Ahas 突變體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了編碼包含至少兩個(gè)突變的乙酰羥酸合酶(AHAS)大亞基的突變體例如雙重和三重突變體的核酸，用于產(chǎn)生對(duì)AHAS抑制型除草劑具有提高的耐受性水平的轉(zhuǎn)基因植物或非轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明也提供了包含編碼AHAS大亞基雙重和三重突變體的多核苷酸的表達(dá)載體、細(xì)胞、植物；包含二種或多種AHAS大亞基單一突變多肽的植物；以及用于制備和使用它們的方法。
【專利說(shuō)明】AHAS突變體
[0001 ] 本申請(qǐng)是中國(guó)專利申請(qǐng)200880011500.8的分案申請(qǐng)，原申請(qǐng)的申請(qǐng)日是2008年4月3日，發(fā)明名稱是“AHAS突變體”。
發(fā)明領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明總體上涉及用于提高植物對(duì)乙酰羥酸合酶抑制型除草劑的耐受性的組合物和方法。
[0003]發(fā)明背景
[0004]乙酰羥酸合酶(AHAS ；EC4.1.3.18，又稱作乙酰乳酸合酶或ALS)是催化支鏈氨基酸纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物化學(xué)合成的第一個(gè)酶(Singh(1999) “纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成(Biosynthesis of valine, leucine and isoleucine), ”在Plant Amino Acids, Singh B.K.編輯，Marcel Dekker Inc.New York, New York,第 227-247頁(yè))。AHAS是結(jié)構(gòu)不同的四種除草劑家族的作用位點(diǎn)，所述除草劑家族包括磺酰脲類(Tan 等人(2005)Pest Manag.Sc1.61:246-57 ；Mal1ry-Smith 和 Retzinger (2003) WeedTechnologyl7:620 - 626 ；LaRossa 和 Falco (1984) Trends Biotechnol.2:158-161)、咪唑啉酮類(Shaver 等人( 1984)，Plant Physiol.76:545-546)、三唑并嘧唳類(Subramanian和Gerwick(1989) “通過(guò)三唑并嘧唳類抑制乙酸乳酸合酶(Inhibitionof acetolactatesynthase by triazolopyrimidines),，，于 Biocatalysis in Agricultural Biotechnology一書中,Whitaker, J.R.和 Sonnet, P.E.編著，ACS Symposium Series, AmericanChemical Society, Washington, D.C.,第277-288頁(yè))和嘧唳基氧基苯甲酸酯類(pyrimidyloxybenzoates) (Subramanian 等人(1990) Plant Physiol.94:239-244)。咪唑啉酮和磺酰脲除草劑在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中廣泛使用，原因是它們?cè)跇O低應(yīng)用率下的效力和在動(dòng)物中相對(duì)無(wú)毒。通過(guò)抑制AHAS活性，這些除草劑家族還阻止包括許多雜草物種在內(nèi)的易感植物的生長(zhǎng)和發(fā)育?？缮藤?gòu)的咪唑啉酮除草劑的一些實(shí)例是PURSUIT? (咪草煙)、SCEPTER? (滅草喹)和ARSENAL? (滅草煙)。磺酰脲除草劑的實(shí)例是綠黃隆、
甲黃隆、嘧黃隆、氯嘧黃隆、噻黃隆、苯黃隆、禾草芐混劑、煙嘧黃隆、胺苯黃隆、玉嘧黃隆、氟胺黃隆、醚苯黃隆、氟嘧黃隆、醚黃隆、磺氨黃隆(amidosulfiuon)、fluzasulfuron、唳咪黃隆、吡嘧黃隆和吡氯黃隆。
[0005]由于咪唑啉酮類除草劑的高效力和低毒性，可以通過(guò)噴灑在植被頂部廣泛區(qū)域來(lái)促進(jìn)它們的應(yīng)用。能夠?qū)⒊輨﹪姙⒌街脖豁敳繌V泛區(qū)域降低了與植物建立和維持相關(guān)的成本，并且減少了在此類化學(xué)劑使用前現(xiàn)場(chǎng)準(zhǔn)備的需要。在目的耐受物種頂部噴灑也導(dǎo)致能夠因競(jìng)爭(zhēng)物種不存在而實(shí)現(xiàn)所需物種最大產(chǎn)量的潛力。然而，使用此類頂部噴灑技術(shù)的能力取決于噴灑區(qū)域中存在所需植被的咪唑啉酮抗性物種。
[0006]在主要的農(nóng)業(yè)作物中，一些豆科物種如大豆天然地抵抗咪唑啉酮除草劑，原因是它們能夠迅速代謝所述除草劑化合物(Shaner和Robson (1985) Weed Sc1.33:469-471)。其它作物如谷物(Newhouse 等人(1992)Plant Physiol.100:882 — 886)和稻(Barrette 等人(1989) Crop Safeners for Herbicides, Academic Press, New York,第 195-220 頁(yè))某種程度地對(duì)咪唑啉酮除草劑易感。對(duì)咪唑啉酮除草劑的差異敏感性取決于特定除草劑的化學(xué)性質(zhì)和在每種植物中該化合物從有毒到無(wú)毒形式的差異性代謝(Shaner等人(1984)PlantPhysiol.76:545-546 ；Brown 等人(1987) Pestic.Biochem.Physiol.27:24-29)。其它的植物生理學(xué)差異如吸收和運(yùn)輸也在敏感性中起到重要作用(Shaner和Robson(1985)WeedSc1.33:469-471)。
[0007]抵抗咪唑啉酮類、磺酰脲類和三唑并嘧啶類的植物已經(jīng)通過(guò)使用種子、小孢子、花粉和愈傷組織誘變法在玉米(Zea mays)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、歐洲油菜(Brassica napus)(即卡諾拉油菜)、大豆(Glycine max)、煙草(Nicotianatabacum)、甜菜(Beta vulgaris)和稻(Oryzasativa)中成功地產(chǎn)生(Sebastian 等人(1989)Crop Sc1.29:1403-1408 ；Swanson 等人，1989Theor.Appl.Genet.78:525-530 ；Newhouse 等人(1"1) Theor.Appl.Genet.83:65_70 ;Sathasivan 等人(I99I)PlantPhysiol.97:1044-1050 ；Mourand 等人(1993)J.Heredity84:91-96 ；ffright 和Penner (1998) Theor.Appl.Genet.96:612-620 ;美國(guó)專利號(hào) 5，545，822)。在全部情況下，單一的、部分顯性的核基因賦予抗性。在普通小麥(Triticum aestivum L.cv.Fidel)的種子誘變后，先前也分離了 4種抗咪唑啉酮的小麥植物(Newhouse等人(1992)PlantPhysiol.100:882-886)。遺傳研究證實(shí)單一的、部分顯性的基因賦予抗性。基于等位研究，作者得出結(jié)論:在4個(gè)所鑒定品系中的突變位于相同的基因座。Fidel栽培品種抗性基因之一被稱作 FS-4 (Newhouse 等人(1992) Plant Physiol.100:882-886)。
[0008]基于計(jì)算機(jī)的AHAS-抑制劑復(fù)合體三維構(gòu)象建模法預(yù)測(cè)了在所提出的抑制劑結(jié)合袋中的幾個(gè)氨基 酸作為誘導(dǎo)突變有可能賦予選擇性咪唑啉酮類抗性的位點(diǎn)(Ott等人
(1996)J.Mol.Biol.263:359-368)。使用在所提出的AHAS酶結(jié)合位點(diǎn)中這些合理設(shè)計(jì)的突變中的一些突變產(chǎn)生的煙草植物事實(shí)上已經(jīng)表現(xiàn)出針對(duì)單一類別除草劑的特異抗性(Ott等人(1996) J.Mol.Biol.263:359-368)。
[0009]抵抗咪唑啉酮除草劑的植物也已經(jīng)在眾多專利中報(bào)道。美國(guó)專利號(hào)4，761，373、5，331，107,5, 304，732,6, 211，438,6, 211，439 和 6，222，100 總體上描述了改變的 AHAS 基因在植物中引起除草劑抗性的用途，并且具體公開了某些抗咪唑啉酮的玉米品系。美國(guó)專利號(hào)5，013，659公開了由于在一個(gè)或多個(gè)保守性區(qū)域中在至少一個(gè)氨基酸中的突變而表現(xiàn)除草劑抗性的植物。在那些文獻(xiàn)中描述的突變編碼針對(duì)咪唑啉酮和磺酰脲的交叉抗性或磺酰脲特異抗性，但是沒有描述咪唑啉酮特異抗性。美國(guó)專利號(hào)5，731，180和美國(guó)專利號(hào)5，767，361討論了在野生型單子葉植物AHAS氨基酸序列中具有單氨基酸替換(產(chǎn)生咪唑啉酮特異抗性)的分離的基因。另外，已經(jīng)通過(guò)突變育種和組織培養(yǎng)選擇法開發(fā)了對(duì)干擾AHAS的除草劑抵抗的稻植物。見美國(guó)專利號(hào)5，545，822、5，736，629、5，773，703、5，773，704,5, 952，553 和 6，274，796。
[0010]如在所有其他生物中所檢測(cè)到的那樣，在植物中AHAS酶由兩個(gè)亞基組成:大亞基(催化作用)和小亞基(調(diào)節(jié)作用)(Duggleby和Pang(200O)J.Biochem.Mol.Biol.33:1-36)。AHAS大亞基(本文中又稱作AHASL)在擬南芥屬(Arabidopsis)和甜菜中可以由一個(gè)單基因編碼，或在玉米、卡諾拉油菜和棉花中由多基因家族成員編碼。在所述大亞基中的特定單核苷酸替換賦予這種酶對(duì)一類或多類除草劑的一定程度的不敏感性(Chang 和 Duggleby (1998) Biochem J.333:765-777)。[0011]例如,面包小麥(Triticum aestivum L.)含有三個(gè)同源的乙酰輕酸合酶大亞基基因?；趤?lái)自全部這三種基因中突變體的除草劑應(yīng)答和生物化學(xué)數(shù)據(jù)，這些基因均表現(xiàn)明顯的表達(dá)(Ascenzi 等人(2003) International Society of Plant Molecular BiologistsCongress, Barcelona, Spain, Ref.N0.S10-17)。三種基因的編碼序列在核苷酸水平上均共有廣泛的同源性(W003/014357)。通過(guò)對(duì)幾個(gè)普通小麥品種來(lái)源的AHASL基因的測(cè)序，發(fā)現(xiàn)大部分頂1-耐受(咪唑啉酮耐受)品系中除草劑耐受性的分子基礎(chǔ)是S653(At)N突變，顯示在等同于擬南芥中第653位氨基酸絲氨酸的位置處絲氨酸至天冬酰胺的替換(W003/014357)。該突變因編碼AHASL蛋白的DNA序列中的單核苷酸多態(tài)性(SNP)所致。
[0012]還已知在雙子葉植物物種中存在多個(gè)AHASL基因。最近，Kolkman等人(2004)Theor.Appl.Genet.109:1147 - 1159)報(bào)道了來(lái)自除草劑抗性和野生型基因型向H葵(Helianthus annuus L.)的三個(gè) AHASL 基因(AHASL1、AHASL2 和 AHASL3)的鑒定、克隆和測(cè)序。Kolkman等人報(bào)道該除草劑抗性是因AHASLl蛋白中的Prol97Leu (使用擬南芥屬AHASL氨基酸位置命名)替換或Ala205Val替換所致并且這些替換的每一個(gè)替換均產(chǎn)生對(duì)咪唑啉酮和磺酰脲除草劑這兩者的抗性。
[0013]已知AHAS大亞基中導(dǎo)致除草劑耐受性或抗性的眾多單一突變(Duggleby等人(2000) Journal of Biochem and Mol.Bi0.33:1-36 ；Jander 等人(2003)PlantPhysiologyl31:139-146)。例如在擬南芥屬AHASL第122位置處的丙氨酸至纈氨酸替換(或在蒼耳屬(Cocklebur)AHASL的相應(yīng)第100位置處的丙氨酸至蘇氨酸替換)賦予針對(duì)咪唑啉酮和磺酰脲的抗性。在擬南芥屬AHASL第124位置處的甲硫氨酸至谷氨酸或異亮氨酸替換賦予針對(duì)咪唑啉酮和磺酰脲的抗性。在擬南芥屬AHASL第197位置處的脯氨酸至絲氨酸替換(或在酵母AHASL的相應(yīng)第192位置處的脯氨酸至丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸或酪氨酸替換)賦予針對(duì)咪唑啉酮類和磺酰脲類的抗性。在擬南芥屬AHASL第199 位置處的精氨酸至丙氨酸或谷氨酸替換賦予咪唑啉酮抗性。在擬南芥屬AHASL第205位置處的丙氨酸至纈氨酸替換(或在酵母AHASL的相應(yīng)第200位置處的丙氨酸至半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、蘇氨酸、色氨酸或酪氨酸替換)賦予針對(duì)咪唑啉酮類和磺酰脲類的抗性。幾乎任意氨基酸對(duì)擬南芥屬AHASL第574位置(對(duì)應(yīng)于酵母AHASL第586位置)處色氨酸的替換賦予針對(duì)咪唑啉酮類、磺酰脲類、三唑并嘧啶和嘧啶基氧基苯甲酸酯的抗性。在擬南芥屬AHASL第653位置處的絲氨酸至苯丙氨酸、天冬酰胺或蘇氨酸替換賦予針對(duì)咪唑啉酮類和嘧啶基氧基苯甲酸酯的抗性。
[0014]美國(guó)專利號(hào)5，853，973 ;5，928，937 ;和6，576，455公開了用于產(chǎn)生AHAS變體的基于結(jié)構(gòu)的建模方法，其中所述的變體在不同于上文所述位置的特定位置處包括氨基酸替換。在Mourad等人(1992)Plantal88 ;491_497中，已經(jīng)證實(shí)抵抗磺酰脲類的突變系交叉抵抗三唑并嘧啶類，并且抵抗咪唑啉酮的突變系交叉抵抗嘧啶基氧基苯甲酸酯類。
[0015]美國(guó)專利號(hào)5，859，348公開了雙重突變的甜菜AHAS大亞基，其具有在第113位氨基酸處的丙氨酸至蘇氨酸替換和第188位氨基酸處的脯氨酸至絲氨酸替換。含有該雙重突變AHAS蛋白的甜菜植物被描述為具有咪唑啉酮抗性和磺酰脲類抗性。
[0016]Mourad 等人(1994)Mol.Gen.Genet.242:178-184 公開了名為 csrl-4 的擬南芥屬AHAS雙重突變體。此csrl-4突變AHAS含有在第589位置處的C至T核苷酸替換(對(duì)應(yīng)于擬南芥屬AHASL第197位氨基酸處的脯氨酸至絲氨酸替換)和在第1958位置處的G至A核苷酸替換(對(duì)應(yīng)于擬南芥屬AHASL第653位氨基酸處的絲氨酸至蘇氨酸替換)。
[0017]Lee 等人(1988) EMBO Journal7:1241-1248 公開了名為 S4_Hra 的煙草 AHAS 雙重突變體，所述雙重突變 體包含在第196位氨基酸處的Pro-Ala替換(對(duì)應(yīng)于擬南芥屬AHASL的第197位氨基酸)和在第573位氨基酸處的Trp-Leu替換(對(duì)應(yīng)于擬南芥屬AHASL的第574位氨基酸)。攜帶所述雙重突變基因的轉(zhuǎn)基因品系顯示磺酰脲除草劑抗性。
[0018]美國(guó)專利號(hào)7，119，256公開了雙重突變的稻AHAS大亞基，其具有在第548位氨基酸處的色氨酸至亮氨酸替換和第627位氨基酸處的絲氨酸至異亮氨酸替換。據(jù)報(bào)道表達(dá)編碼這種雙重突變AHAS蛋白的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因稻植物具有提高的嘧啶基羧酸除草劑雙草醚抗性。
[0019]由于咪唑啉酮類除草劑的高效力和低毒性，它們對(duì)于農(nóng)業(yè)應(yīng)用是有利的。然而，在特定作物生產(chǎn)系統(tǒng)中使用咪唑啉酮除草劑的能力取決于目的作物植物的咪唑啉酮抗性品種的可獲得性。為產(chǎn)生此類咪唑啉酮抗性品種，仍需要包含突變AHAS多肽的作物植物，其中與具備現(xiàn)有AHAS突變體的作物植物相比時(shí)，所述的突變AHAS多肽賦予經(jīng)證實(shí)的針對(duì)咪唑啉酮類和/或其他AHAS抑制型除草劑的提高的耐受性。
[0020]雖然已經(jīng)表征了一些AHAS突變體，仍需要這樣的突變AHAS多肽，其中與作物植物中的現(xiàn)有AHAS突變體相比，所述突變AHAS多肽在目的作物植物中表達(dá)時(shí)賦予經(jīng)證實(shí)的針對(duì)一類或多類AHAS抑制型除草劑的提高的除草劑耐受性。
[0021]發(fā)明概述
[0022]本發(fā)明涉及新的突變AHAS多肽，其顯示針對(duì)除草劑、尤其咪唑啉酮除草劑或磺酰脲除草劑或其混合物的耐受性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，相對(duì)于使用已知AHAS突變體所獲得的除草劑耐受性，由本發(fā)明突變體賦予的除草劑耐受性得以改善和/或增強(qiáng)。本發(fā)明的突變體包含在AHAS大亞基多肽中的至少兩個(gè)氨基酸替換。
[0023]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼AHAS大亞基雙重突變多肽的分離的多核苷酸，其中所述的雙重突變多肽選自由以下多肽組成的組:在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO: 2第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或色氨酸的多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQID N0:2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO: 2第167位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺的多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO: 2第165位置的位置處具有絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸的多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第124位置或SEQ ID NO: 2第92位置的位置處具有谷氨酸、異亮氨酸、亮氨酸或天冬酰胺的多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第139位置或SEQ ID NO: 2第107位置的位置處具有異亮氨酸的多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第269位置或SEQ ID NO: 2第237位置的位置處具有組氨酸的多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第416位置或SEQ ID NO: 2第384位置的位置處具有甲硫氨酸的多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第426位置或SEQ ID NO: 2第394位置的位置處具有異亮氨酸的多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第430位置或SEQ IDNO: 2第398位置的位置處具有纈氨酸的多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ IDNO:2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第442位置或SEQ ID NO: 2第410位置的位置處具有異亮氨酸的多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第445位置或SEQ ID NO: 2第413位置的位置處具有異亮氨酸或天冬氨酸的多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第580位置或SEQ ID NO: 2第548位置的位置處具有谷氨酸的多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第124位置或SEQ ID NO: 2第92位置的位置處具有谷氨酸、異亮氨酸、亮氨酸或天冬酰胺且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO: 2第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或色氨酸的多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ IDNO:2第165位置的位置處具有絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO: 2第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或色氨酸的多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQID NO:1第197位置或SEQ ID NO: 2第165位置的位置處具有絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第375位置或SEQ ID NO: 2第343位置的位置處具有天冬酰胺的多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO:2第167位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺的多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO: 2第167位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺且在對(duì)應(yīng)于SEQID NO:1第653位置或SEQ ID NO: 2第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或色氨酸的多肽；和在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第205位置或SEQ ID NO: 2第173位置的位置處具有纈氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、蘇氨酸、色氨酸或酪氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO: 2第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或色氨酸的多肽。
[0024]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼AHAS大亞基三重突變多肽的分離的多核苷酸，其中所述的三重突變多肽選自由以下多肽組成的組:多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸、在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO: 2第167位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺且在對(duì)應(yīng)于SEQ IDNO:1第653位置或SEQ ID NO: 2第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或色氨酸；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸，在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置處具有絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第653位置或SEQID NO:2第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或色氨酸；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸，在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置處具有絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO: 2第167位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸，在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第57位置的位置處具有精氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第398位置或SEQ ID NO: 2第366位置的位置處具有亮氨酸；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第124位置或SEQ ID NO: 2第92位置的位置處具有谷氨酸、異亮氨酸、亮氨酸或天冬酰胺，在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO: 2第165位置的位置處具有絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO: 2第167位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ IDNO:1第95位置或SEQ ID NO: 2第63位置的位置處具有亮氨酸、在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第416位置或SEQ ID NO: 2第384位置的位置處具有谷氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或色氨酸；和多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO: 2第165位置的位置處具有絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸，在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO: 2第167位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺并且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第574位置或SEQ ID NO:2第542位置的位置處具有任意氨基酸。
[0025]本發(fā)明還涉及包含上文所述雙重和三重突變體的AHASL多肽、包含編碼上文所述AHASL雙重和三重突變體的多核苷酸的表達(dá)載體、包含編碼上文所述AHASL雙重和三重突變體的多核苷酸的細(xì)胞、包含上文所述多核苷酸和多肽的轉(zhuǎn)基因植物、以及產(chǎn)生和使用轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中所述的轉(zhuǎn)基因植物包含編碼上文所述AHASL雙重和三重突變體的多核苷酸。
