一種以蘋果渣為原料的細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基及利用該培養(yǎng)基生產(chǎn)細菌纖維素的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種以蘋果渣為原料的細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基及利用該培養(yǎng)基生產(chǎn)細菌纖維素的方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明的細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基中含有蔗糖、牛肉膏、磷酸氫二鈉、檸檬酸、乙醇及蘋果渣水解液。利用該培養(yǎng)基生產(chǎn)細菌纖維素的方法，包括：1)將木糖葡糖酸醋桿菌進行活化、擴培，得木糖葡糖酸醋桿菌種子液，將木糖葡糖酸醋桿菌種子液接入細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵，得細菌纖維素發(fā)酵液；2)取細菌纖維素發(fā)酵液中的細菌纖維素膜，處理后即得細菌纖維素。該方法具有成本低、工藝簡單、便于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點，穩(wěn)定性及重現(xiàn)性都較好，發(fā)酵所得細菌纖維素產(chǎn)量大于15g/L，適宜進行大規(guī)模生產(chǎn)。
【專利說明】一種以蘋果渣為原料的細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基及利用該培養(yǎng)基生產(chǎn)細菌纖維素的方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種以蘋果渣為原料的細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基及利用該培養(yǎng)基生產(chǎn)細菌纖維素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]細菌纖維素是由生長在液態(tài)含糖基質(zhì)中的細菌產(chǎn)生的，并分泌到基質(zhì)中的纖維素成分，是由葡萄糖以β-1，4糖苷鍵連接而成的高分子聚合物，在生物醫(yī)學(xué)材料、藥學(xué)材料、滲透氣化膜、燃料電池、造紙及其纖維素衍生物等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景。然而細菌纖維素培養(yǎng)基成本高、產(chǎn)量和產(chǎn)率低等問題卻是其工業(yè)化生產(chǎn)和推廣應(yīng)用的瓶頸。利用各種廢渣、廢液進行細菌纖維素的生產(chǎn)，降低其生產(chǎn)成本，是促進其工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用的有效途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于一種以蘋果渣為原料的細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基及利用該培養(yǎng)基生產(chǎn)細菌纖維素的方法，該方法工藝簡單，穩(wěn)定性好，能夠批量工業(yè)化生產(chǎn)。
[0004]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn):
[0005]一種以蘋果渣為原料的細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基，每升該培養(yǎng)基中含有蔗糖10~20g,牛肉膏4~5g,磷酸氫二鈉4~5g,檸檬酸0.8~1.0g,乙醇8~1g,其余為蘋果洛水解液，該培養(yǎng)基的pH值 為5.5~6.5 ;
[0006]所述的蘋果渣水解液是將蘋果渣干燥、粉碎后進行再生，然后加水充分混勻，再加入終濃度為20~25EGU/g的纖維素酶進行水解后制得；
