一種不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉混合菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉混合菌株。該混合菌株由黃曲霉(Aspergillus?flavus)AF-15和黃曲霉(Aspergillus?flavus)AF-20混合而成；所述黃曲霉(Aspergillus?flavus)AF-15和所述黃曲霉(Aspergillus?flavus)AF-20，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號分別為CGMCC?No.8965和CGMCC?No.8966。實驗證明，本發(fā)明所提供的混合菌株對產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉菌株產(chǎn)毒有抑制作用，且當(dāng)這兩株菌混合在一起時，比單獨使用時對產(chǎn)毒菌的抑制效果好，當(dāng)不產(chǎn)毒菌AF-15、AF-20與產(chǎn)毒菌GD-1的孢子濃度比為5×104:5×104:1×105時，該不產(chǎn)毒混合菌株對產(chǎn)毒菌的抑制產(chǎn)毒率達(dá)到近100％。該菌株對于抑制產(chǎn)毒黃曲霉侵染農(nóng)產(chǎn)品、降低農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素污染具有重要意義。
【專利說明】一種不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉混合菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)產(chǎn)品安全領(lǐng)域，涉及一種不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉混合菌株，以及該菌株在抑制黃曲霉產(chǎn)毒方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]黃曲霉毒素(Aflatoxins, AFT)屬于真菌毒素，是由黃曲霉(Aspergillus,flavus)、寄生曲霉(A.parasiticus)、集蜂曲霉(A.nonius)和溜曲霉(A.tamarii)產(chǎn)生的具有致畸、致癌性、致突變的次級代謝產(chǎn)物。常常存在于土壤、動植物、各種堅果特別是花生和核桃中?，F(xiàn)已分離出AFBp AFB2, AFG1, AFG2, AFM1, AFM2等18種不同結(jié)構(gòu)的黃曲霉毒素，其中最重要的是AFBpAFB2AFGpAFGy其中AFBi的毒性最強(qiáng)，其毒性為氰化鉀的10倍、砒霜的68倍。具有強(qiáng)致癌性，并能引發(fā)家畜疾病，從而產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)損失。1993年黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為第一類致癌物。黃曲霉毒 素主要污染花生等作物，嚴(yán)重影響我國花生及其制品的出口，給我國的出口貿(mào)易帶來了巨大損失。因此，有效防控黃曲霉毒素污染，對于保障我國食品安全和維護(hù)國家經(jīng)濟(jì)利益具有重要意義。
[0003]其中，利用不產(chǎn)毒黃曲霉或寄生曲霉來抑制產(chǎn)毒菌菌群數(shù)量及產(chǎn)毒量是防控黃曲霉毒素污染的重要手段。美國環(huán)境保護(hù)協(xié)會注冊了兩株不產(chǎn)毒的黃曲霉菌株，用于防治棉花和花生黃曲霉毒素污染，并在美國多個州的試驗田中廣泛試用。但是來自不同地區(qū)的不產(chǎn)毒菌株在抑制產(chǎn)毒菌方面有一定的適用范圍，例如非洲篩選獲得的不產(chǎn)毒菌能較好地抑制當(dāng)?shù)攸S曲霉產(chǎn)毒，而美國篩選得到的菌株在抑制非洲產(chǎn)毒黃曲霉產(chǎn)毒方面就沒有很好的效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉混合菌株，以及該菌株在抑制黃曲霉產(chǎn)毒方面的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明所提供的不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉混合菌株，具體由黃曲霉(Aspergillusflavus)AF-15 和黃曲霉(Aspergillus flavus)AF-20 混合而成；
[0006]所述黃曲霉(Aspergillus flavus) AF-15,在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC N0.8965 ；
[0007]所述黃曲霉(Aspergillus flavus) AF-20,在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC N0.8966。
[0008]在所述混合菌株中，所述黃曲霉(Aspergillus flavus)AF-15CGMCC N0.8965和所述黃曲霉(Aspergillus flavus)AF-20CGMCC N0.8966的抱子數(shù)配比具體可為1:1。
