專利名稱：鑒別致命鵝膏的特征性核苷酸序列、核酸分子探針和方法
技術領域：
本發(fā)明屬于利用分子生物學方法檢測一種常見毒蘑菇的技術領域，具體涉及一種用于鑒別致命鵝膏(Amanita exitialis)的特征性核苷酸序列、核酸分子探針和方法
背景技術：
鵝膏屬(Amanita)是世界性分布的大屬，隸屬于真菌界、擔子菌門、擔子菌綱、蘑菇 目、鵝膏科。據(jù)《真菌學詞典》第十版(2008)記載，全世界鵝膏屬種類已達500種，中國已知種類近100種(楊祝良，2005)，它們的一些種類如產(chǎn)于東亞的致命鵝膏(A. exitialis)、灰花紋鵝膏(A. fuliginea)等都屬于劇毒蘑菇種類。成年人若誤食致命鵝膏或灰花紋鵝膏的一個子實體，不及時搶救，就足以致命(陳作紅等，2003)。目前，誤食毒蘑菇致死是我國食物中毒致死的主要原因，蘑菇中毒的死亡率高達43. 80%,是目前死亡率最高的嚴重突發(fā)公共衛(wèi)生事件(2007)。因此，快速、準確的鑒別致命鵝膏的方法對于搶救誤食致命鵝膏的患者具有重要的意義。隨著分子生物學技術的快速發(fā)展以及計算機輔助分析技術的誕生，真菌的快速檢測已成為可能。目前常用的檢測方法主要有RAPD、RFLP, ap-PCR、rDNA序列分析和特異性引物的PCR檢測等。真菌的ITS序列是核糖體DNA上的一個非編碼區(qū)域，受外界環(huán)境因素的影響較小，進化速度快，因而可以提供較為豐富的信息位點。利用真菌rDNA-ITS序列在屬、種水平上的差異，設計特異性引物，進行真菌物種的鑒定、檢測，已經(jīng)成為國際上廣泛使用的分子生物學方法。目前，已有用于鑒別部分真菌的核苷酸特征序列獲得專利，但尚未發(fā)現(xiàn)專一性鑒別致命鵝膏的核苷酸序列專利。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是提供了一種利用分子生物學手段，獲得鑒別致命鵝膏(A. exitialis)的特征性核苷酸序列。本發(fā)明用于鑒別致命鵝膏的特征性核苷酸序列來源于致命鵝膏的核糖體rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITSU ITS2和它們之間的5. 8S rDNA基因，具體序列如SEQ ID NO. I所示。本發(fā)明的第二個目的是提供一種基于致命鵝膏的特征性核苷酸序列(SEQ IDNO. I)設計的用于鑒別致命鵝膏的核酸分子探針，該核酸分子探針序列如下ZMF 5'-GAAGTTGAAATCTGGGTG-3' ；ZMR : 5'-TAACTAGCATTGCTCCTG-3'。上述核酸分子探針序列ZMF和ZMR，它們的退火溫度相近，均不能形成引物二聚體，具有極高的專一性，僅與致命鵝膏發(fā)生反應，而不與其他鵝膏反應。利用該探針通過PCR擴增可以快速的對致命鵝膏(菌絲體、子實體)進行鑒別。本發(fā)明的第三個目的是提供一種致命鵝膏快速鑒定試劑盒，包括上述核酸分子探針ZMF和ZMR，以及常規(guī)的DNA提取試劑和常規(guī)的PCR反應試劑。所述的致命鵝膏快速鑒定試劑盒優(yōu)選還包括真菌核糖體rDNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物 ITSl 5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' ；ITS4 :5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。該通用引物可以作為鑒定致命鵝膏的陽性對照。本發(fā)明的第四個目的是提供一種鑒別致命鵝膏的方法。本方法是采用上述核酸分子探針ZMF和ZMR作為特異性擴增引物，以致命鵝膏基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴增，電泳檢測，獲得清晰的致命鵝膏特異性條帶，實現(xiàn)對致命鵝膏的鑒別。優(yōu)選，利 用ITSl和ITS4作為PCR引物，以致命鵝膏的基因組DNA作為模板進行常規(guī)的PCR，以作為陽性對照。本發(fā)明基于鑒別致命鵝膏的特征性核苷酸序列(SEQ ID NO. I)設計了特異性的核酸分子探針ZMF和ZMR，并以該核酸分子探針為引物，以致命鵝膏的基因組DNA為模板，按照常規(guī)PCR方法進行擴增，獲得的DNA片段，經(jīng)測序其具體序列如SEQ ID NO. I的第124 524位堿基所示，長度為40Ibp。利用本發(fā)明的核酸分子探針ZMF和ZMR進行PCR擴增，僅致命鵝膏能夠擴增獲得該特異性片段，而其他樣品沒有擴增到任何片段(如圖3)，這表明本發(fā)明的核酸分子探針ZMF和ZMR具有極高的專一性，可以用于快速的鑒別致命鵝膏(子實體和菌絲體)。本發(fā)明采用PCR技術進行檢測，材料用量少，僅20mg就足夠，方法簡單，特異性好，用時短，半日即可完成。