[0026] 本發(fā)明還涉及包含一種或多種多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物和非轉(zhuǎn)基因植物，其中所述的多核苷酸包含兩個(gè)或多個(gè)突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的植物包含編碼第一 AHASL單一突變多肽的第一多核苷酸和編碼第二 AHASL單一突變多肽的第二多核苷酸，或包含兩個(gè)核苷酸突變的編碼AHASL的多核苷酸，所述核苷酸突變產(chǎn)生所述的第一和第二 AHASL單一突變多肽的氨基酸突變，其中所述的第一和第二 AHASL單一突變多肽選自由以下多肽組成的組:在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或色氨酸的第二多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO: 2第167位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺的第二多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO: 2第165位置的位置處具有絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸的第二多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第124位置或SEQ ID NO: 2第92位置的位置處具有谷氨酸、異亮氨酸、亮氨酸或天冬酰胺的第二多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第139位置或SEQ ID NO: 2第107位置的位置處具有異亮氨酸的第二多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在對(duì)應(yīng)于SEQID NO:1第269位置或SEQ ID NO: 2第237位置的位置處具有組氨酸的第二多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第416位置或SEQ ID NO: 2第384位置的位置處具有甲硫氨 酸的第二多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第426位置或SEQ ID NO: 2第394位置的位置處具有異亮氨酸的第二多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第430位置或SEQID NO: 2第398位置的位置處具有纈氨酸的第二多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第442位置或SEQ ID NO: 2第410位置的位置處具有異亮氨酸的第二多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第445位置或SEQ ID NO:2第413位置的位置處具有異亮氨酸或天冬氨酸的第二多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第580位置或SEQ ID NO: 2第548位置的位置處具有谷氨酸的第二多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第124位置或SEQ ID NO: 2第92位置的位置處具有谷氨酸、異亮氨酸、亮氨酸或天冬酰胺的第一多肽且在對(duì)應(yīng)于SEQ IDNO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或色氨酸的第二多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO: 2第165位置的位置處具有絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸的第一多肽和在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO: 2第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或色氨酸的第二多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO: 2第165位置的位置處具有絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸的第一多肽和在對(duì)應(yīng)于SEQ IDNO:1第375位置或SEQ ID NO: 2第343位置的位置處具有天冬酰胺的第二多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO: 2第165位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸的第一多肽和在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO:2第167位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺的第二多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第199位置或SEQID N0:2第167位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺的第一多肽且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO: 2第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或色氨酸的第二多肽；和在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第205位置或SEQ ID NO: 2第173位置的位置處具有纈氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、蘇氨酸、色氨酸或酪氨酸的第一多肽和在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或色氨酸的第二多肽。
[0027]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物包含編碼第一 AHASL單一突變多肽的第一多核苷酸、編碼第二 AHASL單一突變多肽的第二多核苷酸，和編碼第三AHASL單一突變多肽的第三多核苷酸；或包含三個(gè)突變的編碼AHASL的多核苷酸，其中所述的三個(gè)核苷酸突變導(dǎo)致與所述第一、第二和第三AHASL單一突變多肽的氨基酸突變相對(duì)應(yīng)的氨基酸突變；或包含單一突變的編碼AHASL的多核苷酸和包含雙重突變的編碼AHASL的多核苷酸，其中所述的核苷酸突變導(dǎo)致與所述第一、第二和第三AHASL單一突變多肽的氨基酸 突變相對(duì)應(yīng)的氨基酸突變，其中所述第一、第二和第三AHASL單一突變多肽選自由以下多肽組成的組:在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽、在對(duì)應(yīng)于SEQID NO:1第199位置或SEQ ID NO: 2第167位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺的第二多肽且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或色氨酸的第三多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽，在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置處具有絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸的第二多肽且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或色氨酸的第三多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽，在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置處具有絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸的第二多肽且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO: 2第167位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺的第三多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽，在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第57位置的位置處具有精氨酸的第二多肽且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第398位置或SEQ ID NO: 2第366位置的位置處具有亮氨酸的第三多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第124位置或SEQ ID NO: 2第92位置的位置處具有谷氨酸、異亮氨酸、亮氨酸或天冬酰胺的第一多肽，在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO: 2第165位置的位置處具有絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸的第二多肽且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO: 2第167位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺的第三多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第95位置或SEQ ID NO: 2第63位置的位置處具有亮氨酸的第一多肽、在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第416位置或SEQ ID NO: 2第384位置的位置處具有谷氨酸的第二多肽且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO: 2第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或色氨酸的第三多肽；和在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ IDNO:2第165位置的位置處具有絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸的第一多肽、在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO: 2第167位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺的第二多肽且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第574位置或SEQ ID NO: 2第542位置的位置處具有任意氨基酸的第三多肽。
[0028]本發(fā)明提供了控制本發(fā)明轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植物附近的雜草的方法。此類植物具有相對(duì)于野生型植物的提高的除草劑抗性。所述方法包括施加有效量的AHAS抑制型除草劑至所述雜草和至本發(fā)明的植物。
[0029]附圖簡(jiǎn)述
[0030]圖1描述擬南芥屬(Arabidopsis)AHAS大亞基蛋白的全長(zhǎng)序列(氨基酸序列SEQID NO:1 ;核酸序列SEQ ID NO: 31)，推定的翻譯顯示以粗體字和下劃線指示的突變位置。DNA編號(hào)在左邊而氨基酸編號(hào)在右邊。
[0031]圖2描述玉米AHAS大亞基蛋白的全長(zhǎng)序列(氨基酸序列SEQ ID NO: 2 ;核酸序列SEQ ID N0:32)，在要求專利保護(hù)的突變的位置處的氨基酸以粗體字和下劃線顯示。DNA編號(hào)在左邊而氨基酸編號(hào)在右邊。
[0032]圖3是擬南芥屬AHAS大亞基蛋白(AtAHASL，SEQ ID NO:1)與眾多物種AHAS大亞基蛋白的可以產(chǎn)生本發(fā)明雙重和三重突變體的相應(yīng)位置的比對(duì)結(jié)果，所述的比對(duì)結(jié)果顯示了與SEQ ID NO:1中替換位置相對(duì)應(yīng)的替換位置,所述物種是:覓(Amaranthus sp.)(AsAHASL SEQ ID N0:9)、歐洲油菜(Brassica napus) (BnAHASLlA SEQ ID N0:3、BnAHASLlCSEQ ID NO: 10、BnAHASL2A SEQ ID NO: 11)、小果亞麻薺(Camelina microcarpa) (CmAHASLlSEQID NO: 12、CmAHASL2SEQ ID NO: 13)、馬鈴薯(Solanum tuberosum) (StAHASLlSEQ ID NO: 16、StAHASL2SEQ ID NO: 17)、稻(Oryza sativa) (OsAHASL SEQ ID NO:4)、多花黑麥草(LoIiummultiflorum) (LmAHASL SEQ ID NO:20)、東方龍葵(Solanum ptychanthum) (SpAHASL SEQID NO: 14)、雙色蜀黍(Sorghum bicolor) (SbAHASL SEQ ID NO: 15)、大豆(Glycine max)(GmAHASL SEQ ID NO: 18)、向日葵(Helianthus annuus) (HaAHASLlSEQ ID NO: 5、HaAHASL2SEQIDN0:6、HaAHASL3SEQ IDN0:7)、普通小麥(Triticum aestivum) (TaAHASLlA SEQ IDN0:21、TaAHASLlB SEQ ID NO:22、TaAHASLlD SEQ ID NO:23)、蒼耳(Xanthium sp.) (XsAHASL SEQ IDNO: 19)、玉米(Zea mays) (ZmAHASLlSEQ ID NO:8、ZmAHASL2SEQ ID NO: 2)、陸地棉(Gossypiumhirsutum) (GhAHASA5SEQ ID NO:24、GhAHASA19SEQ ID NO:25)和大腸桿菌(E.coli) (ilvBSEQ ID NO: 26、ilvG SEQ ID NO: 27、ilvl SEQ ID NO:28)。
[0033]圖4是用于在大腸桿菌中構(gòu)建擬南芥屬AHASL突變體AE2-AE8的AE基礎(chǔ)載體的圖譜，標(biāo)出突變?cè)跀M南芥屬AHASL中的相對(duì)位置。
[0034]圖5是用于載體AP2-AP5構(gòu)建的植物轉(zhuǎn)化基礎(chǔ)載體AP的載體圖，所述載體AP2-AP5僅因表1中所示的突變而不同。
[0035]圖6是用來(lái)在大腸桿菌中研究玉米AHASL突變體ZE2、ZE5、ZE6和ZE7的基礎(chǔ)載體ZE的圖譜，標(biāo)出了突變的相關(guān)位置。
[0036]圖7是植物轉(zhuǎn)化載體ZP的圖譜，其中所述的植物轉(zhuǎn)化載體ZP用作構(gòu)建ZP2-ZP10載體的基礎(chǔ)載體。
[0037]圖8是源自不同物種的AHASL基因的一致氨基酸位置的表格。
[0038]圖9是源自不同物種的AHASL基因的蛋白質(zhì)同一性百分?jǐn)?shù)的表格。在VectorNTI軟件包中開展分析(空位開口罰分=10，空位延伸罰分=0.05，空位隔開罰分=8，blosum62MT2 矩陣)。
[0039]圖10給出了種子的立式平板生長(zhǎng)測(cè)試法的結(jié)果，其中所述的種子來(lái)自撒播在含有37.5微摩爾咪草煙(imazethapyr)的培養(yǎng)基上的幾個(gè)擬南芥屬品系。所用種子是:1)野生型生態(tài)型Columbia2 ；2)csrl-2突變體(對(duì)于AHAS大亞基基因的基因組拷貝中的AtAHASL S653N 突變是純合的)；3)用 APl 轉(zhuǎn)化的 Columbia2 ；4)用 AP7 轉(zhuǎn)化的 Columbia2 ；和5)用AP2轉(zhuǎn)化的Columbia〗。
[0040]圖11是用于載體AUP2和AUP構(gòu)建的植物轉(zhuǎn)化基礎(chǔ)載體AUP的載體圖，所述載體AUP2和AUP僅因表3中所示的突變而不同。
[0041]圖12是植物轉(zhuǎn)化載體BAPl的載體圖，所述的植物轉(zhuǎn)化載體包含帶S653N突變的AtAHASL的編碼序列。
[0042]發(fā)明詳述
[0043]本發(fā)明提供編碼具有至少2個(gè)突變的AHASL(例如雙重或三重突變體)的多核苷酸，所述的具有至少2個(gè)突變的AHASL顯示針對(duì)除草劑、尤其咪唑啉酮除草劑，并且任選地針對(duì)磺酰脲類、三唑并嘧啶磺酰苯胺和/或嘧啶基氧基苯甲酸酯除草劑的耐受性。當(dāng)僅在雜交種的一個(gè)親代中或在多倍體植物的一個(gè)基因組上存在時(shí)，本發(fā)明的AHASL突變體可以用來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，其顯示足夠賦予商業(yè)水平除草劑耐受性的除草劑抗性水平。本發(fā)明的多核苷酸也可以用作選擇性標(biāo)記以轉(zhuǎn)化編碼其他性狀的連鎖基因，如美國(guó)專利號(hào)6,025, 541中所描述。
[0044] 雖然多個(gè)物種的AHASL蛋白在長(zhǎng)度上因幾個(gè)氨基酸而不同，不過(guò)根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行修飾的殘基的相對(duì)位置是保守的(圖8)。因此，除非另外說(shuō)明或從上下文顯而易見，本文中所述的突變就與擬南芥屬AHASL多肽(SEQ ID NO: 1，圖1，圖8)的氨基酸殘基編號(hào)相對(duì)應(yīng)的位置進(jìn)行表述。例如，擬南芥屬AHASL的第122位殘基對(duì)應(yīng)于玉米AHASL的第90位殘基、歐洲油菜AHASL1A的第104位殘基、歐洲油菜AHASL1C的第107位殘基、稻AHASL的第96位殘基、覓AHASL的第113位殘基、大腸桿菌ilvG的第26位殘基、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) AHASL的第117位殘基、甜菜的第113位殘基、棉花的第111位殘基、小果亞麻薺AHASLl的第120位殘基、小果亞麻薺AHASL2的第117位殘基、馬鈴薯AHASLl的第109位殘基、馬鈴薯AHASL2的第111位殘基、多花黑麥草的第92位殘基、東方龍葵的第27位殘基、雙色蜀黍的第93位殘基、大豆的第103位殘基、向日葵AHASLl的第107位殘基、向日葵AHASL2的第101位殘基、向日葵AHASL3的第97位殘基、普通小麥的第59位殘基和蒼耳的第100位殘基。這些對(duì)應(yīng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的?；谶@種對(duì)應(yīng)性，AHAS大亞基序列中沒有在本文具體公開的相應(yīng)位置可以由技術(shù)人員容易地確定。在圖3中描述與本發(fā)明有關(guān)的對(duì)應(yīng)性的具體示例性區(qū)域。
[0045]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼擬南芥屬AHASL雙重突變體的分離的多核苷酸，所述的雙重突變體選自由以下多肽組成的組:多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO: 2第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或色氨酸；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO: 2第167位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ IDNO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO: 2第165位置的位置處具有絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第124位置或SEQ ID NO: 2第92位置的位置處具有谷氨酸、異亮氨酸、亮氨酸或天冬酰胺；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第139位置或SEQ ID NO: 2第107位置的位置處具有異亮氨酸；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第269位置或SEQID NO: 2第237位置的位 置處具有組氨酸；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQID N0:2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第416位置或SEQ ID NO: 2第384位置的位置處具有甲硫氨酸；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第426位置或SEQ ID NO: 2第394位置的位置處具有異亮氨酸；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第430位置或SEQ ID NO: 2第398位置的位置處具有纈氨酸；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第442位置或SEQ ID NO: 2第410位置的位置處具有異亮氨酸；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第445位置或SEQ IDNO: 2第413位置的位置處具有異亮氨酸或天冬氨酸；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第580位置或SEQ ID NO: 2第548位置的位置處具有谷氨酸；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第124位置或SEQ ID NO:2第92位置的位置處具有谷氨酸、異亮氨酸、亮氨酸或天冬酰胺且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO: 2第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或色氨酸；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQID NO:1第197位置或SEQ ID NO: 2第165位置的位置處具有絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或色氨酸；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO: 2第165位置的位置處具有絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第375位置或SEQ ID NO: 2第343位置的位置處具有天冬酰胺；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO: 2第165位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID N0:2第167位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ IDN0:2第167位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO: 2第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或色氨酸；和在對(duì)應(yīng)于SEQ IDN0:1第205位置或SEQ ID NO: 2第173位置的位置處具有纈氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、蘇氨酸、色氨酸或酪氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO: 2第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或色氨酸的多肽。
[0046]在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼擬南芥屬AHAS大亞基三重突變多肽的分離的多核苷酸，所述的三重突變多肽選自由以下多肽組成的組:多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸、在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO:2第167位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO: 2第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸 或色氨酸；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸，在對(duì)應(yīng)于SEQ IDNO:1第197位置或SEQ ID NO: 2第165位置的位置處具有絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或色氨酸；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸，在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ IDNO:2第165位置的位置處具有絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO: 2第167位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸，在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第57位置的位置處具有精氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第398位置或SEQ ID NO: 2第366位置的位置處具有亮氨酸；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第124位置或SEQ ID NO: 2第92位置的位置處具有谷氨酸、異亮氨酸、亮氨酸或天冬酰胺，在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO: 2第165位置的位置處具有絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO: 2第167位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第95位置或SEQ ID NO: 2第63位置的位置處具有亮氨酸、在對(duì)應(yīng)于SEQ IDNO:1第416位置或SEQ ID NO: 2第384位置的位置處具有谷氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或色氨酸；和多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO: 2第165位置的位置處具有絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸，在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO: 2第167位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺并且在對(duì)應(yīng)于SEQID NO:1第574位置或SEQ ID NO: 2第542位置的位置處具有任意氨基酸。
[0047]其他的優(yōu)選實(shí)施方案包括來(lái)自其他物種的AHASL雙重或三重突變體，其中所述雙重或三重突變?cè)趯?duì)應(yīng)于上文和圖8所示表中描述的具體擬南芥屬和玉米突變體的那些突變相對(duì)應(yīng)的位置處存在。例如，來(lái)自微生物如大腸桿菌、釀酒酵母、沙門氏菌屬(Salmonella)、集胞藻屬(Synichocystis);和來(lái)自植物如小麥、黑麥、燕麥、黑小麥、稻、大麥、高粱、谷子、甜菜、甘鹿、大豆、落花生、棉屬、油菜籽、卡諾拉油菜、蕓苔屬(Brassica)物種、木薯、甜瓜、南瓜、辣椒、向日葵、萬(wàn)壽菊、爺科植物、馬鈴薯、甘薯、煙草、爺子、番爺、蠶豆屬(Vicia)物種 、豌豆、苜蓿、咖啡、可可的相應(yīng)AHASL雙重或三重突變體也處在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如美國(guó)專利號(hào) 5, 565, 350 ；5, 731, 181 ;5756，325 ；5, 760,012 ;5，795，972 和5，871，984中所描述，此類雙重或三重突變體可以使用已知方法，例如，體外使用位點(diǎn)定向誘變法或體內(nèi)使用定向誘變法或相似技術(shù)產(chǎn)生。