[0009]另外，所述黃曲霉(Aspergillus flavus)AF-15CGMCC N0.8965也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0010]所述黃曲霉(Aspergillus flavus)AF-15CGMCC N0.8965有大段基因缺失，缺失黃曲霉毒素合成基因norB、黃曲霉毒素合成基因cypA、黃曲霉毒素合成基因aflT、黃曲霉毒素合成基因pksA、黃曲霉毒素合成基因nor-Ι、黃曲霉毒素合成基因fas_2、黃曲霉毒素合成基因fas-Ι、黃曲霉毒素合成基因aflR、黃曲霉毒素合成基因aflj、黃曲霉毒素合成基因adhA、黃曲霉毒素合成基因estA、黃曲霉毒素合成基因norA。因此,該菌株不能合成黃曲霉毒素。
[0011] 所述黃曲霉(Aspergillus flavus)AF-20CGMCC N0.8966有大段基因缺失，缺失黃曲霉毒素合成基因aflT、黃曲霉毒素合成基因pksA、黃曲霉毒素合成基因nor-Ι、黃曲霉毒素合成基因fas-2、黃曲霉毒素合成基因fas-Ι、黃曲霉毒素合成基因aflR、黃曲霉毒素合成基因aflj、黃曲霉毒素合成基因adhA、黃曲霉毒素合成基因estA、黃曲霉毒素合成基因norA、黃曲霉毒素合成基因ver-Ι、黃曲霉毒素合成基因verA ;因此,該菌株不能合成黃曲霉毒素。
[0012]所述的混合菌株，或所述黃曲霉(Aspergillusflavus)AF-15CGMCC N0.8965,在抑制產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉產(chǎn)毒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0013]本發(fā)明還提供了一種用于抑制產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉產(chǎn)毒的菌劑。
[0014]本發(fā)明所提供的用于抑制產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉產(chǎn)毒的菌劑，它的活性成分具體可為所述混合菌株，或所述黃曲霉(Aspergillus flavus) AF-15CGMCC N0.8965。
[0015]在上述應(yīng)用或菌劑中，各黃曲霉(Aspergillus flavus)均可為分生孢子或/和菌絲體。
[0016]在上述應(yīng)用或菌劑中，所述抑制產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉產(chǎn)毒體現(xiàn)在:使所述產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉的產(chǎn)毒素量降低，具體如使所述產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉在農(nóng)產(chǎn)品中的產(chǎn)毒量降低。
[0017]所述農(nóng)產(chǎn)品可為谷物、油料作物、堅果、香辛料、飼料原料、中草藥和水果等。在本發(fā)明的一個實施例中，所述農(nóng)產(chǎn)品為花生，具體為含水量25% (質(zhì)量百分含量)的花生。在本發(fā)明的另一個實施例中，所述農(nóng)產(chǎn)品為玉米，具體為含水量25% (質(zhì)量百分含量)的玉米。
[0018]在所述混合菌株抑制所述產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉產(chǎn)毒的過程中，所述黃曲霉(Aspergillus flavus)AF-15CGMCC N0.8965、所述黃曲霉(Aspergillus flavus)AF-20CGMCC N0.8966和所述產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉的孢子個數(shù)比為1:1:2。
[0019]具體的，在本發(fā)明中，在抑制所述產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉產(chǎn)毒的過程中，所述黃曲霉(Aspergillus flavus)AF-15CGMCC N0.8965 的抱子、所述黃曲霉(Aspergillus flavus)AF-20CGMCC N0.8966的孢子、所述產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉的孢子和所述花生的配比為5X104個孢子:5X104個孢子:1X105個孢子:10g花生(或玉米)。另外，在抑制所述產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉產(chǎn)毒的過程中，培養(yǎng)條件為30°C，培養(yǎng)14天。
[0020]在所述黃曲霉(Aspergillus flavus)AF-15CGMCC N0.8965抑制所述產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉產(chǎn)毒的過程中，所述黃曲霉(Aspergillus flavus)AF-15CGMCC N0.8965和所述產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉的孢子個數(shù)比為1:1。