[0007]所述的再生是取干燥、粉碎后的蘋果渣，加入離子液體至蘋果渣的質(zhì)量濃度為3%~7%，然后在90~120°C、80~120r/min的條件下，攪拌處理60~120min，得到蘋果渣溶液，再加入蘋果渣溶液4~8倍體積的水，在150~200r/min攪拌處理30~60min后,在3000~5000r/min下,離心10~20min,收集沉淀,將沉淀在40~60°C真空干燥3~5h，得到再生蘋果渣。
[0008]所述的離子液體為氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑、氯化1-丁基-3-甲基咪唑、氯化1-乙基-3-甲基咪唑或醋酸1-乙基-3-甲基咪唑。
[0009]按照Ig: (4~7)mL的料液比，向再生后的蘋果渣中加水。
[0010]所述的水解是在pH值為4.5~5.5，溫度為55~65°C的條件下，水解10~12h。
[0011]水解后還包括升溫、滅酶的操作，具體操作是將水解得到的蘋果渣水解液升溫至90 ~100°C，滅酶 10 ~15min。
[0012]所述的干燥、粉碎是取新鮮蘋果渣，在100~110°C下干燥處理10~12h，然后粉碎過60~80目篩網(wǎng)。
[0013]一種利用以蘋果渣為原料的細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)細菌纖維素的方法，包括以下步驟:[0014]I)將木糖葡糖酸醋桿菌活化，得活化的木糖葡糖酸醋桿菌，將活化的木糖葡糖酸醋桿菌擴大培養(yǎng)，得到木糖葡糖酸醋桿菌種子液，按照每10mL接種3~6mL的接種量將木糖葡糖酸醋桿菌種子液接種至細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28~32°C下，發(fā)酵8~10d，得到細菌纖維素發(fā)酵液；
[0015]2)將細菌纖維素發(fā)酵液液面上層的細菌纖維素膜取出，水洗后，于80~90°C下，在堿性溶液中浸泡20~40min，然后取出，反復(fù)沖洗至細菌纖維素膜呈透明狀，吸干水分，干燥至恒重，得到細菌纖維素。
[0016]步驟I)所述的活化是將木糖葡糖酸醋桿菌接種于活化培養(yǎng)基中，在28~32°C下，一次培養(yǎng)28~32h，得到木糖葡糖酸醋桿菌一次培養(yǎng)菌株，將該木糖葡糖酸醋桿菌一次培養(yǎng)菌株再次接種于活化培養(yǎng)基中，在28~32°C下，二次培養(yǎng)28~32h，得到活化的木糖葡糖酸醋桿菌；
[0017]其中，所述的活化培養(yǎng)基中含有蔗糖40~50g/L，牛肉膏10~15g/L，磷酸氫二鈉4~5g/L,梓檬酸0.8~1.0g/L,乙醇8~10g/L,瓊脂15~20g/L, pH值為5.5~6.5。
[0018]步驟I)所述的擴大培養(yǎng)是將活化的木糖葡糖酸醋桿菌接種于擴培培養(yǎng)基中，在溫度為28~32°C，轉(zhuǎn)速為150~200rpm的條件下，振蕩培養(yǎng)18~22h，得到木糖葡糖酸醋桿菌種子液； [0019]其中，所述的擴培培養(yǎng)基中含有蔗糖40~50g/L，牛肉膏10~15g/L，磷酸氫二鈉4~5g/L,梓檬酸0.8~1.0g/L,乙醇8~10g/L, pH值為5.5~6.5。
[0020]步驟2)所述的堿性溶液為質(zhì)量濃度為1.0~1.5 %的NaOH溶液；所述的干燥是在100~110°C下進行；沖洗是用蒸餾水反復(fù)進行沖洗。
[0021]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果:
[0022]本發(fā)明公開的細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基以蘋果渣為原料，原料經(jīng)預(yù)處理后，采用纖維素酶水解蘋果渣中纖維素為還原糖，作為木糖葡糖酸醋桿菌發(fā)酵生產(chǎn)細菌纖維素的營養(yǎng)基質(zhì)。蘋果渣中主要含有纖維素、還原糖等成分。在對蘋果渣原料處理過程中，本發(fā)明首次提出了利用咪唑類離子液體對蘋果渣進行再生。咪唑類離子液體對蘋果渣中的纖維素具有良好的溶解性能及較低的降解作用，且合成工藝簡單，熱穩(wěn)定性好。與纖維素作用過程中，其陰離子具有很強的氫鍵接受能力，可以和纖維素大分子鏈中羥基上的氫形成氫鍵，從而破壞了纖維素中大分子鏈間存在的大量氫鍵，最終導(dǎo)致纖維素的溶解。