[0048]在用于目的植物中表達(dá)的表達(dá)盒中提供本發(fā)明的多核苷酸。該表達(dá)盒包含與本發(fā)明的AHASL多核苷酸序列有效連接的調(diào)節(jié)序列。如本文中所用的術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)元件”指能夠調(diào)節(jié)有效連接的多核苷酸轉(zhuǎn)錄的多核苷酸。它包括但不限于啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、內(nèi)含子、5’UTR和3’ UTR0 “有效連接”意指啟動(dòng)子與第二序列之間的功能性連接，其中所述啟動(dòng)子序列啟動(dòng)并介導(dǎo)對(duì)應(yīng)于所述第二序列的DNA序列轉(zhuǎn)錄。通常，有效連接意思是連接的核酸序列是緊接的并且在需要連接兩個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)的情況下，是緊接的且在相同的可讀框中。該表達(dá)盒可以額外地含有待共轉(zhuǎn)化至生物內(nèi)的至少一個(gè)額外基因。備選地，可以在多個(gè)表達(dá)盒上提供所述額外基因。
[0049]此種表達(dá)盒提供有多個(gè)限制性位點(diǎn)，所述限制性位點(diǎn)用于插入待受到調(diào)節(jié)區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的AHASL多核苷酸。該表達(dá)盒可以額外地含有選擇性標(biāo)記基因。
[0050]此表達(dá)盒在5’_3’轉(zhuǎn)錄方向上包含在植物中有功能的轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)(即啟動(dòng)子)、本發(fā)明的AHASL多核苷酸序列以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)(即終止區(qū))。所述啟動(dòng)子可以是天然的或類似的，或?qū)τ谥参锼拗骱?或?qū)τ诒景l(fā)明的AHASL多核苷酸序列是外來(lái)或異源的。另外，該啟動(dòng)子可以是天然序列或備選地是合成序列。在啟動(dòng)子對(duì)于植物宿主是“外來(lái)的”或“異源的”的情況下，意指該啟動(dòng)子在導(dǎo)入此啟動(dòng)子的天然植物中不存在。在啟動(dòng)子對(duì)于本發(fā)明的AHASL多核苷酸序列是“外來(lái)的”或“異源的”的情況下，意指該啟動(dòng)子對(duì)于本發(fā)明有效連接的AHASL多核苷酸序列而言不是本來(lái)的或天然存在的啟動(dòng)子。如本文中所用，嵌合基因包含編碼序列，其中所述的編碼序列有效連接到對(duì)該編碼序列為異源的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。
[0051]盡管使用異源啟動(dòng)子表達(dá)本發(fā)明的AHASL多核苷酸可以是優(yōu)選的，也可以使用天然啟動(dòng)子序列。此類構(gòu)建體將改變植物或植物細(xì)胞中AHASL蛋白的表達(dá)水平。因此，改變了植物或植物細(xì)胞的表型。
[0052]所述終止區(qū)可以是與轉(zhuǎn)錄起始區(qū)天然聯(lián)系的，可以是與有效連接的目的AHASL序列天然聯(lián)系的，可以是與植物宿主天然聯(lián)系的，或可以從另外的來(lái)源(即，對(duì)啟動(dòng)子、目的AHASL多核苷酸序列、植物宿主或其任意組合為外來(lái)或異源的)衍生。常規(guī)終止區(qū)可以從根癌農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)的Ti質(zhì)粒得到，如章魚堿合酶和胭脂氨酸合酶終止區(qū)。也見 Guerineau 等人(1991)Mol.Gen.Genet.262:141-144 ；Proudfoot (1991)Cell64:671_674 ；Sanfacon 等人(1991)Genes Dev.5:141-149 ；Mogen 等人(1990)PlantCell2:1261-1272 ;Munroe 等人(1990)Gene91:151-158 ;Ballas 等人(1989)Nucleic AcidsRes.17:7891-7903 ;和 Joshi 等人(1987) Nucleic Acid Res.15:9627-9639。
[0053]根據(jù)需要，基因可以進(jìn)行優(yōu)化用于在轉(zhuǎn)化植物中增加表達(dá)。也即是可以使用植物優(yōu)選密碼子來(lái)合成所述基因用于改進(jìn)表達(dá)。見，例如Campbell和Gowri (1990)PlantPhysiol.92:1-11對(duì)宿主優(yōu)選密碼子選擇的討論。本領(lǐng)域中可獲得用于合成植物優(yōu)選基因的方法。見，例如美國(guó)專利號(hào)5，380，831和5，436，391，以及Murray等人(1989) NucleicAcids Res.17:477-498,所述文獻(xiàn)在本文通過(guò)引用的方式并入。
[0054]已知額外的序列修飾來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞宿主中的基因表達(dá)。這些包括消除編碼假多腺苷酸化信號(hào)的序列、外顯子-內(nèi)含子剪接位點(diǎn)信號(hào)的序列、轉(zhuǎn)座子樣重復(fù)序列的序列和可能有損于基因表達(dá)的其它此類充分表征的序列?？梢哉{(diào)整序列的G-C含量至給定細(xì)胞宿主的平均水平，其中所述的平均水平如通過(guò)參考該宿主細(xì)胞中表達(dá)的已知基因加以計(jì)算。當(dāng)可能時(shí)，修飾所述序列以避免預(yù)測(cè)的發(fā)夾二級(jí)mRNA結(jié)構(gòu)。
[0055]用于增強(qiáng)基因表達(dá)的核苷酸序列也可以用在植物表達(dá)載體中。這些核苷酸序列包括玉米AdhI的內(nèi)含子，內(nèi)含子I基因(Callis等人(1987) Genes andDevelopmentl:1183-1200),以及來(lái)自煙草花葉病毒(TMV)、玉米褪綠矮縮病毒和苜蓿花葉病毒的前導(dǎo)序列(W-序列)(Gallie 等人(1987)Nucleic Acid Res.15:8693-8711和 Skuzeski 等人(1990) Plant Molec.Biol.15:65-79)。已顯不來(lái)自玉米皺縮蛋白-1 (shrunken-Ι)基因座的第一內(nèi)含子提高了嵌合基因構(gòu)建體中的基因表達(dá)。美國(guó)專利號(hào)5，424，412和5，593，874公開了特定內(nèi)含子在基因表達(dá)構(gòu)建體中的用途，并且Gallie等人，1994，Plant Physiol.106:929-939也證明內(nèi)含子可用于在組織特異性基礎(chǔ)上調(diào)芐基因表達(dá)。為進(jìn)一步增強(qiáng)或優(yōu)化AHAS大亞基基因表達(dá),本發(fā)明的植物表達(dá)載體還可以包含含有基質(zhì)附著區(qū)(MAR)的DNA序列。之后，用此類修飾的表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞可以表現(xiàn)出本發(fā)明核苷酸序列的過(guò)量表達(dá)或組成型表達(dá)。
[0056]表達(dá)盒可以額外地在表達(dá)盒構(gòu)建體中含有5’前導(dǎo)序列。此類前導(dǎo)序列可以起到增強(qiáng)翻譯的作用。翻譯前導(dǎo)序列是本領(lǐng)域已知的并且包括:小RNA病毒前導(dǎo)序列，例如EMCV 前導(dǎo)序列(腦心肌炎 5’ 非編碼區(qū))(Elroy-Stein 等人(1989) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:6126-6130);馬鈴薯Y病毒前導(dǎo)序列，例如TEV前導(dǎo)序列(煙草蝕斑病毒)(Gallie等人(1995) Genel65 (2):233-238)、MDMV 前導(dǎo)序列(玉米矮花葉病毒)(Virologyl54:9_20)，和人免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BiP) (Mace jak等人(1991) Nature353:90_94);來(lái)自苜?；ㄈ~病毒的外被蛋白mRNA (AMV RNA4)的非翻譯前導(dǎo)序列(Jobling等人(1987)Nature325:622-625);煙草花葉病毒(TMV)前導(dǎo)序列(Gallie 等人(1989)，于 MolecularBiology of RNA 一書中,Cech編著(Liss, New York),第237-256頁(yè));玉米裡綠斑駁病毒前導(dǎo)序列(MCMV) (Lommel 等人(1991)，Virology81:382-385)。也見 Della-Cioppa 等人
(1987), Plant Physiol.84:965-968。也可以使用已知增強(qiáng)翻譯的其它方法，例如內(nèi)含子等。
[0057]在制備表達(dá)盒時(shí)，可以操作多種DNA片段，從而使得DNA序列處于合適的方向并且根據(jù)需要處于恰當(dāng)?shù)拈喿x框中。為此目的，可以使用銜接頭或接頭來(lái)連接DNA片段或可以包括其它操作來(lái)提供方便的限制性位點(diǎn)、移除多余DNA、移除限制性位點(diǎn)等。為此目的，可以涉及體外誘變、引物修復(fù)、限制、復(fù)性和再替換，例如轉(zhuǎn)換和顛換。
[0058]可以在本發(fā)明的實(shí)踐中使用眾多啟動(dòng)子?？梢曰谒枰慕Y(jié)果選擇啟動(dòng)子。核酸可以與組成型、組織優(yōu)選的或其它啟動(dòng)子組合用于在植物中表達(dá)。 [0059]例如，此類組成型啟動(dòng)子包括Rsyn7啟動(dòng)子的核心啟動(dòng)子和在W099/43838和美國(guó)專利號(hào)6，072，050中公開的其它組成型啟動(dòng)子；核心CaMV35S啟動(dòng)子(Odell等人(1985)Nature313:810-812);稻肌動(dòng)蛋白(McElroy 等人(1990)Plant Cell2:163-171);遍在蛋白啟動(dòng)子(Christensen等人(1989)Plant Mol.Biol.12:619-632和Christensen等人(1992)Plant Mol.Biol.18:675-689) ;pEMU(Last 等人(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588)；MAS(Velten 等人，(1984)EMBO J.3:2723-2730) ；ALS 啟動(dòng)子(美國(guó)專利號(hào) 5，659，026)等。其它組成型啟動(dòng)子包括例如美國(guó)專利號(hào)5，608，149,5,608, 144,5,604, 121,5, 569，597、5，466，785,5, 399，680,5, 268，463,5, 608，142 和 6，177，611。
[0060]組織優(yōu)選的啟動(dòng)子可以用來(lái)在特定的植物組織中達(dá)到增強(qiáng)的AHASL表達(dá)。此類組織優(yōu)選的啟動(dòng)子包括但不限于，葉優(yōu)選的啟動(dòng)子、根優(yōu)選的啟動(dòng)子、種子優(yōu)選的啟動(dòng)子和莖優(yōu)選的啟動(dòng)子。組織優(yōu)選的啟動(dòng)子包括Yamamoto等人(1997)Plant J.12(2):255-265 ；Kawamata 等人(1997)Plant Cell Physiol.38(7):792-803 ；Hansen 等人(1997)Mol.Gen Genet.254(3):337-343;Russell 等人(1997)Transgenic Res.6(2):157-168 ;Rinehart 等人(1996) Plant Physiol.112(3): 1331-1341 ；Van Camp 等人(1996) PlantPhysiol.112(2):525-535 ；Canevascini 等人(1996)Plant Physiol.112(2):513-524 ；Yamamoto等人(1994)Plant Cell Physiol.35(5):773-778 ；Lam(1994)Results Prob1.CellDiffer.20:181-196 ;0rozco等人(1993)Plant Mol Biol.23(6):1129-1138 ;Matsuoka等人(1993) Proc Natl.Acad.Sc1.USA90 (20):9586-9590 和 Guevara-Garcia 等人(1993) PlantJ.4(3):495-505所公開的啟動(dòng)子。如果需要，可以修飾此類啟動(dòng)子用于弱表達(dá)。
[0061]在一個(gè)實(shí)施方案中，將目的核酸靶向到葉綠體用于表達(dá)。以這種方式，在目的核酸不直接被插入葉綠體時(shí)，表達(dá)盒額外地包含葉綠體靶向序列，該靶向序列包含編碼指引目的基因產(chǎn)物到葉綠體中的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核苷酸序列。此類轉(zhuǎn)運(yùn)肽是本領(lǐng)域已知的。就葉綠體靶向序列而言，“有效連接”意指編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽(即葉綠體靶向序列)的核酸序列與本發(fā)明的AHASL多核苷酸連接，從而這兩個(gè)序列是緊接的且在相同的可讀框中。見，例如，Von Heijne 等人(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9:104-126 ；Clark 等人(1989)J.Biol.Chem.264:17544-17550 ;Della_Cioppa 等人(1987)Plant Physiol.84:965-968 ；Romer 等人(1993) Biochem.Biophys.Res.Commun.196:1414-1421 ；和 Shah 等人(1986)Science233:478-481。盡管本發(fā)明的AHASL蛋白包括天然的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，可以通過(guò)將葉綠體靶向序列有效連接到編碼本發(fā)明成熟AHASL蛋白的核苷酸序列的5’端，將本領(lǐng)域已知的任何葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽融合到本發(fā)明的成熟AHASL蛋白的氨基酸序列上。
[0062]葉綠體靶向序列是本領(lǐng)域已知的并且包括核酮糖-1，5- 二磷酸羧化酶(Rubisco)的葉綠體小亞基(de Castro Silva Filho 等人(1996)Plant Mol.Biol.30:769-780 ；Schnell 等人(1991) J.Biol.Chem.266 (5): 3335-3342) ;5_(烯醇式丙酮酰)莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS) (Archer 等人(1990) J.Bioenerg.Biomemb.22 (6): 789-810);色氨酸合酶(Zhao 等人(1995)J.Biol.Chem.270(11):6081-6087);質(zhì)體藍(lán)素(Lawrence 等人
(1997)J.Biol.Chem.272(33):20357-20363);分支酸合酶(Schmidt 等人(1993) J.Biol.Chem.268 (36): 27447-27457);和捕獲光的葉綠素a/b結(jié)合蛋白(LHBP) (Lamppa等人
(1988)J.Biol.Chem.263:14996-14999)。也參見 Von Heijne 等人(1991) Plant Mol.Biol.Rep.9:104-126 ；Clark 等人(1989)J.Biol.Chem.264:17544-17550 ;Della_Cioppa等人(1987)Plant Physiol.84:965-968 ;Romer 等人(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196:1414-1421 ;和 Shah 等人(1986) Science233:478-481。
[0063]用于轉(zhuǎn)化葉綠體的方法是本領(lǐng)域已知的(見,例如,Svab等人(1990)，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87:8526-8530 ；Svab 和 Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:913-917 ；Svab和Maliga (1993) EMBO J.12:601-606)。所述方法依賴于粒子槍遞送含有選擇性標(biāo)記的DNA和通過(guò)同源重組靶將該DNA向到質(zhì)體基因組。另外，可以通過(guò)核編碼的和質(zhì)體導(dǎo)向的RNA聚合酶的組織優(yōu)選的表達(dá)，通過(guò)沉默質(zhì)體產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的反式激活作用來(lái)實(shí)現(xiàn)質(zhì)體轉(zhuǎn)化。此類系統(tǒng)已經(jīng)在 McBride 等人(1994)，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA91:7301-7305 中報(bào)道。
[0064]可以優(yōu)化待靶向到葉綠體的目的核酸用于在葉綠體中表達(dá)，因?yàn)樵谥参锛?xì)胞核和此細(xì)胞器之間的密碼子選擇存在不同。以這種方式，可以使用葉綠體優(yōu)選的密碼子合成目的核酸。見，例如，美國(guó)專利號(hào)5，380，831，在本文引用作為參考。
[0065]特別地，本發(fā)明描述了使用編碼AHASL突變多肽的多核苷酸來(lái)設(shè)計(jì)耐受除草劑的植物，其中所述AHASL突變多肽包含至少2個(gè)突變。這種策略在本文已經(jīng)使用擬南芥屬AHASL突變體在擬南芥中，和使用玉米AHASL2突變體在谷物中進(jìn)行了證實(shí)，不過(guò)其應(yīng)用不限于這些基因或不限于這些植物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，除草劑是咪唑啉酮和/或磺酰脲。在其他的優(yōu)選實(shí)施方案中，與野生型植物和與已知的AHAS突變體相比，改善和/或增強(qiáng)了除草劑耐受性。
[0066]本發(fā)明也提供產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因作物植物的方法，所述的轉(zhuǎn)基因作物植物含有包含至少2個(gè)突變的AHASL突變體編碼核酸，其中與野生型植物或與已知的AHAS突變型植物相比時(shí)，所述多核苷酸在該植物中的表達(dá)導(dǎo)致除草劑耐受性，所述方法包括:(a)將包含核酸的表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞，所述核酸編碼具有至少2個(gè)突變的AHASL突變體，和(b)從該植物細(xì)胞產(chǎn)生耐受除草劑的轉(zhuǎn)基因植物。該植物細(xì)胞包括但不限于原生質(zhì)體、配子生產(chǎn)細(xì)胞、和再生為完整植物的細(xì)胞。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因的”指含有至少一種重組多核苷酸的全部或部分的任意植物、植物細(xì)胞、愈傷組織、植物組織或植物部分。在多種情況下，重組多核苷酸的全部或部分穩(wěn)定地整合至染色體或整合至穩(wěn)定的染色體外元件，從而它被傳遞到后續(xù)世代中。
[0067] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及使用本發(fā)明的突變AHASL多肽作為選擇性標(biāo)記。本發(fā)明提供了鑒定或選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、植物組織、植物或其部分的方法，所述方法包括a)提供經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、植物組織、植物或其部分，其中所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、植物組織、植物或其部分包含編碼如上文所述的本發(fā)明AHAS大亞基雙重突變多肽的分離核酸，其中使用該多肽作為選擇性標(biāo)記，并且其中所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、植物組織、植物或其部分可以任選地包含其他的目的分離核酸；b)使所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、植物組織、植物或其部分與至少一種AHAS抑制劑或AHAS抑制性化合物接觸；c)確定所述植物細(xì)胞、植物組織、植物或其部分是否受所述抑制劑或抑制性化合物影響；和d)鑒定或選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、植物組織、植物或其部分。
[0068]本發(fā)明也體現(xiàn)在本文中所述的含有雙重和三重突變的純化AHASL蛋白，所述的純化AHASL蛋白用于分子建模研究以設(shè)計(jì)進(jìn)一步改善除草劑耐受性。蛋白質(zhì)純化的方法是熟知的，并且可以使用市售產(chǎn)品或?qū)ｉT設(shè)計(jì)的方法輕易完成，例如在ProteinBiotechnology, Walsh 和 Headon (Wiley, 1994)中描述。
[0069]本發(fā)明還提供了非轉(zhuǎn)基因的和轉(zhuǎn)基因的耐受除草劑的植物，所述耐受除草劑的植物包含編碼AHASL雙重突變多肽的一種多核苷酸或編碼AHASL單一突變多肽的兩種多核苷酸。從其中產(chǎn)生的非轉(zhuǎn)基因植物可以通過(guò)這種方式產(chǎn)生，即第一植物與第二植物交叉授粉并使花粉接受植物(可以是所述第一或第二植物)從這種交叉授粉中產(chǎn)生種子。所產(chǎn)生的種子和后代植物可以具有雜交到一個(gè)單一等位基因或兩個(gè)等位基因上的雙重突變。該花粉接受植物可以是第一或第二植物。所述第一植物包含編碼第一 AHASL單一突變多肽的第一多核苷酸。所述第二植物包含編碼第二 AHASL單一突變多肽的第二多核苷酸。所述第一和第二 AHASL單一突變多肽包含相對(duì)于野生型AHASL多肽的不同單一氨基酸替換?？梢赃x擇源自其中的種子或后代植物，所述的種子或后代植物包含編碼AHASL雙重突變多肽的一種多核苷酸或編碼所述兩種AHASL單一突變多肽的兩種多核苷酸。所選擇的后代植物表現(xiàn)了出人意料的較高水平的AHAS抑制型除草劑(例如咪唑啉酮除草劑或磺酰脲除草劑)耐受性，所述水平高于從兩種AHASL單一突變多肽在單個(gè)植物中組合所預(yù)測(cè)的水平。后代植物表現(xiàn)表現(xiàn)了除草劑耐受性 方面的協(xié)同作用，其中在包含來(lái)自親代植物的第一和第二突變的后代植物中的除草劑耐受性水平高于包含兩拷貝的第一多核苷酸或兩拷貝的第二多核苷酸的植物的除草劑耐受性水平。
[0070]當(dāng)所述第一和第二植物分別對(duì)所述第一和第二多核苷酸是純合時(shí)，所得后代植物的每一株包含所述第一和第二多核苷酸的每種多核苷酸的一個(gè)拷貝，并且可以省略選擇步驟。當(dāng)?shù)谝缓偷诙参镏辽僦皇请s合時(shí)，可以選出包含兩種多核苷酸的后代植物，例如通過(guò)分析后代植物的DNA以鑒定包含所述第一和第二多核苷酸的后代植物，或通過(guò)測(cè)試后代植物提高的除草劑耐受性。包含所述第一和第二多核苷酸這兩者的后代植物表現(xiàn)出比包含兩個(gè)拷貝的第一多肽或兩個(gè)拷貝的第二多肽的植物的除草劑耐受性水平更高的除草劑耐受性水平。
[0071]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的植物包含編碼第一 AHASL單一突變多肽的第一多核苷酸和編碼第二 AHASL單一突變多肽的第二多核苷酸，或包含兩個(gè)核苷酸突變的編碼AHASL的多核苷酸，所述兩個(gè)核苷酸突變導(dǎo)致與所述第一和所述第二 AHASL單一突變多肽的氨基酸突變相對(duì)應(yīng)的氨基酸突變，其中所述的第一和第二 AHASL單一突變多肽選自由以下多肽組成的組:在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或色氨酸的第二多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO:2第167位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺的第二多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ IDNO:2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO: 2第165位置的位置處具有絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸的第二多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第124位置或SEQ ID NO:2第92位置的位置處具有谷氨酸、異亮氨酸、亮氨酸或天冬酰胺的第二多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ IDNO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第139位置或SEQ ID NO: 2第107位置的位置處具有異亮氨酸的第二多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第269位置或SEQ ID NO: 2第237位置的位置處具有組氨酸的第二多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第416位置或SEQ ID NO:2第384位置的位置處具有甲硫氨酸的第二多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ IDNO:2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 1第426位置或SEQ ID NO: 2第394位置的位置處具有異亮氨酸的第二多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第430位置或SEQ ID NO: 2第398位置的位置處具有纈氨酸的第二多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第442位置或SEQ ID NO: 2第410位置的位置處具有異亮氨酸的第二多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第445位置或SEQ ID NO: 2第413位置的位置處具有異亮氨酸或天冬氨酸的第二多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第580位置或SEQ ID NO:2第548位置的位置處具有谷氨酸的第二多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第124位置或SEQ ID NO: 2第92位置的位置處具有谷氨酸、異亮氨酸、亮氨酸或天冬酰胺的第一多肽且在對(duì)應(yīng)于SEQID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或色氨酸的第二多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置處具有絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸的第一多肽和在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO: 2第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或色氨酸的第二多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO: 2第165位置的位置處具有絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸的第一多肽和在對(duì)應(yīng)于SEQID NO:1第375位置或SEQ ID NO: 2第343位置的位置處具有天冬酰胺的第二多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO: 2第165位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸的第一多肽和在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO:2第167位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺的第二多肽；在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第199位置或SEQID N0:2第167位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺的第一多肽且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO: 2第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或色氨酸的第二多肽；和在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第205位置或SEQ ID NO: 2第173位置的位置處具有纈氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、蘇氨酸、色氨酸或酪氨酸的第一多肽和在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或色氨酸的第二多肽?？梢酝ㄟ^(guò)除上文所述交叉授粉法之外的方法產(chǎn)生包含AHASL多核苷酸的雙重突變的非轉(zhuǎn)基因植物,所述的方法例如是,但不限于如Kochevenko等人(PlantPhys.132:174-184, 2003)中所述的定向體內(nèi)誘變。所述雙重突變可以位于植物基因組的單個(gè)等位基因或兩個(gè)等位基因上。
