姜黃素在制備大電導(dǎo)鈣激活鉀通道開放劑中的用途
【專利摘要】本發(fā)明屬中藥領(lǐng)域，涉及中藥姜黃主要活性成分姜黃素的新的藥用用途，具體涉及姜黃素在制備鉀通道開放劑中的用途，尤其是姜黃素作為大電導(dǎo)鈣激活鉀通道開放劑的新用途。本發(fā)明經(jīng)細胞實驗結(jié)果證明，所述的姜黃素具有開放大電導(dǎo)鈣激活鉀通道的作用，包括：對該通道電流的增大作用，對該通道蛋白的總表達和表面表達的增加作用，抑制該通道蛋白的降解途徑，增強其穩(wěn)定性的作用。所述的姜黃素進一步可制備新的大電導(dǎo)鈣激活鉀通道開放劑藥物，用以制備治療平滑肌功能紊亂相關(guān)疾病的藥物，包括治療膀胱過度活動癥、胃蠕動過強等平滑肌功能紊亂相關(guān)疾病的藥物。
【專利說明】姜黃素在制備大電導(dǎo)鈣激活鉀通道開放劑中的用途【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬中藥領(lǐng)域，涉及中藥姜黃主要活性成分姜黃素的新的藥用用途，具體涉及姜黃素在制備鉀通道開放劑中的用途，尤其是姜黃素作為大電導(dǎo)鈣激活鉀通道開放劑的新用途。
【背景技術(shù)】
[0002]研究報道，大電導(dǎo)鈣激活的鉀通道(BK通道)廣泛分布于各種類型的細胞中，尤其在平滑肌細胞、神經(jīng)元和內(nèi)分泌細胞等興奮性細胞中表達豐富。BK通道受膜電位和細胞內(nèi)Ca2+濃度雙重調(diào)節(jié)，是細胞興奮性，肌肉收縮和遞質(zhì)釋放等多種生理過程的強大調(diào)節(jié)器。有研究顯示，BK通道的激活、失活和變異與多種疾病調(diào)節(jié)有關(guān)，例如:作為血管平滑肌細胞膜上的優(yōu)勢離子通道，BK通道的激活和表達增加能夠平衡高血壓時冠脈張力的上升，增強平滑肌細胞舒張功能適應(yīng)性；在固有免疫中，阻斷BK通道使微生物殺傷和消化過程受到抑制；在若干種腫瘤的發(fā)生過程中，BK通道抑制腫瘤細胞增殖，影響其遷移，表現(xiàn)出抗腫瘤的特性，在神經(jīng)系統(tǒng)中，激活的BK通道對神經(jīng)細胞有保護作用。因此，BK通道是治療高血壓，腦中風(fēng)，惡性腫瘤等許多疾病的潛在靶點。
[0003]鑒于BK通道在人類生理、病理過程中的重要作用，尋找高活性、高選擇性、類藥性好的BK通道開放劑成為本領(lǐng)域研究的熱點。但是，目前對BK通道開放劑的研究大多還停留在早期藥物發(fā)現(xiàn)的階段，僅有4個開放劑進入臨床試驗的開放劑，而其中3個(NS8，BMS204352和TA1702)都因故被中止，只有Andolast還在試驗中。
[0004]姜黃素是一種從草本植物姜黃中提取的天然植物酚類化合物。據(jù)文獻報道，姜黃素是一個多靶點治療藥物，對若干疾病，如炎癥性疾病，阿爾茲海默癥、心血管疾病、腫瘤等有治療作用。現(xiàn)代藥理研究表明，姜黃素主要通過抗炎、抗氧化、抑制多種酶類等藥理活性發(fā)揮作用。
[0005]目前，尚未見關(guān)于姜黃素具有調(diào)節(jié)BK通道活性的作用的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供姜黃素新的藥用用途，涉及姜黃素在制備鉀通道(BK通道)開放劑中的用途，尤其涉及姜黃素在制備大電導(dǎo)鈣激活鉀通道開放劑中的用途。
[0007]本發(fā)明通過細胞實驗，證實了姜黃素能夠顯著增加BK通道的電流，增加BK通道的蛋白表達，以及進一步產(chǎn)生的開放BK通道的用途。
[0008]本發(fā)明所述的姜黃素是一種從草本植物姜黃中提取的天然植物酚類化合物，可以按常規(guī)方法通過中 藥姜黃進行人工提取，或通過市購的渠道獲得。
[0009]本發(fā)明以攜帶BK通道基因的pCMV-myc質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞，使BK通道在HEK293細胞中過表達；采用全細胞膜片鉗的方法研究姜黃素對BK通道電生理活性的影響；用蛋白質(zhì)免疫印跡實驗(Western Blot)和細胞表面生物素化方法檢測BK通道總蛋白和細胞膜表面蛋白的表達水平，通過Cycloheximide-based protein chase實驗研究姜黃素對BK通道蛋白降解過程的作用。經(jīng)細胞生物學(xué)實驗結(jié)果證明，姜黃素具有以下開放BK通道的作用:
[0010]1、增加瞬時轉(zhuǎn)染BK通道基因的HEK293細胞中BK通道總蛋白的表達。
[0011]2、增大BK通道電流。
