專(zhuān)利名稱(chēng)：鉀離子通道阻滯化合物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及瞬時(shí)外向鉀離子通道和其它鉀離子通道的抑制劑。
背景技術(shù)：
以下是對(duì)相關(guān)技術(shù)的描述，其中無(wú)論哪個(gè)都不會(huì)認(rèn)為是權(quán)利要求的現(xiàn)有技術(shù)。
鉀離子(K+)通道是跨膜蛋白，它能隨著膜電位的變化，或者隨著陽(yáng)離子和/或配位體的激活而選擇性地把K+移入或移出細(xì)胞。K+通道的主要作用是保持靜息膜電位另一個(gè)作用是使敏感細(xì)胞中動(dòng)作電位復(fù)極。鉀離子通道代表了不同類(lèi)型的離子通道蛋白，并且現(xiàn)在已經(jīng)闡明幾種毒素主要是通過(guò)阻滯一種或多種特殊K+通道來(lái)起作用(如果不只是唯一的作用)(Rudy，＂Diversity and Ubiquityof K Channels＂，25Neuroscience 729，1988)。心臟細(xì)胞是以K+通道不同亞型的顯著多樣性為特征的。在一次動(dòng)作電位過(guò)程中因膜的除極而能夠打開(kāi)好幾種類(lèi)型的K+通道，這些不同通道運(yùn)載的離子流(currents)總和會(huì)引起膜的復(fù)極而達(dá)到靜息電位。一旦膜除極，這些類(lèi)型通道之一的瞬時(shí)外向K+通道能夠產(chǎn)生快速(在1-10毫秒)啟動(dòng)的一股離子流(I10)，然后迅速(10-200毫秒)衰退(失活)。I10對(duì)心臟動(dòng)作電位的最初復(fù)極起著最顯著的作用，并且能被幾種非特異性藥用化合物如氨基吡啶類(lèi)化合物和tedisamil，一種三類(lèi)抗心律失常劑所阻滯(Dukes等，“Tedisamil Blocksthe Transient and Delayed Rectifier K+Currents inMammal ian Cardiac and Glial Cells”254J.Pharmacd.Exp.Ther.560，1990)。阻滯I10導(dǎo)致心臟動(dòng)作電位的延長(zhǎng)。已從人心臟細(xì)胞中記錄下了I10，如Escande等在“ Two Types ofTransient Outward Currents inAdult Human Atrial Cells”，252Am.J.Physiol H142，1987中所述。據(jù)說(shuō)延長(zhǎng)心臟動(dòng)作電位(并且因此無(wú)刺激反應(yīng))是抑制再活動(dòng)性心房和心室心律失常的一種機(jī)理(Lynch等，“Therapeutic Potential of ModulatingPotassium Currents in the Diseased Myocardium”6FASEB J.2952，1992)。目前可得到的第III類(lèi)抗心律失常劑，其中多數(shù)能夠通過(guò)阻滯稱(chēng)作延緩型校正K+通道的一種單獨(dú)的K+通道亞型起作用，它可以引起心臟動(dòng)作電位的過(guò)度延長(zhǎng)，這樣會(huì)導(dǎo)致心室心律失常的出現(xiàn)，稱(chēng)作torsades de pointes(Sanguinetti，“Modulation of Potassium Channels by Antiarrhythmicand Antihypertensive Drugs”，19 Hypertension 228，1992)。
電壓依賴(lài)性K+通道的打開(kāi)也是中樞神經(jīng)元非常短的動(dòng)作電位特征過(guò)程中出現(xiàn)細(xì)胞膜復(fù)極的機(jī)理。在這種過(guò)程中，瞬時(shí)外向K+通道離子流(在神經(jīng)元中稱(chēng)作IA)起著重要作用。樹(shù)突毒素(dendrotoxin)，一種源于蛇類(lèi)的毒素，選擇性阻滯神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中遲緩型非失活K+離子流(Penner等，“DendrotoxinASelective Blocker of a Non-inactivating PotassiumCurrent in Guinea-Pig Porsal Root Ganglion Neurones，407 Pfluqers Arch.365，1986)，并且在海馬狀突起的切片中也能阻滯瞬時(shí)外向K+離子流(IA)(Halliwell等，“CentralAction of DendrotoxinSelective Reduction of aTransient K Conductance in Hippocampus and Binding toLocalized Acceptors”，83Proc.Natl.Acad.sci.USA493，1986)。由樹(shù)突毒素所引起的神經(jīng)元中動(dòng)作電位時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)釋放的增加(Harvey and Anderson，“DendrotoxinsSnake Toxins That Block Potassium Channels andFacilitate Neurotransmitter Release”，31 Pharmac.Ther.33，1985)。有人已經(jīng)提出在這個(gè)領(lǐng)域中的進(jìn)一步研究可證實(shí)這將成為治療認(rèn)識(shí)性疾病如阿爾茨海默氏癥的一種藥理途徑(Lavretskyand Jarvik，“A Group of Potassium-Channel Blockers-Acetylcholine ReleasersNev Potentials for AlzheimerDisease？A Review”，12J.Clinical Psychopharm.110，1992)。發(fā)明概述本發(fā)明一般涉及瞬時(shí)外向鉀離子通道(例如，在心臟細(xì)胞和神經(jīng)元中分別稱(chēng)作I10或IA的離子流)的新的特異性和有效的抑制劑或阻滯劑。本發(fā)明也涉及到從蜘蛛毒液中分離出的新多肽或其等同物，它們對(duì)一種或多種鉀離子通道如瞬時(shí)外向鉀離子通道有活性。
具體來(lái)說(shuō)，提供了從蜘蛛疾行異足蛛和Olios fasciculatus的毒液中分離出的多肽毒素新活性的例子。這些肽(這里將其簡(jiǎn)稱(chēng)為化合物1、2和3)是電壓依賴(lài)性瞬時(shí)外向K+通道的特異性有效的阻滯劑，它們阻滯心臟細(xì)胞的相應(yīng)整細(xì)胞離子流(I10)。這些藥劑本身，其片段或用一種配位體結(jié)合測(cè)定法(或其等同方法)應(yīng)用這些毒素或其等同物發(fā)現(xiàn)的化合物，或其等同物，可用于治療心律不齊，并且可用于治療學(xué)習(xí)和記憶的障礙(如阿爾茨海默氏病)、帕金森氏癥、多發(fā)性硬化癥、精神分裂癥、癲癇、中風(fēng)和肌肉痙攣癥。
一般來(lái)說(shuō)，從蜘蛛疾行異足蛛和Olios fascicul atus的毒液中能夠分離到本文所述和要求保護(hù)類(lèi)型的有用的K+通道阻滯性多肽。也能分離到其它阻滯鉀離子通道的具有相似或同源氨基酸(或其它化合物或單體)序列的多肽(或其等同物)。申請(qǐng)人相信本發(fā)明首次測(cè)出了源于蜘蛛毒液的毒素中這種K+通道阻滯活性的存在，由此表明對(duì)蜘蛛毒液中其它這類(lèi)多肽的篩選是有用的和可生產(chǎn)的。本發(fā)明還涉及使用這些多肽來(lái)篩選作為活性劑可作用于共同位點(diǎn)(即，瞬時(shí)外向鉀離子通道)的其他藥劑的方法。
本申請(qǐng)人相信能選擇性地阻滯中樞神經(jīng)元中IA通道并引起神經(jīng)遞質(zhì)釋放增加的化學(xué)藥劑可用于治療阿爾茨海默氏病和其它神經(jīng)疾病，相似地，本申請(qǐng)人也相信能選擇性阻滯心臟細(xì)胞中I10通道的藥劑可用于治療心律失常。因此，能夠把這些多肽和相關(guān)的化合物或藥劑用于治療心律失常，阿爾茨海默氏病，帕金森氏病，多發(fā)性硬化病，精神分裂癥，癲癇，中風(fēng)和肌肉痙攣癥。
所以，本發(fā)明第一方面闡述特異性有效的瞬時(shí)外向鉀離子通道抑制劑、阻滯劑或拮抗劑。
術(shù)語(yǔ)“瞬時(shí)外向鉀離子通道”是一個(gè)熟知的術(shù)語(yǔ)，該術(shù)語(yǔ)定義為不同種類(lèi)細(xì)胞中特定亞型的鉀離子通道，如，在心臟細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞中分別以上述注明的離子流I10和IA為特征的K+通道。
術(shù)語(yǔ)“抑制劑”是用來(lái)指減少由瞬時(shí)外向鉀離子通道所產(chǎn)生的離子流的藥劑。在本領(lǐng)域中，術(shù)語(yǔ)如“阻滯劑”和“拮抗劑”是與術(shù)語(yǔ)“抑制劑”互換使用的。
“特異性”是指對(duì)瞬時(shí)外向鉀離子通道阻滯的半數(shù)最大值(IC50)為100nM或低于100nM，并且在至少高于瞬時(shí)外向K+通道IC50值10倍的濃度時(shí)對(duì)其它K+通道(如遲緩型校正K+通道，內(nèi)向校正K+通道，乙酰膽堿激活的或ATP抑制的K+通道)，Na+或Ca2+通道均沒(méi)有作用。
“有效”是指在抑制劑的濃度小于100nM，優(yōu)選小于10nM和更優(yōu)選小于1nM時(shí)能夠抑制指定瞬時(shí)外向K+通道的50％。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些藥劑是多肽或源于蜘蛛毒液中的多肽。盡管本文提供了這種多肽的具體實(shí)例，但在本發(fā)明中這些實(shí)例不是限定性的，并且本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)意識(shí)到在各種蜘蛛毒液中能夠容易鑒定出其它多肽，包括卻不限于本文所述的多肽。此外，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)意識(shí)到用標(biāo)準(zhǔn)方法能夠合成等同的多肽。用常規(guī)的篩選方法能夠很容易地鑒定出這些肽阻滯、抑制或拮抗選定的瞬時(shí)外向鉀離子通道的特定活性部位。例如，能夠合成或用各種肽酶從完整的多肽中生成特定肽片段，并目如下文所述在測(cè)定方法中測(cè)得這些片段具有抑制活性。在本發(fā)明中作為抑制劑具有活性的這些片段可用于各種篩選試驗(yàn)和治療應(yīng)用中。
此外，能夠很容易地合成這種多肽的類(lèi)似物或突變蛋白。這些合成包括對(duì)氨基酸序列中不影響原始多肽抑制或阻滯活性的區(qū)域進(jìn)行修飾。在該抑制劑的許多保守區(qū)域中，可以取代氨基酸而不顯著改變?cè)撘种苿┑幕钚?，例如，使用較小的氨基酸如甘氨酸取代其它較小的氨基酸如纈氨酸，或者用帶正電或負(fù)電荷的氨基酸取代相似電荷的氨基酸。