[0072]本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及用包含分離的多核苷酸的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述的分離的多核苷酸編碼選自由以下多肽組成的組的乙酰羥酸合酶大亞基(AHASL)雙重突變多肽:多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID N0:2 第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或色氨酸；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO: 2第167位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置處具有絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第124位置或SEQ ID NO: 2第92位置的位置處具有谷氨酸、異亮氨酸、亮氨酸或天冬酰胺；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第139位置或SEQ ID NO: 2第107位置的位置處具有異亮氨酸；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第269位置或SEQ ID NO: 2第237位置的位置處具有組氨酸；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第416位置或SEQ IDNO: 2第384位置的位置處具有甲硫氨酸；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQID N0:2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第426位置或SEQ ID NO: 2第394位置的位置處具有異亮氨酸；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第430位置或SEQ ID NO: 2第398位置的位置處具有纈氨酸；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第442位置或SEQ ID NO: 2第410位置的位置處具有異亮氨酸；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第445位置或SEQ ID NO: 2第413位置的位置處具有異亮氨酸或天冬氨酸；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第580位置或SEQ ID NO: 2第548位置的位置處具有谷氨酸；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第124位置或SEQ ID NO: 2第92位置的位置處具有谷氨酸、異亮氨酸、亮氨酸或天冬酰胺且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO: 2第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或色氨酸；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO: 2第165位置的位置處具有絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO: 2第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或色氨酸；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置處具有絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第375位置或SEQID NO: 2第343位置的位置處具有天冬酰胺；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO: 2第167位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO: 2第167位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或色氨酸；和在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第205位置或SEQ ID NO: 2第173位置的位置處具有纈氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、蘇氨酸、色氨酸或酪氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或色氨酸的多肽。
[0073]本發(fā)明還提供了非轉(zhuǎn)基因的和轉(zhuǎn)基因的耐受除草劑的植物，所述耐受除草劑的植物包含編碼AHASL三重突變多肽的一種多核苷酸或一種或多種編碼AHASL的多核苷酸，其中所述的編碼AHASL的多核苷酸包含三個(gè)突變。為了使用包含三個(gè)突變的一種或多種多核苷酸產(chǎn)生非轉(zhuǎn)基因植物，包含一種或兩種多核苷酸(其包含上文所述的第一和第二突變)的后代植物與包含編碼第三AHASL單一突變多肽的第三多核苷酸的第三植物交叉授粉。相對(duì)于野生型AHASL多肽，第三AHASL單一突變多肽包含與所述第一或第二 AHASL單一突變多肽不同的單個(gè)氨基酸替換。如上文所述選擇包含一種或多種多核苷酸的種子或后代植物，所述的多核苷酸包含所述三個(gè)突變。選擇的后代植物包含這樣的除草劑耐受水平，其大于組合三種在單個(gè)植物中的AHASL單一突變多肽的加合作用。可以通過(guò)除上文所述交叉授粉法之外的方法產(chǎn)生包含AHASL多核苷酸的三重或多重突變的非轉(zhuǎn)基因植物，所述的方法例如是，但不限于如上文所述的定向體內(nèi)誘變。所述多重突變可以位于植物基因組的單個(gè)等位基因或多個(gè)等位基因上。
[0074]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的植物包含編碼第一 AHASL單一突變多肽的第一多核苷酸、編碼第二 AHASL單一突變多肽的第二多核苷酸和編碼第三AHASL單一突變多肽的第三多核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的植物包含了含有3個(gè)突變的編碼AHASL的多核苷酸，其中所述三個(gè)核苷酸突變導(dǎo)致與所述第一、所述第二和所述第三AHASL單一突變多肽的突變相對(duì)應(yīng)的氨基酸突變。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的植物包含了含有單一突變的編碼AHASL的多核苷酸和含有雙重突變的多核苷酸，其中所述的核苷酸突變導(dǎo)致與前述第一、第二和第三AHASL單一突變多肽的突變相對(duì)應(yīng)的氨基酸突變，其中所述的第一、第二和第三AHASL單一突變多肽選自由以下多肽組成的組:多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID N0:2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸、在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO: 2第167位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或色氨酸；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸，在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO: 2第165位置的位置處具有絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO: 2第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或色氨酸；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸，在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO: 2第165位置的位置處具有絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO: 2第167位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸，在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第57位置的位置處具有精氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第398位置或SEQ ID NO: 2第366位置的位置處具有亮氨酸；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第124位置或SEQ ID NO: 2第92位置的位置處具有谷氨酸、異亮氨酸、亮氨酸或天冬酰胺，在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO: 2第165位置的位置處具有絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO: 2第167位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第95位置或SEQ ID NO: 2第63位置的位置處具有亮氨酸、在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第416位置或SEQ ID NO: 2第384位置的位置處具有谷氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ IDNO: 2第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或色氨酸；和多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO: 2第165位置的位置處具有絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸，在對(duì)應(yīng)于SEQID NO:1第19 9位置或SEQ ID NO: 2第167位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺并且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第574位置或SEQID NO:2第542位置的位置處具有任意氨基酸。
[0075]備選地，如下產(chǎn)生包含編碼AHASL單一突變多肽的一種或多種多核苷酸的植物，通過(guò)用兩種或多種此類多核苷酸轉(zhuǎn)化植物或用編碼第一 AHASL單一突變多肽的第一多核苷酸轉(zhuǎn)化第一植物并且所述第一植物與包含編碼第二 AHASL單一突變多肽的第二多核苷酸的第二植物交叉授粉。所述第二植物包含第二多核苷酸，所述第二多核苷酸包含內(nèi)源性或通過(guò)轉(zhuǎn)化作用導(dǎo)入的第二 AHASL單一突變多肽。所述第一和第二 AHASL單一突變多肽包含相對(duì)于野生型AHASL多肽為不同的單一氨基酸替換。根據(jù)需要，如上文所述選擇包含所述第一和第二多核苷酸的種子或后代植物。
[0076]本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案涉及用包含分離的多核苷酸的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述的分離的多核苷酸編碼選自由以下多肽組成的組的乙酰羥酸合酶大亞基(AHASL)三重突變多肽:多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸、在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID N0:2第167位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO: 2第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或色氨酸；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸，在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO: 2第165位置的位置處具有絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO: 2第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或色氨酸；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸，在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO: 2第165位置的位置處具有絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、 谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQID NO:1第199位置或SEQ ID NO: 2第167位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO: 2第90位置的位置處具有纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸，在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第57位置的位置處具有精氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第398位置或SEQ ID NO: 2第366位置的位置處具有亮氨酸；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第124位置或SEQ ID NO:2第92位置的位置處具有谷氨酸、異亮氨酸、亮氨酸或天冬酰胺，在對(duì)應(yīng)于SEQ IDNO:1第197位置或SEQ ID NO: 2第165位置的位置處具有絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO: 2第167位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺；多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第95位置或SEQ ID NO: 2第63位置的位置處具有亮氨酸、在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第416位置或SEQ ID NO: 2第384位置的位置處具有谷氨酸且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO: 2第621位置的位置處具有苯丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或色氨酸；和多肽，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID N0:2第165位置的位置處具有絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸或異亮氨酸，在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第199位置或SEQID N0:2第167位置的位置處具有丙氨酸、谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺并且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1第574位置或SEQ ID NO: 2第542位置的位置處具有任意氨基酸。
[0077]本發(fā)明提供了除草劑耐受性或除草劑抗性植物，所述植物包含除草劑耐受性或除草劑抗性AHASL蛋白，所述除草劑耐受性或除草劑抗性AHASL蛋白包括但不限于由本發(fā)明多核苷酸編碼的AHASL單一突變多肽和AHASL 二重和三重突變多肽。“除草劑耐受性”或“除草劑抗性”植物意指耐受或抵抗在通常會(huì)殺死正?；蛞吧椭参锘蛞种破渖L(zhǎng)的水平的至少一種除草劑的植物。“除草劑耐受性AHASL蛋白”或“除草劑抗性AHASL蛋白”意指當(dāng)存在已知干擾AHAS活性的至少一種除草劑并處于該除草劑的已知抑制野生型AHASL蛋白AHAS活性的濃度或水平時(shí)，相對(duì)于野生型AHASL蛋白的AHAS活性，此種AHASL蛋白表現(xiàn)較高的AHAS活性。進(jìn)一步地，這種除草劑耐受性或除草劑抗性AHASL蛋白的AHAS活性可以在本文中稱作“除草劑耐受性”或“除草劑抗性”AHAS活性。
[0078]對(duì)于本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“除草劑耐受的”和“除草劑抵抗的”可互換使用并且意圖具有等同的意義和等同的范圍。類似地，術(shù)語(yǔ) “除草劑耐受性”和“除草劑抗性”可互換使用并且意圖具有等同的意義和等同的范圍。同樣地，術(shù)語(yǔ)“咪唑啉酮抵抗的”和“咪唑啉酮抗性”可互換使用并且意圖分別具有如術(shù)語(yǔ)“咪唑啉酮耐受的”和“咪唑啉酮耐受性”那樣的等同意義和等同范圍。
[0079]本發(fā)明包括除草劑抗性AHASL多核苷酸和除草劑抗性AHASL蛋白?！俺輨┛剐訟HASL多核苷酸”意指編碼包含除草劑抗性AHAS活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸?！俺輨┛剐訟HASL蛋白”意指編碼包含除草劑抗性AHAS活性的蛋白質(zhì)或多肽。
[0080]另外，認(rèn)識(shí)到除草劑耐受性或除草劑抗性AHASL蛋白可以通過(guò)用編碼除草劑耐受性或除草劑抗性AHASL蛋白的核苷酸序列轉(zhuǎn)化植物或其祖先來(lái)導(dǎo)入植物。此類除草劑耐受性或除草劑抗性AHASL蛋白由除草劑耐受性或除草劑抗性AHASL多核苷酸編碼。備選地，除草劑耐受性或除草劑抗性AHASL蛋白，例如本文中所公開的AHASL單一突變多肽，可以在植物中因植物或其先祖的基因組中內(nèi)源性AHASL基因中天然存在的突變或誘導(dǎo)的突變而存在。
[0081]本發(fā)明提供了植物、植物組織、植物細(xì)胞和宿主細(xì)胞，它們具有提高的針對(duì)至少一種除草劑、尤其咪唑啉酮或磺酰脲除草劑的抗性或耐受性。除草劑的優(yōu)選量或濃度是“有效量”或“有效濃度”。術(shù)語(yǔ)“有效量”或“有效濃度”分別意指這種量或濃度，即它足夠殺死相似的、野生型植物、植物組織、植物細(xì)胞或宿主細(xì)胞或抑制其生長(zhǎng)，但是該量并不殺死本發(fā)明的除草劑抗性植物、植物組織、植物細(xì)胞和宿主細(xì)胞或嚴(yán)重地抑制其生長(zhǎng)。一般地，除草劑的有效量是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)系統(tǒng)中例行用來(lái)殺死目的雜草的量。這種量是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。
[0082]術(shù)語(yǔ)“相似的、野生型植物、植物細(xì)胞或宿主細(xì)胞”分別意指缺少本文中所公開的本發(fā)明的除草劑抗性特征和/或具體多核苷酸的植物、植物組織、植物細(xì)胞或宿主細(xì)胞。使用術(shù)語(yǔ)“野生型”因此不意圖暗示植物、植物組織、植物細(xì)胞或其它宿主細(xì)胞在其基因組中缺少重組DNAjP /或不擁有與本文中所公開那些除草劑抗性特征不同的除草劑抗性特征。
[0083]如本文中所用，除非另外清楚地說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“植物”意指處于任意發(fā)育期的植物，以及可以與完整無(wú)缺的植物相聯(lián)系或分離的任意植物部分或諸部分。此類植物部分包括但不限于植物的器官、組織和細(xì)胞。具體植物部分的實(shí)例包括莖、葉、根、花序、花、小花、果實(shí)、花梗、花序梗、雄蕊、花藥、柱頭、花柱、子房、花瓣、萼片、心皮、根尖、根冠、根毛、葉毛、種毛、花粉粒、微孢子、子葉、下胚軸、上胚軸、木質(zhì)部、韌皮部、薄壁組織、胚乳、伴細(xì)胞、保衛(wèi)細(xì)胞和植物的任意其他已知器官、組織和細(xì)胞。另外，認(rèn)識(shí)到種子是植物。
[0084]本發(fā)明的植物包括非轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因植物?！胺寝D(zhuǎn)基因植物”意指其基因阻中缺少重組DNA的植物。“轉(zhuǎn)基因植物”意指其基因阻中包含重組DNA的植物。這種轉(zhuǎn)基因植物可以通過(guò)將重組DNA導(dǎo)入植物基因組產(chǎn)生。當(dāng)這種重組DNA并入轉(zhuǎn)基因植物的基因組時(shí)，該植物的后代植物也可以包含該重組DNA。包含至少一種先祖轉(zhuǎn)基因植物的重組DNA的至少一部分的后代植物也是轉(zhuǎn)基因植物。
[0085]在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過(guò)突變育種法產(chǎn)生的除草劑抗性植物。此類植物包含編碼AHAS大亞基單一突變多肽的多核苷酸并且耐受一種或多種AHAS抑制型除草劑。此類方法可以包括例如使植物或種子暴露于致變物、尤其化學(xué)致變物例如甲磺酸乙酯(EMS)，并且選擇具有針對(duì)至少一種AHAS抑制型除草劑、尤其咪唑啉酮除草劑或磺酰脲除草劑的增強(qiáng)耐受性的植物。然而，本發(fā)明不限于通過(guò)包括化學(xué)致變物EMS在內(nèi)的誘變方法產(chǎn)生的耐受除草劑的植物。本領(lǐng)域已知的任意誘變方法可以用來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明的除草劑抗性植物。此類誘變方法可以包括例如使用任意一種或多種以下致變物:輻射，如X-射線、Y射線(例如，鈷60或銫137)、中子(例如，原子反應(yīng)堆中鈾235的核裂變產(chǎn)物)、β輻射(例如，從放射性同位素如磷32或碳14發(fā)射)和紫外輻射(優(yōu)選地2500至2900nm)和化學(xué)致變物如堿基類似物(例如，5-溴-尿嘧啶)、相關(guān)化合物(例如8-乙氧咖啡因)、抗生素(例如鏈黑霉素)、烷化劑(例如硫芥子氣、氮芥子氣、環(huán)氧化物、乙烯亞胺、硫酸酯、磺酸酯、砜、內(nèi)酯)、氮化物、羥胺、亞硝酸或吖啶。除草劑抗性植物也可以使用選擇植物細(xì)胞的組織培養(yǎng)方法產(chǎn)生，所述的組織培養(yǎng)方法包括產(chǎn)生除草劑抗性突變并隨后從中再生除草劑抗性植物。例如，參見美國(guó)專利號(hào)5，773，702和5，859，348，兩者均通過(guò)引用方式完整地并入本文。突變育種法的進(jìn)一步細(xì)節(jié)可以在“Principals of CultivarDevelopment^ehr, 1993Macmillan Publishing Company 中找到，其中所述文獻(xiàn)的公開內(nèi)容通過(guò)引用的方式并入本文。
[0086]本發(fā)明提供用于增強(qiáng)植物、植物組織、植物細(xì)胞或其他宿主細(xì)胞針對(duì)干擾AHAS酶活性的至少一種除草劑的耐受性或抗性的方法。優(yōu)選地，這種除草劑是咪唑啉酮除草劑、磺酰脲除草劑、三唑并嘧啶除草劑、嘧啶基氧基苯甲酸酯除草劑、磺酰氨基-羰基三唑啉酮除草劑或它們的混合物。更優(yōu)選地，這種除草劑是咪唑啉酮除草劑、磺酰脲除草劑或它們的混合物。對(duì)于本發(fā)明，咪唑啉酮除草劑包括但不限于PURSUIT? (咪草煙)、CADRE? (甲滅草煙)、RAPTOR? (甲氧咪草煙)、SCEPTER? (滅草喹)、ASSERT? (imazethabenz)、ARSENAL.? (滅草煙)、任意前述除草劑的衍生物，或兩種或多種前述除草劑的混合物，例如滅草煙/甲氧咪草煙(ODYSSEY?)。更具體地，咪唑啉酮除草劑可以選自但不限于2-(4-異丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-煙酸、[2-(4-異丙基)-4-][甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-3-喹啉羧]酸、[5-乙基-2- (4-異丙基_] 4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-煙酸、2- (4-異丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-5-(甲氧甲基)_煙酸、[2-(4-異丙基-4-甲基-5-氧代-2-]咪唑啉-2-基)-5-甲基煙酸和甲基[6-(4-異丙基-4-]甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-間-甲苯甲酸酯和甲基[2-(4-異丙基-4-甲基-5-]氧代-2-咪唑啉-2-基)-對(duì)-甲苯甲酸酯的混合物。優(yōu)選使用5-乙基-2-(4-異丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-煙酸和[2-(4-異丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-]基)_5_(甲氧甲基)_煙酸。特別優(yōu)選使用[2-(4-異丙基-4-]甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-5-(甲氧甲基)_煙酸。