[0012]3、增加BK通道蛋白的表面表達。
[0013]4、抑制BK通道蛋白降解途徑，從而穩(wěn)定BK通道蛋白。
[0014]本發(fā)明經(jīng)細胞實驗結(jié)果證明，姜黃素具有開放大電導(dǎo)鈣激活鉀通道的作用，包括對該通道電流的增大作用；對該通道蛋白的總表達和表面表達的增加作用；抑制該通道蛋白的降解途徑，增強其穩(wěn)定性。
[0015]本發(fā)明所述的姜黃素進一步可制備新的大電導(dǎo)鈣激活鉀通道開放劑藥物，用以治療平滑肌功能紊亂相關(guān)疾病的藥物，包括治療膀胱過度活動癥、胃蠕動過強等平滑肌功能紊亂相關(guān)疾病。
[0016]本發(fā)明為姜黃素抗腫瘤，神經(jīng)保護等的多種藥理作用的機制提供了理論依據(jù)；有助于確證BK作為藥物靶標；也為進一步將姜黃素作為大電導(dǎo)鈣激活鉀通道開放劑制備治療膀胱過度活動癥，胃蠕動過強等平滑肌功能紊亂相關(guān)疾病的藥物奠定了實驗基礎(chǔ)。
[0017]為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實施例對本發(fā)明的姜黃素作為大電導(dǎo)鈣激活鉀通道開放劑的新用途進行詳細地描述。需要特別指出的是，具體實例和附圖僅是為了說明，顯然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這 些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1是Western Blot方法證實瞬時轉(zhuǎn)染pCMV-myc_BK質(zhì)粒后BK通道蛋白的過表達圖。
[0019]圖2是姜黃素對BK通道總蛋白的增加作用，
[0020]其中，與空白對照相比，P <0.05。
[0021]圖3是姜黃素對BK通道電流的增大作用，
[0022]其中，A:瞬時給藥姜黃素的作用；B:長時間給藥姜黃素的作用。
[0023]圖4是姜黃素增加BK通道蛋白的表面表達，
[0024]其中，與對照組相比P <0.05。
[0025]圖5是姜黃素對BK通道蛋白降解途徑的抑制作用，
[0026]其中，*:與對照組同時間點相比，P < 0.05。
【具體實施方式】
[0027]實施例1
[0028]I)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞
[0029]轉(zhuǎn)染前一天，將HEK293細胞傳代，并以3X 108!/1的密度接種于直徑3.5cm的培養(yǎng)皿中，含10%胎牛血清的DMEM液培養(yǎng)24h。將I μ g質(zhì)粒DNA加入到100 μ L無血清無抗生素培養(yǎng)基中混勻，2 μ L Lipofectamine2000加入到100 μ L無血清無抗生素培養(yǎng)基中混勻，室溫下兩種溶液靜置5分鐘，然后將兩種溶液混合，室溫靜置20分鐘。用無血清抗生素培養(yǎng)基沖洗細胞兩次，加入500 μ L無血清無抗生素培養(yǎng)基，將前面制備好的混合液加入培養(yǎng)皿，用300 μ L無血清無抗生素培養(yǎng)基沖洗EP管后加入培養(yǎng)皿中，加入C02細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6小時后換成正常培養(yǎng)基，48~72h后進行試驗。熒光顯微鏡下觀察對照組熒光細胞形態(tài)，估計轉(zhuǎn)染效率。
[0030]實驗結(jié)果顯示，pCMV-myc-BK質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染HEK293細胞24小時后，BK通道蛋白有
效表達。
[0031]2)姜黃素增加BK通道總蛋白
[0032]實驗方法:
[0033]HEK293細胞以3X 108!/1的密度接種于直徑3.5cm的培養(yǎng)皿中，含10%胎牛血清的DMEM液培養(yǎng)24小時后進行轉(zhuǎn)染實驗。轉(zhuǎn)染后24小時，實驗組給予不同濃度的姜黃素(2.5 μ M、5 μ Μ、10 μ M、20 μ M)。藥物作用24小時后，裂解細胞，收集蛋白，進行WesternBlot實驗，檢測BK通道蛋白的表達情況。
[0034]I) HEK293細胞蛋白提取:
[0035]①細胞藥物處理完畢后，棄上清，0° C的PBS洗滌2次，細胞刮收集細胞，置EP管中，4° C條件下離心，3000rpm5min,棄上清；
[0036]②加入細胞裂解液，在冰水浴中裂解0.5h，每隔IOmin反復(fù)震蕩一次，使細胞充分裂解；