溶解后的纖維素溶液加水之后可使纖維素沉淀析出，實現(xiàn)纖維素的再生。再生過程可去除木質(zhì)素成分，降低對后續(xù)酶水解過程的抑制作用。同時再生過程可使纖維素分子中部分氫鍵斷裂，聚合度、結(jié)晶度降低，使纖維素晶型由I型轉(zhuǎn)變?yōu)楦诿杆獾腎I型，同時使纖維素的表面形態(tài)發(fā)生改變，表面積增大，進而與酶的接觸面積增大。因此咪唑類離子液體應(yīng)用于蘋果渣纖維素的預(yù)處理可顯著提高纖維素酶水解效率，提高水解液中還原糖產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本。
[0023]本發(fā)明以蘋果渣為原料的細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基的利用減少了傳統(tǒng)工藝中蔗糖等培養(yǎng)基原料用量，節(jié)省了發(fā)酵培養(yǎng)基制備成本，同時能夠有效解決果汁生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的大量蘋果渣引起的環(huán)境污染問題，為蘋果渣的綜合利用、附加值的提升和開展果汁清潔生產(chǎn)提供了一條新的途徑。
[0024]本發(fā)明還公開了利用以蘋果渣為原料的細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)細菌纖維素的方法，該方法操作簡便，便于工業(yè)化生產(chǎn)，穩(wěn)定性及重現(xiàn)性都較好，通過該方法生產(chǎn)的細菌纖維素產(chǎn)量大于15g/L，適宜進行大規(guī)模生產(chǎn)。
【具體實施方式】
[0025]下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。
[0026]實施例1
[0027]本發(fā)明所述的菌種:木糖葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacter xyIinus),購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌株號acccl0215。
[0028]一種生產(chǎn)細菌纖維素的方法，包括以下步驟:
[0029](I)木糖葡糖酸醋桿菌的活化
[0030]制備木糖葡糖酸醋桿菌活化培養(yǎng)基，活化培養(yǎng)基的配方包括蔗糖40g/L，牛肉膏10g/L，磷酸氫二鈉4g/L，檸檬酸0.8g/L，乙醇8g/L，瓊脂15g/L，調(diào)節(jié)pH值為5.5。接種木糖葡糖酸醋桿菌aCCC10215于活化培養(yǎng)基，在28°C培養(yǎng)28h，將培養(yǎng)后的菌種再次接種于相同的、新的活 化培養(yǎng)基中，于28°C培養(yǎng)28h，制得活化的木糖葡糖酸醋桿菌；
[0031](2)木糖葡糖酸醋桿菌的擴培
[0032]制備木糖葡糖酸醋桿菌擴培培養(yǎng)基，擴培培養(yǎng)基的配方包括蔗糖40g/L，牛肉膏10g/L,磷酸氫二鈉4g/L，檸檬酸0.8g/L，乙醇8g/L，調(diào)節(jié)pH值為5.5，接種活化的木糖葡糖酸醋桿菌于擴培培養(yǎng)基中，在150r/min、28°C下培養(yǎng)18h，得到木糖葡糖酸醋桿菌種子液；
[0033](3)細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基的制備
[0034]取新鮮蘋果渣，100°C干燥處理10h，輾槽粉碎后過60~80目篩網(wǎng)，得粉碎蘋果渣，加入離子液體AMMCl (氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑)至蘋果渣終質(zhì)量濃度為3% (g/g，此處終濃度指蘋果渣在離子液體中的質(zhì)量分數(shù))然后在90°C、80r/min處理60min，使蘋果渣完全溶解，得到蘋果渣溶液，之后加入蘋果渣溶液4倍體積自來水，150r/min劇烈攪拌30min，3000r/min離心10min，收集沉淀，40°C真空干燥3h，得到再生蘋果渣，按照Ig:4mL的料液比，向再生后蘋果渣中加自來水充分混勻后，加纖維素酶至終濃度為20EGU/g，在pH值為4.5、溫度為55°C的條件下水解10h，反應(yīng)結(jié)束后升溫至90°C維持1min滅纖維素酶，得蘋果渣水解液；