術(shù)語(yǔ)“衍生”簡(jiǎn)單地表示能夠根據(jù)蜘蛛毒液中所鑒定的多肽通式結(jié)構(gòu)合成化合物。用本領(lǐng)域所熟知的方法能進(jìn)行這種衍生，上文一般性地提供了這種特定例子。術(shù)語(yǔ)“衍生”優(yōu)選包括如上所述的類(lèi)似物，突變蛋白和片段，它們具有如上文所述的多肽毒素的所需調(diào)節(jié)活性。
用蜘蛛疾行異足蛛和Olios fasciculatus的毒液中發(fā)現(xiàn)的多肽舉例說(shuō)明上述發(fā)明，按照本發(fā)明的三種特定多肽以及含有該多肽的級(jí)份包括疾行異足蛛肽化合物1(SEQ.ID.NO.1)，疾行異足蛛肽化合物2(SEQ.ID.NO.2)，和Ol ios fasciculatus肽化合物3(SEQ.ID.NO.3)。在一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明的多肽阻滯心臟和神經(jīng)細(xì)胞中的瞬時(shí)外、向K+通道。本發(fā)明包括具有與疾行異足蛛肽化合物1和化合物2以及Olios fascicul atus肽化合物3的多肽基本上相同的氨基酸序列和基本上相同的K+離子流阻滯活性的多肽。
本發(fā)明第二方面闡述一種篩選瞬時(shí)外向鉀離子通道活性劑的方法，它包括把一種瞬時(shí)外向鉀離子通道與一種已知特異性瞬時(shí)外向鉀離子通道抑制劑(如上述那些)和一種可能的瞬時(shí)外向鉀離子通道活化劑相接觸，然后測(cè)定可能的活化劑對(duì)已知抑制劑的結(jié)合的抑制作用。結(jié)合抑制作用表明是一種有用的瞬時(shí)外向鉀離子通道活化劑。能夠很容易地篩選出這類(lèi)活化劑并測(cè)定其特異性。
“活性劑”是指增加(如果它作為一種激動(dòng)劑)或者減少(如果它作為一種抑制劑)通過(guò)瞬時(shí)外向鉀離子通道離子流的一種化合物。
本發(fā)明相關(guān)的一方面闡述一種從蜘蛛毒液中篩選一種有用的K+通道活化劑的方法，作為本文所述方法的舉例說(shuō)明。篩選該毒液來(lái)測(cè)定含有所需活性的級(jí)份。
“K+通道活性劑”是指增加或者抑制任何一種其它類(lèi)型的K+通道(如遲緩型校正K+通道，內(nèi)向校正K+通道Ca2+—激活或ATP—敏感型的K+通道)的化合物。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該篩選方法包括使用心臟或神經(jīng)組織的瞬時(shí)外向鉀離子通道。
本發(fā)明范圍還包括一種鑒別能與瞬時(shí)外向鉀離子通道結(jié)合的化合物的方法，所述化合物優(yōu)選在與疾行異足蛛肽化合物1和化合物2，以及Olios fasciculatus肽化合物3結(jié)合的相同位點(diǎn)上結(jié)合。
本發(fā)明第三方面闡述一種治療疾病或癥狀的方法，其中通過(guò)給生物體使用一種治療有效量的一種特異性瞬時(shí)外向鉀離子通道抑制劑或者一種源于蜘蛛毒液中的多肽(或其等同物)，調(diào)節(jié)瞬時(shí)外向鉀離子通道的活性，來(lái)達(dá)到治療有用的結(jié)果。被治療的特殊疾病包括(但不限定)上述所列的那些。
“調(diào)節(jié)”是指降低瞬時(shí)K+通道的活性。例如，通過(guò)阻滯該通道的細(xì)孔，或者通過(guò)改變通道閘門(mén)的電壓依賴(lài)性。
治療包括的步驟是，首先用常規(guī)的臨床方法診斷患有疾病或癥狀的患者(人或非人類(lèi))，然后給這類(lèi)患者提供一種治療有效的本發(fā)明組合物。
“治療有效”是指能夠使患者的所述疾病或狀態(tài)的一種或多種癥狀緩解(到某種程度)的一種用量。此外，“治療有效”還指能夠使與該疾病或狀態(tài)有關(guān)的或是該疾病或狀態(tài)病因的生理或生化參數(shù)部分或者全部地恢復(fù)到正常的一種用量。通常該用量在大約1nmol/kg和1μmol/kg分子之間，這取決于它的EC50和患者的年齡，體重和疾病。
本發(fā)明另外一方面闡述一種藥用組合物，它包括一種特異性瞬時(shí)外向鉀離子通道抑制劑或蜘蛛毒液多肽(或其等同物)。
本發(fā)明還一方面闡述從一種蜘蛛毒液中可獲得的一種多肽(或其類(lèi)似物)，它是鉀離子通道活性的一種抑制劑。本發(fā)明還提供這種多肽的獨(dú)特片段。如上文所定義，這種類(lèi)似物不是從毒液中所得到的多肽本身，而是通過(guò)分析一種已分離出的多肽(如本文舉例說(shuō)明的)所衍生的或者通過(guò)篩選其它毒液所獲得的。
術(shù)語(yǔ)“獨(dú)特片段”是指在本申請(qǐng)申請(qǐng)日已知序列中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)同樣等同物的部分。用申請(qǐng)日時(shí)存在的一個(gè)解析多肽的數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)測(cè)定等同物能夠很容易地識(shí)別這些片段。
“藥學(xué)上可接受的組合物”是指在一種藥學(xué)上可接受的載體中含有一種治療有效量的本發(fā)明的一種化合物，即，一種制劑，其中能夠把該化合物加入其中溶解或者用別的方法使該化合物易于給藥。藥學(xué)可接受的載體例子包括水，生理鹽水和生理緩沖鹽水。這種藥物組合物是以適當(dāng)劑量來(lái)提供的。這些組合物一般是指由FDA或者非美國(guó)的相同機(jī)構(gòu)所批準(zhǔn)用于治療一種特定疾病的那些組合物。
“疾病或狀態(tài)”是指上述所列出的那些疾病和涉及心臟或神經(jīng)細(xì)胞的相關(guān)疾病。
這種化合物用作殺蟲(chóng)劑也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。申請(qǐng)人相信本文所述的化合物具有顯著的殺蟲(chóng)作用，或許是通過(guò)阻滯與哺乳動(dòng)物心肌的瞬時(shí)外向K+通道結(jié)構(gòu)上相似的通道起作用。我們知道蜘蛛產(chǎn)生的毒液含有具有有效殺蟲(chóng)活性的多種毒素(Quistad，G.B，等“Insecticidal activity of Spider(Araneae)，centipede(Chilopoda)，scorpion(Scorpionidae)，and snake(Serpentes)venoms 85 Journal Economic Entomology 33，l992)。這些毒素在釋放壓力的作用下而放出，從而產(chǎn)生能夠有效和迅速殺死或麻痹捕獲昆蟲(chóng)的毒素(Jackson，H和P.N.R.Usherwood，“Spider toxins as tools for dissectingelements of excitary amino acid transmission”，11Trends in Neurosciences 278，1988)。
本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)在下列所述的優(yōu)選實(shí)施方案和權(quán)利要求中將是顯而易見(jiàn)的。
優(yōu)選實(shí)施方案的描述首先簡(jiǎn)要說(shuō)明附圖附1是在用80％A/20％B平衡的、Vydac C18反相HPLC柱(10×250mm)上進(jìn)行分離的疾行異足蛛毒液(120μl)的色譜分析圖。在44分鐘內(nèi)用76％A/24％B到65％A/35％B的線(xiàn)性梯度洗脫(A＝0.1％TFA(含水)，B＝0.1％TFA(溶于CH3CN中))。注射該毒液5分鐘后開(kāi)始該梯度洗脫，并在39分鐘時(shí)停止洗脫用3分鐘時(shí)間將柱洗以50％B以洗脫最后的峰。在220nm處監(jiān)測(cè)洗脫物的吸收度。以吸收峰底部的數(shù)值標(biāo)記級(jí)份(#1—8和最后級(jí)份)。
圖2是在陽(yáng)離子交換柱上進(jìn)行分離的肽化合物1和2的色譜分析圖。(a圖)對(duì)肽化合物1而言，用0～0.32M NaCl的50mM醋酸鈉pH4.0的線(xiàn)性梯度在32分鐘內(nèi)展開(kāi)該柱，然后用0.32～1M NaCl的50mM醋酸鈉pH4.0的線(xiàn)性梯度在5分鐘內(nèi)展開(kāi)該柱。(b圖)對(duì)肽化合物2而言，用0-0.3M NaCl的50mM醋酸鈉pH4.0的線(xiàn)性梯度在3分鐘內(nèi)展開(kāi)該柱，然后用含0.3-1M NaCl的50mM醋酸鈉pH4.0的線(xiàn)性梯度在35分鐘內(nèi)展開(kāi)該柱。以1ml/分鐘的流速洗脫，并在280nm處監(jiān)測(cè)流出物。如色譜圖所示收集級(jí)份。
圖3是在Vydac C-18反相柱(300，10×250mm)上進(jìn)行分離的Olios fasciculatus毒液(108ul)的色譜圖。注射試樣5分鐘后，用20-45％乙腈/0.1％TFA線(xiàn)性梯度在75分鐘內(nèi)展開(kāi)該柱。在50分鐘時(shí)，用100％乙腈/0.1％TFA流過(guò)柱子7分鐘。流速在3.0ml/分鐘，并且監(jiān)測(cè)在320nm處流出物。如色譜圖所示收集級(jí)份。
圖4是用陽(yáng)離子交換色譜分析純化的肽化合物3的色譜圖。注射試樣5分鐘后，用0.25-lM NaCl的50mM醋酸鈉緩沖液pH4.0的線(xiàn)性梯度在75分鐘內(nèi)展開(kāi)該柱。以1ml/分鐘流速洗脫并在280nm處監(jiān)測(cè)流出物。如該色譜圖所示收集級(jí)份。
以下詳細(xì)描述發(fā)現(xiàn)和使用本發(fā)明有用的化合物治療如心律失常和記憶、學(xué)習(xí)障礙的方法和實(shí)驗(yàn)。一種主要方法是用放射性配位體結(jié)合技術(shù)(或其等同技術(shù))能夠迅速篩選出化合物(合成的和天然產(chǎn)物)，來(lái)識(shí)別能修改被化合物1、化合物2或化合物3所結(jié)合的瞬時(shí)外向K+通道上的位點(diǎn)結(jié)合的那些化合物。用一種相似方法能夠進(jìn)行從蜘蛛毒液中篩選K+通道阻滯劑。此外，用這種技術(shù)也能很容易地篩選這種多肽的有用衍生物或類(lèi)似物或突變蛋白質(zhì)。
其他實(shí)驗(yàn)包括記錄心臟和神經(jīng)細(xì)胞中整個(gè)細(xì)胞離子流來(lái)確定那些能夠作為瞬時(shí)外向鉀離子流特異性活性藥劑而與放射性標(biāo)記的化合物1、化合物2或化合物3競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，并且對(duì)其它類(lèi)型的通道沒(méi)有顯著作用的藥劑。