[0021]具體的，在本發(fā)明中，在抑制所述產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉產(chǎn)毒的過程中，所述黃曲霉(Aspergillus flavus)AF-15CGMCC N0.8965的孢子、所述產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉的孢子和所述花生的配比為IXlO5個孢子:1X105個孢子:10g花生(或玉米)。另外，在抑制所述產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉產(chǎn)毒的過程中，培養(yǎng)條件為30°C，培養(yǎng)14天。
[0022]在上述應(yīng)用或菌劑中，所述產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉具體可為黃曲霉(Aspergillusflavus)GD-1。
[0023]在上述應(yīng)用或菌劑中，所述不產(chǎn)黃曲霉毒素具體為至少不產(chǎn)黃曲霉毒素B2, G1和G20
[0024]以上所有的所述產(chǎn)毒中的“毒”均指“黃曲霉毒素”，進(jìn)一步為“黃曲霉毒素B1 ”和
/或“黃曲霉毒素B2 ”。
[0025]所述混合菌株，或所述黃曲霉(Aspergillusflavus) AF-15CGMCC N0.8965,在制備所述菌劑中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0026]所述混合菌株，或所述黃曲霉(Aspergillusflavus) AF-15CGMCC N0.8965,在生產(chǎn)分生孢子或/和菌絲體中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0027]本發(fā)明所提供的所述混合菌株，或所述黃曲霉(Aspergillus flavus)AF-15CGMCCN0.8965的菌落形態(tài)與普通黃曲霉相似，但不合成黃曲霉毒素；其不產(chǎn)毒素的機(jī)制是:AF-15缺失12個黃曲 霉毒素生物合成路徑上的基因，AF-20缺失12個黃曲霉毒素生物合成路徑上的基因。
[0028]實驗證明，本發(fā)明所提供的由所述黃曲霉(Aspergillus flavus)AF-15CGMCCN0.8965 和所述黃曲霉(Aspergillus flavus) AF-20CGMCC N0.8966 組成的混合菌株對產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉菌株產(chǎn)毒有抑制作用，且當(dāng)這兩株菌混合在一起時，比單獨使用時對產(chǎn)毒菌的抑制效果好，當(dāng)不產(chǎn)毒菌AF-15、AF-20與產(chǎn)毒菌GD-1的孢子濃度比為5X 104:5X 104:1 X 105時，該不產(chǎn)毒混合菌株對產(chǎn)毒菌的抑制產(chǎn)毒率達(dá)到近100%。該菌株對于抑制產(chǎn)毒黃曲霉侵染農(nóng)產(chǎn)品、降低農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素污染具有重要意義。
[0029]保藏說明
[0030]囷種名稱:黃曲霉
[0031]拉丁名:(Aspergillusflavus)
[0032]菌株編號:AF_15
[0033]保藏機(jī)構(gòu):中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
[0034]保藏機(jī)構(gòu)簡稱:CGMCC
[0035]地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號
[0036]保藏日期:2014年3月25日
[0037]保藏中心登記入冊編號:CGMCC N0.8965
[0038]囷種名稱:黃曲霉
[0039]拉丁名:(Aspergillusflavus)
[0040]菌株編號:AF_20
[0041]保藏機(jī)構(gòu):中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
[0042]保藏機(jī)構(gòu)簡稱:CGMCC
[0043]地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號
[0044]保藏日期:2014年3月25日
[0045]保藏中心登記入冊編號:CGMCC N0.8966
[0046]囷種名稱:黃曲霉[0047]拉丁名:(Aspergillusflavus)
[0048]菌株編號:GZ-17
[0049]保藏機(jī)構(gòu):中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
[0050]保藏機(jī)構(gòu)簡稱:CGMCC
[0051]地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號
[0052]保藏日期:2013年8月21日
[0053]保藏中心登記入冊編號:CGMCC N0.8050
【專利附圖】

【附圖說明】
[0054]圖1為黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜。其中，I為黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品中AFG2,保留時間為8.914min ；2為黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品中AFG1,保留時間為10.092min ;3為黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn) 品中AFB2,保留時間為11.879min ；4為黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品中AFB1,保留時間為13.713min。
