一種野生奧德蘑種類的鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種野生奧德蘑鑒定方法，包括：（1）野外采集；（2）外部形態(tài)鑒定；（3）微觀結(jié)構(gòu)鑒定；（4）分子序列鑒定；（5）綜合鑒定：綜合外部形態(tài)特征、微觀結(jié)構(gòu)和分子序列比對的種類，綜合比較，準(zhǔn)確確定野生奧德蘑的種類。本發(fā)明與常規(guī)形態(tài)學(xué)鑒定相比，具有鑒定準(zhǔn)確性高、定位準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，在我國奧德蘑品種的鑒定中具有代表性。
【專利說明】一種野生奧德蘑種類的鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于野生奧德蘑的鑒定領(lǐng)域，特別涉及一種野生奧德蘑種類的鑒定方法。【背景技術(shù)】
[0002]我國蘑菇鑒定從20世紀(jì)初就已有，但一直處于傳統(tǒng)的外部形態(tài)特征階段，較為原始，且鑒定不準(zhǔn)確 ，很多情況下不能定位到種的水平。隨著顯微鏡在蘑菇鑒定中的應(yīng)用，微觀結(jié)構(gòu)觀察已應(yīng)用于蘑菇的鑒定中。外部形態(tài)和微觀結(jié)構(gòu)的結(jié)合，使蘑菇鑒定準(zhǔn)確度大為提高。但很多情況下并不能準(zhǔn)確區(qū)分開屬內(nèi)種間的差異，特別是兩個(gè)較為相似的屬內(nèi)種類。20世紀(jì)后期，隨著分子水平的發(fā)展，分子序列逐漸在鑒定中有所應(yīng)用，特別是蘑菇基因中較為保守的ITS序列逐漸在蘑菇鑒定中得到重視。蘑菇中，奧德蘑種類是一個(gè)大的類群，而中國的奧德蘑種類占世界的很大一部分。而中國奧德蘑種類的鑒定一直為傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定，而中國為全球生物多樣性最豐富的國家之一，中國發(fā)現(xiàn)的野生奧德蘑種類逐年增加，同時(shí)，奧德蘑種類的人工栽培等近年逐漸在市場中受到重視，如長根奧德蘑等已在市場中出現(xiàn)，并深受好評，因此發(fā)現(xiàn)并鑒定從而進(jìn)行奧德蘑的開發(fā)利用勢在必行。而鑒定不準(zhǔn)確的現(xiàn)狀制約了奧德蘑種類應(yīng)用的發(fā)展。因此探索并發(fā)現(xiàn)新的鑒定奧德蘑種類的方法迫在眉睫。
[0003]面對這種形勢，需要我們進(jìn)一步加快野生奧德蘑種類鑒定技術(shù)的研究，在傳統(tǒng)鑒定研究中引進(jìn)更為有效準(zhǔn)確的野生奧德蘑種類鑒定技術(shù)和方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種野生奧德蘑種類的鑒定方法，通過采用外部形態(tài)特征、顯微結(jié)構(gòu)和分子序列相結(jié)合的新方法對野生奧德蘑種類進(jìn)行鑒定。
[0005]本發(fā)明的一種野生奧德蘑鑒定方法，包括下列步驟:
[0006](I)野外采集
[0007]先對從野外采集的野生奧德蘑子實(shí)體進(jìn)行拍照，拍攝清楚菌蓋、菌柄、菌環(huán)和菌褶等部位以及子實(shí)體周圍的生境；照片拍攝后采集奧德蘑野生子實(shí)體，測量并記錄其外部形態(tài)特征，并進(jìn)行菌種分離；
[0008](2)外部形態(tài)鑒定
[0009]將步驟(1)采集到的野生奧德蘑子實(shí)體的外部形態(tài)特征和現(xiàn)有的奧德蘑子實(shí)體的外部形態(tài)特征進(jìn)行比對，找出相似種類；
[0010](3)微觀結(jié)構(gòu)鑒定
[0011]將步驟(1)得到的奧德蘑野生子實(shí)體進(jìn)行顯微結(jié)構(gòu)觀察，然后將野生奧德蘑與步驟(2)得到的相似種類的奧德蘑的顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對，找到顯微結(jié)構(gòu)相似的種類；
[0012](4)分子序列鑒定
[0013]I) DNA提取:提取總DNA，測定濃度后調(diào)節(jié)至IOOng/μ L備用；