[0087]對(duì)于本發(fā)明，磺酰脲除草劑包括但不限于綠黃隆、甲磺隆、嘧黃隆、氯嘧黃隆、噻黃隆、苯黃隆、禾草芐混劑、煙嘧黃隆、胺苯黃隆、玉嘧黃隆、氟胺黃隆、醚苯黃隆、氟嘧黃隆、醚黃隆、磺氨黃隆(amidosulfiuon)、fluzasulfuron、唳咪黃隆、批氯黃隆、氯批氯黃隆、四唑嘧磺隆、環(huán)丙嘧磺隆、乙氧嘧磺隆、啶嘧磺隆、氟啶嘧磺隆、甲酰氨磺隆、碘磺隆(iodosulfuron)、環(huán)氧嘧磺隆、甲基二磺隆(mesosulfuron)、氟磺隆、磺?；锹　⑷锹?、三氟甲磺隆、任意前述除草劑的衍生物、和兩種或多種前述除草劑的混合物。本發(fā)明的三唑并嘧啶除草劑包括但不限于氯酯磺草胺、雙氯磺草胺、雙氟磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草唑胺和五氟磺草胺。本發(fā)明的嘧啶基氧基苯甲酸酯(或嘧啶羧酸)除草劑包括但不限于雙草醚、嘧硫草醚、嘧草醚、嘧啶肟草醚和環(huán)酯草醚?；酋０被?羰基三唑啉酮除草劑包括但不限于氟酮磺隆和丙苯黃隆。
[0088]認(rèn)識(shí)到嘧啶基氧基苯甲酸酯除草劑與嘧啶基硫代苯甲酸酯(pyrimidinyIthiobenzoate)除草劑密切相關(guān)并且由美國(guó)雜草科學(xué)學(xué)會(huì)(Weed ScienceSociety of America)在后一名稱下概述。因此，本發(fā)明的除草劑還包括喃唳基硫代苯甲酸酯除草劑，其包括但不限于上文所述的嘧啶基氧基苯甲酸酯除草劑。
[0089]本發(fā)明提供用于增強(qiáng)植物中AHAS活性的方法，所述方法包括用包含有效連接到本發(fā)明AHASL核苷酸 序列的啟動(dòng)子的多核苷酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物。所述方法包括將本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體導(dǎo)入至少一個(gè)植物細(xì)胞并從中再生轉(zhuǎn)化的植物。所述方法包括使用能夠驅(qū)動(dòng)植物細(xì)胞中基因表達(dá)的啟動(dòng)子。優(yōu)選地，這種啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子或組織優(yōu)選的啟動(dòng)子。所述方法用于增強(qiáng)或提高植物針對(duì)干擾AHAS酶催化活性的至少一種除草劑、尤其咪唑啉酮除草劑的抗性。
[0090]本發(fā)明提供用于在植物、植物組織、植物細(xì)胞和其它宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)盒。所述表達(dá)盒包含在目的植物、植物組織、植物細(xì)胞或其它宿主細(xì)胞中可表達(dá)的啟動(dòng)子，其有效連接至包含編碼全長(zhǎng)(即包括葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽)或成熟(即無(wú)葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽)AHASL蛋白的核苷酸序列的本發(fā)明多核苷酸上。若需要在植物或植物細(xì)胞的質(zhì)體或葉綠體中表達(dá)，該表達(dá)盒也可以包含有效連接的編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的葉綠體祀向序列。
[0091]本發(fā)明的表達(dá)盒用在增強(qiáng)植物或宿主細(xì)胞的除草劑耐受性的方法中。所述方法包括用本發(fā)明的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化該植物或宿主細(xì)胞，其中所述的表達(dá)盒包含在目的植物或宿主細(xì)胞中可表達(dá)的啟動(dòng)子，并且該啟動(dòng)子有效連接至本發(fā)明的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含編碼本發(fā)明的咪唑啉酮抗性AHASL蛋白的核苷酸序列。
[0092]本文中術(shù)語(yǔ)“多核苷酸構(gòu)建體”的使用不意圖將本發(fā)明限于包含DNA的多核苷酸構(gòu)建體。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，包含核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸的組合的多核苷酸構(gòu)建體，尤其多核苷酸和寡核苷酸，也可以用在本文公開的方法中。因此，本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體包括可以用在本發(fā)明方法中用于轉(zhuǎn)化植物的全部多核苷酸構(gòu)建體，包括但不限于包含脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和其組合的那些多核苷酸構(gòu)建體。此類脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成類似物。本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體還包括全部形式的多核苷酸構(gòu)建體，它們包括但不限于單鏈形式、雙鏈形式、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、莖環(huán)結(jié)構(gòu)等。另外，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員理解在本文公開的每種核苷酸序列還包括所例示的核苷酸序列的互補(bǔ)物。
[0093]另外，認(rèn)識(shí)到為了在目的宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸，該多核苷酸一般有效連接至能夠驅(qū)動(dòng)目的宿主細(xì)胞中基因表達(dá)的啟動(dòng)子。用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)多核苷酸的本發(fā)明方法不依賴于特定的啟動(dòng)子。所述方法包括使用本領(lǐng)域已知的并且能夠驅(qū)動(dòng)目的宿主細(xì)胞中基因表達(dá)的任意啟動(dòng)子。
[0094]本發(fā)明包括AHASL多核苷酸分子以及其片段和變體。作為這些核苷酸序列的片段的多核苷酸分子也由本發(fā)明包括?！捌巍币庵妇幋a本發(fā)明AHASL蛋白的核苷酸序列的部分。優(yōu)選地，本發(fā)明的AHASL核苷酸序列的片段編碼AHASL蛋白的生物學(xué)活性部分。AHASL蛋白的生物學(xué)活性部分可以通過(guò)下列方式制備:分離一種本發(fā)明AHASL核苷酸序列的一部分，表達(dá)該AHASL蛋白的編碼部分(例如通過(guò)體外重組表達(dá))，并且評(píng)估該AHASL蛋白的編碼部分的活性。作為AHASL核苷酸序列的片段并編碼AHASL蛋白的生物學(xué)活性部分的多核苷酸分子至少包含大約 500、750、1000、1250、1500、1600、1700、1800、1900 或 2000 個(gè)核苷酸，或者多達(dá)在本文公開的全長(zhǎng)核苷酸序列中存在的核苷酸數(shù)目(例如，對(duì)于SEQ ID NO:30為2013個(gè)核苷酸)，這取決于預(yù)期用途。
[0095]編碼本發(fā)明AHASL蛋白的生物學(xué)活性部分的AHASL多核苷酸序列片段編碼至少約200，300, 400, 500, 550, 650,或650個(gè)連續(xù)氨基酸，或多達(dá)在本發(fā)明的全長(zhǎng)AHASL蛋白中存在的氨基酸總數(shù)(例如，對(duì)于SEQ ID NO:1為670個(gè)氨基酸)。
[0096]本發(fā)明也包含這樣的多核苷酸分子，其中所述的多核苷酸分子包含本文中所公開的核苷酸序列的變體的核苷酸序列。本發(fā)明的AHASL核苷酸序列的“變體”包括編碼本文公開的突變AHASL多肽但是由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性而保守性不同的那些序列。這些天然存在的等位基因變體可以使用熟知的分子生物學(xué)技術(shù)鑒定，如下文說(shuō)明的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和雜交技術(shù)。變體核苷酸序列也包括合成方式衍生的核苷酸序列，例如，它們通過(guò)使用位點(diǎn)定向誘變產(chǎn)生，但如下文所討論仍編碼本發(fā)明中所公開的AHASL蛋白。通常，本發(fā)明的多核苷酸序列變體與本文公開的特定核苷酸序列具有至少約80%、85(%、90(%、91(%、92(%、93(%、94 %、95 %、96 %、97 %、98 %或99 %的同一性。變體AHASL多核苷酸序列分別編碼這樣的AHASL突變多肽，所述AHASL突變多肽具有與本文公開的AHASL多肽的氨基酸序列具備至少約 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% 同一性的氨基酸序列。
[0097]另外，技術(shù)人員還了解，可以通過(guò)突變將改變引入本發(fā)明的多核苷酸序列，從而導(dǎo)致所編碼的AHASL雙重和三重突變多肽的氨基酸序列改變而不改變所述雙重和三重突變多肽的生物學(xué)活性。因此，可以通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)核苷酸替換、添加或缺失引入本文公開的相應(yīng)核苷酸序列，從而 將一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、添加或缺失引入所編碼的蛋白質(zhì)中，來(lái)產(chǎn)生編碼AHASL雙重和三重突變多肽的分離的多核苷酸分子，其中所述的AHASL雙重和三重突變多肽具有與圖1和2中所述雙重和三重突變序列不同的序列?？梢酝ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如位點(diǎn)定向誘變和PCR介導(dǎo)的誘變來(lái)導(dǎo)入突變。此類變體核苷酸序列也由本發(fā)明包括。[0098]例如，優(yōu)選地，可以在一個(gè)或多個(gè)預(yù)測(cè)的、優(yōu)選地非必需氨基酸殘基處產(chǎn)生保守性氨基酸替換。“非必需”氨基酸殘基是可以從AHASL蛋白的野生型序列(例如SEQ ID NO:1的序列)改變但是不改變生物學(xué)活性的殘基，而“必需”氨基酸殘基是生物學(xué)活性所需要的?！氨Ｊ匦园被崽鎿Q”是其中氨基酸殘基替換為具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的氨基酸殘基替換。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族已經(jīng)在本領(lǐng)域中定義。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有分支的側(cè)鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)，以及具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。不對(duì)保守氨基酸殘基或不對(duì)存在于保守基序中的氨基酸殘基進(jìn)行此類替換。
[0099]本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以以多種方式進(jìn)行改變，包括氨基酸替換、缺失、截短和插入。用于此類操作的方法通常是本領(lǐng)域已知的。例如，可以通過(guò)DNA中的突變來(lái)制備AHASL蛋白的氨基酸序列變體。用于誘變和核苷酸序列變更的方法是本領(lǐng)域熟知的。見，例如，Kunkel, (1985)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA82:488-492 ；KunkeI 等人(1987)Methods in Enzymo1.154:367-382 ;美國(guó)專利號(hào) 4，873, 192 ;Walker 和 Gaastra 編著(1983), Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York),以及其中引用的參考文獻(xiàn)。關(guān)于不影響目的蛋白質(zhì)生物學(xué)活性的適當(dāng)氨基酸替換的指導(dǎo)可以在 Dayhoff 等人(1978), Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl.Biomed.Res.Found., Washington, D.C.)的模型中找到，所述文獻(xiàn)在本文中引用作為參考。保守性替換，如將一個(gè)氨基酸替換為具有相似特性的另一個(gè)氨基酸，可以是優(yōu)選的。
[0100]認(rèn)識(shí)到本發(fā)明的多核苷酸分子和多肽包括這樣的多核苷酸分子和多肽，它們包含與圖1和2中所示的雙重突變或三重突變核苷酸序列或與圖1和2中所示的氨基酸序列充分同一的核苷酸序列或氨 基酸序列。術(shù)語(yǔ)“充分同一的”在本文中用來(lái)指含有足夠或最小數(shù)目的與第二氨基酸或核苷酸序列相同或等同(例如具有相似側(cè)鏈的)氨基酸殘基或核苷酸的第一氨基酸或核苷酸序列，從而所述的第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有共同的結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu)域和/或共同的功能活性。例如，包含具有至少約80%同一性、優(yōu)選85%同一性、更優(yōu)選90%、95%或98%同一性的共同結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu)域的氨基酸或核苷酸序列在本文中定義為充分同一的。
[0101]為確定兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核酸的百分同一性，所述序列為最佳比較目的進(jìn)行比對(duì)。這兩個(gè)序列之間的百分同一性是所述序列共有的相同位置的函數(shù)(即百分同一性=相同位置數(shù)/位置總數(shù)(例如，重疊位置)x100)。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)序列具有相同長(zhǎng)度。可以使用與下文所述那些技術(shù)相似的技術(shù)，在容許或不容許空位的情況下確定兩個(gè)序列之間的百分同一性。在計(jì)算百分同一性中，一般計(jì)數(shù)精確匹配。
[0102]可以使用數(shù)學(xué)算法完成兩個(gè)序列之間百分同一性的確定。用于比較兩個(gè)序列的數(shù)學(xué)算法的優(yōu)選的非限制性實(shí)例是Karlin和Altschul, (1990)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87:2264 的算法，該算法如在 Karlin 和 Altschul, (1993) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:5873-5877 中改良。此種算法并入至 Altschul 等人(1990) J.Mol.Biol.215:403 的NBLAST和XBLAST程序?？梢杂肗BLAST程序、分值=100、字長(zhǎng)=12進(jìn)行BLAST核苷酸搜索以獲得與本發(fā)明多核苷酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序、分值=50、字長(zhǎng)=3進(jìn)行BLAST蛋白質(zhì)搜索以獲得與本發(fā)明的蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。為了出于比較目的獲得空位比對(duì)結(jié)果，可以如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3389中所述使用空位BLAST。備選地，PS1-Blast可以用來(lái)開展檢測(cè)分子間遠(yuǎn)緣關(guān)系的重復(fù)搜索。見上文Altschul等人，1997。當(dāng)使用BLAST、空位BLAST和PS1-Blast程序時(shí)，可以使用各自程序(例如 XBLAST 和 NB LAST)的默認(rèn)參數(shù)。見 http://www.ncb1.nlm.nih.gov。另一個(gè)用于序列比較的優(yōu)選的非限制性數(shù)學(xué)算法實(shí)例是Myers和Miller (1988) CAB10S4:11-17的算法。此種算法并入至ALIGN程序(版本2.0)，該程序是GCG序列比對(duì)軟件包的一部分。當(dāng)使用ALIGN程序以比較氨基酸序列時(shí)，可以使用PAMl20權(quán)重殘基表、空位長(zhǎng)度罰分12和空位罰分4?？梢酝ㄟ^(guò)目測(cè)法手動(dòng)開展比對(duì)。
[0103]除非另外說(shuō)明，本文中提供的序列同一性/相似性值指通過(guò)算法ClustalW(Nucleic Acid Research, 22(22):4673-4680, 1994)，使用在軟件包 Vector NTI Suite 第9 版(Invitrogen, 1600Faraday Ave., Carlsbad, CA92008)中包括的程序 AlignX,使用默認(rèn)參數(shù)；或其任意等同程序，使用本發(fā)明的全長(zhǎng)序列并使用多重比對(duì)結(jié)果獲得的值?！暗韧绦颉币庵溉我獾男蛄斜容^程序，對(duì)于討論的任意兩個(gè)序列而言，與軟件包Vector NTI Suite第9版中的AlignX所產(chǎn)生的相應(yīng)比對(duì)結(jié)果比較時(shí)，所述序列比較程序產(chǎn)生具有相同核苷酸或氨基酸殘基匹配和相同百分序列同一性的比對(duì)結(jié)果。
[0104]不希望缺失、插入和替換本文所包括的蛋白質(zhì)序列會(huì)引起蛋白質(zhì)特征的根本變化。但是，當(dāng)如此操作之前難以預(yù)測(cè)替換、缺失或插入的確切作用時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員了解可以通過(guò)常規(guī)篩選測(cè)定法評(píng)估這種作用。那就是說(shuō)，可以通過(guò)AHAS活性測(cè)定法評(píng)估此活性。見，例如Singh等人(1988)Anal.Biochem.171:173-179，在本文引用作為參考。
[0105]如本文中公開，本發(fā)明的多核苷酸用來(lái)增強(qiáng)在其基因組中包含編碼除草劑耐受性AHASL蛋 白的基因的植物的除草劑耐受性。此種AHASL基因可以是內(nèi)源基因或轉(zhuǎn)基因。另外，在某些實(shí)施方案中，可以將本發(fā)明的多核苷酸序列與目的多核苷酸序列的任何組合堆積在一起以產(chǎn)生具有所需表型的植物。例如，本發(fā)明的多核苷酸可以與編碼具有殺蟲和/或殺昆蟲(insecticidal)活性的多肽(例如蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)毒蛋白)的任何其它多核苷酸堆積在一起(在美國(guó)專利號(hào)5，366，892 ;5，747，450 ；5，737，514 ;5，723，756 ;5，593，881 ;和 Geiser 等人(1986) Gene48:109 中描述)。生成的組合還可以包括任何一種目的多核苷酸的多個(gè)拷貝。
[0106]盡管本發(fā)明的表達(dá)盒作為選擇性標(biāo)記基因用于植物選擇，不過(guò)本發(fā)明的表達(dá)盒可以包括另一個(gè)選擇性標(biāo)記基因以選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。選擇性標(biāo)記基因(包括本發(fā)明的那些選擇性標(biāo)記基因)用于選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織。標(biāo)記基因包括但不限于編碼抗生素耐藥性的基因，如編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II (NEO)和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)的那些基因，以及賦予針對(duì)除草劑化合物(如草銨膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧乙酸酯(2, 4-D))抗性的基因?？傮w上參見 Yarranton(1992)Curr.0pin.Biotech.3:506-511 ；Christopherson 等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:6314-6318 ;Yao 等人(1992)Cell71:63-72 ；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6:2419-2422 ；Barkley 等人(1980)The Operon,第 I77-22O 頁(yè)；Hu 等人(I987)Cell^z555-566Jrown 等人(I987)Cell49:603-612 ；Figge 等人(1988)Cell52:713-722 ；Deuschle 等人(1989)Proc.Natl.Acad.Ac1.USA86:5400-5404 ；Fuerst 等人(1989) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:2549-2553 ；Deuschle 等人(1990) Science248:480-483 ；Gossen (1993) Ph.D.Thesis,海德堡大學(xué)；Reines 等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:1917-1921 ；Labow 等人(1990)Mol.Cell.Biol.10:3343-3356 ；Zambretti 等人(1992) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:3952-3956 ；Baim等人(1991) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88:5072-5076 ；ffyborski 等人(1991) Nucleic AcidsRes.19:4647-4653 ；Hillenand-ffissman (1989)Topics Mol.Struc.Biol.10:143-162 ；Degenkolb 等人(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35:1591-1595 ；Kleinschnidt等人(1988)Biochemistry27:1094-1104 ;Bonin (1993)Ph.D.Thesis, University ofHeidelberg ；Gossen 等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:5547-5551 ;01iva 等人(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36:913-919 ；Hlavka 等人(1985)Handbook ofExperimental Pharmacology, Vol.78(Springer-Verlag,Berlin) ；Gill 等人(1988)Nature334:721-724。此類公開在本文引用作為參考。
[0107]選擇性標(biāo)記基因的上述列表不意圖是限制的。在本發(fā)明中可以使用任何選擇性標(biāo)
記基因。
[0108]包含編碼本發(fā)明AHASL蛋白的核苷酸序列的分離的多核苷酸分子可以在載體中用來(lái)轉(zhuǎn)化植物，從而所產(chǎn)生的植物具有針對(duì)除草劑、尤其咪唑啉酮除草劑或磺酰脲除草劑的增強(qiáng)耐受性。本發(fā)明的分離的AHASL多核苷酸分子可以在載體中單獨(dú)或與下述核苷酸序列組合使用，其中所述的核苷酸序列編碼在植物中賦予除草劑抗性的酶AHAS的小亞基(AHASS)。見美國(guó)專利號(hào)6，348，643，其在本文中引用作為參考。
[0109]本發(fā)明也涉及植物表達(dá)載體，其包含這樣的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)植物中與其有效連接的本發(fā)明 的分尚的多核苷酸分子表達(dá)。所述的分尚的多核苷酸分子包含編碼本發(fā)明AHASL蛋白或其功能性片段或變體的核苷酸序列。本發(fā)明的植物表達(dá)載體不依賴于特定的啟動(dòng)子，只要這種啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)植物細(xì)胞中的基因表達(dá)即可。優(yōu)選的啟動(dòng)子包括組成型啟動(dòng)子和組織優(yōu)選的啟動(dòng)子。
[0110]本發(fā)明的轉(zhuǎn)化載體可以用來(lái)產(chǎn)生以目的基因轉(zhuǎn)化的植物。該轉(zhuǎn)化載體包含待導(dǎo)入的并一般在經(jīng)轉(zhuǎn)化植物中表達(dá)的本發(fā)明選擇性標(biāo)記基因和目的基因。此種選擇性標(biāo)記基因包含編碼AHASL雙重或三重突變多肽的本發(fā)明多核苷酸，其中所述多核苷酸與驅(qū)動(dòng)在宿主細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子有效連接。為用于植物和植物細(xì)胞中，該轉(zhuǎn)化載體包含選擇性標(biāo)記基因，所述的選擇性標(biāo)記基因包含與驅(qū)動(dòng)在植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子有效連接的編碼AHASL雙重或三重突變多肽的本發(fā)明多核苷酸。
[0111]本發(fā)明的目的基因根據(jù)所需結(jié)果而變化。例如，表型的多種改變可以是令人感興趣的，這包括調(diào)節(jié)植物中的脂防酸組成、改變植物的氨基酸含量、改變植物的昆蟲和/或病原體防御機(jī)制等?？梢酝ㄟ^(guò)使得植物中異源產(chǎn)物表達(dá)或內(nèi)源性產(chǎn)物表達(dá)提高實(shí)現(xiàn)這些結(jié)果。備選地，可以通過(guò)使得植物中一種或多種內(nèi)源性產(chǎn)物尤其是酶或輔因子的表達(dá)降低實(shí)現(xiàn)所述結(jié)果。這些變化導(dǎo)致經(jīng)轉(zhuǎn)化植物的表型改變。
[0112]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，目的基因包括昆蟲抗性基因，例如，蘇云金芽孢桿菌毒素蛋白基因(美國(guó)專利號(hào) 5，366，892 ;5，747，450 ;5，736，514 ;5，723，756 ;5，593，881 ;和Geiser 等人(1986) Gene48:109)。
[0113]本發(fā)明的AHASL蛋白或多肽可以純化自例如向日葵植物，并且可以用在組合物中。另外，編碼本發(fā)明的AHASL蛋白的分離的多核苷酸分子可以用來(lái)在微生物(如大腸桿菌或酵母)中表達(dá)本發(fā)明的AHASL蛋白。表達(dá)的AHASL蛋白可以通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任意方法從大腸桿菌或酵母的提取物中純化。
[0114]本發(fā)明的多核苷酸用于增強(qiáng)耐受除草劑的植物的抗性的方法中。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述耐受除草劑的植物包含編碼AHASL雙重或三重突變多肽的本發(fā)明多核苷酸。本發(fā)明還提供了包含編碼AHASL單一突變多肽的兩個(gè)或多個(gè)多核苷酸的耐受除草劑的植物。編碼除草劑耐受性AHASL蛋白的多核苷酸和包含編碼除草劑耐受性AHASL蛋白的內(nèi)源性基因的耐受除草劑的植物包括本發(fā)明的多核苷酸和植物以及本領(lǐng)域已知的那些多核苷酸和植物。見，例如美國(guó)專利號(hào)5，013，659,5, 731，180,5, 767，361,5, 545，822、5，736，629,5, 773，703,5, 773，704,5, 952，553 和 6，274，796，全部所述文獻(xiàn)在本文通過(guò)引用的方式并入。用于增強(qiáng)耐受除草劑的植物的抗性的此類方法包括用至少一種多核苷酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化耐受除草劑的植物，所述的多核苷酸構(gòu)建體包含驅(qū)動(dòng)植物細(xì)胞中基因表達(dá)的啟動(dòng)子和與其有效連接的本發(fā)明多核苷酸。