[0055]圖2為菌株AF-15的HPLC圖譜。
[0056]圖3為菌株AF-20的HPLC圖譜。
[0057]圖4為黃曲霉菌株AF-15和AF-20毒素合成基因缺失示意圖。空心圓對應(yīng)的基因表不缺失；實心圓對應(yīng)的基因表不不缺失。
[0058]圖5為單獨產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉菌⑶-1在花生培養(yǎng)基上的HPLC圖譜。其中，I和2為目的洗脫峰。
[0059]圖6為單獨產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉菌⑶-1在玉米培養(yǎng)基上的HPLC圖譜。其中，I和2為目的洗脫峰。
[0060]圖7 為 AF-15:AF-20:GD-1 (5X 104:5X 104:1 X 105)在花生培養(yǎng)基上的 HPLC 圖譜。其中，I為目的洗脫峰。
[0061]圖8 為 AF-15:AF-20:GD-1 (5X 104:5X 104:1 X 105)在玉米培養(yǎng)基上的 HPLC 圖譜。其中，I為目的洗脫峰。
【具體實施方式】
[0062]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0063]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0064]產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉菌⑶-1:記載于“張初署.中國四個生態(tài)區(qū)花生土壤中黃曲霉菌分布，產(chǎn)毒特征及遺傳多樣性研究[D].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2013.”一文。
[0065]黃曲霉毒素B1(A6636)J2 (A9887KG1(AOl38)A G2 (AO263)購于 Sigma 公司。
[0066]實施例1、黃曲霉菌株AF-15和AF-20的采集、分離、鑒定
[0067]一、從花生種植土壤中分離黃曲霉菌株AF-15和AF-20
[0068]AF-15和AF-20分別從廣東省和山東省花生種植土壤中用DG18培養(yǎng)基分離黃曲霉菌株。具體操作如下:
[0069]1、土壤樣品菌懸液的制備
[0070]取IOg 土樣,加入90mL0.1 %蛋白胨無菌水(w/v),在室溫震蕩30min,制成KT1菌懸液；再取0.SmLKT1菌懸液加4.5mL0.1 %蛋白胨無菌水，制備出10_2稀釋度的菌懸液；按上述方法制備10_3稀釋度的菌懸液。
[0071]2、菌株的分離與純化
[0072]每個稀釋度取0.1mL菌液，涂布在DG18培養(yǎng)基(配方:酪蛋白胨5.0g，無水葡萄糖10.0g,磷酸二氫鉀1.0g,硫酸鎂0.5g，氯硝胺0.002g,瓊脂15.0g,氯霉素0.lg，用蒸餾水1000mL溶解，再加入200.0g的甘油，混勻，121 °C滅菌。)上，30°C黑暗培養(yǎng)5d，每個稀釋度重復(fù)3次。挑取長有黃色孢子的菌株在DG18培養(yǎng)基上進(jìn)行二次劃線分離，直至得到單個菌落。挑取單個菌落于MEA斜面試管培養(yǎng)基(配方:每升培養(yǎng)基中含有麥芽浸粉30.0g,大豆蛋白胨3.0g，瓊脂15.0g;pH5.8)上，于30°C培養(yǎng)3d后保存于4°C中。將其中兩株菌記為 AF-15 和 AF-20。
[0073]二、菌株AF-15和AF-20的鑒定
[0074]1、形態(tài)學(xué)鑒定
[0075]挑取保存于MEA培養(yǎng)基上的菌株AF-15和AF-20于AFPA培養(yǎng)基(配方:蛋白胨10.0g/L,酵母浸粉20.0g/L,檸檬酸鐵銨0.5g/L，氯硝銨0.002g/L,氯霉素0.lg/L，瓊脂15.0g/L, pH為6.3)上，30°C培養(yǎng)3_5d，可見AFPA培養(yǎng)基背面為亮橘色。
[0076]2、分子鑒定
[0077]通過真菌鈣調(diào)基因序列對菌株AF-15和AF-20進(jìn)行分子鑒定(Rodrigues, P.，Santos, C., Venancio, A., Lima, N., 2011.Species identification of Aspergillus sectionFlavi isolates from Portuguese almonds using phenotypic, including MALD1-TOFI CMS, and molecular approaches.J Appl Microbiollll, 877-892)。黃曲霉基因組鈣調(diào)蛋白PCR擴(kuò)增所用的引物為CLl和CL2A (序列如下)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序為:94°C預(yù)變性5min，I個循環(huán)；94°C變性30s，54°C退火30s，72°C延伸90s，共30個循環(huán)；72°C最后延伸7min。擴(kuò)增后，產(chǎn)物保存于4°C。產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司測序。并在BLAST researches上比對測序結(jié)果(http:"www.ncb1.nlm.nih.gov/)。