[0014]2)PCR擴(kuò)增:選用真菌通用引物ITSl和ITS4擴(kuò)增奧德蘑核糖體RNA部分18S、ITSU5.8S、ITS2和部分28S的DNA片段；反應(yīng)體系總量20 μ L，包含有Taq酶5U、Mg2+L 5mmol/L、dNTP 各 200 μ mol/L、引物各 1.0X 10-5 μ mol、模版 DNAlOOng ；PCR 反應(yīng)程序94°C預(yù)變性 5min，30 個(gè)循環(huán)中 94°C 50s、51°C 50s,72°C lmin，最后 72°C延伸 lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)觀察后，用回收試劑盒回收擴(kuò)增片段；
[0015]3)PCR測序:經(jīng)ITS擴(kuò)增片段進(jìn)行雙向測序，測序結(jié)果經(jīng)過比對拼接后確定最終序列；
[0016]4) ITS序列分析:將測序好的序列在Genebank中進(jìn)行Blast比對；
[0017](5)綜合鑒定:綜合外部形態(tài)特征、微觀結(jié)構(gòu)和分子序列比對的種類，綜合比較，準(zhǔn)確確定野生奧德蘑的種類。
[0018]將步驟(1)中所采集到的奧德蘑野生子實(shí)體放入固定的器具中以免損壞。
[0019]步驟(1)中所示的測量并記錄其外部形態(tài)特征包括:測量菌蓋直徑、菌柄長度和直徑，與比色卡進(jìn)行比對并記錄菌蓋、菌柄、菌褶顏色及形狀，記錄其味道和氣味。
[0020]步驟(3)中所述的顯微結(jié)構(gòu)觀察的具體操作為:選取步驟(1)得到的奧德蘑野生子實(shí)體的菌褶少許，放入事先配置好的滴定有5%K0H溶液的載玻片上，待菌褶充分溶解還原后，蓋上蓋玻片，置于放大400倍的顯微鏡下觀察，觀察孢子、擔(dān)子、囊狀體、菌絲等顯微結(jié)構(gòu)的特征，并測量其大小，同時(shí)進(jìn)行顯微照片拍攝。
[0021]步驟(4)中所述的提 取總DNA的方法為采用改良的CTAB法提取總DNA，包括:
[0022]I)將_20°C冷凍干燥的野生奧德蘑子實(shí)體0.1g研磨成粉末，加入65°C預(yù)熱的2XCTAB抽提液，65°C保溫45min以上，間或輕搖混勻；
[0023]2) 12000rpm, 4°C離心 20min,取上清液；
[0024]3 )加入等體積的酚、氯仿和異戊醇的混合液，其中酚、氯仿和異戊醇的體積比為
25:24:1，輕輕混勻lOmin, 12000rpm, 4°C離心lOmin,取上清液移入新離心管中；
[0025]4)加入等體積的氯仿、異戊醇混合液，其中的氯仿、異戊醇的體積比為24:1，輕輕混勻lOmin, 12000rpm,4°C離心lOmin,取上清液移入新離心管中；
[0026]5)加入2/3體積的_20°C預(yù)冷的異丙醇,輕輕搖動(dòng)5min,8000rpm,4°C離心lOmin,去上清;
[0027]6)將沉淀依次用體積百分?jǐn)?shù)為75%的乙醇、lOmmol/L醋酸鉀各洗滌2~3次，每次8000rpm,室溫離心5min ；
[0028]7)加入預(yù)冷的體積百分?jǐn)?shù)為95%的乙醇,輕輕上下顛倒,8000rpm室溫離心IOmin,
棄乙醇，真空抽干或自然晾干；
[0029]8)加入IOOuL 10 X TE緩沖液，輕輕敲打使沉淀溶解；
[0030]9)加入 IuL 10mg/mL RNaseA37°C水浴，lhr,去除 RNA，即得 DNA 提取物，于 _20°C冰箱貯藏備用。
[0031]步驟(4)中所述的真菌通用引物ITSl 為:5，-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’，ITS4 為 5，-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3，。
[0032]步驟(4)中所述的ITS序列分析中，有相同的序列，則比對的兩種奧德蘑種類相同。
[0033]步驟(4)中所述的ITS序列分析中，序列相似度低于98%或找不到對應(yīng)的序列，則為兩個(gè)不同的奧德蘑種類。
[0034]有益效果:[0035]本發(fā)明鑒定方法與常規(guī)形態(tài)學(xué)鑒定相比，具有檢測準(zhǔn)確性高、定位準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0036]圖1、奧德蘑野生子實(shí)體的照片；