圖I是本發(fā)明所述的致命鵝膏的特征性核苷酸序列及對致命鵝膏專一性核酸分子探針ZMF和ZMR的位置圖，左側為5'端，右側為3'端，其中黑色部分為專一性核酸分子探針ZMF和ZMR擴增的片斷大小及位置；圖2是利用ITSl和ITS4作為引物按照常規(guī)的PCR方法對不同鵝膏樣品進行PCR的產(chǎn)物的電泳圖，其中I、灰花紋鵝膏，2、致命鵝膏，3、黃蓋鵝膏白色變種，4、土紅粉蓋鵝膏，
5、歐式鵝膏，6、大白菇Russula delica (外型與致命鵝膏近似，可食用)，M為2Kb的DNA分子量標準。圖3是利用本發(fā)明的核酸分子探針ZMF和ZMR作為引物按照常規(guī)的PCR方法對不同鵝膏樣品進行PCR的產(chǎn)物的電泳圖，其中I、灰花紋鵝膏，2、致命鵝膏，3、黃蓋鵝膏白色變種，4、土紅粉蓋鵝膏，5、歐式鵝膏，6、大白菇Russula delica (外型與致命鵝膏近似，可食用)，M為2Kb的DNA分子量標準。
具體實施例方式以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。實施例I :致命鵝膏基因組DNA的提取和ITS rDNA基因的獲得取20mg致命鵝膏樣品置于無菌的研缽中，將液氮倒入并快速研磨，加入2%(w/v)CTAB抽提緩沖液600 μ 1，其中含有2%的SDS，繼續(xù)研磨幾秒后倒入I. 5ml微量離心管中，65°C水浴保溫lh。冷卻至室溫后，向I. 5ml含有樣品的微量離心管中加入等體積的飽和酚氯仿異戊醇(25:24:1)，顛倒混勻2min，12000rpm離心15min，用200 μ I移液器將上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中，棄沉淀。上清液中加入與之等體積的氯仿異戊醇(24:1)，顛倒混勻2min，12000rpm離心15min，用200 μ I的微量移液器將含有DNA的上層(水相)小心地移入一只新管中，如果在水相和有機相交界處有白色沉淀物，則重新抽提有機相1-2次，合并水相。將最終的上清液用200 μ I的微量移液器小心轉(zhuǎn)入一只新離心管中。往上清液(DNA溶液)中加入1/10體積的3mol/L pH5. 2的乙酸鈉，用手指輕彈離心管壁幾次使之混勻。加入與DNA溶液(含鹽溶液)等體積的異丙醇(-4°C預冷)輕輕混勻，于-4°C靜置2h。12000rpm離心15min，棄上清液，用體積分數(shù)75%乙醇水溶液洗滌沉淀物兩次。室溫下自然晾干。自然干燥后加入20 μ I無菌的超純水重懸，選用DNA純化試劑盒(東盛生物科技有限公司的基因組純化試劑盒，其貨號為Ν1091)純化重懸的DNA，而獲得致命鵝膏的基因組DNA。灰花紋鵝膏、黃蓋鵝膏白色變種、土紅粉蓋鵝膏、歐式鵝膏和大白菇Russula delica的基因組DNA參照上述方法提取。取真菌ITS rDNA 通用引物 ITSl 和 ITS4, ITSl :5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' ；ITS4 :5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，引物由上海生工生物工程有限公司合成。反應體系為 25 μ L 總體積，ddH2012. 8μ L，10 倍緩沖液(Mg2+) 8μ L，dNTP (2. 5mmol/L) 2 μ L，ITSl(10 μ mol/L) O. 5 μ L, ITS4 (10 μ mol/L) O. 5 μ L, HotStart Taq (5u/ μ L) O. 2 μ L,模板DNA (灰花紋鵝膏、致命鵝膏、黃蓋鵝膏白色變種、土紅粉蓋鵝膏、歐式鵝膏或大白菇Russuladelica 的基因組 DNA) I μ L。反應程序為 94°C 5min 預變性；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 90s，35個循環(huán)；72°C 8min。致命鵝膏的PCR產(chǎn)物送北京華大基因測序，獲得ITS rDNA基因序列，致命鵝膏的ITS rDNA序列如SEQ ID NO. I和圖I所示，電泳圖如圖2所示。由圖2可以看出，利用通用引物ITSl和ITS4可以從灰花紋鵝膏、致命鵝膏、黃蓋鵝膏白色變種、土紅粉蓋鵝膏、歐式鵝膏和大白菇Russula delica的基因組DNA中擴增出序列。實施例2 :致命鵝膏特異性引物的PCR擴增根據(jù)致命鵝膏ITS rDNA基因序列設計特異性引物ZMF和ZMR，ZMF 5'-GAAGTTGAAATCTGGGTG-3' 和 ZMR :5'-TAACTAGCATTGCTCCTG-3'，引物由上海生工生物工程有限公司合成。