[0078]CLl:5，-GARTWCAAGGAGGCCTTCTC-3，；
[0079]CL2A: 5，-TTTTTGCATCATGAGTTGGAC-3，。
[0080]菌株AF-15和AF-20的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測序結(jié)果分別如序列表中序列I和序列2所示。將菌株AF-15和AF-20的鈣調(diào)蛋白基因的測序結(jié)果提交上NCBI上進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)，序列I和序列2與黃曲霉菌NRRL3357和NRRL21882的同源性均為99%。
[0081]經(jīng)過以上形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定，可知菌株AF-15和AF-20為黃曲霉(Aspergillus flavus)。
[0082]3、利用高效液相色譜法檢測菌株AF-15和AF-20是否產(chǎn)黃曲霉毒素
[0083](I)待測樣品制備
[0084]將黃曲霉菌株AF-15和AF-20分別接種到Y(jié)ES培養(yǎng)基(配方:20g酵母提取物/L，150g蔗糖/L，15g瓊脂/L)上，30°C黑暗條件下培養(yǎng)7天。從培養(yǎng)好的平板上挑取3塊瓊脂放入4ml的離心管中，加入1ml的甲醇，用高振蕩器高速震蕩60min，然后用滅過菌的濾紙進(jìn)行過濾，用蒸流水將濾液進(jìn)行稀釋后，再用微纖維濾紙過濾；取IOmL濾液加入到免疫親和柱(華安麥科，HCMO125)中(使黃曲霉毒素掛到柱子上，從而有效去除雜質(zhì))，使液體以2-3ml/min的速度流出；待液體排干后，用蒸餾水或去離子水洗滌2次，每次10mL，流速3-4ml/min ;待液體排干后,上樣ImL甲醇(色譜級)，用樣品瓶接洗脫液，流速lml/min ;洗脫后液體將用0.45 μ m的濾膜過濾，濾液利用HPLC測定黃曲霉毒素的含量。
[0085](2)高效液相色譜法檢測待測樣品
[0086]取Sigma 公司的黃曲霉毒素 B1 (A6636)、B2 (A9887)、G1 (A0138)、G2 (A0263)，自行配制黃曲霉混合標(biāo)準(zhǔn)品，用色譜級甲醇配制成溶液，使其中黃曲霉毒素B1的終濃度為IOng/μ 1、黃曲霉毒素B2的終濃度為5ng/μ 1、黃曲霉毒素G1的終濃度為IOng/μ 1、黃曲霉毒素G2的終濃度為5ng/y I。再取步驟(1)制備的待測樣品，分別按照如下條件進(jìn)行高效液相色譜檢測?？创郎y樣品的色譜圖在與黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品相同的保留時間處是否有色譜峰出現(xiàn)。[0087]其中，高效液相色譜條件為:C18色譜柱(4.6mmX 150mm, 5 μ m);熒光檢測器2475型，激發(fā)波長360nm，發(fā)射波長:440nm;柱溫:30°C ;流動相:以甲醇:7jC (1:1，V:V)為流動相；進(jìn)樣量:20 μ L ;流速:1.0mL/min。
[0088]黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜如圖1所不，從圖1中可以看出，黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品中AFBi的保留時間為13.713min,AFB2的保留時間為11.STgmin7AFG1的保留時間為10.092min, AFG2 的保留時間為 8.914min。
[0089]菌株AF-15的HPLC圖譜如圖2所示，從圖2中可以看出，在與黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的以上四個保留時間處均沒有色譜峰產(chǎn)生。由此可見，菌株AF-15不產(chǎn)黃曲霉毒素。
[0090]菌株AF-20的HPLC圖譜如圖3所示，從圖3中可以看出，在與黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的以上四個保留時間處均沒有色譜峰產(chǎn)生。由此可見，菌株AF-20不產(chǎn)黃曲霉毒素。
[0091]通過以上鑒定結(jié)果，確定步驟二所得的菌株AF-15和AF-20為不產(chǎn)生黃曲霉毒素的黃曲霉(Aspergillus flavus)。并對菌株AF-15和AF-20分別進(jìn)行了保藏,保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏日期為:2014年3年25日，菌株AF-15的保藏號:CGMCC N0.8965 ;菌株 AF-20 的保藏號:CGMCC N0.8966。
[0092]實施例2、黃曲霉(Aspergillus flavus)AF_15和AF-20中黃曲霉毒素合成基因缺失鑒定
[0093]本發(fā)明的發(fā)明人以Genbank登錄號為AY510451黃曲霉的毒素合成基因的序列為參照，設(shè)計了毒素合成相關(guān)基因hypB、hypC、hypD和hypE四對引物，其他基因的引物參考 Perng-Kuang Chang(Chang, P.K., Horn, B.ff.and Dorner, J.ff.(2005)Sequencebreakpoints in the aflatoxin biosynthesis gene cluster and flanking regions innonaflatoxigenic Aspergillus flavus isolates.Fungal Genet Bio42,914 - 923.)。待測的29個基因及其對應(yīng)的引物序列如表1所示。