[0115]用于轉(zhuǎn)化植物的眾多植物轉(zhuǎn)化載體和方法是可用的。見，例如，An，G.等人(1986)Plant Physiol., 81:301-305 ；Fry, J.等人(1987)Plant Cell Rep.6:321-325 ;Block, M.(1988)Theor.Appl Genet.76:767-774 ；Hinchee 等人(1990)Stadler.Genet.Symp.203212.203-212 ；Cousins 等人(1991)Aust.J.Plant Physiol.18:481-494 ;Chee, P.P.和 SI ightom, J.L.(1992) Gene.118: 255-260 ;Chri stou 等人(1992)Trends.Biotechnol.10:239-246 ;D’Halluin 等人(1992)Bio/Technol.10:309-314 ;Dhir 等人(1992)Plant Physiol.99:81-88 ；Casas 等人(1993)Proc.Nat.Acad Sc1.USA90:11212-11216 ；Christou, P.(1993) In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant ；29P:119-124 ；Davies 等人(1993)Plant Cell Rep.12:180-183 ；Dong, J.A.和 Mchughen, A.(1993)PlantSc1.91:139-148 ；Franklin, C.1.和 Trieu, T.N.(1993)Plant.Physiol.102:167 ；Golovkin等人(1993)Plant Sc1.90:41-52 ；Guo Chin Sc1.Bull.38:2072-2078 ；Asano 等人(1994)Plant Cell Rep.13 ；Ayeres N.M.和 Park, W.D.(1994) Crit.Rev.Plant.Sc1.13:219-239 ；Barcelo 等人(1994) Plant.J.5:583-592 ;Becker 等人(1994)Plant.J.5:299-307 ；Borkowska 等人(1994)Acta.Physiol Plant.16:225-230 ；Christou, P.(1994)Agr0.Food.1nd.Hi Tech.5:17-27 ；Eapen 等人(1994)Plant Cell Rep.13:582-586 ；Hartman 等人(1994)Bio-Technologyl2:919923 ;Ritala 等人(1994)Plant.Mol.Biol.24:317-325 ；和Wan, Y.C.和 Lemaux’P.G.(1994)Plant Physiol.104:3748。
[0116]本發(fā)明的某些方法包括將多核苷酸構(gòu)建體導(dǎo)入植物中。術(shù)語(yǔ)“導(dǎo)入”意指將多核苷酸構(gòu)建體以這樣的方式呈遞至植物中，從而該構(gòu)建體進(jìn)入植物細(xì)胞的內(nèi)部。本發(fā)明的方法不依賴于將多核苷酸構(gòu)建體導(dǎo)入植物中的特定方法，只要該多核苷酸構(gòu)建體進(jìn)入植物的至少一個(gè)細(xì)胞的內(nèi)部即可。用于將多核苷酸構(gòu)建體導(dǎo)入植物的方法是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化方法、瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法和病毒介導(dǎo)的方法。
[0117]術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化”意指導(dǎo)入植物的多核苷酸構(gòu)建體整合到該植物的基因組中并且能夠由其后代繼承。術(shù)語(yǔ)“瞬時(shí)轉(zhuǎn)染”意指導(dǎo)入植物的多核苷酸構(gòu)建體沒有整合到該植物的基因組中。
[0118]為轉(zhuǎn)化植物和植物細(xì)胞，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將本發(fā)明的核苷酸序列插入本領(lǐng)域已知的適于在植物或植物細(xì)胞中表達(dá)該核苷酸序列的任何載體。載體的選擇取決于優(yōu)選的轉(zhuǎn)化技術(shù)和待轉(zhuǎn)化的靶標(biāo)植物物種。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，AHASL核苷酸序列與已知用于植物細(xì)胞中高水平表達(dá)的植物啟動(dòng)子有效連接，并且隨后將該構(gòu)建體導(dǎo)入易感于咪唑啉酮或磺酰脲除草劑的植物，并再生出轉(zhuǎn)化的植物。經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物耐受對(duì)咪唑啉酮或磺酰脲除草劑下述水平的暴露，所述的咪唑啉酮或磺酰脲除草劑水平會(huì)殺死或嚴(yán)重傷害非轉(zhuǎn)化的植物。這種方法可以應(yīng)用于任意植物物種；然而，當(dāng)應(yīng)用于作物植物時(shí)，它是最有益處的。
[0119]用于構(gòu)建植物表達(dá)盒和將外來(lái)核酸導(dǎo)入植物的方法學(xué)通常是本領(lǐng)域已知的并且已經(jīng)在之前描述過(guò)。例如，外源DNA可以使用瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒載體導(dǎo)入植物中?；谵r(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。農(nóng)桿菌菌株(例如，根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)或發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes))包含在用農(nóng)桿菌感染后轉(zhuǎn)移至植物的質(zhì)粒(Ti或Ri質(zhì)粒)和T-DNA元件。T-DNA(轉(zhuǎn)移的DNA)整合至植物細(xì)胞的基因組中。該T-DNA可以位于R1-或T1-質(zhì)粒上或分別包含在所謂二元載體中。用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法例如在Horsch RB等人(1985) Science225:1229f中描述。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化可以在雙子葉植物和單子葉植物中使用。在White FF, Vectors for GeneTransfer in Higher Plants ?’第 I 卷,Engineering and Utilization, S.D.Kung 和 R.Wu編著,Academic Press, 1993,第 15-38 頁(yè)；Jenes B 等人(1993) Techniques for GeneTransfer,在:Transgenic Plants,第 I 卷,Engineering and Utilization, S.D.Kung和 R.Wu 編著,Academic Press,第 128-143 頁(yè)；Potrykus (1991) Annu Rev Plant PhysiolPlant Molec Biol42:205-225中描述了通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物。用于外源DNA遞送的其它方法包括使用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、電穿孔法、顯微注射須法(whisker)和用于直接DNA攝取的生物射彈法或微粒轟擊法。此類方法是本領(lǐng)域已知的。(授予Vasil等人的美國(guó)專利號(hào) 5，405，765 ；Bilang 等人(1991)GenelOO:247-250 ；Scheid 等人(1991)Μο1.Gen.Genet., 228:104-112 ；Guerche 等人(1987)Plant Science52:111-116 ；Neuhause 等人(1987)Theor.Appl Genet.75:30-36 ；Klein 等人(1987)Nature327:70-73 ；Howell 等人(1980)Science208:1265 ;Horsch 等人(1985)Science227:1229-1231;DeBlock 等人
(1989)Plant Physiology91:694-701 ；Methods for Plant Molecular Biology(ffeissbach和 Weissbach 編著)Academic Press, Inc.(1988)以及 Methods in Plant MolecularBiology (Schuler 和 Zielinski 編著)Academic Press, Inc.(1989))。轉(zhuǎn)化方法取決于待轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、所用載體的穩(wěn)定性、基因產(chǎn)物的表達(dá)水平和其它參數(shù)。
[0120]將核苷酸序列導(dǎo)入植物細(xì)胞并且隨后插入植物基因組中的其它合適方法包括如 Crossway 等人(1986), Biotechniques4:320-334 所描述的顯微注射法、如 Riggs 等人(1986) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA83:5602-5606 所描述的電穿孔法、如 Townsend 等人(美國(guó)專利號(hào)5，563，055)和Zhao等人(美國(guó)專利號(hào)5，981，840)所描述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法、如Paszkowski等人(1984)EMBO J.3:2717-2722所描述的直接基因轉(zhuǎn)移法和在例如Sanford等人(美國(guó)專利號(hào)4，945，050)、Tomes等人(美國(guó)專利號(hào)5，879，918)、Tomes等人(美國(guó)專利號(hào)5，886，244)、Bidney等人(美國(guó)專利號(hào)5，932，782)、在PlantCell, Tissue, and Organ Culture:Fundamental Methods, Gamborg 和 Phillips 編著(Springer-Verlag, Berlin)中Tomes等人(1995) “通過(guò)微粒轟擊法將DNA直接轉(zhuǎn)移至完整植物細(xì)胞中(Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via MicroprojectileBombardment) ” ；McCabe 等人(1988) Biotechnology6:923-926)中所描述的射彈粒子加速法；以及 Lecl 轉(zhuǎn)化法(W000/28058)。也見，Weissinger 等人(1988) Ann.Rev.Genet.22:421-477 ;Sanford等人(1987) Particulate Science and Technology5:27-37 (洋蔥)；Christou 等人(1988) Plant Physiol.87:671-674 (大豆)；McCabe 等人(1988)Bio/Technology6:923-926 (大豆)；Finer 和 McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P: 175-182(大豆)；Singh 等人(1998) Theor.Appl.Genet.96:319-324 (大豆)；Datta 等人(1990) Biotechnology8:736-740 (稻)；Klein 等人(1988) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:4305-4309(玉米)；Klein 等人(1988)Biotechnology6:559-563 (玉米)；Tomes,美國(guó)專利號(hào) 5，240，855 ；Buising 等人，美國(guó)專利號(hào) 5，322，783 和 5，324，646 ；在 Plant Cell, Tissue,and Organ Culture: Fundamental Methods, Gamborg 編著(Springer-Verlag, Berlin)中Tomes等人(1995) “通過(guò)微粒轟擊法將DNA直接轉(zhuǎn)移至完整植物細(xì)胞中(Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via MicroprojectileBombardment)” (玉米);Klein 等(1988) Plant Physiol.91:440-444 (玉米)；Fromm 等人
(1990)Biotechnology8:833-839 (玉米)；Hooykaas-Van Slogteren 等人(1984), Nature (London) 311:763-764 ;Bowen 等人，美國(guó)專利號(hào) 5，736，369 (谷類)；Bytebier 等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA84:5345-5349 (百合科(Liliaceae)) ；De Wet 等人(1985)在The Experimental Manipulation of Ovule Tissues,編者 Chapman 等人,Longman, NY,第197-209 頁(yè)中(花粉);Kaeppler 等人(1990)Plant Cell Reports9:415-418 和 Kaeppler等人(1992) Theor.Appl.Genet.84:560-566 (須(whisker)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)；D’Halluin 等
(1992)Plant Cell4:1495-1505 (電穿孔)；Li 等人(1993)Plant Cell Reportsl2:250-255以及 Christou 和 Ford (1995) Annals of Botany75:407-413 (稻)；0s joda 等人(1996)Nature Biotechnology 14:745-750 (通過(guò)根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的玉米);全部文獻(xiàn)在本文中引用作為參考。
[0121] 本發(fā)明的多核苷酸可以通過(guò)使植物與病毒或病毒核酸接觸而導(dǎo)入植物中。通常，此類方法包括將本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體摻入病毒DNA或RNA分子中。認(rèn)識(shí)到本發(fā)明的AHASL蛋白最初可以作為病毒多蛋白的一部分被合成，隨后可通過(guò)體內(nèi)或體外的蛋白水解進(jìn)行加工以產(chǎn)生所需的重組蛋白。另外，認(rèn)識(shí)到本發(fā)明的啟動(dòng)子還包括用于通過(guò)病毒RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。用于將多核苷酸構(gòu)建體(包括病毒DNA或RNA分子)導(dǎo)入植物中并且在其中表達(dá)所編碼蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域已知的。見，例如，美國(guó)專利號(hào)5，889，191、5，889，190,5, 866，785,5, 589，367和5，316，931，所述文獻(xiàn)在本文引用作為參考。
[0122]已經(jīng)被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以根據(jù)常規(guī)方法培育成植物。見，例如McCormick等人
(1986)Plant Cell R印orts5:81-84。這些植物隨后可以加以培育，并且與相同的轉(zhuǎn)化株系或不同株系授粉，并且鑒定具有所需表型特征組成型表達(dá)的所得雜交種。可以培育兩個(gè)或多個(gè)世代以確保所需表型特征的表達(dá)是穩(wěn)定維持和遺傳的，并且隨后收獲種子以確保已經(jīng)實(shí)現(xiàn)所需表型特征的表達(dá)。以這種方式，本發(fā)明提供了具有本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體(例如本發(fā)明的表達(dá)盒)穩(wěn)定摻入其基因組的經(jīng)轉(zhuǎn)化種子(也稱作“轉(zhuǎn)基因種子”)。
[0123]本發(fā)明可以用于轉(zhuǎn)化任何植物物種，包括但不限于單子葉植物和雙子葉植物。目的植物物種的實(shí)例包括但不限于谷物或玉米(Zea mays)、蕓苔屬物種(Brassica sp.)(例如歐洲油菜(B.napus)、蕪青(B.rapa)、芥菜(B.juncea)),尤其是可作為種子油來(lái)源的蕓苔屬物種，苜猜(Medicago sativa)、稻、黑麥(Secale cereale)、高粱(雙色蜀黍(Sorghumbicolor)、高梁(Sorghum vulgare))、粟(例如御谷(Pennisetum glaucum)、稷(Panicummiliaceum)、谷子(Setaria italica)、龍爪稷(Eleusine coracana))、向日葵(Helianthusannuus)、紅花(Carthamus tinctorius)、小麥(普通小麥(Triticum aestivum)、硬粒小麥(T.Turgidum ssp.durum))、大豆(Glycine max)、煙草(Nicotiana tabacum)、馬鈴薯(Solanum tuberosum)、落花生(Arachis hypogaea)、棉(海島棉(Gossypium barbadense)、陸地棉(Gossypium hirsutum))、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡屬物種(Coffea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、鳳梨(Ananas comosus)、柑桔屬物種(Citrus spp.)、可可樹(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、色蕉屬物種(Musaspp.)、鱷梨(Persea americana)、無(wú)花果(Ficus casica)、番石槽(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、油撤攬(Olea europaea)、番木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardiumoccidentale)、全緣葉澳洲堅(jiān)果(Macadamia integrifolia)、扁桃(Prunus amygdalus)、甜菜(Beta vulgaris)、甘鹿屬物種(Saccharum spp.)、燕麥、大麥、蔬菜、觀賞植物和松柏類植物。優(yōu)選地，本發(fā)明的植物是作物植物(例如，向日葵、蕓苔屬物種、棉屬植物、甜菜、大豆、落花生、苜蓿、紅花、煙草、谷物、稻、小麥、黑麥、大麥、黑小麥、高粱、谷子等)。
[0124]本發(fā)明的植物是除草劑抗性植物并且因此用于涉及應(yīng)用除草劑的雜草控制的方法中。因此，本發(fā)明還提供控制本發(fā)明除草劑抗性植物附近的雜草的方法。該方法包括施加有效量的除草劑至雜草和除草劑抗性植物，其中與野生型植物相比，所述植物具有針對(duì)至少一種AHAS抑制型除草劑、尤其咪唑啉酮或磺酰脲除草劑的提高抗性。在控制雜草的此種方法中，本發(fā)明的除草劑抗性植物優(yōu)選地是作物植物，包括但不限于向日葵、苜蓿、蕓苔屬物種、大豆、棉屬植物、紅花、落花生、煙草、番茄、馬鈴薯、小麥、稻、玉米、高粱、大麥、黑麥、谷子和高粱。
[0125]通過(guò)提供具有針對(duì)除草劑、尤其咪唑啉酮或磺酰脲除草劑的提高抗性的植物，類型眾多的制劑可以用于保 護(hù)植物免受雜草影響，從而增強(qiáng)植物生長(zhǎng)并且降低對(duì)營(yíng)養(yǎng)的競(jìng)爭(zhēng)。除草劑本身可以用于本文中所述植物周圍的區(qū)域內(nèi)出苗前、出苗后、播種前和播種時(shí)控制雜草或可以使用含有其他添加劑的咪唑啉酮除草劑制劑。除草劑也可以用作種子處理。咪唑啉酮或磺酰脲除草制劑中存在的添加劑包括其他除草劑、去污劑、佐藥、鋪展劑、粘合劑、穩(wěn)定劑或其他等。除草劑制劑可以是濕式或干式制品并且可以包括但不限于懸浮散劑(flowable powder)、乳油(emulsifiabIe concentrate)和液態(tài)母液(liquid concentrate)?？梢愿鶕?jù)常規(guī)方法施加除草劑和除草劑制劑，例如通過(guò)噴灑、灌溉、灑粉等。
[0126]本發(fā)明提供非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因植物和種子，其具有針對(duì)至少一種除草劑、特別是AHAS抑制型除草劑、更特別地是針對(duì)咪唑啉酮和磺酰脲除草劑、最特別地是針對(duì)咪唑啉酮除草劑的提高耐受性。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的植物和種子顯示比僅包含一種AHASL單一突變多肽的相似植物更高的除草劑耐受水平。本發(fā)明的此類植物和種子用在控制雜草的改良方法中，所述的改良方法允許以有效量施加除草劑至雜草和除草劑抗性植物，其中所述的有效量包含比可以與僅包含一種AHASL單一突變多肽的相似植物一起使用的更高濃度或比率。因此，與現(xiàn)有方法相比時(shí)，所述改良方法提供優(yōu)異的雜草控制，其中所述的現(xiàn)有方法涉及僅包含一種AHASL單一突變多肽和應(yīng)用較低的除草劑濃度或比率。
[0127]本發(fā)明提供了包含編碼AHASL雙重或三重突變多肽的多核苷酸的除草劑抗性植物和包含編碼AHASL單一突變多肽的兩種或多種多核苷酸的除草劑抗性植物。本發(fā)明的這些除草劑抗性植物在通過(guò)包括有性繁殖在內(nèi)的常規(guī)植物育種法產(chǎn)生除草劑抗性植物的方法中使用。所述方法包括將作為本發(fā)明除草劑抗性植物的第一植物與不抵抗該除草劑的第二植物雜交。第二植物可以是與所述第一植物雜交時(shí)，能夠產(chǎn)生有活力的后代植物(即種子)的任意植物。通常，但非必需地，第一植物和第二植物屬于相同的物種。所述方法可以任選地包括選擇這樣的后代植物，其包含編碼AHASL突變多肽的多核苷酸或編碼所述第一植物的AHASL單一突變多肽的兩種或多種多核苷酸。本發(fā)明的方法還可以包括第一次雜交的后代植物與下述植物回交的一個(gè)或多個(gè)世代，所述的植物具有與第一或第二植物相同的品系或基因型。備選地，第一次雜交或任意后續(xù)雜交的子代可以與第三植物雜交，其中所述的第三植物具有不同于第一或第二植物的不同品系或基因型。
[0128]包含編碼AHASL雙重或三重突變多肽的多核苷酸的本發(fā)明除草劑抗性植物和包含編碼AHASL單一突變多肽的兩種或多種多核苷酸的除草劑抗性植物也在通過(guò)包括有性繁殖在內(nèi)的常規(guī)植物育種法提高植物的除草劑抗性的方法中使用。所述方法包括將作為本發(fā)明除草劑抗性植物的第一植物與第二植物雜交，其中所述的第二植物可以抵抗或可以不抵抗與第一植物相同的除草劑，或可以抵抗與第一植物不同的除草劑。第二植物可以是與所述第一植物雜交時(shí)，能夠產(chǎn)生有活力的后代植物(即種子)的任意植物。通常，但非必需地，第一植物和第二植物屬于相同的物種。所述方法可以任選地包括選擇這樣的后代植物，其包含編碼所述第一植物的AHASL突變多肽的多核苷酸或編碼AHASL單一突變多肽的兩種或多種多核苷酸和所述第二植物的除草劑抗性。與第一或第二植物或這兩種植物比較時(shí)，由本發(fā)明的這種方法產(chǎn)生的后代植物具有提高的除草劑抗性。當(dāng)?shù)谝缓偷诙参锏挚共煌某輨r(shí)，所述后代植物會(huì)具有所述第一和第二植物的聯(lián)合除草劑耐受特征。本發(fā)明的方法還可以包括第一次雜交的后代植物與下述植物回交的一個(gè)或多個(gè)世代，所述的植物具有與第一或第二植物相同的品系或基因型。備選地，第一次雜交或任意后續(xù)雜交的子代可以與第三植物雜交 ，其中所述的第三植物具有不同于第一或第二植物的不同品系或基因型。
[0129]本發(fā)明也提供用本發(fā)明的至少一種多核苷酸分子、表達(dá)盒或轉(zhuǎn)化載體所轉(zhuǎn)化的植物、植物器官、植物組織、植物細(xì)胞、種子和非人宿主細(xì)胞。此類轉(zhuǎn)化的植物、植物器官、植物組織、植物細(xì)胞、種子和非人宿主細(xì)胞針對(duì)在這樣的除草劑水平上的至少一種除草劑具有增強(qiáng)的耐受性或抗性，所述的除草劑水平分別殺死非轉(zhuǎn)化的植物、植物組織、植物細(xì)胞或非人宿主細(xì)胞或抑制其生長(zhǎng)。優(yōu)選地，本發(fā)明的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物、植物組織、植物細(xì)胞和種子是擬南芥和作物植物。
[0130]本發(fā)明提供了包括使用至少一種AHAS抑制型除草劑的方法，所述的AHAS抑制型除草劑選自由咪唑啉酮除草劑、磺酰脲除草劑、三唑并嘧啶除草劑、嘧啶基氧基苯甲酸酯除草劑、磺酰氨基-羰基三唑啉酮除草劑、和它們的混合物組成的組。在這些方法中，所述AHAS抑制型除草劑可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任意方法施加，所述方法包括但不限于種子處理、土壤處理和葉處理。
[0131]在施加之前，可以將AHAS抑制型除草劑轉(zhuǎn)化成常用制劑，例如溶液劑、乳劑、混懸劑、粉劑、散劑、糊劑和顆粒劑。使用形式取決于具體的預(yù)期目的；在每種情況下，應(yīng)當(dāng)確保本發(fā)明化合物的精細(xì)和均勻分布。[0132]按照已知方式制備制劑(綜述，見例如US3，060, 084、EP_A707445 (液態(tài)濃縮物)、Browning, ”Agglomeration，，, Chemical Engineering, Dec.4, 1967, 147-48>Perry> s ChemicalEngineer’ s Handbook, 4 版.,McGraw-Hill, New York, 1963,第 8-57 頁(yè)以及下列文獻(xiàn)，W091/13546，US4,172，714，US4,144，050，US3, 920，442，US5, 180，587，US5, 232，701，US5, 20
8,030, GB2, 095, 558, US3, 299, 566, Klingman, Weed Control as a Science, John Wiley andSons, Inc., New York, 1961，Hance等Weed Control Handbook,第8版，Blackwell ScientificPublications, Oxford, 1989 和 Mollet, H., Grubemann, A., Formulation technology, WileyVCH Verlag GmbH, Weinheim(Germany), 2001, 2.D.A.Knowles, Chemistry and Technology ofAgrochemical Formulations, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 1998 (ISBNO-7514-0443-8)，例如通過(guò)用適于配制農(nóng)用化學(xué)品的助劑填充活性化合物，如溶劑和/或載體，(根據(jù)需要)乳化劑、表面活性劑和分散劑、防腐劑、消泡劑、防凍劑，對(duì)于種子處理制劑，還任選地是色料和/或粘合劑和/或膠凝劑。
[0133]合適溶劑的實(shí)例是水、芳香族溶劑(例如Solvesso產(chǎn)品、二甲苯)、石蠟(例如礦物油級(jí)分)、醇(例如甲醇、丁醇、戊醇、芐醇)、酮(例如環(huán)己酮、Y-丁內(nèi)酯)、吡咯烷酮(ΝΜΡ、Ν0Ρ)、乙酸酯(乙二醇二乙酸酯)、二元醇、脂防酸二甲酰胺、脂防酸和脂防酸酯。原則上，也可以使用溶劑混合物。