本發(fā)明所述方法鑒別的藥劑的理想特性包括1)特異地和有效地阻滯一種鉀離子通道，如心臟或神經(jīng)的瞬時(shí)外向K+通道。特異性阻滯是指該藥劑在體內(nèi)特定濃度時(shí)對(duì)其它離子通道或受體沒(méi)有明顯的作用，所說(shuō)特定濃度是指以對(duì)心律失常或?qū)W習(xí)、記憶失調(diào)或者以上所列的其它疾病的治療有效的劑量阻滯I10或IA時(shí)的體內(nèi)濃度。
2)在治療劑量時(shí)無(wú)明顯副作用，包括過(guò)度延長(zhǎng)心電圖的QT間隔，心搏緩慢，高度興奮性或疾病突然發(fā)作。蜘蛛毒液毒素的分離以下是一種非限定的方法實(shí)例，由該方法可以分離本發(fā)明的抑制劑蜘蛛毒素。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)預(yù)想到用等同方法可以分離和識(shí)別具有本發(fā)明有用活性的其它多肽(或其等同物)。等同化合物是本文所指的類(lèi)似物，突變蛋白和衍生物，并且是可用本文所述的方法來(lái)識(shí)別的具有對(duì)一種或多種K+通道有活性的類(lèi)似物，突變蛋白和衍生物。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)預(yù)想到一旦識(shí)別和測(cè)序出一種有用的K+通道活性劑，就能夠化學(xué)合成其全部或片段，并且如下所述，可以對(duì)該序列進(jìn)行修飾。此外，這類(lèi)片段或多肽本身可以用來(lái)篩選其活性與原多肽等同的其它活性劑。
按照對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法用電刺激分泌方法從蜘蛛疾行異足蛛和0lios fasciculatus中獲得毒液。所用的方法優(yōu)選應(yīng)當(dāng)保證全部毒液不被腹部反流液或血淋巴所污染。這種方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的。在—78℃左右以冷凍狀態(tài)存放這樣獲得的全部毒液直到用于如下所述的精制。在各種預(yù)備和半預(yù)備柱如C-4和C-18 Vydac柱(Rainin Instrument Co.Inc.，Mack Road；Woburn，Massachusetts 01801)上用反相高效液相色譜法實(shí)現(xiàn)從全部毒液中精制組分。在220nm進(jìn)行單色峰值測(cè)定。例如用一臺(tái)Waters990二極管排列的測(cè)量?jī)x(Millipore Corporation，WatersChromatography Division，34Maple Street，Milford，Massachusetts 01757)所測(cè)定收集的多色U V數(shù)據(jù)對(duì)級(jí)份進(jìn)行進(jìn)一步的分析。用已知方法如使用一臺(tái)級(jí)份收集儀和一臺(tái)ISCO2159峰值測(cè)定儀(ISCO，4700Superior，Lincoln，Nebraska，68504)收集柱中的級(jí)份。用適當(dāng)大小的容器如無(wú)菌聚乙烯實(shí)驗(yàn)室器皿收集該級(jí)份。然后用凍干洗脫液，再凍干水份來(lái)完成對(duì)級(jí)份的濃縮。使用與最后精制級(jí)份時(shí)所用體系不同類(lèi)型的柱子通過(guò)色譜分析方法測(cè)定所得到的級(jí)份的純度。
肽的測(cè)序按照已知方法能夠?qū)Πl(fā)明的多肽，如本文所識(shí)別的多肽進(jìn)行測(cè)序。測(cè)定主結(jié)構(gòu)的一般方法包括如下列步驟1)將二硫鍵連接的半胱氨酸殘基還原和進(jìn)行S-吡啶化來(lái)提高底物對(duì)酶作用的敏感性；2)通過(guò)單一或多次步驟的酶解來(lái)控制該肽的裂解；3)用反相高效液相色譜層析法(HPLC)分離和純化肽的片段；4)經(jīng)N-末端測(cè)序和離子噴射質(zhì)譜分析使肽片段特征化。
例如在溶液中進(jìn)行該多肽半胱氨酸殘基的S-吡啶乙基化研究，接著進(jìn)行該多肽的氨基酸測(cè)序。如下所述能夠完成S-吡啶乙基化的步驟。
把約1到10μg的多肽溶于或稀釋在最多5μl的-種緩沖液中，這種緩沖液是混合1份含4mM EDTA pH8.5的三羥甲基氨基甲烷鹽酸和3份8M鹽酸胍制得的。加入2.5μl10％2-巰基乙醇水溶液并在暗處氬氣中室溫下把混合物保溫兩小時(shí)，保溫之后，加入2μl4-乙烯基吡啶(-20℃氬氣中存放的新鮮試劑)，并把混合物在暗處氬氣中室溫下再保溫兩小時(shí)。然后除去混合物中的鹽分，優(yōu)選在一只較短的反相柱上用色譜法進(jìn)行。最后按照已知方法對(duì)回收的烷基化多肽測(cè)序。
另一方面，如Kruft等，193Aral.Biochem.306(1991)所述在原位還原并S-吡啶乙基化后對(duì)該多肽測(cè)序。
目前，就來(lái)自疾行異足蛛毒液中的肽化合物1和化合物2和來(lái)自olios fasciculatus毒液中的肽化合物3而言，本文公開(kāi)了特定的優(yōu)點(diǎn)，使用不通過(guò)分離/純化整個(gè)毒液的方法也能夠獲得其它肽。使用重組DNA技術(shù)通過(guò)克隆所述多肽或其部分的一種編碼序列能夠生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。例如，按照本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法使用已利用目前已知該多肽氨基酸序列信息的雜交探針來(lái)克隆整個(gè)多肽的編碼序列。結(jié)合使用重組DNA技術(shù)和體外蛋白合成技術(shù)也能生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。這種體外蛋白合成方法包括，但不限于，使用一臺(tái)ABI430A固相肽合成儀(Applied Biosystems，Ins.，850LincolnCentre Drive，F(xiàn)oster City，California94404)應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)Merrifield化學(xué)法或其它固相化學(xué)方法。等同的肽眾所周知，在多肽中能夠進(jìn)行特定氨基酸的取代而不影響或基本上不影響所說(shuō)多肽的功能。這種可行性的取代在實(shí)際操作中因多肽的不同而有所不同。按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法對(duì)可允許的取代進(jìn)行測(cè)定。因此，具有基本上相同的氨基酸序列和基本上相同的K+通道阻滯活性的所有多肽都應(yīng)當(dāng)屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。生物活性這種多肽及其片段可用于治療心律失常或記憶、學(xué)習(xí)失調(diào)如阿爾茨海默氏病以及上述其它疾病。當(dāng)用于這類(lèi)適應(yīng)癥時(shí)，把該多肽及其片段按照本領(lǐng)域公知的常規(guī)制劑方法如在Remington′sPharmaceutical Sciences(最新版，Mack Pnblishing Company，Easton，PA)中所公開(kāi)的那些方法，制備成制劑。該制劑的性能將取決于給藥途徑和所需劑量。使用肽類(lèi)藥物常用的常規(guī)最優(yōu)化技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)特定適應(yīng)癥的劑量最佳化。
一般來(lái)說(shuō)，優(yōu)選靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，皮下或腹膜內(nèi)注射給藥。對(duì)注射液來(lái)說(shuō)，在液體基質(zhì)如林格氏液，Hank溶液或其它形式的生理鹽水中配制該肽或片段。制劑也包括凍干制劑，它能在給藥時(shí)重新配制。把本發(fā)明活性化合物提供給受體的另一種方法包括透過(guò)粘膜或透皮給藥，其中該制劑含有滲透促進(jìn)劑，如洗滌劑，以及其它賦形劑。適當(dāng)配制的口服給藥也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。使用肽類(lèi)化合物1，2和3進(jìn)行篩選測(cè)定此外，這種肽類(lèi)及其生物活性片段可用于篩選試驗(yàn)以測(cè)定小分子或其它準(zhǔn)藥物抑制化合物1，2或3與心臟或神經(jīng)瞬時(shí)外向鉀離子通道結(jié)合的能力。本文以下描述了對(duì)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的適當(dāng)測(cè)定，其中使用了本發(fā)明的化合物1，2和3。在用于這種測(cè)定時(shí)，一般以放射性標(biāo)記的形式提供多肽類(lèi)化合物1，2或3(或一種活性片段)，并且評(píng)價(jià)所測(cè)化合物與放射性標(biāo)記化合物競(jìng)爭(zhēng)的能力。
以下實(shí)施例是用來(lái)詳細(xì)說(shuō)明而不是限定本發(fā)明的。
實(shí)施例1疾行異足蛛的毒液級(jí)份通過(guò)用A把75-120μl等份的粗制毒液稀釋成1ml，并將稀釋的部分上樣到20％B平衡的一只Vydae C18柱上(10×250mm)，將約900μl的疾行異足蛛毒液進(jìn)行分級(jí)分離。(A＝0.1％TFA(含水)；B＝0.1％TFA(溶于CH3CN))。3分鐘后，用1分鐘時(shí)間將梯度變?yōu)?4％B并且在第5分鐘時(shí)，開(kāi)始用44分鐘時(shí)間將線(xiàn)性梯度由24％變?yōu)?5％B。流速為3.5ml/分鐘，并在220nm測(cè)定流出液(

圖1)。收集到下列級(jí)份級(jí)份1(在5和16分鐘之間洗脫的峰)，級(jí)份2(在16和19分鐘之間洗脫的峰)，級(jí)份3(在19和23.5分鐘之間洗脫的峰)，級(jí)份4(在23.5和26.5分鐘之間洗脫的峰)，級(jí)份5(在26.5和29.5分鐘之間洗脫的峰)，級(jí)份6(在29.5和33分鐘之間洗脫的峰)，級(jí)份7(在33和37分鐘之間洗脫的峰)，級(jí)份8(在37和39分鐘之間洗脫的峰)以及最后的級(jí)份(在39和46分鐘之間洗脫的峰)。在39分鐘時(shí)，大部分毒液組分已經(jīng)洗脫后，用50％B過(guò)柱3分鐘。當(dāng)再?zèng)]有峰值洗脫出時(shí)(～7分鐘)，用4分鐘時(shí)間把柱恢復(fù)到20％B并平衡柱子用于下一次色譜分離。合并且凍干從8次色譜分離流出的類(lèi)似級(jí)份。如下面實(shí)施2和4中分另所述，級(jí)份6和7的主要峰與化合物1和2一致。
