或室溫保存。12. YPD液體培養(yǎng)基取2. Og酵母提取物，4. Og蛋白胨溶于180ml雙蒸水中，121°C，30min高壓滅菌，冷卻后加入20ml 10XD。
13. YPD固體培養(yǎng)基取2. Og酵母提取物，4. Og蛋白胨溶于180ml雙蒸水中，加入終濃度為20g/L的瓊月旨，121°C，30min高壓滅菌，冷卻后加入20ml 10XD。 14. BMGY液體培養(yǎng)基取蛋白胨20g，酵母提取物10g，加入去離子水700ml，121 °C，20min高壓滅菌，而后加入無菌的10XGY，10XYNB，10X磷酸鹽緩沖液各100ml，冷至室溫后補(bǔ)加500XBiotin2ml即配成BMGY培養(yǎng)基。15. BMMY液體培養(yǎng)基取蛋白胨20g，酵母提取物10g，加入去離子水700ml，121 °C, 20min高壓滅菌，而后加入無菌的10XM，10XYNB，10X磷酸鹽緩沖液各100ml，冷至室溫后補(bǔ)加500XBiotin2ml即配成BMGY培養(yǎng)基。 16. MD固體培養(yǎng)基在160ml水中加入3. Og瓊脂，高壓滅菌，冷卻至60°C后，依次加入20mll0XYNB，20ml 10XD，0.4ml 500XBiotin，立即鋪板。17. MM固體培養(yǎng)基在160ml水中加入3. Og瓊脂，高壓滅菌，冷卻至60°C后，依次加入20mll0XYNB，20ml 10XM,O. 4ml 500XBiotin，立即鋪板。18.酵母感受態(tài)處理液IOOmM LiAc, IOmM DTT, O. 6M 山梨醇，and IOmM Tris-HCl，ρΗ7· 519. G418-YPD 平板取2. Og酵母提取物，4. Og蛋白胨溶于180ml雙蒸水中，加入終濃度為20g/L的瓊脂，12rC，30min高壓滅菌，冷卻后加入20ml 10XD和不同濃度的G418(0、0. 25,0. 5、1· O、I. 5、2· 0,4. Omg/ml)，充分搖勻鋪板，4°C備用。20.洗膜液(PBST)稱取NaCl 8. 0g,KCl O. 2g,KH2PO4 O. 2g,Na2HPO4 · 12Η202· 9g 溶于 800ml ddH20 中，加入 500ul Tween-20 后 ddH20 定容至 1L。21.轉(zhuǎn)膜緩沖液(ρΗ8· 3)稱取Tris3. 0g、甘氨酸11. 3g,加入甲醇200ml后ddH20定容至1L。22. CAPS電轉(zhuǎn)緩沖液稱取CAP2. 2g溶于800ml ddH20中，加入IOOml甲醇，NaOH調(diào)PH至11并定容至IL023.麗春紅S染色液稱取I 春紅S O. 5g,加入冰乙酸lml, ddH20定容至100ml。24.封閉液/ 一抗、二抗稀釋液稱取脫脂奶粉5g溶于100ml PBST中。25.檸檬酸三鈉底物緩沖液稱取檸檬酸O. 51g、Na2HPO4. 12H20 I. 84g 加入 ddH20 定容至 100ml。26.顯色液稱取DAB 15mg，加入甲醇5ml、30% H2O215uI和檸檬酸三鈉底物緩沖液25ml。
27. O. Olmol/L PBS (pH 7. 4)溶液配置NaCl 8. OOg, KCl 0. 20g, KH2PO4 0. 20g, NaH2PO4 · H2O I. 56g, 1000ml ddH20 溶解，高溫高壓滅菌，4°C保存。實(shí)施例I :基因及引物的合成I. IexCAR 和 IgGl Fe 基因的合成根據(jù)GenBank中人源性CAR胞外區(qū)基因編碼序列(exCAR)(AccessionNumber:NM_001338)和 IgGlFc 段基因編碼序列(Accession Number AF237583)，同時依據(jù)畢赤酵母遺傳密碼偏嗜性將exCAR和IgGl Fe段基因序列進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，由上海生工分別合成exCAR和IgGl Fe基因并構(gòu)建工程菌PUC_exCAR/DH5a、PUC-Fc/DH5a，密碼子優(yōu)化后的核酸序列如下exCAR (65 lbp) SEQ ID NO :1 ttgtccatcactactccagaagagatgattgagaaggctaagggtgagactgcctacttgccatgtaagttcactttgtctccagaagaccaaggtccattggacatcgagtggttgatttccccagctgacaatcagaaggttgatcaagtcattattttgtactctggtgacaagatttacgacgactactacccagacttgaagggtagagttcacttcacctccaatgacttgaagtctggtgatgcttctatcaatgtcaccaatttgcaattgtctgacattggtacttaccagtgtaaggtcaagaaggctccaggtgttgctaataagaagattcacttggtcgttttggttaagccatccggtgctagatgttacgttgacggttctgaggaaattggttccgacttcaagatcaagtgtgagccaaaggaaggttccttgccattgcagtacgagtggcaaaagttgtctgactcccagaagatgccaacttcttggttggctgagatgacttcctctgttatttctgtcaagaatgcttcttctgagtactctggtacttactcctgtaccgtcagaaacagagtcggttctgaccagtgtttgttgagattgaacgttgtcccaccatccaataaggctIgGlFc (696bp) SEQ ID NO :2gagccaaagtcttgtgacaagactcacacctgtccaccatgtccagctccagagttgttgggtggtccatccgtcttcttgttcccaccaaagccaaaggacaccttgatgatctccagaaccccagaggtcacctgcgtcgttgtcgacgtctcccacgaggacccagaggtcaagttcaactggtacgtcgacggtgttgaggtccacaatgctaagaccaagccaagagaggagcagtacaactccacctacagagtcgtctctgtcttgaccgtcttgcaccaggactggttgaatggtaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaggctttgccagctccaatcgagaagaccatctccaaggctaagggtcagccaagagagccacaggtctacaccttgccaccatccagagaggagatgaccaagaaccaggtctccttgacctgcttggtcaagggtttctacccatccgacatcgctgtcgagtgggagtctaatggtcagccagagaacaactacaagaccaccccaccagtcttggactccgacggttccttcttcttgtactccaagttgaccgttgacaagtctagatggcagcagggtaacgtcttctcctgctccgtcatgcacgaggctttgcacaaccactacactcagaagtccttgtccttgtccccaggtaag畢赤酵母表達(dá)的融合蛋白exCAR-Fc核酸序列(框內(nèi)為加入的EcoR I酶切位點(diǎn)，atg為起始密碼子，tga為終止密碼)SEQ ID NO 3
atggtgtccatcactactccagaagagatgattgagaaggctaagggtgagactgcctacttgccatgtaagttcactttgtctccagaagaccaaggtccattggacatcgagtggttgatttccccagctgacaatcagaaggttgatcaagtcattattttgtactctggtgacaagatttacgacgactactacccagacttgaagggtagagttcacttcacctccaatgacttgaagtctggtgatgcttctatcaatgtcaccaatttgcaattgtctgacattggtacttaccagtgtaaggtcaagaaggctccaggtgttgctaataagaagattcacttggtcgttttggttaagccatccggtgctagatgttacgttgacggttctgaggaaattggttccgacttcaagatcaagtgtgagccaaaggaaggttccttgccattgcagtacgagtggcaaaagttgtctgactcccagaagatgccaacttcttggttggctgagatgacttcctctgttatttctgtcaagaatgcttcttctgag
tactctggtacttactcctgtaccgtcagaaacagagtcggttctgaccagtgtttgttgagattgaacgttgtcccaccatccaataaggct gaallq gagccaaagtcttgtgacaagactcacacctgtccaccatgtccagctccagagttgttgggtggtccatccgtcttcttgttcccaccaaagccaaaggacaccttgatgatctccagaaccccagaggtcacctgcgtcgttgtcgacgtctcccacgaggacccagaggtcaagttcaactggtacgtcgacggtgttgaggtccacaatgctaagaccaagccaagagaggagcagtacaactccacctacagagtcgtctctgtcttgaccgtcttgcaccaggactggttgaatggtaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaggctttgccagctccaatcgagaagaccatctccaaggctaagggtcagccaagagagccacaggtctacaccttgccaccatccagagaggagatgaccaagaaccaggtctccttgacctgcttggtcaagggtttctacccatccgacatcgctgtcgagtgggagtctaatggtcagccagagaacaactacaagaccaccccaccagtcttggactccgacggttccttcttcttgtactccaagttgaccgttgacaagtctagatggcagcagggtaacgtcttctcctgctccgtcatgcacgaggctttgcacaaccactacactcagaagtccttgtccttgtccccaggtaagtga畢赤酵母表達(dá)的融合蛋白exCAR-Fc氨基酸序列(45IAA, M. W 50. 3kD，ρΙ6· 43)SEQ ID NO 4VSITTPEEMIEKAKGETAYLPCKFTLSPEDQGPLDIEWLISPADNQKVDQVIILYSGDKIYDDYYPDLKGRVHFTSNDLKSGDASINVTNLQLSDIGTYQCKVKKAPGVANKKIffl,WLVKPSGARCYVDGSEEIGSDFKIKCEPKEGSLPLQYEWQKLSDSQKMPTSWLAEMTSSVISVKNASSEYSGTYSCTVRNRVGSDQCLLRLNWPPSNKA @ EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRffQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK1. 