[0035]按照每升該培養(yǎng)基中含有蔗糖10g，牛肉膏4g，磷酸氫二鈉4g，檸檬酸0.Sg,乙醇8g,其余為蘋果渣水解液，調(diào)節(jié)pH值為5.5，得細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基；
[0036](4)細菌纖維素的發(fā)酵
[0037]取種齡為18h的木糖葡糖酸醋桿菌種子液，按照每10mL接種3mL的接種量，將木糖葡糖酸醋桿菌種子液接入細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28°C靜態(tài)發(fā)酵8d后結(jié)束發(fā)酵，得細菌纖維素發(fā)酵液；
[0038](5)細菌纖維素膜的處理
[0039]取細菌纖維素發(fā)酵液中的細菌纖維素膜，蒸餾水沖洗，于80°C下，在質(zhì)量濃度為1%的NaOH溶液中浸泡20min，然后將細菌纖維素膜取出后，用蒸餾水反復(fù)沖洗至凝膠膜透明無色，用干燥濾紙吸干表面水分，100°C干燥至恒重，得細菌纖維素產(chǎn)品，細菌纖維素發(fā)酵產(chǎn)量為15.31g/L。
[0040]實施例2[0041]一種生產(chǎn)細菌纖維素的方法，包括以下步驟:
[0042](I)木糖葡糖酸醋桿菌的活化
[0043]制備木糖葡糖酸醋桿菌活化培養(yǎng)基，活化培養(yǎng)基的配方包括蔗糖45g/L，牛肉膏13g/L，磷酸氫二鈉4.5g/L，檸檬酸0.9g/L，乙醇9g/L，瓊脂17g/L，調(diào)節(jié)pH值為6.0。接種木糖葡糖酸醋桿菌aCCC10215于活化培養(yǎng)基，在28°C培養(yǎng)28h，將培養(yǎng)后的菌種再次接種于相同的、新的活化培養(yǎng)基中，于28°C培養(yǎng)28h，制得活化的木糖葡糖酸醋桿菌；
[0044](2)木糖葡糖酸醋桿菌的擴培
[0045]制備木糖葡糖酸醋桿菌擴培培養(yǎng)基，擴培培養(yǎng)基的配方包括蔗糖45g/L，牛肉膏13g/L，磷酸氫二鈉4.5g/L，檸檬酸0.9g/L，乙醇9g/L，調(diào)節(jié)pH值為6.0,接種活化的木糖葡糖酸醋桿菌于擴培培養(yǎng)基中，在180r/min、3(TC下培養(yǎng)20h，得到木糖葡糖酸醋桿菌種子液；
[0046](3)細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基的制備
[0047]取新鮮蘋果渣，105°C干燥處理I lh，輾槽粉碎后過60~80目篩網(wǎng)，得粉碎蘋果渣，加入離子液體BMMCl (氯化1-丁基-3-甲基咪唑)至蘋果渣終濃度為5% (g/g，此處終濃度指蘋果渣在離子液體中的質(zhì)量分數(shù))，110°C、100r/min處理90min，使蘋果渣完全溶解，得到蘋果渣溶液，之后加入蘋果渣溶液6倍體積自來水，200r/min劇烈攪拌40min，4000r/min離心10~Omin,收集沉淀,50 °C真空干燥4h,得到再生蘋果洛，按照Ig:5mL的料液t匕，向再生后的蘋果渣中加自來水充分混勻后，加纖維素酶至終濃度為23EGU/g，在pH值為
6.0、溫度為60°C的 條件下水解llh，反應(yīng)結(jié)束后升溫至95°C維持12min滅纖維素酶，得蘋果洛水解液；
[0048]按照每升該培養(yǎng)基中含有蔗糖15g，牛肉膏4.5g，磷酸氫二鈉4.5g，檸檬酸0.9g，乙醇9g，其余為蘋果渣水解液，調(diào)節(jié)pH值為6.0，得細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基；
[0049](4)細菌纖維素的發(fā)酵
[0050]取種齡為20h的木糖葡糖酸醋桿菌種子液，按照每10mL接種4mL的接種量，將木糖葡糖酸醋桿菌種子液接入細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C靜態(tài)發(fā)酵9d后結(jié)束發(fā)酵，得細菌纖維素發(fā)酵液；