[0037]圖2、奧德蘑野生子實(shí)體的照片；
[0038]圖3、奧德蘑孢子的顯微照片；
[0039]圖4、奧德蘑囊狀體的顯微照片。
【具體實(shí)施方式】
[0040]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0041]實(shí)施例1
[0042]1、野外采集
[0043]野外發(fā)現(xiàn)奧德蘑野生子實(shí)體后，先對其從進(jìn)行拍照，拍攝清楚菌蓋直徑(7.0~
16.0cm),初半球形，后凸面鏡形至近平展，表面光滑，濕時(shí)粘，無條紋，粉白色至粉黃色(442~5八2);菌褶寬0.4~0.6cm，稀疏，稍彎生至離生，不等長，具小菌褶，粉白色(3A2~4A2);菌柄長(9.0~22.0cm)、粗(0.5~1.5cm),中生至偏生，具菌環(huán)，初中位，后上位，基部稍膨大，非假根狀，菌 柄中部具瘤狀凸起，上部近亮白色，下部淺褐色至深褐色(5B3-5C4)，密披淺褐色至褐色鱗片；菌肉白色，薄，味淡。
[0044]2、外部結(jié)構(gòu)鑒定
[0045]首先收集世界上查找世界上所有發(fā)表和報(bào)道的奧德蘑種類134個(gè)記錄；
[0046]2)根據(jù)采集到的奧德蘑子實(shí)體外部形態(tài):菌蓋7.0~16.0cm,凸面鏡形,表面光滑，濕時(shí)粘，粉白色至粉黃色。菌褶寬0.4~0.6cm,稍彎生至離生，粉白色；菌柄0.5~
1.5X9.0~22.0cm,中生至偏生，具菌環(huán)，上部近亮白色，下部淺褐色至深褐色，密披淺褐色至褐色鱗片。
[0047]初步確定屬于膨蝴菌科Physalacriceae奧德薦屬Oudemansiella Speg.。
[0048](3)微觀結(jié)構(gòu)鑒定
[0049]取奧德蘑菌褶少許，放入事先滴定好5%K0H溶液的載玻片上，待菌褶充分溶解還原后，蓋上蓋玻片，放于放大400倍的顯微鏡下觀察，觀察并發(fā)現(xiàn)擔(dān)子17.2~19.6X14.7~17.0 μ m，四孢；擔(dān)孢子17.2~19.6X14.7~17.0 μ m，卵圓形至寬橢圓形，光滑，無色；側(cè)生囊狀體和褶緣囊狀體78.0~122.5X 14.7~51.5 μ m，長棒形。菌蓋皮層菌絲為粘子實(shí)層-柵欄型排列，菌絲直徑9.8~29.4 μ m ;具淡黃色色素菌絲，菌絲直徑8.5μπι。菌柄皮層菌絲近平行排列，菌絲直徑3.7~7.4 μ m，具黃褐色色素。子實(shí)體菌絲未發(fā)現(xiàn)鎖狀聯(lián)合。觀察時(shí)進(jìn)行顯微照片拍攝。
[0050]顯微結(jié)構(gòu)觀察后進(jìn)行野生奧德蘑種類與經(jīng)過外部形態(tài)特征比對后相似的奧德蘑種類的顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對，找到顯微結(jié)構(gòu)相似的種類，經(jīng)進(jìn)一步鑒定，屬于奧德蘑屬Oudemansiella Speg.中的小奧德蘑組Section Oudemansiella,與擬粘小奧德蘑基本相同。
[0051](4)分子序列鑒定
[0052]I )DNA提取:取野生子實(shí)體0.1g,采用改良的CTAB法提取總DNA，提取后的DNA測定濃度后調(diào)節(jié)至IOOng/ μ L備用；
[0053]2) PCR 擴(kuò)增:選用真菌通用引物 ITSl (5，-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’)和ITS4 (5，-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’)擴(kuò)增奧德蘑核糖體 RNA 部分 18S、ITS1、5.8S、ITS2和部分28S的DNA片段；反應(yīng)體系總量20 μ L，包含有Taq酶5U、Mg2+L 5mmol/L、dNTP各 200 μ mol/L、引物各 1.0X 10-5 μ mol、模版 DNAlOOng ；PCR 反應(yīng)程序 94°C預(yù)變性 5min, 30個(gè)循環(huán)中94°C 50s、51°C 50s,72°C lmin，最后72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)觀察后，用回收試劑盒回收擴(kuò)增片段。