實(shí)施例2Heteropoda肽化合物1將疾行異足蛛粗制毒液(～50μl)上樣至反相HPLC柱(Vydac，C-18300A，22×250nm)，并且在60分鐘內(nèi)使用從80％A和20％B到65％A和35％B雙相線(xiàn)性梯度進(jìn)行洗脫(A＝0.1％三氟醋酸(TFA)，B＝乙腈)，在220nm處測(cè)定，流速為15ml/分鐘。收集所需要的43到44分鐘的級(jí)份。用冷凍干燥法濃縮由各次運(yùn)行中收集的組份。
用下列方法測(cè)定并確定肽化合物1的結(jié)構(gòu)。使用Waters Pico-Tag系統(tǒng)對(duì)三份相同的1-10nmol樣品進(jìn)行PTC氨基酸分析。在一臺(tái)脈沖-液相測(cè)序儀(ABI)上對(duì)天然和還原的/吡啶乙基化肽進(jìn)行N-末端測(cè)序。從一臺(tái)SCI-EXAPI III離子噴射質(zhì)譜儀上得到質(zhì)譜分析。
按照Kruft等，193 Anal.Biochem.306(1991)的方法原位生產(chǎn)適合于N-末端測(cè)序的化合物1的吡啶乙基化衍生物。
同時(shí)獲得的這些數(shù)據(jù)證實(shí)了肽化合物1的結(jié)構(gòu)如下所示。SEo.ID.No.1Asp Asp Cys Gly Lys Leu Phe Ser Gly Cys Asp Thr Ash Ala1 5 10Asp Cys Cys Glu Gly Tyr Val Cys Arg Leu Trp Cys Lys Leu15 20 25Asp Trp3030個(gè)殘基，6個(gè)半胱氨酸，3個(gè)二硫鍵。計(jì)算的質(zhì)量＝3412.86(酰胺)。測(cè)得的質(zhì)量＝3412.70(離子噴射質(zhì)譜)。估算的p1＝3.76。
實(shí)施例3Heteropoda肽化合物1在一只HEMA-IEC BIO SB柱(10μm，4.6×150cm；Alltech Associates，Deerfield，IL 60015)上用離子交換色譜分離法進(jìn)一步純化肽化合物1。把從反相層析法得到的含有肽化合物1的凍干物溶于3ml50mM醋酸鈉(pH4.0)，并且如下用三等分進(jìn)行層析分離。把1ml樣品上樣在用50mM醋酸鋼(pH4.0)平衡的HEMA-IEC BIO SB柱子上。5分鐘后，在32分鐘內(nèi)用0-0.32M NaCl的50mM醋酸鈉溶液(pH4.0)的線(xiàn)性梯度展開(kāi)該柱，接著在5分鐘內(nèi)用0.32-1M NaCl的50mM醋酸鈉溶液(pH4.0)的線(xiàn)性梯度展開(kāi)該柱(圖2a)。10分鐘后，在5分鐘內(nèi)把柱恢復(fù)到起始條件，并且平衡該柱以用于下一步的色譜分析。以1ml/分鐘洗脫，并在280nm監(jiān)測(cè)洗出液。如色譜圖上所示收集級(jí)份。把另外2ml粗制化合物1如上所述進(jìn)行色譜分離并合并三次色譜分離中相似的級(jí)份。
在一只Vydac C-18反相柱(10×250mm，300)上使在26.5和29分鐘之間從離子交換柱上洗脫出的主要吸收峰脫鹽，把合并的級(jí)份(～10ml)裝載到用20％乙腈/0.1％TFA平衡的反相柱上。10分鐘后，在30分鐘內(nèi)用20-35％的乙腈/0.1％TFA的線(xiàn)性梯度以3.5ml/分鐘的流速展開(kāi)該柱，并在220nm處監(jiān)測(cè)洗出液。把35.5和38分鐘之間洗脫出的級(jí)份冷凍干燥，得到641μg的純化肽化合物1。測(cè)得該肽質(zhì)量為3412.72(電子噴射離子化質(zhì)譜法)。
實(shí)施例4Heteropoda肽化合物2把疾行異足蛛粗制毒液(～50μl)上樣至一只反相HPLC柱(Vydac，C-18，300A，22×250mm)上，并在60分鐘內(nèi)使用由80％A和20％B到65％A和35％B的雙相線(xiàn)性梯度進(jìn)行洗脫(A＝0.1三氟醋酸(TFA)，B二乙腈)，在220nm測(cè)定，流速為15ml/分鐘。在46到48.5分鐘之間收集所要的級(jí)份。用冷凍干燥法濃縮從各次運(yùn)行中收集的級(jí)份。
把源于50μl粗制毒液的上述級(jí)份的物質(zhì)上樣至一只反相HPLC柱(Vydac，C-18，300A，22×250mm)上，并使用75％A和25％B+(A＝0.1％TFA，B＝乙腈)等效洗脫程序進(jìn)行洗脫，在220nm處測(cè)定，并以3.5ml/分鐘的流速進(jìn)行操作。在55到68分鐘之間收集所需的級(jí)份。用冷凍干燥法濃縮從各次運(yùn)行中收集的級(jí)份。
用下列方法測(cè)定并確定肽化合物2的結(jié)構(gòu)。用Waters Pico-Tag系統(tǒng)對(duì)三份相同的1-10nmol樣品進(jìn)行PTC氨基酸分析。用一臺(tái)脈沖-液相測(cè)序儀(ABI)對(duì)天然和還原的/吡啶乙基化肽進(jìn)行N-末端測(cè)序，從一臺(tái)SCI-EXAPI III離子噴射質(zhì)譜儀上得到質(zhì)譜分析。
按照Kruft等，193Anal Biochem 306(1991)的方法原位生產(chǎn)適合N-末端測(cè)序的化合物的吡啶乙基化衍生物。
同時(shí)獲得的這些數(shù)據(jù)證實(shí)了如下所示的肽化合物2的結(jié)構(gòu)。SEQ.ID.No.2Glu Cys Gly Thr Leu phe ser Gly Cys Ser Thr His Ala Asp1 5 10Cys Cys Giu Gly Phe Ile Cys Lys Leu Trp Cys Arg Tyr Glu15 20 25Arg Thr Trp3031個(gè)殘基，6個(gè)半胱氨酸，3個(gè)二硫鍵。計(jì)算的質(zhì)量＝3599.05(酰胺)測(cè)得的質(zhì)量＝3599.38(離子噴射質(zhì)譜)估算的pl＝5.41。
實(shí)施例5Heteropoda肽化合物2在一只HEMA-IEC BI0 SB柱(10μm，4.6×150cm)上用陽(yáng)離子交換層析法純化肽化合物2。把從最初反相層析得到的含有肽化合物2的凍干物溶解在3ml50mM醋酸鈉(pH4.0)中，并如下對(duì)三等份進(jìn)行色譜分析。把1ml樣品上樣至在用50mM醋酸鈉(pH4.0)平衡的HEMA-IEC BIO SB柱上。5分鐘后，在3分鐘內(nèi)用0-0.3M NaCl的50mM醋酸鈉溶液(pH4.0)的線(xiàn)性梯度展開(kāi)該柱子，接著在35分鐘內(nèi)用0.3-1M NaCl的50mM醋酸鈉溶液(pH4.0)線(xiàn)性梯度展開(kāi)該柱(圖2b)。5分鐘后，在10分鐘內(nèi)把該柱恢復(fù)到起始條件并進(jìn)行平衡以用于下一步層析。以1ml/分鐘流速洗脫，并在280nm監(jiān)測(cè)洗出液。如色譜上所示收集級(jí)份。如上所述把其它兩毫升粗制化合物2進(jìn)行層析。并且合并來(lái)自三次層析的相同級(jí)份。
在一只Vydac c-18反相柱(10×250mm，300)上分兩部分脫去在30和34分鐘之間從陽(yáng)離子交換柱上洗脫的主要吸收峰的鹽分。把該柱在25％乙腈/0.1％TFA中平衡，并用起始溶劑洗脫10分鐘接著在20分鐘內(nèi)用25-35％乙腈/0.1％TFA線(xiàn)性梯度以3.5ml/分鐘的流速洗脫。在220nm處監(jiān)測(cè)洗出液，并且在26.5到29分鐘以單峰形式洗脫出肽化合物2。然后把從陽(yáng)離子交換柱中得到的其它洗出液脫去鹽分，并且合并相同的級(jí)份。冷凍干燥這些流出液得到1.88mg純化的肽化合物2。測(cè)得這種肽的質(zhì)量為3599.52(電子噴射離子化質(zhì)譜法)。
實(shí)施例6Olios fasciculatus毒液的分級(jí)分離用1.5ml的20％乙腈/0.1％TFA稀釋大約108μl的Oliosfasci culatus的毒液并將樣品上樣至用相同緩沖液平衡過(guò)的一只VydacC-18柱(300，10×250mm)將全部毒液進(jìn)行分級(jí)分離。注射樣品5分鐘后，在75分鐘內(nèi)用20-45％乙腈/0.1％TFA的線(xiàn)性梯度展開(kāi)該柱(圖3)。在50分鐘時(shí)，大多數(shù)毒液成分洗脫下來(lái)后，用7分鐘時(shí)間將柱子洗以100％乙腈/0.1％TFA。流速為3.0ml/分鐘，并且在220nm監(jiān)測(cè)洗出液。如色譜圖上所示收集級(jí)份。冷凍干燥在40和42分鐘之間洗脫出的含有肽化合物3的級(jí)份(#21)，并把殘余物溶于2ml 50nM醋酸鈉，0.25M NaCl溶液(pH4.0)中。
實(shí)施例7Olios fasciculatus化合物3在一只HEMA-IEC BIO SB柱(10μm，4.6×150cm，來(lái)自Alltech Associates，Deerfield，IL60015)上用陽(yáng)離子交換層析法進(jìn)一步純化肽化合物3。把從反相層析中得到的含肽化合物3的溶液(1.5ml)裝載在用相同緩沖液平衡過(guò)的HEMA-IEC BIO SB柱上。5分鐘后，在75分鐘內(nèi)用0.25-1M NaCl的50mM醋酸鈉緩沖液(pH4.0)的線(xiàn)性梯度展開(kāi)該柱(圖4)。以1ml/分鐘流速洗脫，并在280nm處監(jiān)測(cè)洗出液。如該色譜圖上所示收集級(jí)份。
在一只Vydac C-18反相柱(10×250mm，300)上把在27和32分鐘之間從陽(yáng)離子交換柱上洗脫下來(lái)的主要峰值的物質(zhì)(級(jí)份#4)脫鹽。把級(jí)份(～4.5ml)裝載在用0.1％TFA平衡過(guò)的反相柱上。3分鐘后，在3分鐘內(nèi)用0-15％異丙醇/0.1％TFA的線(xiàn)性梯度展開(kāi)該柱，接著在5分鐘內(nèi)用15-30％異丙醇/0.1％TFA的線(xiàn)性梯度展開(kāi)該柱。以1.0ml/分鐘流速洗脫，并在220nm處監(jiān)測(cè)洗出液。冷凍干燥在43和45分鐘之間洗脫出的級(jí)份得到70μg純化的肽化合物3。測(cè)得該肽的質(zhì)量為3786.64(電子噴射離子化質(zhì)譜法)。
得到了還原、衍生的肽化合物3的N-末端序列分析。序列如下
SEQ.ID.No.3Asp Asp Cys Ala Gly Trp Met Glu Ser Cys Ser Ser Lys1 5 10Pro Cys Cys Ala Gly Arg Lys Cys Phe Ser Glu Trp Tyr15 20 25Cys Lys Leu Val Val Asp Gln Asn3034個(gè)殘基，6個(gè)半胱氨酸，3個(gè)二硫鍵。測(cè)得質(zhì)量＝3786.64(離子噴射質(zhì)譜)對(duì)氨基酸33和34的鑒別可信度較低。實(shí)施例8疾行異足蛛和Olils fasCiculatus肽級(jí)份和化合物1，2和3的K+通道阻滯活性用下列方法證實(shí)本發(fā)明的肽級(jí)份和化合物1，2和3阻滯瞬時(shí)外向K+通道的能力。