[0051](5)細菌纖維素膜的處理
[0052]取細菌纖維素發(fā)酵液中的細菌纖維素膜，蒸餾水沖洗，于85°C下，在質(zhì)量濃度為1.3%的NaOH溶液中浸泡30min，然后將細菌纖維素膜取出后，用蒸餾水反復(fù)沖洗至凝膠膜透明無色，用干燥濾紙吸干表面水分，105°C干燥至恒重，得細菌纖維素產(chǎn)品，細菌纖維素發(fā)酵產(chǎn)量為17.41g/L。
[0053]實施例3
[0054]一種生產(chǎn)細菌纖維素的方法，包括以下步驟:
[0055](I)木糖葡糖酸醋桿菌的活化
[0056]制備木糖葡糖酸醋桿菌活化培養(yǎng)基，活化培養(yǎng)基的配方包括蔗糖50g/L，牛肉膏15g/L，磷酸氫二鈉5g/L，檸檬酸1.0g/L,乙醇10g/L，瓊脂20g/L，調(diào)節(jié)pH值為6.5。接種木糖葡糖酸醋桿菌aCCC10215于活化培養(yǎng)基，在32°C培養(yǎng)32h，將培養(yǎng)后的菌種再次接種于相同的、新的活化培養(yǎng)基中，于32°C培養(yǎng)32h，制得活化的木糖葡糖酸醋桿菌；
[0057](2)木糖葡糖酸醋桿菌的擴培[0058]制備木糖葡糖酸醋桿菌擴培培養(yǎng)基，擴培培養(yǎng)基的配方包括蔗糖50g/L，牛肉膏15g/L，磷酸氫二鈉5g/L，檸檬酸1.0g/L,乙醇10g/L，調(diào)節(jié)pH值為6.5，接種活化的木糖葡糖酸醋桿菌于擴培培養(yǎng)基中，在200r/min、32°C下培養(yǎng)22h，得到木糖葡糖酸醋桿菌種子液；
[0059](3)細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基的制備
[0060]取新鮮蘋果渣，110°C干燥處理12h，輾槽粉碎后過60~80目篩網(wǎng)，得粉碎蘋果渣，加入離子液體EMMCl (氯化1-乙基-3-甲基咪唑)至蘋果渣終濃度為7% (g/g，此處終濃度指蘋果渣在離子液體中的質(zhì)量分數(shù))，120°C、120r/min處理120min，使蘋果渣完全溶解，得到蘋果渣溶液，之后加入蘋果渣溶液8倍體積自來水，200r/min劇烈攪拌60min，5000r/min離心20min,收集沉淀,60°C真空干燥5h,得到再生蘋果洛,按照Ig:7mL的料液比，向再生后的蘋果渣中加自來水充分混勻后，加纖維素酶至終濃度為25EGU/g，在pH值為6.5、溫度為65°C的條件下水解12h，反應(yīng)結(jié)束后升溫至100°C維持15min滅纖維素酶，得蘋果渣水解液；
[0061]按照每升該培養(yǎng)基中含有蔗糖20g，牛肉膏5g，磷酸氫二鈉5g，檸檬酸lg，乙醇10g，其余為蘋果渣水解液，調(diào)節(jié)pH值為6.5，得細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基；
[0062](4)細菌纖維素的發(fā)酵
[0063]取種齡為22h的木糖葡糖酸醋桿菌種子液，按照每10mL接種6mL的接種量，將木糖葡糖酸醋桿菌種子液接入細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基中，在32°C靜態(tài)發(fā)酵1d后結(jié)束發(fā)酵，得細菌纖維素發(fā)酵液；
[0064](5)細菌纖維素膜的處理
[0065]取細菌纖維素發(fā)酵液中的細菌纖維素膜，蒸餾水沖洗，于90°C下，在質(zhì)量濃度為1.5%的NaOH溶液中浸泡40min，然后將細菌纖維素膜取出后，用蒸餾水反復(fù)沖洗至凝膠膜透明無色，用干燥濾紙吸干表面水分，110°C干燥至恒重，得細菌纖維素產(chǎn)品，細菌纖維素發(fā)酵產(chǎn)量為16.12g/L。
[0066]實施例4
[0067]一種生產(chǎn)細菌纖維素的方法，包括以下步驟:
[0068](I)木糖葡糖酸醋桿菌的活化
[0069]制備木糖葡糖酸醋桿菌活化培養(yǎng)基，活化培養(yǎng)基的配方包括蔗糖45g/L，牛肉膏15g/L，磷酸氫二鈉4.5g/L，檸檬酸0.89g/L，乙醇9g/L，瓊脂18g/L，調(diào)節(jié)pH值為6.0。接種木糖葡糖酸醋桿菌aCCC10215于活化培養(yǎng)基，在30°C培養(yǎng)28h，將培養(yǎng)后的菌種再次接種于相同的、新的活化培養(yǎng)基中，于30°C培養(yǎng)28h，制得活化的木糖葡糖酸醋桿菌；