以基因組DNA為模板，反應體系為25 μ L總體積ddH2012. 8 μ L，10倍緩沖液(Mg2+)8y L，dNTP (2. 5mmol/L)2 μ L，ZMF (10 μ mol/L)0. 5 μ L, ZMR (10 μ mol/L)0. 5 μ L,HotStart Taq (5u/μ L)0. 2 μ L，模板DNA (灰花紋鵝膏、致命鵝膏、黃蓋鵝膏白色變種、土紅粉蓋鵝膏、歐式鵝膏或大白菇Russula delica的基因組DNA)1 μ L。反應程序為94°C 5min預變性;94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 60s，35個循環(huán)；72°C 8min。電泳檢測PCR結果，電泳圖如圖3所示，從圖3可以看出，僅致命鵝膏能夠擴增出特異性片段，而灰花紋鵝膏、黃蓋鵝膏白色變種、土紅粉蓋鵝膏、歐式鵝膏和大白菇Russula delica沒有擴增出任何片段，這表明本發(fā)明的核酸分子探針具有極高的專一性，特異性好，因此可以用于快速的鑒別致命鵝膏。將致命鵝膏的特異性片段送去測序，其序列如SEQ ID NO. I的第12Γ524位堿基所示，其長度為 401bp。權利要求
1.一種用于鑒別致命鵝膏(Amanita exitialis)的特征性核苷酸序列,其特征在于,該特征性核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.一種用于鑒別致命鵝膏的核酸分子探針，其特征在于，該核酸分子探針為ZMF 5'-GAAGTTGAAATCTGGGTG-3' ；ZMR 5'-TAACTAGCATTGCTCCTG-3'。
3.—種致命鵝膏快速鑒定試劑盒，其特征在于，包括權利要求2所述的核酸分子探針序列ZMF和ZMR，以及常規(guī)的DNA提取試劑和常規(guī)的PCR反應試劑。
4.根據(jù)權利要求3所述的致命鵝膏快速鑒定試劑盒，其特征在于，還包括真菌核糖體rDNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物ITSl 5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' ；ITS4 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。
5.一種鑒別致命鵝膏的方法，其特征在于，是采用權利要求2所述的核酸分子探針ZMF和ZMR作為PCR引物，利用PCR方法鑒定致命鵝膏，具體步驟按常規(guī)PCR方法進行。
6.根據(jù)權利要求5所述的鑒別致命鵝膏的方法，其特征在于，還利用ITSl5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' ；ITS4 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' 作為 PCR 引物，以致命鵝膏的基因組DNA作為模板進行常規(guī)的PCR，以作為陽性對照。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒別致命鵝膏的特征性核苷酸序列、核酸分子探針和方法。該特征性核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。該核酸分子探針為ZMF5`-GAAGTTGAAATCTGGGTG-3`和ZMR5`-TAACTAGCATTGCTCCTG-3`。其方法為是采用上述核酸分子探針ZMF和ZMR作為PCR引物，利用PCR方法鑒定致命鵝膏，具體步驟按常規(guī)PCR方法進行。本發(fā)明以ZMF和ZMR作為引物，以致命鵝膏的基因組DNA為模板，按照常規(guī)PCR方法進行PCR，擴增到特異性片段。經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)，僅致命鵝膏能夠擴增到特異性片段，而其他鵝膏樣品，如灰花紋鵝膏、黃蓋鵝膏白色變種、土紅粉蓋鵝膏、歐式鵝膏和大白菇Russula delica都沒有擴增到任何片段，這表明本發(fā)明的核酸分子探針ZMF和ZMR具有極高的專一性，可以用于快速的鑒別致命鵝膏。
文檔編號C12N15/11GK102719544SQ20121021613
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月27日 優(yōu)先權日2012年6月27日
發(fā)明者宋斌, 李挺, 李泰輝, 鄧旺秋 申請人:廣東省微生物研究所