按照前面所述的方法(Kamp等，“Voltage-and Use-dependent Modulation of Cardiac Calcium Channels bythe Dihydropyridine(+)-202-791”，64 Circ.Res.3381989)分離鼠心室的心肌細(xì)胞。該方法包括用含有膠原酶和蛋白酶的溶液逆行灌注到一個(gè)切下的鼠心臟來(lái)酶解整個(gè)心臟從而分離適用于標(biāo)準(zhǔn)電位差施加試驗(yàn)的單個(gè)心臟肌細(xì)胞。用其他所詳細(xì)描述(Hamill等，“Improved Patch Clamp Techniqnes for High-resolutionCurrent Recording from Cells and Cell-Free MembranePatches”，391 Pflugers Arch.85，1981)的施加電位差技術(shù)從分離的肌細(xì)胞記錄全部細(xì)胞的離子流。把細(xì)胞放入一個(gè)0.5ml記錄室中，并用下列組合物的緩沖液浸泡，這種組合物為(以mM計(jì))NaCl 132MgCl2，1.2: CaCl2，1.8；KCl，4；HEPES，10；葡萄糖，10pH為7.4。在記錄K+離子流的大多數(shù)試驗(yàn)中，去除CaCl2而向該溶液中加1mM Co2+來(lái)阻滯Ca2+離子流。用商業(yè)上可買(mǎi)到的片夾放大器(Axon Instruments Axopatch ID)給該肌細(xì)胞施加一個(gè)電位差，并用個(gè)人計(jì)算機(jī)收集和分析數(shù)據(jù)。給細(xì)胞施加-60mV的電壓。使用的測(cè)試電壓(500毫秒間隔)范圍是-40至+30mV。利用這些技術(shù)能夠記錄這些細(xì)胞中的幾種K+離子流，包括內(nèi)向校正K+離子流；迅速激活、非失活的遲緩型校正K+離子流；和電壓依賴(lài)性的瞬時(shí)外向K+離子流(I10)。分別把實(shí)施例1中所述制得的毒液級(jí)份1-8和最后級(jí)份的干級(jí)份殘余物溶于1ml水中。然后用3ml的緩沖液稀釋10μl的每個(gè)樣品來(lái)測(cè)試心臟K+離子流的作用。在這些條件下，肽級(jí)份2-9以一種電壓依賴(lài)性的方式阻滯I10。在-10mV的試驗(yàn)電位時(shí)完全阻滯，在+30mV試驗(yàn)電位時(shí)阻滯降低到對(duì)照值的30到70％。如上述實(shí)施例3和5中所述分離并純化級(jí)份6(化合物1)和級(jí)份7(化合物2)的主要肽?；衔?以電壓依賴(lài)性方式阻滯I10，在較小的除極試驗(yàn)電位時(shí)有較大的阻滯出現(xiàn)。通過(guò)測(cè)定抑制50％的I10所需的濃度(IC50)和在三種不同的試驗(yàn)電位時(shí)這種離子流的最大阻滯的方法來(lái)定量表示這種阻滯。在-10mV，+20mV和+50mV試驗(yàn)電位時(shí)I10的最大阻滯分別是100％，79％和69％，阻滯I10的IC50在-10mV為16nM，在+20mV為35nM以及在+50mV為138nM(n＝4-6)。與阻滯I10一樣，在90％復(fù)極時(shí)測(cè)得，化合物1(30nM)延長(zhǎng)了34±5％所分離的鼠心室肌細(xì)胞的動(dòng)作電位時(shí)間。選擇性地延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)間是第三類(lèi)抗心律失常藥的活性(VaughanWilliams，“Delayed ventricular repolarization as anantiarrhythmic principle”，6 Eur.Heart J.145，1985)。測(cè)定化合物1或2對(duì)其它心臟離子流的作用來(lái)評(píng)價(jià)其特異性。如使用標(biāo)準(zhǔn)全細(xì)胞電位施加技術(shù)所測(cè)試的，在0.2-1.0μm濃度時(shí)化合物1或化合物2不影響下列心臟的離子流——鼠心室肌細(xì)胞中超速遲緩型校正K+離子流(Ikur)——豚鼠心室肌細(xì)胞中緩慢遲緩型校正K+離子流(Iks)——鼠和豚鼠心室肌細(xì)胞中內(nèi)向校正K+離子流(Iki)——鼠心室肌細(xì)胞的鈉離子流(INa)——鼠和豚鼠心室肌細(xì)胞中L型Ca2+離子流(Ica-L)在一個(gè)分離的人心室肌細(xì)胞中，化合物1(0.2μM)也阻滯I10但不阻滯Ikw，類(lèi)似于在鼠心室肌細(xì)胞中的發(fā)現(xiàn)。
化合物3也有相似活性，在試驗(yàn)電位＜0mV在1μM時(shí)完全阻滯I10，同時(shí)對(duì)遲緩型校正或內(nèi)向校正K+離子流沒(méi)有影響。一旦失去了毒素，化合物1和化合物2(1μM)的作用基本上相反。
還測(cè)試了化合物1或2對(duì)由分離的非心臟細(xì)胞所記錄的許多其他K+通道的活性。在0.2-1.0μM，化合物1或2對(duì)下列無(wú)作用——鼠中樞細(xì)胞(浦肯野氏神經(jīng)元，小腦粒細(xì)胞，海馬錐體細(xì)胞，交感神經(jīng)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞)，GH3垂體細(xì)胞或兔破骨細(xì)胞的迅速遲緩型校正K+離子流(Ik)——鼠小腦粒細(xì)胞或交感神經(jīng)的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的瞬時(shí)外向電流(In)——在Xenopus oocytes中所表達(dá)的一種克隆通道。
因此表明化合物1和2對(duì)心臟肌細(xì)胞中的一種類(lèi)型的通道(一種電壓激活的瞬時(shí)外向K+離子流)是非常具有特異性唯一報(bào)道的抑制(神經(jīng)細(xì)胞中)瞬時(shí)外向K+離子流的其它毒素是樹(shù)突毒素(Halinell等“Central action of dendrotoxinSelective veductionof a transient K conductance in hippocampus andbinding to localized acceptors”83 Proc.Natl.Acad.Sci.USA493，1986)。但是，我們已證明樹(shù)突毒素(2μM)對(duì)鼠心臟I10沒(méi)有作用。所以，化合物1，2和3是首次描述能特異性阻滯心臟I10的毒素。
實(shí)施例9化合物1和2的神經(jīng)作用用本發(fā)明化合物1和2對(duì)海馬切片的電生理作用來(lái)證實(shí)它影響中樞神經(jīng)活性的能力。
用斷頭術(shù)處死雄性Sprague-Dawley鼠(100-2009)。從顱內(nèi)取出大腦，馬上放入冷的(4-6℃)充氧的(95％O2/5％CO2)人造腦脊髓液(aCSF)中，這種人造腦脊髓液是由NaCl，126；KCl，2.5，NaH2PO4，1.24；MgSO4，1.3；CaCl2，2.4；NaHCO3，26；葡萄糖11(單位mM)所組成，如前面(Mueller等，“Arylamine spider toxins antagonize NMDA receptor-mediated synaptic transmission in rat hippocampalslices”，9synapse244，1991)所述制備海馬切片。室溫下把切片保存在有充氧的aCSF的200ml容器中。在1小時(shí)的恢復(fù)期后，把一個(gè)切片轉(zhuǎn)移到小容量(～300μl)的記錄室中。在該切片上放置較輕的鉑來(lái)增加記錄的穩(wěn)定性。用aCSF覆蓋該切片，并以一種過(guò)冷系統(tǒng)保持。新鮮充氧的aCSF流速為2ml/分鐘。保持該切片浸泡在該流動(dòng)的aCSF中，以使藥物進(jìn)入該切片的電位問(wèn)題降到最低。對(duì)細(xì)胞外的電位記錄時(shí)，把記錄室的溫度保持在33℃。在肉眼觀察下把雙極同軸刺激電極放在靠近CA1-CA2邊緣的輻射層下。為引發(fā)突觸反應(yīng)，每30秒向各切片釋放3-50V的50微秒的單向脈沖同時(shí)測(cè)量該反應(yīng)，直到從特定記錄位置上得到電位的最大幅度為止。然后設(shè)置電壓來(lái)引發(fā)半數(shù)最大反應(yīng)。用充有0～9％NaCl的2-3MW玻璃微電極進(jìn)行記錄，該電極也是在肉限觀察下放置的。記錄來(lái)源于CA1錐體細(xì)胞層(總體峰)或輻射層(場(chǎng)的興奮性突觸后電位(EPSP)和輸入沖動(dòng)排(AV))的突觸反應(yīng)，并將其數(shù)字化，輸入一種以IBMPC機(jī)為基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)采集和存貯系統(tǒng)中。用磷酸鹽緩沖液(PBSNaCl，140mM；KCl，2.5mM；KH2PO4，1.5mM；Na2HPO4，8.1mM；pH7.4)以所需最終濃度的100-1000倍配制毒素，然后轉(zhuǎn)入儲(chǔ)備注射器中，以便通過(guò)稀釋和混合達(dá)到所需的最終濃度。將全部藥物和毒素過(guò)冷30分鐘后使用，此時(shí)反應(yīng)幅度一般已經(jīng)平衡。把全部波型數(shù)據(jù)化并存盤(pán)。計(jì)算用藥前5分鐘期間(對(duì)照，用藥前)和用藥后5分鐘期間(用藥后25-30分鐘)的細(xì)胞外所記錄反應(yīng)幅度平均值。
化合物1在總體峰的幅度上出現(xiàn)一個(gè)持續(xù)的增長(zhǎng)，這種增長(zhǎng)在用新鮮的aCSF沖洗化合物1期間沒(méi)有恢復(fù)原狀。對(duì)500nM化合物1的平均反應(yīng)是增長(zhǎng)35±9％(平均值±S.E.M.，n＝5個(gè)切片)在這些切片的兩個(gè)切片中，同時(shí)記錄的場(chǎng)興奮性突觸后電位的帽度以16％的平均值增長(zhǎng)，而輸入沖動(dòng)排沒(méi)有變化。
使用純化的化合物2可得到相似結(jié)果，當(dāng)以1μM的最后濃度使用化合物2時(shí)，它能在總體峰的幅度上產(chǎn)生25±7％(平均值±S.E.M.，n＝9個(gè)切片)的增長(zhǎng)。在這些切片的兩個(gè)切片中，同時(shí)記錄的場(chǎng)興奮性突觸后電位的幅度以12％平均值增長(zhǎng)，而輸入沖動(dòng)排沒(méi)有變化。
綜上所述，這些結(jié)果證實(shí)化合物1和2能夠長(zhǎng)時(shí)間增加Schaffer側(cè)突的-CA1錐體細(xì)胞突觸上的突觸傳遞。這些數(shù)據(jù)不能區(qū)分突觸前和突觸后的作用部位，也不能清楚地表明作用的機(jī)理。在突觸傳遞上的這種增長(zhǎng)可能是因?yàn)閷?duì)電壓敏感性鉀離子通道的阻滯所致。