[0070](2)木糖葡糖酸醋桿菌的擴培
[0071]制備木糖葡糖酸醋桿菌擴培培養(yǎng)基，擴培培養(yǎng)基的配方包括蔗糖45g/L，牛肉膏15g/L，磷酸氫二鈉4.5g/L，檸檬酸0.9g/L，乙醇9g/L，調(diào)節(jié)pH值為6.0,接種活化的木糖葡糖酸醋桿菌于擴培培養(yǎng)基中，在170r/min、3(TC下培養(yǎng)18h，得到木糖葡糖酸醋桿菌種子液；
[0072](3)細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基的制備
[0073]取新鮮蘋果渣，105°C干燥處理10h，輾槽粉碎后過60~80目篩網(wǎng)，得粉碎蘋果渣，加入離子液體EMIMAc (醋酸1-乙基-3-甲基咪唑)至蘋果渣終濃度為5% (g/g，此處終濃度指蘋果渣在離子液體中的質(zhì)量分數(shù))，IlO0C UOOr/min處理lOOmin，使蘋果渣完全溶解，得到蘋果渣溶液，之后加入蘋果渣溶液7倍體積自來水，200r/min劇烈攪拌40min，4000r/min離心20min,收集沉淀,50°C真空干燥5h,得到再生蘋果洛,按照Ig:6mL的料液比，向再生后的蘋果渣中加自來水充分混勻后，加纖維素酶至終濃度為23E⑶/g，在pH值為5.0、溫度為60°C的條件下一級水解Ilh，反應(yīng)結(jié)束后升溫至95°C維持1min滅纖維素酶，得蘋果渣水解液；
[0074]按照每升該培養(yǎng)基中含有蔗糖15g，牛肉膏4.5g，磷酸氫二鈉4.5g，檸檬酸0.9g，乙醇9g，其余為蘋果渣水解液，調(diào)節(jié)pH值為6.0，得細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基；
[0075](4)細菌纖維素的發(fā)酵
[0076]取種齡為18h的木糖葡糖酸醋桿菌種子液，按照每10mL接種4mL的接種量，將木糖葡糖酸醋桿菌種子液接入細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C靜態(tài)發(fā)酵8d后結(jié)束發(fā)酵，得細菌纖維素發(fā)酵液；
[0077](5)細菌纖維素膜的處理
[0078]取細菌纖維素發(fā)酵液中的細菌纖維素膜，蒸餾水沖洗，于85°C下，在質(zhì)量濃度為1.0%的NaOH溶液中浸泡20min，然后將細菌纖維素膜取出后，用蒸餾水反復(fù)沖洗至凝膠膜透明無色，用干燥濾紙吸干表面水分，105°C干燥至恒重，得細菌纖維素產(chǎn)品，細菌纖維素發(fā)酵產(chǎn)量為16.60g/L。
[0079]實施例5
[0080]一種生產(chǎn)細菌纖維素的方法，包括以下步驟:
[0081](I)木糖葡糖酸醋桿菌的活化
[0082]制備木糖葡糖酸醋桿菌活化培養(yǎng)基，活化培養(yǎng)基的配方包括蔗糖40g/L，牛肉膏10g/L，磷酸氫二鈉4g/L，檸檬酸0.8g/L，乙醇8g/L，瓊脂15g/L，調(diào)節(jié)pH值為5.5。接種木糖葡糖酸醋桿菌aCCC10215于活化培養(yǎng)基，在28°C培養(yǎng)32h，將培養(yǎng)后的菌種再次接種于相同的、新的活化培養(yǎng)基中，于28°C培養(yǎng)32h，制得活化的木糖葡糖酸醋桿菌；
[0083](2)木糖葡糖酸醋桿菌的擴培
[0084]制備木糖葡糖酸醋桿菌擴培培養(yǎng)基，擴培培養(yǎng)基的配方包括蔗糖40g/L，牛肉膏10g/L,磷酸氫二鈉4g/L，檸檬酸0.8g/L，乙醇8g/L，調(diào)節(jié)pH值為5.5，接種活化的木糖葡糖酸醋桿菌于擴培培養(yǎng)基中，在150r/min、28°C下培養(yǎng)22h，得到木糖葡糖酸醋桿菌種子液；
[0085](3)細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基的制備