[0037]③4。C 條件下離心，12000rpm5min ；
[0038]④吸取上清，1:4加入緩沖液，37° C，20min滅活蛋白質(zhì)，_80°C保存。
[0039]⑤用BCA法測定蛋白濃度。
[0040]2) Western Blot 實驗:
[0041 ] ①制備8%分離膠和5%層積膠；
[0042]②將樣品加入電泳孔槽中，空余孔槽加入等體積的上樣緩沖液，先采用60V恒壓
0.5h，后改用120V至溴酚藍至凝膠底部；
[0043]③電轉(zhuǎn)液配制好后4°C預(yù)冷；裁PVDF膜，濾紙，PVDF膜在甲醇內(nèi)浸泡lOmin，然后與濾紙，海綿，電轉(zhuǎn)夾等一起置入4°C預(yù)冷的電轉(zhuǎn)液中30min ；
[0044]④電泳結(jié)束后，參考蛋白質(zhì)Markers切下目的蛋白所處凝膠區(qū)域，將其用轉(zhuǎn)膜緩沖液漂洗；組裝轉(zhuǎn)印夾層:陰極-3張濾紙，凝膠，PVDF膜，3張濾紙-陽極；用玻棒去除殘留于凝膠和PVDF膜之間的氣泡,然后裝好轉(zhuǎn)膜裝置,220mA恒流轉(zhuǎn)膜2h ；
[0045]⑤將轉(zhuǎn)印膜放入封閉液(含5%脫脂奶粉的TBST)室溫封閉；
[0046]⑥用抗體稀釋液按1:200稀釋一抗，一抗4°C孵育過夜；用了831'漂洗4*5min ; 二抗(1:5000)室溫孵育 lh，TBST 漂洗 4*5min;
[0047]⑦膜上加上Protein ECLkit試劑(等體積的A液和B液充分混合)；使用AlphaEaseFC System下成像，并對條帶進行分析。
[0048]實驗結(jié)果顯示，分別以2.5 μ Μ、5 μ M、10 μ Μ、20 μ M的姜黃素作用于瞬時轉(zhuǎn)染ΗΕΚ293細胞后，相對于對照組可以看到BK通道蛋白的表達量顯著提高，2.5 μ M組P< 0.05 ;5μΜ、10μΜ、20μ]\α?Ρ < 0.01 ；η = 4 ;且 10 μ M 時 BK 通道蛋白表達量提高最多，表明姜黃素能夠提高BK通道蛋白的表達并呈現(xiàn)劑量依賴性。
[0049]3)姜黃素增加BK通道蛋白的細胞表面表達
[0050] 實驗方法:細胞表面生物素化實驗[0051]HEK293細胞接種在IOcm培養(yǎng)皿中，當細胞密度達到90_95%時，可以進行表面生物
素化實驗。
[0052]I)生物素標記(4°C下進行)
[0053]①預(yù)冷DPBS-Ca-Mg (7mL)快速沖洗兩次；
[0054]②用含有l(wèi)mg/mL 的 NHS-SS-biotin/DPBS 溶液孵育細胞 30min (gentlelyshaking) (7mL/ 孔)；
[0055]③用淬火液(含有IOOmM甘氨酸的DPBS-Ca-Mg溶液)漂洗細胞兩次，每次IOmin-終止生物素化反應(yīng)。
[0056]2)裂解細胞(4°C下進行)
[0057]①預(yù)冷DPBS-Ca-Mg漂洗沖洗細胞兩次；
[0058]②刮下細胞，用200uL RIPA(with PMSF)裂解30min，提取蛋白；
[0059]③裂解液以6000Xg離心10min，收集上清。其中1/10 (20uL)上清作為全細胞蛋白上樣對照，剩余進行免疫共沉淀。
[0060]3)免疫共沉淀 [0061]①孵育(4°C):上一步剩余的上清與200uL streptavidin-agarose磁珠孵育。streptavidin-agarose磁珠提取兩次:第一次4°C過夜,第二次4°C 2h ；
[0062]②洗脫(37°C):RIPA沖洗 beads5 次，用 50uL 含有 200mM DTT 的 2XLaemmli 上樣緩沖液37°C孵育一小時，洗脫過程可以重復(fù)兩次。洗脫液不要混合，作為第一次洗脫和第二次洗脫；
[0063]③14000 Xg離心2min，收集洗脫液。
[0064]4) Western Blot 檢測蛋白量
[0065]實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，姜黃素能使BK通道蛋白的細胞表面表達增加。
[0066]4)姜黃素增加BK通道電流
[0067]實驗方法:全細胞膜片鉗實驗
[0068]電極液配制:
[0069]電極內(nèi)液(mmol / L):KC1140, HEPES 10, MgCl2I, Na2ATP5, Na2GTP0.5，EGTA I 和Cacl20.001, pH7.35。
[0070]電極外液(mmoL/ L):Nacll45, KC14, MgCl2I, CaCl2I, HEPES 10 和葡萄糖 10，pH7.4。所有實驗均在室溫(22 °C )下進行。