當(dāng)靜脈注射(i.v.)或當(dāng)通過(guò)腦室內(nèi)注射給藥(i.c.v)時(shí)，許多K+通道阻滯劑能夠引起癲癇發(fā)作。例如，當(dāng)以0.008μg/g通過(guò)腦室內(nèi)注射時(shí)，相當(dāng)于大約0.24μg只鼠，樹(shù)突毒素能引起鼠抽搐和死亡(Schweitz，H.等，＂Purification andpharmacological Characterization of peptide toxins fromthe black mamba(Dendroaspis polylepis)venom＂，28Toxicon 847，1990)。比較起來(lái)，給有聽(tīng)原性癲癇發(fā)作傾向的鼠用1μg(n＝3)或2μg(n＝1)的化合物2通過(guò)腦室內(nèi)注射時(shí)，化合物2不會(huì)引起抽搐或癲癇發(fā)作。以10，15或24μg(n＝1每次劑量)劑量靜脈注射化合物2后，它能引起鼠瞬時(shí)共濟(jì)失調(diào)，但沒(méi)有觀察到抽搐。
實(shí)施例10其它K+通道阻滯毒素化合物1、2和3是指從蜘蛛毒液中分離出來(lái)的能夠阻滯特異性K+通道的首次報(bào)道的毒素例子。在不是疾行異足蛛和Oliosfasciculatus種的蜘蛛毒液中也含有結(jié)構(gòu)上不相關(guān)的毒素(肽類(lèi)和非肽類(lèi))，這些毒素能有效地阻滯哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的I10或者其它類(lèi)型的K+通道。
現(xiàn)在已經(jīng)知道從脊柱動(dòng)物和非脊動(dòng)物毒液中分離的幾種其它毒素的特性。例如，從蜜蜂Apis mellifera毒液中已分離出兩種毒素能夠阻滯K+通道。蜜蜂神經(jīng)毒素能夠阻滯低電導(dǎo)Ca2+激活的K+通道，而MCD(肥大細(xì)胞脫粒)肽能阻滯非失活遲緩型校正K+通道(Strong，“Potassium Channel Toxins”，46Pharmac.Ther.137，1990)。從蝎子和蛇產(chǎn)生的毒液中已分離出了其它K+通道的特異性阻滯毒素。例如，Leiurus quinquestriatus蝎子的毒液中含有至少兩種毒素，charybdotoxin和leiurotoxin，它們分別能阻滯高電導(dǎo)和低電導(dǎo)Ca2+激活性K+通道(Strong，“potassiumChannel Toxins”，46Pharm.Ther.127，1990)?，F(xiàn)在已經(jīng)從窄頭眼鏡蛇的毒液中分離出了能夠阻滯神經(jīng)元的非失活遲緩型校正K+通道的毒素(Harvey和Anderson，“DendrotoxinsSnakeToxins That Block Potassium Channels and FacilitateNeurotransmitter Release”，31Pharmac.Ther.33，1985)。來(lái)自綠色窄頭眼鏡蛇(Dendroaspis angusticeps)的樹(shù)突毒素和來(lái)自黑色窄頭眼鏡蛇(D.Polylepis)的毒素1都具有與β-金環(huán)蛇毒素明顯的序列同源現(xiàn)象，其中β-金環(huán)蛇毒素是從Bungarusmulticinctus的毒液中分離出來(lái)的也能夠阻滯相同類(lèi)型K+通道的一種抑制性突觸前神經(jīng)毒素(Moczydlowski等，“An EmergingPharmacology of Peptide Toxins Targeted Against PotassiumChannels”，105J.Membrane Biol95，1988)。據(jù)報(bào)道以上所指的毒素具有除阻滯非失活遲緩型校正K+通道之外的作用。例如，β-金環(huán)蛇毒素也具有磷脂酶A2活性(Moczydlowski等)，而樹(shù)突毒素也能阻滯海馬神經(jīng)元的鈉離子流和一種緩慢失活的瞬時(shí)K+離子流(Li和McArdle“Dendrotoxin Inhibits Sodium andTransient Potassium Cuments in Murine HippocampalNeurons”，64.Biophys.J.A198，1993)。
上述毒素已經(jīng)用于定義正常細(xì)胞的生理學(xué)和疾病組織細(xì)胞中的特異性K+通道的作用。但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對(duì)幾種K+通道還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)較高特異性和有效的調(diào)節(jié)劑。對(duì)于發(fā)現(xiàn)這類(lèi)新的通道配合體來(lái)說(shuō)，蜘蛛毒液是一種可以發(fā)掘的資源。
通過(guò)使用全細(xì)胞電壓施壓記錄技術(shù)測(cè)定整個(gè)毒液，由標(biāo)準(zhǔn)HPLC方法分離的毒液級(jí)份，和分離的毒素對(duì)分離的哺乳動(dòng)物心臟和神經(jīng)細(xì)胞K+離子流的作用來(lái)檢測(cè)蜘蛛毒液中K+通道特異性毒素的存在。
實(shí)施例11篩洗能存神經(jīng)組織中瞬時(shí)外向K+通道部位與化合物
1/化合物2 /化合物3結(jié)合的化合物的方法用本領(lǐng)域中已知的方法(乳過(guò)氧化物酶，Bolton-Hunter，氯胺T等)用125I標(biāo)記化合物1，2或3或相關(guān)肽。使用下述方法測(cè)定作用于化合物1/化合物2/化合物3結(jié)合部位的候選化合物，通過(guò)測(cè)定其取代用125I標(biāo)記的[125I]化合物1，[125I]化合物2，或[125I]化合物3或相關(guān)肽的特異性結(jié)合的能力來(lái)評(píng)價(jià)所述候選化合物。
把下列測(cè)試法作為一種高生產(chǎn)率的測(cè)試方法，來(lái)篩選產(chǎn)品庫(kù)(如，天然產(chǎn)物庫(kù)和主要制藥公司申請(qǐng)的化合物)從而識(shí)別在I10通道上的化合物1/化合物2/化合物3結(jié)合部位具有活性的新的一類(lèi)化合物。然后用這類(lèi)新化合物作為以神經(jīng)I10通道上化合物1/化合物2/化合物3結(jié)合部位為目標(biāo)的藥物開(kāi)發(fā)項(xiàng)目的化學(xué)主結(jié)構(gòu)。用這種測(cè)試法識(shí)別的化合物給學(xué)習(xí)和記憶失調(diào)如阿爾茨海默氏病和上述所列的其它疾病提供了一種新的治療途徑。如果在定量試驗(yàn)中使用了一種肽，確保該肽保留著它的生物活性是很重要的。就阻滯心臟I10而言，碘化的(125I)化合物1、化合物2和化合物3保留著它們的正?；钚?。例如，125I-化合物1以一種電壓依賴(lài)性方式阻滯鼠心室肌細(xì)胞的I10，估計(jì)IC50在-10mV為25nM，在+20mV為70nM，并且在+50mV為150nM。
按照Williams等(“Effects of Polyamines on theBinding of[3H]MK-801 to the NNDA ReceptorPharmacological Evidence for the Existence of aPolyamine Recognition Site”36Molec.Pharmacol.575，1989)的方法制備鼠腦膜，如下把重量為100-200g的雄性Sprague-Dawley小鼠(Simonsen Laboratories)用斷頭術(shù)處死。用一臺(tái)玻璃/Teflon勻漿機(jī)在含5mMK-EDTA的300ml0.32M蔗糖溶液(pH7.0)中把20只小鼠大腦(去掉小腦和腦干)勻漿。在1000xg把勻漿離心分離10分鐘，去掉上清液，再在30,000xg離心分離30分鐘。把所得到的沉淀物懸浮于250ml 5mM K-EDTA(pH7.0)，并在冰上攪拌15分鐘。然后在30,000xg離心分離30分鐘。把該沉淀物懸浮于90ml 5mM K-EDTA(pH7.0)，并把15-ml等分試樣在0.9M和1.2M蔗糖溶液(各10ml)的不連續(xù)蔗糖梯度中分層。在95,000xg把該梯度溶液離心分離90分鐘，收集在0.9M/1.2M蔗糖溶液界面的突觸漿膜(SPM)。用500ml5mM K-EDTA(pH7.0)的懸浮液沖洗該膜，并在32℃保溫30分鐘，再在100,000xg離心分離30分鐘。重復(fù)三次該沖洗步驟，包括30分鐘的保溫，將最后的沉淀物再懸浮于60ml 5mMK-EDTA(pH7.0)中，并在-80℃以等分試樣存放。為進(jìn)行與[125I]化合物1，2或3的結(jié)合試驗(yàn)，把突觸漿膜(SPMs)融化，在32℃溫育30分鐘，沖洗一次，然后以100,000xg離心分離30分鐘。把SPMs再懸浮于緩沖液A中(20mMK-HEPES，1mM K-EDTA，(pH7.0)。向該反應(yīng)混合物中加入[125I]化合物1，2或3。在聚丙烯試管中進(jìn)行結(jié)合試驗(yàn)。最后溫育體積為200μl。在100μm非放射活性的化合物1，2或3存在下測(cè)定非特異性結(jié)合。把三份相同樣品在32℃溫育2小時(shí)。加入10ml冰冷的緩沖液A結(jié)束試驗(yàn)，然后用玻璃纖維濾紙過(guò)濾(Schl eicher&Schuell No.30)。用另外10ml緩沖液A沖洗濾紙，并用γ計(jì)數(shù)儀測(cè)定125I的放射活性。
為了證實(shí)上述測(cè)試，也進(jìn)行了下列試驗(yàn)。
(a)把200μl含100nM[125I]化合物1、2或3的緩沖液A通過(guò)該玻璃纖維濾紙來(lái)測(cè)定與該濾紙非特異性結(jié)合的[125I]化合物1、2或3的量。用另外10ml緩沖液A沖洗該濾紙，并用閃爍計(jì)數(shù)法測(cè)定與該濾紙結(jié)合的放射活性。如果出現(xiàn)大量的非特異性結(jié)合的[125I]化合物1，2或3，則用未標(biāo)識(shí)的化合物1，2或3提前沖洗該濾紙來(lái)限制這種結(jié)合。如果不出現(xiàn)較高非特異性結(jié)合，則用離心法而不是過(guò)濾法結(jié)束該試驗(yàn)，用閃爍計(jì)數(shù)法測(cè)定沉淀物中放射活性的量。
(b)將SPMs再懸浮于緩沖液A，作出一條飽和曲線(xiàn)。測(cè)試緩沖液含有75μg的蛋白質(zhì)。使用[125I]化合物1，2或3的9個(gè)濃度，范圍從10nM到100μM(半數(shù)對(duì)數(shù)單位)。由數(shù)據(jù)作一條飽和曲線(xiàn)，并用Scatchard分析法(Scatchard，“The Attractionsof Proteins for Small Molecules and Ions”，51Ann.N.Y.Aead.Sci.660，1949)測(cè)定近似KD值和Bmax。用Hill曲線(xiàn)的制圖(Hill，“A New Mathematical Treatmentof Changesof Ionic Concentrations in Musele and Nerve Under theAction of Electric Currents，With a Theory to TheirMode of Excitation”40 J.Physiol.190，1910)測(cè)定[125I]化合物1，2或3的結(jié)合協(xié)同性。