[0086]取新鮮蘋果渣，100°C干燥處理12h，輾槽粉碎后過60~80目篩網(wǎng)，得粉碎蘋果渣，加入離子液體AMMCl (氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑)至蘋果渣終濃度為4% (g/g，此處終濃度指蘋果渣在離子液體中的質(zhì)量分數(shù))，100°C、90r/min處理lOOmin，使蘋果渣完全溶解，得到蘋果渣溶液，之后加入蘋果渣溶液5倍體積自來水，200r/min劇烈攪拌60min，3500r/min離心20min,收集沉淀,60°C真空干燥5h,得到再生蘋果洛,按照Ig AmL的料液t匕，向再生后的蘋果渣中加自來水充分混勻后，加纖維素酶至終濃度為20EGU/g，在pH值為
4.5、溫度為55°C的條件下水解10h，反應(yīng)結(jié)束后升溫至90°C維持15min滅纖維素酶，得蘋果洛水解液；
[0087]按照每升該培養(yǎng)基中含有蔗糖10g，牛肉膏4g，磷酸氫二鈉4g，檸檬酸0.Sg,乙醇8g,其余為蘋果渣水解液，調(diào)節(jié)pH值為5.5，得細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基；[0088](4)細菌纖維素的發(fā)酵
[0089]取種齡為22h的木糖葡糖酸醋桿菌種子液，按照每10mL接種3mL的接種量，將木糖葡糖酸醋桿菌種子液接入細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28°C靜態(tài)發(fā)酵1d后結(jié)束發(fā)酵，得細菌纖維素發(fā)酵液；
[0090](5)細菌纖維素膜的處理
[0091]取細菌纖維素發(fā)酵液中的細菌纖維素膜，蒸餾水沖洗，于80°C下，在質(zhì)量濃度為
1.0%的NaOH溶液中浸泡40min，然后將細菌纖維素膜取出后，用蒸餾水反復(fù)沖洗至凝膠膜透明無色，用干燥濾紙吸干表面水分，100°C干燥至恒重，得細菌纖維素產(chǎn)品，細菌纖維素發(fā)酵產(chǎn)量為15.78g/L。
[0092]綜上所述，本發(fā)明利用蘋果渣發(fā)酵生產(chǎn)細菌纖維素，一方面可以解決蘋果渣大量產(chǎn)生而引起的 環(huán)境污染問題，為蘋果渣的綜合利用、附加值的提升和果汁的清潔化生產(chǎn)提供新途徑，同時也為細菌纖維素的大規(guī)模生產(chǎn)找到一種廉價原料，為其生產(chǎn)成本的降低及大規(guī)模生產(chǎn)提供可能，因此該技術(shù)具有重要意義。
【權(quán)利要求】
1.一種以蘋果渣為原料的細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，每升該培養(yǎng)基中含有鹿糖10~20g,牛肉膏4~5g,磷酸氫二鈉4~5g,檸檬酸0.8~1.0g,乙醇8~1g,其余為蘋果渣水解液，該培養(yǎng)基的pH值為5.5~6.5 ; 所述的蘋果渣水解液是將蘋果渣干燥、粉碎后進行再生，然后加水充分混勻，再加入終濃度為20~25EGU/g的纖維素酶進行水解后制得； 所述的再生是取干燥、粉碎后的蘋果渣，加入離子液體至蘋果渣的質(zhì)量濃度為3%~7%，然后在90~120°C、80~120r/min的條件下，攪拌處理60~120min，得到蘋果渣溶液，再加入蘋果渣溶液4~8倍體積的水，在150~200r/min攪拌處理30~60min后，在3000~5000r/min下,離心10~20min,收集沉淀,將沉淀在40~60°C真空干燥3~5h,得到再生蘋果渣。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以蘋果渣為原料的細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述的離子液體為氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑、氯化1-丁基-3-甲基咪唑、氯化1-乙基-3-甲基咪唑或醋酸1-乙基-3-甲基咪唑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以蘋果渣為原料的細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，按照Ig: (4~7)mL的料液比，向再生后的蘋果渣中加水。