用于檢測菊黃東方鲀生長速度的引物對及方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及檢測菊黃東方鲀生長速度的引物對及方法，該引物對由堿基序列為SEQ?ID?NO：1的上游引物和SEQ?ID?NO:2的下游引物組成，提取多個樣品菊黃東方鲀的DNA序列，采用上述引物對作為PCR擴增的引物進行PCR擴增；將擴增產(chǎn)物進行PAGE、染色處理；觀察對比各個樣品的條帶，含有較多條帶的個體是勝正速度快的個體。通過本發(fā)明的引物對和檢測方法，能夠有效的對于不同個體的菊黃東方鲀的生長速度進行篩選，為人工育種提供有效的信息，篩選后能夠得到生長速度塊的個體養(yǎng)殖時間短，節(jié)約了養(yǎng)殖成本。并且其方法簡單、速度快，能夠廣泛的用于各個地域。
【專利說明】用于檢測菊黃東方鈍生長速度的引物對及方法
[【技術(shù)領(lǐng)域】]
[0001]本發(fā)明涉及菊黃東方飩的檢測引物和方法，具體涉及檢測菊黃東方飩生長速度的引物對及方法。
[【背景技術(shù)】]
[0002]菊黃東方飩(Fugu flavidus)俗稱艇巴、乖魚、菊黃、滿天星等,分類上隸屬飩形目(Tetraodontif-ormes)飩科(Tetraodontidae)東方飩屬(Fugu),主要分布于我國黃海、東海和渤海。由于其味道鮮美，營養(yǎng)豐富，頗受歡迎，是一種名貴的養(yǎng)殖種類。在養(yǎng)殖過程中，生長速度快的個體可以縮短養(yǎng)殖時間，提高飼料的利用率，節(jié)約養(yǎng)殖成本，因此培育篩選生長速度快菊黃東方飩是水產(chǎn)養(yǎng)殖者追求的目標(biāo)。目前在菊黃東方飩中，與生長相關(guān)的分子標(biāo)記研究是空白。
[0003]肌肉生長抑制因子(Myostatin，MSTN)最先從小鼠骨骼肌cDNA文庫克隆到，它主要在肌肉組織中大量表達(dá)，屬于TGF-β超級家族。對MSTN基因敲除小鼠地研究表明，突變小鼠的體重比雜合體和野生型小鼠體重增加約30%，其中肌細(xì)胞增生(hyperplasia)和肌纖維肥大(hypertrophy)雙重作用所造成的肌肉肥大是造成體重增加的主要原因，并且這一特性與動物的性別及年齡無關(guān)，而且不影響動物的繁殖能力。因此，MSTN是肌肉生長的一個重要負(fù)調(diào)控主效基因?；罨腗STN與細(xì)胞膜表面受體(活化素受體蛋白II B (ACVR2B)和活化素受體蛋白IB (ACVRB))相結(jié)合，可以激活下游的S媽的2/3和p38MAPK細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑，從而調(diào)節(jié)各組織的生長發(fā)育。
[0004]在《黃顙魚MSTN基因多肽性及其與生長性狀的相關(guān)分析》(朱媛媛等，遺傳，2012年I月34 (I):72-78頁)一文中，披露了 MSTN對黃顙魚生長速度的影響，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)和DNAi技術(shù)抑制斑馬魚的MSTN基因發(fā)現(xiàn)實驗魚的肌肉明顯比正常魚發(fā)達(dá)，因此認(rèn)為該基因在動物肌肉生長發(fā)育中起到重要抑制作用，也可能參與脂肪的生成和調(diào)節(jié)。在魚類中，MSTN mDNA可以在肌肉，眼，腦、腸`、腮、腎、心、脾中發(fā)現(xiàn)，并且在不同的魚種中MSTN還分為兩類，MSTN1、MSTN2(牙鲆肌肉生長抑制素(MSTN)基因克隆，徐建勇、陳松林，水產(chǎn)學(xué)報第32卷第 4 期，2008 年 7 月，497-498 )。
[
【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005]為了彌補現(xiàn)有技術(shù)的空白，提供一種能夠?qū)τ诰拯S東方飩生長速度進行檢測的引物對。
[0006]菊黃東方飩中存在可用于篩選生長相關(guān)的片段，該片段位于菊黃東方飩MSTN2基因3端非翻譯區(qū)域如序列SEQ ID NO:3及附圖1所示。其中框里陰影部分為GT重復(fù)的微衛(wèi)星核心區(qū)域。在菊黃東方飩中存在染色體加倍現(xiàn)象，在擴增過程中，其他拷貝上的片段也會出現(xiàn)擴增現(xiàn)象。
[0007]在上述發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，發(fā)明一種檢測菊黃東方飩生長速度的引物對，該引物對由堿基序列為SEQ ID NO:1的上游引物和SEQ ID NO:2的下游引物組成。[0008]本發(fā)明還包括一種檢測菊黃東方飩生長速度的方法，于由以下步驟組成，
[0009]提取樣品菊黃東方飩的肌肉生長抑制因子的DNA序列，
[0010]采用上述引物對作為PCR擴增的引物對樣品進行PCR擴增；
[0011 ] 將擴增產(chǎn)物進行PAGE、染色處理；
[0012]觀察對比各個樣品的條帶，條帶越多的個體生長速度越快。
[0013]上述方法還具有如下優(yōu)化方案:
[0014]所述的PCR擴增的反應(yīng)體系20 μ L，包括2ul 10 XPCR緩沖液，0.8ul IOmmoI/L的dNTP mix, 0.4 μ mol/L的上游引物，0.4 μ mol/L的下游引物，30ng的樣品菊黃東方飩DNA0
[0015]所述的PCR擴增反應(yīng)條件如下，94°C變性3分鐘，然后94°C變性30秒，55°C復(fù)性30秒，及72°C延伸30秒，42個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。
[0016]通過本發(fā)明的引物對和檢測方法，能夠有效的對于不同個體的菊黃東方飩的生長速度進行篩選，為人工育種提供有效的信息，篩選后能夠得到生長速度塊的個體養(yǎng)殖時間短，節(jié)約了養(yǎng)殖成本。并且其方法簡單、速度快，能夠廣泛的用于各個地域。
[【專利附圖】

【附圖說明】]
[0017]圖1為菊黃東方飩MSTN2基因中的微衛(wèi)星核心區(qū)域示意圖；
[0018]圖2位不同樣品菊黃東方飩的PAGE條帶對比圖。
[【具體實施方式】]`
[0019]下面通過具體實施例結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步說明，下述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定。
[0020]實施例1:選用取自半齡的菊黃東方飩，按照體重體長分成兩組，按常規(guī)方法采用酚氯仿抽提法(參見黃培堂等譯《分子克隆實驗指南》(第三版)，科學(xué)出版社，2002年9月)提取菊黃東方飩DNA，設(shè)計合成一對選擇性擴增引物:
[0021]MSTN2SSR3F1 5 ’-CCTGTTTCTTTGGGACGTTTTGG-3’，
[0022]MSTN2SSR3R1 5’ -GATTCTGTGGGAAGATGCGGT-3’ ；
[0023]對其DNA進行PCR擴增，反應(yīng)體系20 μ L，包括2ul 10XPCR緩沖液，0.8ull0mmol/L的dNTP mix, 0.4 μ mol/L的上游引物,0.4 μ mol/L的下游引物，30ng的樣品菊黃東方飩DNA，反應(yīng)條件如下，94°C變性3分鐘，然后94°C變性30秒，55°C復(fù)性30秒，及72°C延伸30秒，42個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。
[0024]產(chǎn)物經(jīng)6%的變性PAGE電泳，經(jīng)過染色顯色，觀察結(jié)果,操作如下:取等量變性上樣緩沖液加入PCR產(chǎn)物(配方見分子克隆手冊)，99°C變性10分鐘，在尿素變性PAGE (6%)中進行電泳至溴酚藍(lán)跑出PAGE。進行銀染，固定，染色及顯色。如圖2所示，觀察條帶大小，含有187-189bp大小條帶的個體，是生長速度快的個體。
[0025]圖中GT-3表示在序列中GT重復(fù)次數(shù)為3，GT_4表示GT重復(fù)次數(shù)為4次，GT_5表示GT重復(fù)次數(shù)為5次，GT-6表示GT重復(fù)次數(shù)為6次。
[0026]其中GT次數(shù)為3-4次的個體，為生長速度慢的個體,GT重復(fù)次數(shù)在5_6次的為生長速度快的個體。
[0027]養(yǎng)殖戶可以通過該種方法，選擇生長速度快的個體進行養(yǎng)殖，養(yǎng)殖速度快，經(jīng)濟效益高。
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測菊黃東方飩生長速度的引物對，其特征在于由堿基序列為SEQ ID NO:I的上游引物和SEQ ID NO:2的下游引物組成。
2.一種檢測菊黃東方飩生長速度的方法，其特征在于由以下步驟組成， 提取樣品菊黃東方飩的肌肉生長抑制因子的DNA序列， 采用權(quán)利要求1引物對作為PCR擴增的引物對樣品進行PCR擴增； 將擴增產(chǎn)物進行PAGE、染色處理； 觀察對比各個樣品的條帶，條帶越多的個體生長速度越快。
3.如權(quán)利要求2所述的檢測菊黃東方飩生長速度的方法，其特征在于所述的PCR擴增的反應(yīng)體系 20yL，包括 2ul 10 X PCR 緩沖液，0.8ul 10mmol/L 的 dNTP mix, 0.4 μ mol/L 的上游引物，0.4ymol/L的下游引物，30ng的樣品菊黃東方飩DNA。
4.權(quán)利要求2所述的檢測菊黃東方飩生長速度的方法，其特征在于所述的PCR擴增反應(yīng)條件如下，94°C變性3分鐘，然后94°C變性30秒，55°C復(fù)性30秒，及72°C延伸30秒，42個循環(huán)，最后72°C 延伸10分鐘。
【文檔編號】C12N15/11GK103805694SQ201310654636
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2013年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月5日
【發(fā)明者】張之文, 施永海, 張根玉, 張海明, 張中華, 徐嘉波, 鄧平平 申請人:上海市水產(chǎn)研究所