[0094]表1不同黃曲霉毒素合成基因的引物序列
[0095]
【權(quán)利要求】
1.一種不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉混合菌株，由黃曲霉(Aspergillus flavus)AF-15和黃曲霉(Aspergillus flavus)AF-20 混合而成； 所述黃曲霉(Aspergillus flavus) AF-15,在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC N0.8965 ； 所述黃曲霉(Aspergillus flavus) AF-20,在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC N0.8966。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的混合菌株，其特征在于:所述黃曲霉(Aspergillusflavus)AF-15CGMCC N0.8965 和所述黃曲霉(Aspergillus flavus)AF-20CGMCC N0.8966 的孢子數(shù)配比為1:1。
3.黃曲霉(Aspergillusflavus) AF-15,它在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC N0.8965。
4.權(quán)利要求1或2所述的混合菌株，或權(quán)利要求3所述的黃曲霉(AspergiI Iusflavus) AF-15，在抑制產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉產(chǎn)毒中的應(yīng)用。
5.一種用于抑制產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉產(chǎn)毒的菌劑，它的活性成分為權(quán)利要求1或2所述的混合菌株，或權(quán)利要求3所述的黃曲霉(Aspergillus flavus)AF-15。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，或權(quán)利要求5所述的菌劑，其特征在于:所述抑制產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉產(chǎn)毒體現(xiàn)在:使所述產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉的產(chǎn)毒量降低。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或6所述的應(yīng)用，其特征在于:在所述混合菌株抑制所述產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉產(chǎn)毒的過程中，所述黃曲霉(Aspergillus flavus)AF-15CGMCC N0.8965、所述黃曲霉(Aspergillus flavus)AF-20CGMCC N0.8966和所述產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉的孢子個數(shù)比為1:1:2 ;或 在所述黃曲霉(Aspergillus flavus)AF-15CGMCC N0.8965抑制所述產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉產(chǎn)毒的過程中，所述黃曲霉(Aspergillus flavus)AF-15CGMCC N0.8965和所述產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉的孢子個數(shù)比為1:1。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一所述的應(yīng)用或菌劑，其特征在于:所述產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉為黃曲霉(Aspergillus flavus)GD_l。
9.權(quán)利要求1或2所述的混合菌株，或權(quán)利要求3所述的黃曲霉(AspergiI Iusflavus)AF-15，在制備權(quán)利要求5、6和8中任一所述菌劑中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1或2所述的混合菌株，或權(quán)利要求3所述的黃曲霉(Aspergillusflavus) AF-15,在生產(chǎn)分生孢子或/和菌絲體中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N3/00GK103937686SQ201410165562
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月23日
【發(fā)明者】劉陽, 周露, 魏丹丹, 張初署, 邢福國, 趙月菊, 王龑 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所