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以蘋果渣為原料的細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述的水解是在PH值為4.5~5.5，溫度為55~65°C的條件下，水解10~12h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以蘋果渣為原料的細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，水解后還包括升溫、滅酶的操作，具體操作是將水解得到的蘋果渣水解液升溫至90~100。。，滅酶 10 ~15m in。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以蘋果渣為原料的細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述的干燥、粉碎是取新鮮蘋果渣，在100~110°C下干燥處理10~12h，然后粉碎過60~80目篩網(wǎng)。
7.一種利用權(quán)利要求1~6中任意一項所述的以蘋果渣為原料的細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)細菌纖維素的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)將木糖葡糖酸醋桿菌活化，得活化的木糖葡糖酸醋桿菌，將活化的木糖葡糖酸醋桿菌擴大培養(yǎng),得到木糖葡糖酸醋桿菌種子液，按照每10mL接種3~6mL的接種量將木糖葡糖酸醋桿菌種子液接種至細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28~32°C下，發(fā)酵8~10d，得到細菌纖維素發(fā)酵液； 2)將細菌纖維素發(fā)酵液液面上層的細菌纖維素膜取出，水洗后，于80~90°C下，在堿性溶液中浸泡20~40min，然后取出，反復(fù)沖洗至細菌纖維素膜呈透明狀，吸干水分，干燥至恒重，得到細菌纖維素。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種生產(chǎn)細菌纖維素的方法，其特征在于，步驟I)所述的活化是將木糖葡糖酸醋桿菌接種于活化培養(yǎng)基中，在28~32°C下，一次培養(yǎng)28~32h，得到木糖葡糖酸醋桿菌一次培養(yǎng)菌株，將該木糖葡糖酸醋桿菌一次培養(yǎng)菌株再次接種于活化培養(yǎng)基中，在28~32°C下，二次培養(yǎng)28~32h，得到活化的木糖葡糖酸醋桿菌； 其中，所述的活化培養(yǎng)基中含有蔗糖40~50g/L，牛肉膏10~15g/L，磷酸氫二鈉4~5g/L,梓檬酸0.8~1.0g/L,乙醇8~10g/L,瓊脂15~20g/L, pH值為5.5~6.5。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種生產(chǎn)細菌纖維素的方法，其特征在于，步驟I)所述的擴大培養(yǎng)是將活化的木糖葡糖酸醋桿菌接種于擴培培養(yǎng)基中，在溫度為28~32°C，轉(zhuǎn)速為150~200rpm的條件下，振蕩培養(yǎng)18~22h，得到木糖葡糖酸醋桿菌種子液； 其中，所述的擴培培養(yǎng)基中含有蔗糖40~50g/L，牛肉膏10~15g/L，磷酸氫二鈉4~5g/L,梓檬酸 0.8 ~1.0g/L,乙醇 8 ~10g/L, pH 值為 5.5 ~6.5。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種生產(chǎn)細菌纖維素的方法，其特征在于，步驟2)所述的堿性溶液為質(zhì)量濃度為1.0~1.5%的NaOH溶液；所述的干燥是在100~110°C下進行；沖洗是用蒸餾水反復(fù)進行沖洗。
【文檔編號】C12R1/02GK104031956SQ201410247526
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月5日
【發(fā)明者】王學(xué)川, 張雯, 劉蘭, 高媛, 李彥軍, 鬲萬云 申請人:陜西科技大學(xué)