[0071]操作方法:
[0072]玻璃微管電極在電極拉制機上兩步拉制而成，充灌電極內(nèi)液后，尖端阻抗為2~3ΜΩ。將拉制好的電極尖端先在不含anaphotericin-B的電極內(nèi)液中浸]Λ3秒,然后從電極尾部反向充灌含amphotericin-B的電極內(nèi)液,用手指輕彈電極中部排除尖端氣泡。在10分鐘內(nèi)盡快進行細胞封接。在室溫下，將貼附有細胞的蓋玻片放入盛有Iml浴液的實驗小槽中，在倒置相差顯微鏡下找到折光性好、膜光滑的細胞，用微推進器控制電極接近細胞，使檢測方波的高度下降約一半時放掉正壓，給予電極尖端約l(T20cmH20的負壓，使微管電極尖端與細胞間形成電-化學(xué)絕緣，阻抗達到10-1006Ω，即形成細胞貼附式膜片(cell-attached patch),約3~20分鐘,可以看到膜電容出現(xiàn)并逐漸增大,而Rs則逐漸變小，提示穿孔膜片正在逐漸形成，20-30分鐘后，膜電容瞬變值和Rs都趨于穩(wěn)定。給予細胞-1OOmV至+IOOmV,步階電壓為+20mV的電壓刺激，電流經(jīng)Axon膜片鉗放大器后，記錄到pClamp9.0和Clamp9.0軟件系統(tǒng)中，以獲取電流-電壓變化曲線。
[0073]BK通道電流和1-U曲線記錄:
[0074]電流記錄程序為維持電位一 60mV，刺激電位從一 IOOmV至IOOmV,階躍10mV，刺激時問100ms，刺激問隔時間10 S。先記錄未加入BK通道特異性阻滯劑IBTX)(前BK通道電流，然后再記錄加入IBTX后BK通道電流。采用Clampfit軟件，將加入IBTX前后記錄的BK通道電流相減，可得IBTX敏感的鉀離子流，即為BK通道電流，以電流和刺激電位作圖，可得1-U曲線。
[0075]BK通道電流時間-過程圖:
[0076]電流記錄程序為維持電位一 60mV，刺激電位IOOmV,刺激時間100ms，刺激間隔時間10s，可記錄到總鉀離子流的變化。
[0077]實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，在不同電壓刺激下，實驗組BK通道的電流明顯高于對照組。表明姜黃素對BK通道具有開放作用。
[0078]5)姜黃素對BK通道蛋白降解途徑的抑制作用
[0079]實驗方法:Cycloheximide_basedprotein chase 實驗
[0080]肥(293細胞轉(zhuǎn)染后2處，預(yù)給藥姜黃素(10^) 12小時后，加入蛋白合成抑制劑Cycloheximide (CHX)0分別于CHX作用細胞0、3、6、12、24h后，收集細胞，提取蛋白進行Western Blot 實驗。
[0081]實驗結(jié)果顯示，與對照組相同作用時間節(jié)點相比，實驗組BK通道蛋白量明顯增多。用AlphaEaseFC軟件對3次實驗結(jié)果進行光密度測定，用Excel繪制平均BK蛋白量-時間趨勢圖，實驗組曲線下降趨勢比對照組緩慢。表明姜黃素可降低了 BK通道蛋白的降解速率，增加BK通道蛋白的穩(wěn)定性。
【權(quán)利要求】
1.姜黃素在制備大電導(dǎo)鈣激活鉀通道開放劑中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的姜黃素增加大電導(dǎo)鈣激活鉀通道的總蛋白和表面蛋白表達。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的姜黃素增加大電導(dǎo)鈣激活鉀通道的電流。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的姜黃素抑制大電導(dǎo)鈣激活鉀通道蛋白降解，增加該蛋白的穩(wěn)定性。
5.大電導(dǎo)鈣激活鉀通道開放劑在制備治療平滑肌功能紊亂相關(guān)疾病的藥物中的用途，所述的大電導(dǎo)鈣激活鉀通道開放劑中以姜黃素為活性成分。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述的平滑肌功能紊亂相關(guān)疾病選自膀胱過度活動癥 或胃蠕動過強癥。
【文檔編號】A61P1/00GK103933020SQ201310023700
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2013年1月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月22日
【發(fā)明者】張雪梅, 彭文, 陳啟菁, 王云滿, 付文成, 王利, 王浩 申請人:復(fù)旦大學(xué)