(c)把SPMs懸浮于緩沖液A來(lái)測(cè)定結(jié)合對(duì)蛋白(受體)濃度的依賴(lài)性。這種試驗(yàn)緩沖液(200μl)含有與其KD值相等濃度的[125I]化合物1，2或3和可增長(zhǎng)濃度的蛋白。[125I]化合物1、2或3的特異性結(jié)合應(yīng)當(dāng)與蛋白(受體)的含量呈線(xiàn)性關(guān)系。
(d)把SPMs懸浮于緩沖液A中來(lái)測(cè)定配合體-受體結(jié)合的時(shí)間過(guò)程。該試驗(yàn)用的緩沖液(300μl)含有與其KD值相等濃度的[125I]化合物1，2或3和100μg蛋白。在不同時(shí)間長(zhǎng)度于32℃溫育三份相同的樣品；測(cè)定達(dá)到平衡的時(shí)間，并且在所有隨后進(jìn)行的試驗(yàn)中通常用到這個(gè)時(shí)間點(diǎn)。
(e)用競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)?zāi)軌蚍治鼋Y(jié)合部位的藥理。在這種試驗(yàn)中，保持[125I]化合物1，2或3的濃度和蛋白量不變，同時(shí)改變?cè)囼?yàn)(競(jìng)爭(zhēng))藥物的濃度。這種試驗(yàn)?zāi)軌驕y(cè)定競(jìng)爭(zhēng)藥物的IC50和近似KD(Cheng和Prusoff，“Relationship Between theInhibition Constant(K1)and the Concentration ofInhibitor Which Causes 50 Percent Inhibition(IC50)ofan Enzymatic Reaction”，22J.Biochem.Pharmacol.3099，1973)。用Hill曲線(xiàn)分析法確定該競(jìng)爭(zhēng)藥物的結(jié)合協(xié)同性?；衔?，2或3的特異性結(jié)合是指能與I10通道上的一個(gè)新部位結(jié)合。按照這樣，與化合物1，2或3相關(guān)的肽應(yīng)當(dāng)以競(jìng)爭(zhēng)性方式競(jìng)爭(zhēng)[125I]化合物1，2或3的結(jié)合，并且在這種試驗(yàn)中它們的功效應(yīng)當(dāng)與在阻滯I10(如，在分離出的神經(jīng)或心臟細(xì)胞中對(duì)I10的抑制)的功能性試驗(yàn)中它們的抑制功效有關(guān)。相反，在I10通道上的其它部位具有活性的化合物應(yīng)當(dāng)不能以競(jìng)爭(zhēng)性方式替換[125I]化合物1，2或3的結(jié)合。相反地，可能會(huì)出現(xiàn)對(duì)[125I]化合物1，2或3結(jié)合的復(fù)雜變構(gòu)調(diào)節(jié)，這表明是非競(jìng)爭(zhēng)性的相互作用。
(f)在[125I]化合物1，2或3的結(jié)合達(dá)到平衡(見(jiàn)上述(d))后測(cè)定它們的結(jié)合，并向反應(yīng)混合物中加入較多過(guò)量的無(wú)放射活性的競(jìng)爭(zhēng)性藥物來(lái)進(jìn)行評(píng)估解離動(dòng)態(tài)的研究。然后在不同時(shí)間間隔測(cè)定[125I]化合物1，2或3的結(jié)合。用這種測(cè)試方法，測(cè)出[125I]化合物1，2或3結(jié)合的結(jié)合和解離比(Titeler，“Multiple Dopamine ReceptorsReceptor Binding Studiesin Dopamine Pharmacology”，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，1983)。另外的試驗(yàn)包括改變反應(yīng)溫度(20℃到37℃)來(lái)搞研究這些參數(shù)對(duì)溫度的依賴(lài)性。
實(shí)施例12能夠結(jié)合至心臟組織的瞬時(shí)外向K+通道上化合物1/化合物2/化合物3結(jié)合部位的化合物的篩選方法通過(guò)本領(lǐng)域中已知方法(乳過(guò)氧化物酶，Bolton-Hunter氯胺T等)用125I標(biāo)記化合物1，化合物2，化合物3和相關(guān)的肽。用以下所述的技術(shù)測(cè)定作用于化合物1/化合物2/化合物3結(jié)合部位的候選化合物替換[125I]化合物1，[125I]化合物2，[125I]化合物3或用125I標(biāo)記的相關(guān)肽的特異性結(jié)合的能力來(lái)評(píng)估它們。
把下列測(cè)試法當(dāng)作一種高生產(chǎn)率的試驗(yàn)方法使用來(lái)篩選產(chǎn)品庫(kù)(如，天然產(chǎn)物庫(kù)和多數(shù)制藥公司申請(qǐng)的化合物)，從而識(shí)別在心臟I10通道上化合物1/化合物2/化合物3結(jié)合部分具有活性的新的一類(lèi)化合物。然后用這類(lèi)新化合物作為以心臟I10通道上化合物1/化合物2/化合物3的結(jié)合部位為目標(biāo)的藥物開(kāi)發(fā)項(xiàng)目的化學(xué)主結(jié)構(gòu)。用這種測(cè)試法識(shí)別出的化合物給治療再活動(dòng)性室上和心室的心律失常提供了一條新的治療途徑。
按照Doyle等的方法(“Saxitoxin binding and“Fast”SodiumChannel Inhibition in Sheep Heart Plasma Membrane”249Am.J.Physiol H328，1985)。以及Jones和Besch的方法(“Isolation of Canine Cardiac Sarcolemmal Vesicles”，5Methods in Pharmacology 1，1984)，如Kamp和Miller改良的方法(“Voltage-dependent Nitrendipine Binding toCardiac Sarcolemmal Vesicles”，32Mol.Pharmacol.278，1987)制備心臟肌纖維膜泡囊。在0-4℃下制備新鮮的?；蚱渌线m哺乳動(dòng)物心臟組織的心臟肌纖維膜泡囊。把心臟切成1cm3的小塊，并用一臺(tái)絞肉機(jī)制成糊狀。在4倍肉糊體積的0.75M膽堿氯中(用30mMN-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)-15mMTris緩沖到pH7.4)把該肉糊勻漿。用一種Tekmar T185軸在300ml聚丙烯離心管中進(jìn)行兩次30秒的勻化攪拌。這種和所有其它的緩沖液都包括蛋白酶抑制劑0.2mM苯基甲磺酰氟，1mM EGTA，和1mM二硫蘇糖醇(dithiothreitol)。在一臺(tái)Sorvall離心機(jī)的GSA轉(zhuǎn)子中以27,000xg把所得到的勻漿離心20分鐘。除去上清液并把沉淀物再懸浮于10mM HEPES-5mM Tris(pH7.4)中，并如上述再進(jìn)行離心。把這次離心沉淀物再懸浮于10mM HEPES-Tris中，并用Tekmar的T185軸以5檔設(shè)置進(jìn)行三次勻化各30秒。在GSA轉(zhuǎn)子中以14,000xg把勻漿離心20分鐘。然后在GSA轉(zhuǎn)子中以27,500xg把上清液離心70分鐘。
在初步離心后，該膜懸浮于50％蔗糖，150mM KCl，100mMTris Cl和5mM焦磷酸鈉中。把這些泡囊填充到四步不連續(xù)梯度的底部其它步驟的濃度為30％，21.5％和9.5％蔗糖。在一臺(tái)Beckman50.2Ti轉(zhuǎn)子中以193,000xg把這個(gè)梯度溶液離心1.5小時(shí)。在9.5％-21.5％蔗糖溶液界面的薄膜富集在表面肌纖維膜上。收集這種薄膜并將其釋釋到含150mM KCl，0.8mM NgSO4和10mM Tris HCl的緩沖液(pH＝7.4@22℃)中，然后在193.000×g離心35分鐘。把所得到的沉淀物再懸浮于填料緩沖液，并再離心一次。把最后的沉淀物再懸浮于填料緩沖液到最終蛋白濃度為2mg蛋白/ml，液氮冷凍并在-70℃存貯到使用。
用150mM KCl填充膜泡囊(20-40μg蛋白)并稀釋50倍制成1ml含150mM KCl的結(jié)合緩沖液。把該泡囊在37℃預(yù)保溫5分鐘，然后在沒(méi)濃度的[125I]化合物1，2或3(1nM-1μm)存在下再次溫育達(dá)到平衡條件所需的時(shí)間(由最初試驗(yàn)測(cè)得準(zhǔn)確的時(shí)間)。加入4ml冰冷的結(jié)合緩沖液來(lái)終止結(jié)合反應(yīng)，然后在Whatman GF/C濾紙上迅速過(guò)濾，隨后用另外三份4ml的冰冷的結(jié)合緩沖液沖洗。用常規(guī)的γ計(jì)數(shù)技術(shù)測(cè)定與該濾紙結(jié)合的放射活性。[125I]化合物1，2或3的特異性結(jié)合定義為用總結(jié)合減去在1-10μm冷的化合物1，2或3存在下測(cè)得的結(jié)合。
用實(shí)施例8的(a)-(f)圖中所略述的方法證實(shí)上述試驗(yàn)。
實(shí)施例13重組受體結(jié)合試驗(yàn)下面是迅速篩選本發(fā)明有用化合物的試驗(yàn)例。在這個(gè)試驗(yàn)中，用一般方法從合適的生物體如入可獲得編碼I10通道結(jié)合部位(受體)的cDNA或基因克隆。已克隆出了這類(lèi)受體，并且在現(xiàn)有技術(shù)中是公知的。在一種適當(dāng)表達(dá)載體中表達(dá)該克隆的分離片段來(lái)生產(chǎn)從該受體中能獲得的最小多肽，這種多肽保留了結(jié)合化合物1，2或3的能力。用這種方法能夠識(shí)別出含有新的化合物1/化合物2/化合物3受體的多肽。使用表達(dá)I10通道的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系(如，HEK293細(xì)胞)能使這種試驗(yàn)變得容易。
另一方面，化合物1/化合物2/化合物3受體能夠與化學(xué)改性的化合物1，2或3以這樣一種方法進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，即修飾與選擇的化合物接觸(或相鄰)的化合物1/化合物2/化合物3肽受體的氨基酸殘基，并由此可得到識(shí)別。如上所述，使用標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)載體能夠重組表達(dá)化合物1/化合物2/化合物3受體的片段，該片段含有經(jīng)測(cè)定能與化合物1，2或3結(jié)合且足以能夠與所說(shuō)分子結(jié)合的那些氨基酸。