2引物合成及PCR反應(yīng)體系exCAR 的擴(kuò)增引物上游引物 5’ -tatatacgta Jaccatg)gtgtccatcactactccag-3’ -SEQID NO :5 (下劃線部分為 SnaB I 位點(diǎn)，框內(nèi)為 Kozak 序列)；下游引物 5’ -tatagaattcagccttattggatggtg-3J -SEQ ID NO :6(下劃線部分為 EcoR I 位點(diǎn))。IgGlFc 的擴(kuò)增引物上游引物 5’ -tatagaattcgagccaaagtcttgtgac-3’ -SEQ ID NO :7 (下劃線部分為 EcoRI 位點(diǎn))；下游引物5’ -atttattgcggccgctcacttacctggggacaagg-3’ -SEQ ID NO :8 (下劃線部分為Not I位點(diǎn))。酵母陽性轉(zhuǎn)化子鑒定引物上游引物5’ -gactggttccaattgacaagc-3’ -SEQ ID NO :9 ;下游引物5，-gcaaatggcattctgacatcc-3’ -SEQ ID NO :10。引物由上海生工合成。①exCAR或Fe基因PCR反應(yīng)體系如下
exCAR或F c基因模板1.0 μ I
10X緩沖液5.0 μ I
MgCl22.0 μ I
dNTPs4.0 μ I
KOD-plusTaq 酶1.0 μ I
上游引物(10 μ Μ)2.0 μ I下游引物(10 μ Μ)2.0 μ I ddH2033.0 μ I 總體系50.0 μ I熱循環(huán)參數(shù)94°C3 分鐘；(94°C 30 秒，55°C 30 秒，72°C60 秒)X 32 循環(huán)；72°C5分鐘。②exCAR-Fc基因或酵母陽性轉(zhuǎn)化子鑒定的PCR反應(yīng)體系如下
exCAR-Fc基因模板或酵母基因組DNA1.0 μ I
10X緩沖液5.0 μ I
MgCl22.0 μ I
dNTPs4.0 μ IKOD-plus Taq 酶1.0 μ I上游引物(10 μ Μ)2.0 μ I下游引物(ΙΟμΜ)2.0 μ IddH2033.0 μ I總體系50.0 μ I熱循環(huán)參數(shù)94°C3 分鐘；(94°C 30 秒，55°C 30 秒，72°C 90 秒)X 32 循環(huán)；72°C5分鐘。實(shí)施例2 :重組工程菌pPIC3. 5K-exCAR/DH5a的構(gòu)建及鑒定2. IexCAR 基因 EcoR I/SnaB I 酶切將實(shí)施例I. 2中構(gòu)建的PUC-exCAR/DH5a菌液接種于LB (AMPlr)培養(yǎng)基中，37°C、180rpm過夜培養(yǎng)，質(zhì)粒提取試劑盒提取TOC-exCAR質(zhì)粒，并作EcoR I、SnaB I分步酶切。①EcoR I酶切反應(yīng)體系如下
權(quán)利要求
1.一種融合蛋白，其特征在于，包含人源性柯薩奇病毒-腺病毒受體胞外區(qū)與人IgGl的Fe段。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，所述人源性柯薩奇病毒-腺病毒受體胞外區(qū)的基因序列，其序列如SEQ ID N0:1所不。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，所述人IgGl的Fe段基因序列如SEQID NO 2 所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3任一項(xiàng)所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的基因序列如 SEQ ID NO 3 所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至3任一項(xiàng)所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示。
6.權(quán)利要求I所述的融合蛋白在制備治療柯薩奇病毒和/或腺病毒的藥物中的應(yīng)用。
7.一種融合蛋白表達(dá)載體，其特征在于，包含權(quán)利要求I所述的融合蛋白基因序列和pPIC3. 5K質(zhì)?；蛐蛄小?br> 8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的融合蛋白表達(dá)載體，其特征在于，所述融合蛋白基因序列如SEQ ID NO 2 所示。
9.一種宿主菌,其特征在于,含有權(quán)利要求7所述的融合蛋白表達(dá)載體。
全文摘要
本發(fā)明提供一種融合蛋白及其融合蛋白表達(dá)載體。該融合蛋白包含人源性柯薩奇病毒-腺病毒受體胞外區(qū)與人IgG1的Fc段。該融合蛋白基因序列經(jīng)密碼子優(yōu)化。該融合蛋白表達(dá)載體包含上述的融合蛋白優(yōu)化后的基因序列和pPIC3.5K質(zhì)?；蛐蛄小Ｔ撊诤系鞍啄芘c柯薩奇病毒/腺病毒產(chǎn)生高親和力的結(jié)合，阻止柯薩奇病毒/腺病毒對機(jī)體細(xì)胞特別是表達(dá)CAR的細(xì)胞如心肌細(xì)胞的感染，本融合蛋白可用于柯薩奇病毒和/或腺病毒感染性疾病的治療。
文檔編號A61P31/14GK102816240SQ20111005491
公開日2012年12月12日 申請日期2011年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月8日
發(fā)明者張克斌, 錢桂生, 周世文, 黃春基, 余華, 呂勝青, 盛哈蕾, 何曉梅, 熊竣智 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院