[0134]合適載體的實(shí)例是研磨的天然礦物(例如高嶺土、粘土、滑石、白堊)和研磨的人工礦物(例如高度分散的硅石、硅酸鹽)。
[0135]合適的乳化劑是非離子和陰離子乳化劑(例如聚氧乙烯脂肪醇醚、烷基磺酸酯和芳基磺酸酯)。
[0136]分散劑的 實(shí)例是亞硫酸化木素廢液和甲基纖維素。
[0137]所用的適宜表面活性劑是木素磺酸、萘磺酸、苯酚磺酸、二丁基萘磺酸的堿金屬鹽、堿土金屬鹽和銨鹽、烷基芳基磺酸鹽、烷基硫酸酯、烷基磺酸酯、脂肪醇硫酸酯、脂防酸和硫酸化脂肪醇乙二醇醚，還是磺酸化萘和萘衍生物與甲醛的縮合物、萘和萘磺酸與酚和甲醛的縮合物、聚氧乙烯辛基酚醚、乙氧基化異辛基酚、辛基酚、壬基酚、烷基酚聚乙二醇醚、三丁基苯基聚乙二醇醚、三硬脂基苯基聚乙二醇醚、烷基芳基聚醚醇、醇和脂肪醇環(huán)氧乙烷縮合物、乙氧基化蓖麻油、聚氧乙烯烷基醚、乙氧基化聚氧丙烯、月桂醇聚乙二醇醚縮醛、山梨醇酯、亞硫酸化木素廢液和甲基纖維素。
[0138]適于制備可直接噴灑的溶液劑、乳劑、糊劑或油分散劑的物質(zhì)是中等至高沸點(diǎn)的礦物油級(jí)分，如煤油或柴油，還是煤焦油和植物或動(dòng)物來(lái)源的油、脂族、環(huán)狀和芳香烴，例如甲苯、二甲苯、石蠟、四氫萘、烷基化萘或它們的衍生物、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、環(huán)己醇、環(huán)己酮、異佛爾酮、高極性溶劑，例如，二甲基亞砜、N-甲基吡咯烷酮或水。
[0139]還可以向制劑添加防凍劑(如甘油、乙二醇、丙二醇)和殺菌劑。
[0140]合適的消泡劑是例如基于硅或硬脂酸鎂的消泡劑。
[0141]合適的防腐劑是例如二氯酌 和節(jié)醇半甲醒(benzyIalcoholhemiformaldehyde)。
[0142]種子處理制劑可以額外地包含粘合劑和任選地包含色料。
[0143]可以添加粘合劑以改善處理后活性物質(zhì)對(duì)種子的黏附。合適的粘合劑是嵌段共聚物Ε0/Ρ0表面活性劑，也可以是聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丁烯、聚異丁烯、聚苯乙烯、聚乙烯胺、聚乙烯酰胺、聚乙烯亞胺(Lupasol?, Polymin?:)、聚醚、聚氨基甲酸酯、聚乙烯乙酸酯、纖基乙酸鈉(tylose)和從這些聚合物衍生的共聚物。
[0144]任選地，可以在制劑中還包含色料。對(duì)于種子處理制劑的合適色料或染料是羅丹明B、C.1.顏料紅112、C.1.溶劑紅1、顏料藍(lán)15:4、顏料藍(lán)15:3、顏料藍(lán)15:2、顏料藍(lán)15: 1、顏料藍(lán)80、顏料黃1、顏料黃13、顏料紅112、顏料紅48:2、顏料紅48:1、顏料紅57:1、顏料紅53: 1、顏料橙43、顏料橙34、顏料橙5、顏料綠36、顏料綠7、顏料白6、顏料棕25、堿性紫10、堿性紫49、酸性紅51、酸性紅52、酸性紅14、酸性藍(lán)9、酸性黃23、堿性紅10、堿性紅108。
[0145]合適膠凝劑的實(shí)例是鹿角菜(Satiagel? )
[0146]散劑、鋪展材料和可灑粉產(chǎn)品可以通過(guò)混合或同時(shí)研磨活性物質(zhì)與固體載體進(jìn)行制備。
[0147]顆粒劑，例如包衣顆粒劑、浸潰顆粒劑和均勻顆粒劑，可以通過(guò)將活性化合物黏合至固體載體上制備。固體載體的實(shí)例是礦物土(mineral earth)如硅膠、娃酸鹽、滑石、高嶺土、鎂質(zhì)粘土、石灰?guī)r、石灰、白堊、紅玄武土(bole)、黃土、粘土、白云石、娃藻土、硫酸鈣、硫酸鎂、氧化鎂、研磨的合成材料、肥料例如硫酸銨、磷酸銨、硝酸銨、尿素，和植物源產(chǎn)物如谷物粗粉、樹皮碎屑(tree bark meal)、木粉填料(wood meal)和堅(jiān)果殼屑(nutshell meal)、纖維素粉以及其他固體載體。
[0148]一般而言，制劑包含0.01至95%重量、優(yōu)選0.1至90%重量的AHAS抑制型除草劑。在這種情況下，以90%至100%重量、優(yōu)選95%至100%重量的純度(根據(jù)NMR譜)使用所述AHAS抑制型除草劑。為了處理種子，可以將相應(yīng)制劑稀釋2-10倍，產(chǎn)生即用型制品中0.01至60%重量、優(yōu)選0.1至40%重量活性化合物的濃度。
[0149]AHAS抑制型除草劑可以以其制劑形式或從制劑形式制備的使用形式使用，例如以可直接噴灑的溶液劑、散劑、混懸劑或分散劑、乳劑、油分散劑、糊劑、可灑粉產(chǎn)品、鋪展材料或顆粒劑形式，通過(guò)噴灑、噴霧、噴粉、鋪展或傾倒方式使用。使用形式完全取決于預(yù)期目的；它們意圖確保在每種情況下，本發(fā)明的AHAS抑制型除草劑物最可能地精細(xì)分布。
[0150]含水的使用形式可以通過(guò)添加水從乳劑濃縮物、糊劑或可濕性散劑(噴灑散劑、油分散劑)制備。為制備乳劑、糊劑或油分散劑，原態(tài)或溶解在油或溶劑中的物質(zhì)可以借助濕潤(rùn)劑、增粘劑、分散劑或乳化劑在水中均化。然而，也可以制備包含活性物質(zhì)、濕潤(rùn)劑、增粘劑、分散劑或乳化劑和(根據(jù)需要)溶劑或油的濃縮物，并且此類濃縮物適合用水稀釋。
[0151]即用型制品中的活性化合物濃度可以在相對(duì)寬的范圍內(nèi)變動(dòng)。通常，它們是從
0.0001至10%重量、優(yōu)選從0.01至1%重量。
[0152]也可以在超低容積方法(ULV)中成功地使用AHAS抑制型除草劑，可以施加包含超過(guò)95%重量活性化合物的制劑或甚至在無(wú)添加劑的情況下施加該活性化合物。
[0153]以下是制劑的實(shí)例:
[0154]1.以水稀釋用于葉施用的產(chǎn)品。為了種子處理目的，此類產(chǎn)品可以在稀釋或不稀釋的情況下施加至種子。
[0155]A)水溶性濃縮物(SL，LS)
[0156]在90重量份的水 或水溶性溶劑中溶解10重量份的AHAS抑制型除草劑。作為備選，添加濕潤(rùn)劑或其他助劑。在用水稀釋后，AHAS抑制型除草劑溶解，因而獲得含10% (w/w)AHAS抑制型除草劑的制劑。
[0157]B)可分散性濃縮物(DC)
[0158]在70重量份的環(huán)己酮中溶解20重量份的AHAS抑制型除草劑，添加10重量份的分散劑(例如聚乙烯吡咯烷酮)。用水稀釋產(chǎn)生分散劑，因而獲得含20% (W/W)AHAS抑制型除草劑的制劑。
[0159]C)可乳化濃縮物(EC)
[0160]在7重量份的二甲苯中溶解15重量份的AHAS抑制型除草劑，添加十二烷基苯磺酸鈣和乙氧基化蓖麻油(在每種情況下5重量份)。用水稀釋產(chǎn)生乳劑，因而獲得含15%(w/w) AHAS抑制型除草劑的制劑。
[0161]D)乳劑(EW、E0、ES)
[0162]在35重量份的二甲苯中溶解25重量份的AHAS抑制型除草劑，添加十二烷基苯磺酸鈣和乙氧基化蓖麻油(在每種情況下5重量份)。借助乳化器(例如Ultraturrax)將這種混合物導(dǎo)入30重量份的水中并制成均質(zhì)乳液。用水稀釋產(chǎn)生乳劑，因而獲得含25% (w/w)AHAS抑制型除草劑的制劑。
[0163]E)混懸劑(SC、OD、FS)
[0164]在攪拌式球磨機(jī)中磨碎20重量份的AHAS抑制型除草劑，添加10重量份的分散劑、濕潤(rùn)劑和70重量份的水或有機(jī)溶劑以產(chǎn)生精細(xì)AHAS抑制型除草劑混懸液。用水稀釋產(chǎn)生AHAS抑制型除草劑的穩(wěn)定混懸劑，因而獲得含20% (w/w) AHAS抑制型除草劑的制劑。
[0165]F)水可分散性顆粒劑和水溶性顆粒劑(WG，SG)
[0166] 細(xì)致研磨50重量份的AHAS抑制型除草劑，添加50重量份的分散劑和濕潤(rùn)劑并且借助技術(shù)設(shè)備(例如擠出機(jī)、噴粉塔、流化床)制成水可分散性顆粒劑或水溶性顆粒劑。用水稀釋產(chǎn)生AHAS抑制型除草劑的穩(wěn)定分散劑或溶液劑，因而獲得含50% (w/w) AHAS抑制型除早劑的制劑。
[0167]G)水可分散性散劑和水溶性散劑(WP、SP、SS、WS)
[0168]在轉(zhuǎn)子-定子磨機(jī)中研磨75重量份的AHAS抑制型除草劑,添加25重量份的分散劑、濕潤(rùn)劑和硅膠。用水稀釋產(chǎn)生AHAS抑制型除草劑的穩(wěn)定分散劑或溶液劑，因而獲得含75% (w/w)AHAS抑制型除草劑的制劑。
[0169]H)凝膠制劑(GF)
[0170]在攪拌式球磨機(jī)中磨碎20重量份的AHAS抑制型除草劑，添加10重量份的分散劑、I重量份的膠凝劑、濕潤(rùn)劑和70重量份的水或有機(jī)溶劑以產(chǎn)生精細(xì)AHAS抑制型除草劑混懸液。用水稀釋產(chǎn)生AHAS抑制型除草劑的穩(wěn)定混懸劑，因而獲得含20% (w/w) AHAS抑制型除草劑的制劑。這種凝膠制劑適合用作種子處理劑。
[0171]2.不作稀釋而用于葉施用的產(chǎn)品。為了種子處理目的，此類產(chǎn)品可以在稀釋的情況下施加至種子。
[0172]A)可灑粉的散劑(DP，DS)
[0173]細(xì)致研磨5重量份的AHAS抑制型除草劑并密切與95重量份精細(xì)分散的高嶺土混合。這產(chǎn)生含有5% (w/w)AHAS抑制型除草劑的可灑粉產(chǎn)品。
[0174]B)顆粒劑(GR、FG、GG、MG)
[0175]細(xì)致研磨0.5重量份的AHAS抑制型除草劑并與95.5重量份載體混合，因而獲得含0.5% (w/w) AHAS抑制型除草劑的制劑?，F(xiàn)有方法是擠出法、噴霧干燥法或流化床法。這產(chǎn)生不稀釋的情況用于葉用途的顆粒劑。
[0176]常規(guī)的種子處理制劑包括例如可流動(dòng)的濃縮劑FS、溶液劑LS，用于干式處理的散劑DS、用于淤漿處理的水可分散性散劑WS、水溶性散劑SS和乳劑ES和EC以及凝膠制劑GF。這些制劑可以在稀釋或不稀釋的情況下施加至種子。在播種前進(jìn)行對(duì)種子的施加，或直接施加在種子上。
[0177]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)S制劑用于種子處理。一般，F(xiàn)S制劑可以包含l_800g/I有效成分、l_200g/l表面活性劑、O至200g/l防凍劑、O至400g/l粘合劑、O至200g/l顏料和至多到I升溶劑，優(yōu)選水。對(duì)于種子處理，用除草劑、優(yōu)選用選自由AHAS抑制型除草劑如酰嘧磺隆、四唑嘧磺隆、芐嘧磺隆、氯嘧磺隆、綠黃隆、醚黃隆、環(huán)丙嘧磺隆、氨苯磺隆、乙氧B密磺隆、唳喃磺隆、氟唳喃磺隆(fIupyrsulfuron)、甲酰氨磺隆、氯吡氯黃隆、唳咪黃隆、碘磺隆、甲基二磺隆、甲磺隆、煙嘧黃隆、環(huán)氧嘧磺隆、氟嘧磺隆、氟磺隆、吡嘧磺隆、玉嘧黃隆、甲嘧磺隆、磺?；锹　⑧琰S隆、醚苯黃隆、苯磺隆、三氟啶磺隆、氟胺磺隆、三氟甲磺隆、咪草酸、甲氧咪草煙、甲滅草煙、滅草煙、滅草喹、咪草煙、氯酯磺草胺、雙氯磺草胺、雙氟磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草唑胺、五氟磺草胺、雙草醚、嘧草醚、丙苯黃隆、氟酮磺隆、嘧啶肟草醚、環(huán)酯草醚、嘧硫草醚和它們的混合物組成的組的除草劑或用包含AHAS抑制型除草劑的制劑處理本發(fā)明除草劑抗性植物的種子。
[0178]術(shù)語(yǔ)“種子處理”包括本領(lǐng)域已知的全部合適的種子處理技術(shù)，如拌種、種子包衣、藥粉拌種、浸種和種子丸化。
[0179]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)變例，本發(fā)明的又一個(gè)主題是通過(guò)施加以下制劑、尤其施加至播種溝來(lái)處理土壤的方法:作為組合物/制劑的含有AHAS抑制型除草劑的顆粒制劑(例如，任選具有一種或多種可農(nóng)業(yè)用的固體或液體載體和/或任選具有一種或多種可農(nóng)用表面活性劑的顆粒制劑)。該方法有利地用在例如谷物、玉米、棉和向日葵的播種床中。
[0180]本發(fā)明也包括用種子處理制劑包衣或隨該種子處理制劑一起包含的種子，所述的種子處理制劑包含選自由酰嘧磺隆、四唑嘧磺隆、芐嘧磺隆、氯嘧磺隆、綠黃隆、醚黃隆、環(huán)丙嘧磺隆、氨苯磺隆、乙氧嘧磺隆、啶嘧磺隆、氟啶嘧磺隆、甲酰氨磺隆、氯吡氯黃隆、啶咪黃隆、碘磺隆、甲基二磺隆、甲磺隆、煙嘧黃隆、環(huán)氧嘧磺隆、氟嘧磺隆、氟磺隆、吡嘧磺隆、玉嘧黃隆、甲嘧磺隆、磺?；锹?、噻黃隆、醚苯黃隆、苯磺隆、三氟啶磺隆、氟胺磺隆、三氟甲磺隆、咪草酸、甲氧咪草煙、甲滅草煙、滅草煙、滅草喹、咪草煙、氯酯磺草胺、雙氯磺草胺、雙氟磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草唑胺、五氟磺草胺、雙草醚、嘧草醚、丙苯黃隆、氟酮磺隆、嘧啶肟草醚、環(huán)酯草醚和嘧硫草醚組成的組中的至少一種AHAS抑制型除草劑。
[0181]術(shù)語(yǔ)“種子”包括種子和全部類型的植物繁殖體，它們包括但不限于有性種子、種子片、吸根、球莖、鱗莖、果實(shí)、塊莖、穎果、插條、插條芽(cut shoot)等并且在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中意指有性種子。
[0182]術(shù)語(yǔ)“用包衣和/或含有”通常指有效成分在施加時(shí)絕大部分位于繁殖產(chǎn)物的表面上，盡管更多或更少的有效成分可以滲透到該繁殖產(chǎn)物中，這取決于施加的方法。當(dāng)(再)栽種所述的繁殖產(chǎn)物時(shí)，它可以吸收此有效成分。
[0183]在植物播種前和植物出苗前通過(guò)噴灑或?yàn)⒎塾诜N子實(shí)施用AHAS抑制型除草劑或用包含AHAS抑制型除草劑的制劑處理種子的應(yīng)用。[0184]在種子的處理中，通過(guò)用有效量的AHAS抑制型除草劑或包含該AHAS抑制型除草劑的制劑處理種子而施加相應(yīng)的制劑。此處，施加率一般是每IOOkg種子0.1g至IOkg有效成分(或有效成分的混合物或所述制劑)，優(yōu)選每IOOkg種子Ig至5kg、尤其每IOOkg種子Ig至2.5kg。對(duì)于具體作物如萵苣，該比率可以更高。
[0185]本發(fā)明提供用于對(duì)付不希望的營(yíng)養(yǎng)體(vegetation)和控制雜草的方法,所述方法包括使本發(fā)明抗性植物的種子在播種前和/或出苗后與AHAS抑制型除草劑接觸。該方法還可以包括播種所述種子，例如在大田的土壤中或在溫室的盆栽介質(zhì)中。該方法特別用于在緊鄰所述種子周圍對(duì)付不希望的營(yíng)養(yǎng)體或控制雜草。
[0186]控制不希望的營(yíng)養(yǎng)體理解為殺死和/或遲滯或抑制雜草的正常生長(zhǎng)。在最廣泛的意義上，將雜草理解為在不受歡迎的地點(diǎn)生長(zhǎng)的所有那些植物。
[0187]本發(fā)明的雜草包括例如雙子葉和單子葉雜草。雙子葉雜草包括但不限于以下雜草屬:白芥屬(Sinapis)、獨(dú)行菜屬(Lepidium)、拉拉藤(Galium)、繁縷屬(Stellaria)、母菊屬(Matricaria)、春黃菊屬(Anthemis)、牛膝菊屬(Galinsoga)、藜屬(Chenopodium)、蕁麻屬(Urtica)、千里光屬(Senecio)、覓屬(Amaranthus)、馬齒覓屬(Portulaca)、蒼耳屬(Xanthium)、旋花屬(Convolvulus)、番薯屬(Ipomoea)、寥屬(Polygonum)、田菁屬(Sesbania)、豚草屬(Ambrosia)、薊屬(Cirsium)、飛廉屬(Carduus)、苦苣菜屬(Sonchus)、爺屬(Solanum)、揮菜屬(R orippa)、節(jié)節(jié)菜屬(Rotala)、母草屬(Lindernia)、野芝麻屬(Lamium)、婆婆納屬(Veronica)、苘麻屬(Abutilon)、三棘果屬(Emex)、曼陀羅屬(Datura)、堇菜屬(Viola)、融瓣花屬(Galeopsis)、S粟屬(Papaver)、矢車菊屬(Centaurea)、車軸草屬(Trifolium)、毛直屬(Ranunculus)和蒲公英屬(Taraxacum)。單子葉雜草包括但不限于以下雜草屬:稗屬(Echinochloa)、狗尾草屬(Setaria)、黍?qū)?Panicum)、馬唐屬(Digitaria)、梯牧草屬(Phleum)、早熟禾屬(Poa)、羊茅屬(Festuca)、糝屬(Eleusine)、臂形草屬(Brachiaria)、黑麥草屬(Lolium)、雀麥屬(Bromus)、燕麥屬(Avena)、莎草屬(Cyperus)、高粱屬(Sorghum)、冰草屬(Agropyron)、狗牙根屬(Cynodon)、雨久花屬(Monochoria)、飄拂草屬(Fimbristyslis)、慈姑屬(Sagittaria)、荸莽屬(Eleocharis)、薦草屬(Scirpus)、雀稗屬(Paspalum)、鴨嘴草屬(Ischaemum)、尖瓣花屬(Sphenoclea)、龍爪茅屬(Dactyloctenium)、剪股穎屬(Agrostis)、看麥娘屬(Alopecurus)和阿披拉草屬(Apera)。
[0188]另外，本發(fā)明的雜草可以包括例如在不希望的位置生長(zhǎng)的作物植物。例如，如果大豆植物田中不希望有玉米植物的話，在主要包含大豆植物的大田中存在的自生玉米植物可以視為一種雜草。
[0189]冠詞“一個(gè)”和“一種”在本文中用來(lái)指該冠詞的一個(gè)或多于一個(gè)(即至少一個(gè))
的語(yǔ)法對(duì)象。例如，“一種要素”意指一種或多種要素。
[0190]如本文中所用，字“包含”或變體如“包含了”或“包含著”將理解為暗示包括所述的要素、整數(shù)或步驟，或成組的要素、整數(shù)或步驟，但是不排除任意其他要素、整數(shù)或步驟或成組的要素、整數(shù)或步驟。
[0191]以說(shuō)明方式且不以限制方式提供以下實(shí)施例。呈現(xiàn)給技術(shù)人員的所例舉方法的任意變體意圖處在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0192]實(shí)施例1:[0193]含有擬南芥屬AHASL突變體基因的載體
[0194]在SEQ ID NO: 34 (AtAHASL)中描述了擬南芥基因組DNA的完整XbaI片段，所述的完整XbaI片段含有附帶一些額外DNA的完整AHAS大亞基基因，其中所述額外DNA包括在5’和3’末端處的XbaI位點(diǎn)。SEQ ID NO: 34的第2484至4496位堿基包括擬南芥屬AHAS大亞基基因第653位絲氨酸至蘇氨酸突變等位基因的編碼序列，包括SEQ ID NO:30中所示的終止密碼子。在SEQ ID NO: 34第2484至5717位堿基中包括的于SEQ ID NO: 33中所示的擬南芥屬AHAS大亞基基因第653位絲氨酸至蘇氨酸突變等位基因的較小基因組片段包括所述編碼序列和3’末端，直至并且包括3’末端XbaI位點(diǎn)，其中為清晰起見，去掉了在AtAHASL的起始密碼子處存在的NcoI位點(diǎn)的頭兩個(gè)堿基。
[0195]編碼全長(zhǎng)擬南芥屬AHASL單一突變體S653N和3’非翻譯區(qū)的DNA片段SEQID NO: 33克隆到pKK233-2中，旨在產(chǎn)生名為AEl的載體以在大腸桿菌中表達(dá)和測(cè)試(PKK233-2，細(xì)菌表達(dá)載體，Pharmacia, GenBank登錄號(hào)X70478)。通過(guò)誘變和標(biāo)準(zhǔn)克隆方法從AEl產(chǎn)生載體AE2至AE9。圖4顯示AEl基礎(chǔ)載體的圖譜，標(biāo)出了突變位置。
[0196]載體APl (圖5)是包括擬南芥DNA的基因組片段(SEQ ID NO: 34)的植物轉(zhuǎn)化載體，所述的基因組片段包括帶有單一 S653N突變的AtAHASL基因。如SEQ ID NO: 34中所示的DNA片段以反向互補(bǔ)方向克隆到APl中。使用標(biāo)準(zhǔn)克隆方法從APl和AE質(zhì)粒產(chǎn)生載體AP2-AP7并且它們僅因圖1中所示的突變而不同。為便于克隆，與AP2-AP5相比，使用不同的片段來(lái)產(chǎn)生AP6和AP7。因而，AP6和AP7比AP1-AP5短47個(gè)堿基對(duì)。這種不同位于質(zhì)粒主鏈中而非所述擬南芥基因組片段內(nèi)。
[0197]如下產(chǎn)生載體AElO至AE24。使用Genemorph II隨機(jī)誘變?cè)噭┖?Stratagene, LaJolla, California) 在誘變性條件下擴(kuò)增野生型擬南芥AHAS大亞基基因，從而產(chǎn)生該基因的隨機(jī)誘變的擴(kuò)增DNA片段。隨后將這種突變DNA克隆回到AE7中，從而將野生型擬南芥大亞基基因(位于AE7的SacII和AgeI單一位點(diǎn)之間)替換為誘變形式。將這種DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株TOPlO中并在LB瓊脂培養(yǎng)基上以獲得大量獨(dú)特轉(zhuǎn)化體的方式選擇，每個(gè)轉(zhuǎn)化體具有獨(dú)立的誘變AHAS基因。將這些菌落刮在一起并從這個(gè)完整初級(jí)文庫(kù)中制備質(zhì)粒DNA。將這種DNA轉(zhuǎn)化到AHAS陰性大腸桿菌中并在含有羧芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上再次選擇。使用棉絨，將源自這個(gè)步驟的質(zhì)粒陽(yáng)性菌落復(fù)制鋪板到不含支鏈氨基酸且含有30-微摩爾咪草煙的基本瓊脂培養(yǎng)基上。那些在這種選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落擁有也耐受咪唑啉酮的功能性擬南芥AHAS突變基因。
[0198]對(duì)每一個(gè)生長(zhǎng)陽(yáng)性菌落測(cè)定擬南芥AHAS大亞基基因的DNA序列。不測(cè)定在選擇性培養(yǎng)基上不賦予生長(zhǎng)的擬南芥AHAS大亞基基因的序列。因?yàn)閷?duì)次級(jí)文庫(kù)進(jìn)行AHAS功能和咪唑啉酮耐受性篩選，故而找到了重復(fù)的相同突變體，如DNA序列分析所確定的那樣。僅對(duì)每個(gè)菌落的一個(gè)克隆繼續(xù)在增加的咪唑啉酮濃度上測(cè)試并歸納入表1中。
[0199]表1
[0200]一 1.一大腸桿菌咪草轉(zhuǎn)基因植物耐受
大腸桿菌擬南齊屬
突變'煙耐受性評(píng)分性:超過(guò)APli"的X
質(zhì)粒' 轉(zhuǎn)化載體*
___二_倍改善(大約)
【權(quán)利要求】
1.重組的或誘變的乙酰羥酸合酶大亞基(AHASL)多核苷酸，其編碼SEQID NO:1或SEQID NO: 2的且在SEQ ID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處具有谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸替換的、或者編碼所述多肽序列的進(jìn)一步突變變體的AHASL多肽。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述編碼的AHASL多肽在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO:2第90位置處具有谷氨酰胺替換。
3.權(quán)利要求1或2的多核苷酸，其中所述多核苷酸是選自十字花科成員、豆科成員和禾本科成員的植物的多核苷酸。
4.權(quán)利要求3的多核苷酸,其中選自十字花科成員的所述植物是擬南芥(Arabidopsisthaliana),選自豆科成員的所述植物是大豆,選自禾本科成員的所述植物是玉米。
5.重組的或誘變的乙酰羥酸合酶大亞基(AHASL)多核苷酸，其編碼SEQID NO:1或SEQID NO:2的氨基酸發(fā)生替換的AHASL多肽、或者編碼所述多肽序列的進(jìn)一步突變變體，具有氨基酸替換的所述多肽選自: a)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的纈氨酸，蘇氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或甲硫氨酸替換；和在SEQ ID NO:1第197位置處或SEQ ID NO: 2第165位置處的絲氨酸，丙氨酸，谷氨酸，亮氨酸，谷氨酰胺，精氨酸，纈氨酸，色氨酸，酪氨酸或異亮氨酸替換； b)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的纈氨酸，蘇氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或甲硫氨酸替換；和在SEQ ID NO:1第205位置處或SEQ ID NO: 2第173位置處的纈氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，精氨酸，蘇氨酸，色氨酸或酪氨酸替換；和
c)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的纈氨酸，蘇氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或甲硫氨酸替換；和在SEQ ID NO:1第574位置處或SEQ ID NO: 2第542位置處的任一氨基酸替換； 其中多核苷酸是選自植物擬南芥、玉米、黑麥、燕麥、黑小麥、稻、大麥、高粱、谷子、甜菜、甘蔗、大豆、落花生、棉屬、油菜籽、卡諾拉油菜、蕓苔屬(Brassica)物種、木薯、甜瓜、南瓜、辣椒、萬(wàn)壽菊、茄科植物、馬鈴薯、甘薯、煙草、茄子、番茄、蠶豆屬(Vicia)物種、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳屬(Salix)物種、油棕、椰子和多年生牧草的多核苷酸。
6.權(quán)利要求5的多核苷酸，其中SEQID NO:1或SEQ ID NO: 2的所述氨基酸發(fā)生替換的AHASL多肽、或者所述多肽序列的進(jìn)一步突變變體具有選自以下的氨基酸替換: a)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的蘇氨酸替換；和在SEQID NO:1第197位置處或SEQ ID NO: 2第165位置處的亮氨酸替換； b)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的蘇氨酸替換；和在SEQID NO:1第205位置處或SEQ ID NO: 2第173位置處的纈氨酸替換；和 c)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的蘇氨酸替換；和在SEQID NO:1第574位置處或SEQ ID NO: 2第542位置處的亮氨酸替換。
7.表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。
8.純化的AHASL蛋白，其由權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的多核苷酸編碼。
9.控制作物植物附近的雜草的方法，包括: i)在田間種植包含權(quán)利要求1 一 4中任一項(xiàng)所述多核苷酸的植物或所述植物的種子，并生長(zhǎng)來(lái)自其的作物植物；和ii)施加所述植物耐受的、有效量的咪唑啉酮除草劑、磺酰脲除草劑、或它們的混合物至田間雜草和至田間作物植物；或者至種植種子的田間， 由此控制所述雜草。
10.控制作物植物附近的雜草的方法，包括: a)在田間種植植物或所述植物的種子，并生長(zhǎng)來(lái)自其的作物植物， i)所述植物包含第一乙酰羥酸合酶大亞基(AHASL)多核苷酸和第二AHASL多核苷酸，所述第一 AHASL多核苷酸編碼SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的具有第一氨基酸替換的或者編碼所述多肽序列的進(jìn)一步突變變體的第一 AHASL多肽，所述第二 AHASL多核苷酸編碼SEQID NO:1或SEQ ID NO: 2的具有第二氨基酸替換的或者編碼所述多肽序列的進(jìn)一步突變變體的第二 AHASL多肽；或者 ii)所述植物包含編碼SEQID NO:1或SEQ ID NO:2的具有所述第一和第二氨基酸替換的或者編碼所述多肽序列的進(jìn)一步突變變體的AHASL多肽的AHASL多核苷酸； 其中所述第一和第二氨基酸替換選自: 1)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的纈氨酸，蘇氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或甲硫氨酸替換；和在SEQ ID NO:1第197位置處或SEQ ID NO: 2第165位置處 的絲氨酸，丙氨酸，谷氨酸，亮氨酸，谷氨酰胺，精氨酸，纈氨酸，色氨酸，酪氨酸或異亮氨酸替換； 2)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的纈氨酸，蘇氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或甲硫氨酸替換；和在SEQ ID NO:1第205位置處或SEQ ID NO: 2第173位置處的纈氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，精氨酸，蘇氨酸，色氨酸或酪氨酸替換；和 3)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的纈氨酸，蘇氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或甲硫氨酸替換；和在SEQ ID NO:1第574位置處或SEQ ID NO: 2第542位置處的任一氨基酸替換； 其中多核苷酸是選自植物擬南芥、玉米、黑麥、燕麥、黑小麥、稻、大麥、高粱、谷子、甜菜、甘蔗、大豆、落花生、棉屬、油菜籽、卡諾拉油菜、蕓苔屬物種、木薯、甜瓜、南瓜、辣椒、萬(wàn)壽菊、茄科植物、馬鈴薯、甘薯、煙草、茄子、番茄、蠶豆屬物種、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳屬物種、油棕、椰子和多年生牧草的多核苷酸；和 b)施加所述植物耐受的、有效量的咪唑啉酮除草劑、磺酰脲除草劑、或它們的混合物至田間雜草和至田間作物植物；或者至種植種子的田間，以控制所述雜草。