[0054]3)PCR測序:ITS擴(kuò)增片段經(jīng)回收后送公司進(jìn)行雙向測序，測序結(jié)果經(jīng)過比對拼接后確定最終序列。測定的野生奧德蘑子實(shí)體ITS序列如下。
[0055]TAATCAGTTACAGTTGTCTCAGTCAAGAAGACGGTTCGAAGCGGTCGCAAAAACCTTTCACAGAGTCGCATAGGTATCTCTCCAGAGGAGAGAACACAAAGGGAGCCGTGAGGCAAACCCTTCAAACACCCGAGCTCTGCCAACACTCTGAACCAAGCTAGCTTAGATATTATCACAGCTTAGCGTAGCCCAAGTAATGGTTCGTACTGCTAATGCATTTCAGAGGAGCTGAACCCATTGAAAGGTCCGGCAGGCCTCCACCATCCAACACCATTCGAACTCGAAAAACAAGTAAGAAGGGTTGAGAGTTTACTGACACTCAAACAGGCATGCCCTTCGGAATACCAAAGGGCGCAAGGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTGTATTAAGTTGTTTTAGAGGACGGTGAAGTCCCATAAACGAAGACATTCTAAACATGCAAGAGATGATATGAAGCATAGACCCGGAGGAAACGAAAGGAGGCGAACCTCACCTTCAACCCCAACCAGATCTACAAAAGGTGCACAGGTGGACAAAGAAGAGGCGAGCGACTTCAAAACGTGCACATACTCAAGAGTCAGCAACAGAAGTGAAGCCACAAGCGT。
[0056]ITS 序列大小:690bp。
·[0057]ITS序列分析:將測序好的序列在Genebank中進(jìn)行Blast，并未發(fā)現(xiàn)相同或相似的奧德蘑ITS序列。
[0058]鑒定結(jié)果:結(jié)合外部形態(tài)特征、微觀結(jié)構(gòu)和分子序列比對的種類，綜合比較，采集到的野生奧德蘑子實(shí)體為擬粘小奧德蘑Oudemansiella submucida Corner,屬于奧德蘑屬Oudemansiella Speg.,膨王胡菌科 Physalacriceae0
【權(quán)利要求】
1.一種野生奧德蘑鑒定方法，包括下列步驟: (1)野外采集 先對從野外采集的野生奧德蘑子實(shí)體進(jìn)行拍照，拍攝清楚菌蓋、菌柄、菌環(huán)和菌褶以及子實(shí)體周圍的生境；照片拍攝后采集奧德蘑野生子實(shí)體，測量并記錄其外部形態(tài)特征，并進(jìn)行菌種分離； (2)外部形態(tài)鑒定 將步驟(1)采集到的野生奧德蘑子實(shí)體的外部形態(tài)特征和現(xiàn)有的奧德蘑子實(shí)體的外部形態(tài)特征進(jìn)行比對，找出相似種類； (3)微觀結(jié)構(gòu)鑒定 將步驟(1)得到的奧德蘑野生子實(shí)體進(jìn)行顯微結(jié)構(gòu)觀察，然后將野生奧德蘑與步驟(2)得到的相似種類的奧德蘑的顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對，找到顯微結(jié)構(gòu)相似的種類； (4)分子序列鑒定 1)DNA提取:提取總DNA，測定濃度后調(diào)節(jié)至IOOng/μ L備用； 2)PCR擴(kuò)增:選用真菌通用引物ITSl和ITS4擴(kuò)增奧德蘑核糖體RNA部分18S、ITSU5.8S、ITS2和部分28S的DNA片段；反應(yīng)體系總量20 μ L，包含有Taq酶5U、Mg2+ 1.5mmol/L、dNTP 各 200μ mol/L、引物各 1.0X 10-5 μ mol、模版 DNAlOOng ；PCR 反應(yīng)程序 94°C 預(yù)變性5min，30 個(gè)循環(huán)中 94°C 5 0s、51°C 50s,72°C lmin，最后 72°C延伸 IOmin ; 3)PCR測序:經(jīng)ITS擴(kuò)增片段進(jìn)行雙向測序，測序結(jié)果經(jīng)過比對拼接后確定最終序列； 4)ITS序列分析:將測序好的序列在Genebank中進(jìn)行Blast比對； (5)綜合鑒定:綜合外部形態(tài)特征、微觀結(jié)構(gòu)和分子序列比對的種類，綜合比較，準(zhǔn)確確定野生奧德蘑的種類。