用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法能把具有所需結(jié)合特性的重組多肽與一種固相支持物相結(jié)合。然后把這種固相或親和性基質(zhì)與化合物1，2或3接觸來(lái)證實(shí)這些化合物能與該柱子相結(jié)合，并且測(cè)定出從這些固相上除去該化合物的條件。然后用大數(shù)據(jù)庫(kù)中的化合物重復(fù)這種步驟來(lái)測(cè)定能與該親和性基質(zhì)結(jié)合的那些化合物，然后用與化合物1，2或3的相似方式將其釋放。盡管如此，也可以使用其他的結(jié)合和釋放條件以獲得能夠在不同于化合物1/化合物2/化合物3肽結(jié)合所用的條件(如，尤其是在病理狀態(tài)下能夠更好模擬生理狀態(tài)的條件)下結(jié)合的化合物。因此能夠從存在于液體基質(zhì)或提取物中的非常大量的化合物中篩選出確實(shí)能夠結(jié)合的那些化合物。
一旦鑒別出能與上述化合物1/化合物2/化合物3結(jié)合多肽結(jié)合的化合物，即可用上述各種試驗(yàn)容易地測(cè)定那些化合物，確定它們或其簡(jiǎn)單的衍生物是否是可用于治療心臟和神經(jīng)疾病的有用化合物。
在另外一種方法中，可以將天然化合物1，2或3受體與一種柱或其它固相支持物結(jié)合。然后能夠鑒別出不被在該受體其它部位結(jié)合的試劑所競(jìng)爭(zhēng)的那些化合物。這類(lèi)化合物定義了該受體上新的結(jié)合部位。被其它已知化合物所競(jìng)爭(zhēng)的化合物能夠與已知部位結(jié)合，或者與已知部位重迭的新部位結(jié)合。不管怎樣，這類(lèi)藥物在結(jié)構(gòu)上不同于已知化合物。因此，可以用來(lái)定義可用作治療劑的新化學(xué)類(lèi)別的興奮劑或拮抗劑。制劑和給藥如本文所證實(shí)的，本發(fā)明有用的化合物可用于治療神經(jīng)性疾病或失調(diào)。盡管這些化合物常用于治療人類(lèi)患者，但它們也可用來(lái)治療其它脊椎動(dòng)物如其它靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，農(nóng)用動(dòng)物如豬，牛和家禽，以及體育用動(dòng)物和玩賞用動(dòng)物如馬、狗和描的類(lèi)似或相同疾病。
在治療和/或診斷使用中，把本發(fā)明化合物配制成不同給藥方式的制劑，這些給藥方式包括全身和外科或局部給藥。在Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，EastonPA中一般可以找到制劑技術(shù)和劑型。
對(duì)全身用藥來(lái)說(shuō)，優(yōu)選口服用藥。另一方面，也可以使用注射，如肌內(nèi)，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)和皮下注射。對(duì)注射液來(lái)說(shuō)，把本發(fā)明化合物用液體溶液，優(yōu)選生理上可接受的緩沖液如Hank氏溶液或林格氏溶液配成制劑。另一方面，也可以把本發(fā)明的化合物用一種或多種賦形劑(如，聚乙二醇)配成制劑，這種賦形劑一般是以USP標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的安全性可接受的。此外，可以把該化合物配成固體形式，并且在使用前迅速再溶解或懸浮。也包括凍干形式。
用透過(guò)粘膜或透過(guò)皮膚的方法也能全身給藥，或者口服該化合物給藥。對(duì)透過(guò)粘膜或透過(guò)皮膚給藥來(lái)說(shuō)，在該制劑中使用適合滲透該障礙的滲透劑。這些滲透劑在現(xiàn)有技術(shù)中一般都是已知的。例如，對(duì)透過(guò)粘膜給藥來(lái)說(shuō)，這種滲透劑包括膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物。此外，使用洗滌劑可有利于滲透。透過(guò)粘膜給藥可以通過(guò)部鼻部噴霧給藥，例如，或者使用栓劑給藥。對(duì)口服給藥來(lái)說(shuō)，把該化合物配成常規(guī)的口服劑型如膠囊劑、片劑和保健藥劑。
對(duì)局部給藥來(lái)說(shuō)，如現(xiàn)有技術(shù)中所公知的，可把本發(fā)明化合物配成油劑，油膏劑、凝膠劑或霜?jiǎng)?br> 用一般方法能夠測(cè)定出本發(fā)明不同化合物的必須給藥量。治療用量一般是對(duì)于每公斤所治療動(dòng)物體重，劑量為1到50mg。
其它實(shí)施方案包括在下列權(quán)利要求中。
“序列表”(1)一般資料(i)申請(qǐng)人Michael.C.Sangui nettiAlanMueller(ii)發(fā)明名稱(chēng) 鉀離子通道阻滯化合物及其用途(iii)序列數(shù) 3(iv)通信地址(A)住址 Lyon&Lyon(B)街道 6l1 West Sixth Street(C)城市 Los Angeles(D)州 California(E)國(guó)家 美國(guó)(F)郵編 90017(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類(lèi)型 3.5寸盤(pán)，1.44Mb容量(B)計(jì)算機(jī) IBM兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng) IBM MS-DOS(5.0版)(D)軟件 WordPerfeet(5.1版)(vi)當(dāng)前申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類(lèi)(vii)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)全部在先申請(qǐng)，包括下列所述申請(qǐng)1(A)申請(qǐng)?zhí)?8/033,388
(B)申請(qǐng)03/18/93(viii)律師/代理人資料(A)姓名 WARBURG，RICHARD J.
(B)登記號(hào) 32,327(C)參考/案號(hào)206/093(ix)通訊資料(A)電話(huà) (213)489-1600(B)傳真 (213)955-0440(C)電傳 67-3510(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(xi)序列描述SEQ ID NO1Asp Asp Cys Gly Lys Leu Phe Ser Gly Cys Asp Thr Asn Ala1510Asp Cys Cys Glu Gly Tyr Val Cys Arg Ler Trp Cys Lys Leu15 20 25Asp Trp30(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度31(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單股
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(xi)序列描述SEQ ID NO2Glu Cys Gly Thr Leu Phe Ser Gly Cys Ser Thr His Ala Asp1 5 10Cys Cys Glu Gly Phe Ile Cys Lys Leu Trp Cys Arg Tyr Glu15 20 25Arg Thr Trp30(3)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度34(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(xi)序列描述SEQ ID NO3Asp Asp Cys Ala Gly Trp Met Glu Ser Cys Ser Ser Lys Pro15 10Cys Cys Ala Gly Arg Lys Cys Phe Ser Glu Trp Tyr Cys Lys15 20 25Leu Val Val Asp Gln Asn30
權(quán)利要求
1.特異性有效瞬時(shí)外向鉀離子通道抑制劑。
2.篩選瞬時(shí)外向鉀離子通道活性劑的方法，包括的步驟為把一種所述的瞬時(shí)外向鉀離子通道與一種已知的特異性瞬時(shí)外向鉀離子通道抑制劑和一種可能的瞬時(shí)外向鉀離子通道活性劑接觸，和測(cè)定所述可能的瞬時(shí)外向鉀離子通道活性劑對(duì)所述已知特異性瞬時(shí)外向鉀離子通道抑制劑結(jié)合的抑制作用，其中對(duì)結(jié)合的抑制表明是一種有用的瞬時(shí)外向鉀離子通道活性劑。
3.治療一種疾病或癥狀的方法，其中調(diào)節(jié)瞬時(shí)外向鉀離子通道活性對(duì)所述病癥在治療上是有用的，該方法包括下列步驟給藥一種治療有效的特異性瞬時(shí)外向鉀離子通道抑制劑。
4.治療一種疾病或癥狀的方法，其中調(diào)節(jié)瞬時(shí)外向鉀離子通道活性對(duì)所述病癥在治療上是有用的，該方法包括下列步驟給藥一種治療有效的鉀離子通道抑制劑，所述抑制劑相應(yīng)于存在于蜘蛛毒素中的抑制劑。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述通道是一種瞬時(shí)外向鉀離子通道。
6.從蜘蛛毒液中可獲得的抑制劑或該多肽的獨(dú)特片段或多肽的類(lèi)似物，其對(duì)調(diào)節(jié)一種鉀離子通道具有活性的。
7.篩選一種鉀離子通道活性劑的方法，包括下列步驟把一種所述鉀離子通道與源自蜘蛛毒液的一種已知鉀離子通道抑制劑和一種可能的鉀離子通道活性劑接觸，并測(cè)定所述可能的活性劑對(duì)所述已知抑制劑結(jié)合的抑制作用，其中對(duì)結(jié)合的抑制表明是一種有用的鉀離子通道活性劑。
8.權(quán)利要求2的方法，其中所述外向鉀離子通道抑制劑選自化合物1、化合物2和化合物3。
9.權(quán)利要求3的方法，其中所述瞬時(shí)外向通道抑制劑選自化合物1、化合物2和化合物3。
10.權(quán)利要求2的方法，其中所述瞬時(shí)外向鉀離子通道源于心臟或神經(jīng)組織。
11.一種含有化合物3或其藥學(xué)上可接受的鹽的組合物。
12.一種藥物組合物，含有選自化合物1、化合物2和化合物3中的一種化合物。
13.權(quán)利要求1的一種抑制劑，選自化合物1、化合物2和化合物3。
14.使用從蜘蛛毒液中分離出來(lái)的一種鉀離子通道抑制劑作為殺蟲(chóng)劑的方法，包括下列步驟給昆蟲(chóng)或其環(huán)境使用存在于蜘蛛毒液中的一種抑制劑。
全文摘要
有效的特異性瞬時(shí)外向鉀離子通道抑制劑，和源于蜘蛛毒液的多肽及其用途。
文檔編號(hào)A61K35/56GK1125402SQ94192030
公開(kāi)日1996年6月26日 申請(qǐng)日期1994年3月14日 優(yōu)先權(quán)日1993年3月18日
發(fā)明者M.C.桑金內(nèi)蒂, A.L.米勒 申請(qǐng)人:Nps藥物有限公司