11.權(quán)利要求10的方法,其中所述第一和第二氨基酸替換選自: 1)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的蘇氨酸替換；和在SEQID NO:1第197位置處或SEQ ID NO: 2第165位置處的亮氨酸替換； 2)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的蘇氨酸替換；和在SEQID NO:1第205位置處或在SEQ ID NO: 2第173位置處的纈氨酸替換；和 3)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的蘇氨酸替換；和在SEQID NO:1第574位置處或SEQ ID NO: 2第542位置處的亮氨酸替換。
12.權(quán)利要求9至11中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述咪唑啉酮除草劑包含咪草煙、甲滅草煙、甲氧咪草煙和滅草煙中的一種或多種。
13.產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括步驟:a)用包含權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的多核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和 b)從該植物細(xì)胞再生出表達(dá)所述AHASL突變多肽的轉(zhuǎn)基因植物。
14.產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括步驟: a)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞， i)所述表達(dá)載體包含第一乙酰羥酸合酶大亞基(AHASL)多核苷酸和第二AHASL多核苷酸，所述第一 AHASL多核苷酸編碼SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的具有第一氨基酸替換的或者編碼所述多肽序列的進(jìn)一步突變變體的第一 AHASL多肽，所述第二 AHASL多核苷酸編碼SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的具有第二氨基酸替換的或者編碼所述多肽序列的進(jìn)一步突變變體的第二 AHASL多肽；或者 ii)所述表達(dá)載體包含編碼SEQID NO:1或SEQ ID NO: 2的具有所述第一和第二氨基酸替換的或者編碼所述多肽序列的進(jìn)一步突變變體的AHASL多肽的AHASL多核苷酸； 其中所述第一和第二氨基酸替換選自: 1)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的纈氨酸，蘇氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或甲硫氨酸替換；和在SEQ ID NO:1第197位置處或SEQ ID NO: 2第165位置處 的絲氨酸，丙氨酸，谷氨酸，亮氨酸，谷氨酰胺，精氨酸，纈氨酸，色氨酸，酪氨酸或異亮氨酸替換； 2)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的纈氨酸，蘇氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或甲硫氨酸替換；和在SEQ ID NO:1第205位置處或SEQ ID NO: 2第173位置處的纈氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，精氨酸，蘇氨酸，色氨酸或酪氨酸替換；和 3)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的纈氨酸，蘇氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或甲硫氨酸替換；和在SEQ ID NO:1第574位置處或SEQ ID NO: 2第542位置處的任一氨基酸替換； 其中多核苷酸是選自植物擬南芥、玉米、黑麥、燕麥、黑小麥、稻、大麥、高粱、谷子、甜菜、甘蔗、大豆、落花生、棉屬、油菜籽、卡諾拉油菜、蕓苔屬物種、木薯、甜瓜、南瓜、辣椒、萬(wàn)壽菊、茄科植物、馬鈴薯、甘薯、煙草、茄子、番茄、蠶豆屬物種、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳屬物種、油棕、椰子和多年生牧草的多核苷酸；和 b)從該植物細(xì)胞再生出表達(dá)所述AHASL多肽的轉(zhuǎn)基因植物。
15.權(quán)利要求14的方法,其中所述第一和第二氨基酸替換選自: 1)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的蘇氨酸替換；和在SEQID NO:1第197位置處或SEQ ID NO: 2第165位置處的亮氨酸替換； 2)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的蘇氨酸替換；和在SEQID NO:1第205位置處或在SEQ ID NO: 2第173位置處的纈氨酸替換；和 3)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的蘇氨酸替換；和在SEQID NO:1第574位置處或SEQ ID NO: 2第542位置處的亮氨酸替換。
16.鑒定或選擇植物細(xì)胞、植物組織、植物或其部分的方法，包括: a)提供包含權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的多核苷酸的植物細(xì)胞、植物組織、植物或其部分； b)使所述植物細(xì)胞、植物組織、植物或其部分與至少一種AHAS抑制性化合物接觸；和 c)確定所述植物細(xì)胞、植物組織、植物或其部分是否受所述AHAS抑制性化合物影響；由此鑒定或選擇植物細(xì)胞、植物組織、植物或其部分。
17.鑒定或選擇植物細(xì)胞、植物組織、植物或其部分的方法，包括: a)提供植物細(xì)胞、植物組織、植物或其部分， i)所述植物細(xì)胞、植物組織、植物或其部分包含第一乙酰羥酸合酶大亞基(AHASL)多核苷酸和第二 AHASL多核苷酸，所述第一 AHASL多核苷酸編碼SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的具有第一氨基酸替換的或者編碼所述多肽序列的進(jìn)一步突變變體的第一 AHASL多肽，所述第二 AHASL多核苷酸編碼SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的具有第二氨基酸替換的或者編碼所述多肽序列的進(jìn)一步突變變體的第二 AHASL多肽；或者 ii)所述植物細(xì)胞、植物組織、植物或其部分包含編碼SEQID NO:1或SEQ ID NO: 2的具有所述第一和第二氨基酸替換的或者編碼所述多肽序列的進(jìn)一步突變變體的AHASL多肽的AHASL多核苷酸； 其中所述第一和第二氨基酸替換選自: 1)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的纈氨酸，蘇氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或甲硫氨酸替換；和在SEQ ID NO:1第197位置處或SEQ ID NO: 2第165位置處的絲氨酸，丙氨酸，谷氨酸，亮氨酸，谷氨酰胺，精氨酸，纈氨酸，色氨酸，酪氨酸或異亮氨酸替換； 2)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的纈氨酸，蘇氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或甲硫氨酸 替換；和在SEQ ID NO:1第205位置處或SEQ ID NO: 2第173位置處的纈氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，精氨酸，蘇氨酸，色氨酸或酪氨酸替換；和 3)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的纈氨酸，蘇氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或甲硫氨酸替換；和在SEQ ID NO:1第574位置處或SEQ ID NO: 2第542位置處的任一氨基酸替換； 其中多核苷酸是選自植物擬南芥、玉米、黑麥、燕麥、黑小麥、稻、大麥、高粱、谷子、甜菜、甘蔗、大豆、落花生、棉屬、油菜籽、卡諾拉油菜、蕓苔屬物種、木薯、甜瓜、南瓜、辣椒、萬(wàn)壽菊、茄科植物、馬鈴薯、甘薯、煙草、茄子、番茄、蠶豆屬物種、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳屬物種、油棕、椰子和多年生牧草的多核苷酸； b)使所述植物細(xì)胞、植物組織、植物或其部分與至少一種AHAS抑制性化合物接觸；和 c)確定所述植物細(xì)胞、植物組織、植物或其部分是否受所述AHAS抑制性化合物影響； 由此鑒定或選擇植物細(xì)胞、植物組織、植物或其部分。
18.權(quán)利要求17的方法,其中所述第一和第二氨基酸替換選自: 1)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的蘇氨酸替換，和在SEQ IDNO:1第197位置處或SEQ ID NO: 2第165位置處的亮氨酸替換； 2)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的蘇氨酸替換，和在SEQ IDNO:1第205位置處或在SEQ ID NO: 2第173位置處的纈氨酸替換；和 3)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的蘇氨酸替換，和在SEQ IDNO:1第574位置處或SEQ ID NO: 2第542位置處的亮氨酸替換。
19.權(quán)利要求16至18中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述AHAS抑制性化合物包含咪唑啉酮除草劑、磺酰脲除草劑、三唑并嘧啶除草劑、和嘧啶基氧基苯甲酸酯除草劑中的一種或多種。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述AHAS抑制性化合物包含咪唑啉酮除草劑。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述咪唑啉酮除草劑包含咪草煙、甲滅草煙、甲氧咪草煙、滅草煙中的一種或多種。
22.用于產(chǎn)生除草劑抗性植物的方法，包括將第一植物與第二植物雜交，其中所述第一植物是抵抗除草劑的，包含權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。
23.用于產(chǎn)生除草劑抗性植物的方法，包括將第一植物與第二植物雜交，所述第一植物是抵抗除草劑的，其中 i)所述第一植物包含第一乙酰羥酸合酶大亞基(AHASL)多核苷酸和第二AHASL多核苷酸，所述第一 AHASL多核苷酸編碼SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的具有第一氨基酸替換的或者編碼所述多肽序列的進(jìn)一步突變變體的第一 AHASL多肽，所述第二 AHASL多核苷酸編碼SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的具有第二氨基酸替換的或者編碼所述多肽序列的進(jìn)一步突變變體的第二 AHASL多肽；或者 ii)所述第一植物包含編碼SEQID NO:1或SEQ ID NO: 2的具有所述第一和第二氨基酸替換的或者編碼所述多肽序列的進(jìn)一步突變變體的AHASL多肽的AHASL多核苷酸； 其中所述第一和第二氨基酸替換選自: 1)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的纈氨酸，蘇氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或甲硫氨酸替換；和在SEQ ID NO:1第197位置處或SEQ ID NO: 2第165位置處的絲氨酸，丙氨酸，谷氨酸，亮氨酸，谷氨酰胺，精氨酸，纈氨酸，色氨酸，酪氨酸或異亮氨酸替換； 2)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的纈氨酸，蘇氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或甲硫氨酸替換；和在SEQ ID NO:1第205位置處或SEQ ID NO: 2第173位置處的纈氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，精氨酸，蘇氨酸，色氨酸或酪氨酸替換；和 3)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的纈氨酸，蘇氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或甲硫氨酸替換；和在SEQ ID NO:1第574位置處或SEQ ID NO: 2第542位置處的任一氨基酸替換； 其中多核苷酸是選自植物擬南芥、玉米、黑麥、燕麥、黑小麥、稻、大麥、高粱、谷子、甜菜、甘蔗、大豆、落花生、棉屬、油菜籽、卡諾拉油菜、蕓苔屬物種、木薯、甜瓜、南瓜、辣椒、萬(wàn)壽菊、茄科植物、馬鈴薯、甘薯、煙草、茄子、番茄、蠶豆屬物種、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳屬物種、油棕、椰子和多年生牧草的多核苷酸。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述第一和第二氨基酸替換選自: 1)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的蘇氨酸替換，和在SEQ IDNO:1第197位置處或SEQ ID NO: 2第165位置處的亮氨酸替換； 2)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的蘇氨酸替換，和在SEQ IDNO:1第205位置處或在SEQ ID NO: 2第173位置處的纈氨酸替換；和 3)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的蘇氨酸替換，和在SEQ IDNO:1第574位置處或SEQ ID NO: 2第542位置處的亮氨酸替換。
25.權(quán)利要求22至24中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第二植物不抵抗除草劑。
26.權(quán)利要求22至25中任一項(xiàng)所述的方法，還包括選擇抵抗所述除草劑的后代植物。
27.用于對(duì)付不希望的營(yíng)養(yǎng)體的方法，包括使包含權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述多核苷酸的植物的種子在播種之前和/或在種子催芽之后與AHAS抑制型除草劑接觸。
28.用于對(duì)付不希望的營(yíng)養(yǎng)體的方法，包括使植物的種子在播種之前和/或在種子催芽之后與AHAS抑制型除草劑接觸，其中 i)所述植物包含第一乙酰羥酸合酶大亞基(AHASL)多核苷酸和第二AHASL多核苷酸，所述第一 AHASL多核苷酸編碼SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的具有第一氨基酸替換的或者編碼所述多肽序列的進(jìn)一步突變變體的第一 AHASL多肽，所述第二 AHASL多核苷酸編碼SEQID NO:1或SEQ ID NO: 2的具有第二氨基酸替換的或者編碼所述多肽序列的進(jìn)一步突變變體的第二 AHASL多肽；或者 ii)所述植物包含編碼SEQID NO:1或SEQ ID NO: 2的具有所述第一和第二氨基酸替換的或者編碼所述多肽序列的進(jìn)一步突變變體的AHASL多肽的AHASL多核苷酸； 其中所述第一和第二氨基酸替換選自: 1)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的纈氨酸，蘇氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或甲硫氨酸替換；和在SEQ ID NO:1第197位置處或SEQ ID NO: 2第165位置處的絲氨酸，丙氨酸，谷氨酸，亮氨酸，谷氨酰胺，精氨酸，纈氨酸，色氨酸，酪氨酸或異亮氨酸替換； 2)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的纈氨酸，蘇氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或甲硫氨酸替換；和在SEQ ID NO:1第205位置處或SEQ ID NO: 2第173位置處的纈氨酸，半胱氨 酸，天冬氨酸，谷氨酸，精氨酸，蘇氨酸，色氨酸或酪氨酸替換；和
3)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的纈氨酸，蘇氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或甲硫氨酸替換；和在SEQ ID NO:1第574位置處或SEQ ID NO: 2第542位置處的任一氨基酸替換； 其中多核苷酸是選自植物擬南芥、玉米、黑麥、燕麥、黑小麥、稻、大麥、高粱、谷子、甜菜、甘蔗、大豆、落花生、棉屬、油菜籽、卡諾拉油菜、蕓苔屬物種、木薯、甜瓜、南瓜、辣椒、萬(wàn)壽菊、茄科植物、馬鈴薯、甘薯、煙草、茄子、番茄、蠶豆屬物種、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳屬物種、油棕、椰子和多年生牧草的多核苷酸。
29.權(quán)利要求28的方法,其中所述第一和第二氨基酸替換選自: 1)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的蘇氨酸替換，和在SEQ IDNO:1第197位置處或SEQ ID NO: 2第165位置處的亮氨酸替換； 2)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的蘇氨酸替換，和在SEQ IDNO:1第205位置處或在SEQ ID NO: 2第173位置處的纈氨酸替換；和 3)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的蘇氨酸替換，和在SEQ IDNO:1第574位置處或SEQ ID NO: 2第542位置處的亮氨酸替換。
30.權(quán)利要求27至29中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述AHAS抑制性化合物包含咪唑啉酮除草劑、磺酰脲除草劑、三唑并嘧啶除草劑、和嘧啶基氧基苯甲酸酯除草劑中的一種或多種。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述AHAS抑制性化合物包含咪唑啉酮除草劑。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述咪唑啉酮除草劑包含咪草煙、甲滅草煙、甲氧咪草煙、滅草煙中的一種或多種。
33.用于處理種子的方法，包括將種子處理制劑應(yīng)用至種子，其中所述種子包含權(quán)利要求I至4中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。
34.用于處理種子的方法，包括將種子處理制劑應(yīng)用至種子，其中 i)所述種子包含第一乙酰羥酸合酶大亞基(AHASL)多核苷酸和第二AHASL多核苷酸，所述第一 AHASL多核苷酸編碼SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的具有第一氨基酸替換的或者編碼所述多肽序列的進(jìn)一步突變變體的第一 AHASL多肽，所述第二 AHASL多核苷酸編碼SEQID NO:1或SEQ ID NO: 2的具有第二氨基酸替換的或者編碼所述多肽序列的進(jìn)一步突變變體的第二 AHASL多肽；或者 ii)所述種子包含編碼SEQID NO:1或SEQ ID NO: 2的具有所述第一和第二氨基酸替換的或者編碼所述多肽序列的進(jìn)一步突變變體的AHASL多肽的AHASL多核苷酸； 其中所述第一和第二氨基酸替換選自: 1)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的纈氨酸，蘇氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或甲硫氨酸替換；和在SEQ ID NO:1第197位置處或SEQ ID NO: 2第165位置處的絲氨酸，丙氨酸，谷氨酸，亮氨酸，谷氨酰胺，精氨酸，纈氨酸，色氨酸，酪氨酸或異亮氨酸替換； 2)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的纈氨酸，蘇氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或甲硫氨酸替換；和在SEQ ID NO:1第205位置處或SEQ ID NO: 2第173位置處的纈氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，精氨酸，蘇氨酸，色氨酸或酪氨酸替換；和
3)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的纈氨酸，蘇氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或甲硫氨酸替換；和在SEQ ID NO:1第574位置處或SEQ ID NO: 2第542位置處的任一氨基酸替換； 其中多核苷酸是選自植物擬南芥、玉米、黑麥、燕麥、黑小麥、稻、大麥、高粱、谷子、甜菜、甘蔗、大豆、落花生、棉屬、油菜籽、卡諾拉油菜、蕓苔屬物種、木薯、甜瓜、南瓜、辣椒、萬(wàn)壽菊、茄科植物、馬鈴薯、甘薯、煙草、茄子、番茄、蠶豆屬物種、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳屬物種、油棕、椰子和多年生牧草的多核苷酸。
35.權(quán)利要求34的方法,其中所述第一和第二氨基酸替換選自: 1)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的蘇氨酸替換，和在SEQ IDNO:1第197位置處或SEQ ID NO: 2第165位置處的亮氨酸替換； 2)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的蘇氨酸替換，和在SEQ IDNO:1第205位置處或在SEQ ID NO: 2第173位置處的纈氨酸替換；和 3)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的蘇氨酸替換，和在SEQ IDNO:1第574位置處或SEQ ID NO: 2第542位置處的亮氨酸替換。
36.權(quán)利要求33至35中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述種子處理制劑包含咪唑啉酮除草劑、磺酰脲除草劑、三唑并嘧啶除草劑、和嘧啶基氧基苯甲酸酯除草劑中的一種或多種。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述種子處理制劑包含咪唑啉酮除草劑。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述咪唑啉酮除草劑包含咪草煙、甲滅草煙、甲氧咪草煙、滅草煙中的一種或多種。
39.用于鑒定包含權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的多核苷酸的植物的方法，所述方法包括: (A)提供來(lái)自植物的生物材料，(B)實(shí)施PCR或雜交測(cè)試所述生物材料中的AHASL基因，以確定所述生物材料是否包含權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的核酸，和 (C)基于步驟(B)的結(jié)果，鑒定步驟(A)的植物是包含權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的多核苷酸的植物。
40.用于鑒定植物的方法，所述植物包含 i)第一乙酰羥酸合酶大亞基(AHASL)多核苷酸和第二AHASL多核苷酸，所述第一AHASL多核苷酸編碼SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的具有第一氨基酸替換的或者編碼所述多肽序列的進(jìn)一步突變變體的第一 AHASL多肽，所述第二 AHASL多核苷酸編碼SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的具有第二氨基酸替換的或者編碼所述多肽序列的進(jìn)一步突變變體的第二AHASL多肽；或者 ii)編碼SEQID NO:1或SEQ ID NO: 2的具有所述第一和第二氨基酸替換的或者編碼所述多肽序列的進(jìn)一步突變變體的AHASL多肽的AHASL多核苷酸； 其中所述第一和第二氨基酸替換選自: 1)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的纈氨酸，蘇氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或甲硫氨酸替換；和在SEQ ID NO:1第197位置處或SEQ ID NO: 2第165位置處的絲氨酸，丙氨酸，谷氨酸，亮氨酸，谷氨酰胺，精氨酸，纈氨酸，色氨酸，酪氨酸或異亮氨酸替換； 2)在SEQID NO:1第12 2位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的纈氨酸，蘇氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或甲硫氨酸替換；和在SEQ ID NO:1第205位置處或SEQ ID NO: 2第173位置處的纈氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，精氨酸，蘇氨酸，色氨酸或酪氨酸替換；和 3)在SEQID NO:1第122位置處或SEQ ID NO: 2第90位置處的纈氨酸，蘇氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或甲硫氨酸替換；和在SEQ ID NO:1第574位置處或SEQ ID NO: 2第542位置處的任一氨基酸替換； 其中多核苷酸是選自植物擬南芥、玉米、黑麥、燕麥、黑小麥、稻、大麥、高粱、谷子、甜菜、甘蔗、大豆、落花生、棉屬、油菜籽、卡諾拉油菜、蕓苔屬物種、木薯、甜瓜、南瓜、辣椒、萬(wàn)壽菊、茄科植物、馬鈴薯、甘薯、煙草、茄子、番茄、蠶豆屬物種、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳屬物種、油棕、椰子和多年生牧草的多核苷酸； 所述方法包括: (A)提供來(lái)自植物的生物材料， (B)實(shí)施PCR或雜交測(cè)試所述生物材料中的AHASL基因，以確定所述生物材料是否包含所述AHASL多核苷酸，和 (C)基于步驟(B)的結(jié)果，鑒定步驟(A)的植物是包含所述AHASL多核苷酸的植物。
41.權(quán)利要求39或40的方法，其中所述生物材料是植物種子。
【文檔編號(hào)】C12Q1/527GK104017816SQ201410165607
【公開日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2008年4月3日 優(yōu)先權(quán)日:2007年4月4日
【發(fā)明者】J·A·麥克爾利文, B·辛格 申請(qǐng)人:巴斯福植物科學(xué)有限公司