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種野生奧德蘑鑒定方法，其特征在于:將步驟(1)中所采集到的奧德蘑野生子實(shí)體放入固定的器具中以免損壞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種野生奧德蘑鑒定方法，其特征在于:步驟(1)中所示的測量并記錄其外部形態(tài)特征包括:測量菌蓋直徑、菌柄長度和直徑，與比色卡進(jìn)行比對并記錄菌蓋、菌柄、菌褶顏色及形狀，記錄其味道和氣味。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種野生奧德蘑鑒定方法，其特征在于:步驟(3)中所述的顯微結(jié)構(gòu)觀察的具體操作為:選取步驟(1)得到的奧德蘑野生子實(shí)體的菌褶少許，放入事先配置好的滴定有5%K0H溶液的載玻片上，待菌褶充分溶解還原后，蓋上蓋玻片，置于放大400倍的顯微鏡下觀察，觀察孢子、擔(dān)子、囊狀體、菌絲等顯微結(jié)構(gòu)的特征，并測量其大小，同時(shí)進(jìn)行顯微照片拍攝。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種野生奧德蘑鑒定方法，其特征在于:步驟(4)中所述的提取總DNA的方法為采用改良的CTAB法提取總DNA，包括: 1)將_20°C冷凍干燥的野生奧德蘑子實(shí)體0.1g研磨成粉末，加入65°C預(yù)熱的2XCTAB抽提液，65°C保溫45min以上，間或輕搖混勻； 2)12000rpm, 4°C離心 20min,取上清液； 3)加入等體積的酚、氯仿和異戊醇的混合液，其中酚、氯仿和異戊醇的體積比為25:24:1，輕輕混勻lOmin，12000rpm，4°C離心lOmin，取上清液移入新離心管中； 4)加入等體積的氯仿、異戊醇混合液，其中的氯仿、異戊醇的體積比為24:1，輕輕混勻lOmin, 12000rpm,4°C離心lOmin,取上清液移入新離心管中； 5)加入2/3體積的_20°C預(yù)冷的異丙醇,輕輕搖動(dòng)5min,8000rpm,4°C離心IOmin,去上清； 6)將沉淀依次用體積百分?jǐn)?shù)為75%的乙醇、lOmmol/L醋酸鉀各洗滌2~3次，每次8000rpm,室溫離心 5min ； 7)加入預(yù)冷的體積百分?jǐn)?shù)為95%的乙醇,輕輕上下顛倒，8000rpm室溫離心IOmin,棄乙醇，真空抽干或自然晾干； 8)加入IOOuL10XTE緩沖液，輕輕敲打使沉淀溶解； 9)加入IuL 10mg/mL RNaseA 37°C水浴，Ihr，去除 RNA,即得 DNA 提取物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種野生奧德蘑鑒定方法，其特征在于:步驟(4)中所述的真菌通用引物 ITSl 為:5，-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G_3’，ITS4 為 5，-TCC TCC GCT TATTGA TAT GC-3，。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種野生奧德蘑鑒定方法，其特征在于:步驟(4)中所述的ITS序列分析中，有相同的序列，則比對的兩種奧德蘑種類相同。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種野生奧德蘑鑒定方法，其特征在于:步驟(4)中所述的ITS序列分析中，序列相似 度低于98%或找不到對應(yīng)的序列，則為兩個(gè)不同的奧德蘑種類。
【文檔編號】C12Q1/68GK103667478SQ201310654406
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月5日
【發(fā)明者】李傳華, 黃建春, 譚琦, 尚曉冬, 張勁松, 鮑大鵬 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院