專利名稱：抑制cyp2c8基因表達(dá)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)和基因領(lǐng)域，特別涉及CYP2C8基因的調(diào)控。
背景技術(shù)：
RORy高表達(dá)于肝臟脂肪組織、心臟和骨骼肌，在發(fā)育、免疫和代謝過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。除了在脂類和類固醇等代謝途徑中起重要調(diào)節(jié)作用外，在肝臟RORy通過(guò)結(jié)合到CYP2C8啟動(dòng)子上其特異性原件RORE上，進(jìn)而激活CYP2C8基因的轉(zhuǎn)錄，并最終調(diào)控許多當(dāng)前正在臨床使用藥物的代謝。細(xì)胞功能幾乎總是生物大分子在組裝和通路上協(xié)同作用的結(jié)果，而蛋白復(fù)合物是亂中有序的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，能將生物信息變成細(xì)胞的功能。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些內(nèi)源性或合成的RORy 配體，比如 7-oxygenated sterol、SR1078、T0901317 和 24S-0HC，這些配體經(jīng)證實(shí)都能調(diào)節(jié)ROR Y的轉(zhuǎn)錄活性；Mi-2 0是唯一與ROR Y相互作用進(jìn)而發(fā)揮抑制作用的蛋白。是 否還存在其他相互作用蛋白且參與調(diào)控CYP2C8基因的表達(dá)至今未有報(bào)道，

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供提供一種抑制CYP2C8基因表達(dá)的方法，以及RIP140基因和HSP90的新應(yīng)用，該方法和新應(yīng)用為臨床用藥的作用靶標(biāo)提供了新的思路。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為抑制CYP2C8基因表達(dá)的方法，將RIP140的siRNA轉(zhuǎn)染入靶細(xì)胞I中，所述RIP140的干擾片段如SEQID NO :1、SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3中任一所示。所述RIP140的核苷酸序列如 NCBI Reference Sequence NM 003489. 3進(jìn)一步，將HSP90的siRNA轉(zhuǎn)染入靶細(xì)胞II中，所述RIP140的干擾片段如SEQID NO :4、SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 6中任一所示，所述HSP90的核苷酸序列如NCBIReference Sequence NP 031381. 2。進(jìn)一步，所述靶細(xì)胞為IfepG2細(xì)胞。進(jìn)一步，所述方法還包括陽(yáng)性對(duì)照組，所述陽(yáng)性對(duì)照組具體為將ROR Y的siRNA轉(zhuǎn)染入H印G2細(xì)胞中，所述RIP140的干擾片段如SEQ ID NO :7、SEQ IDNO :8或SEQ ID NO:
9中任一所示，所述 ROR y 的核苷酸序列如 NCBI Reference Sequence :NM_005060. 3。進(jìn)一步,在轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后,還包括鑒定步驟,具體為I)提取未轉(zhuǎn)染siRNA的H印G2細(xì)胞中的總RNA，再逆轉(zhuǎn)錄成cDNA為模板；以CYP2C8基因特異Q-PCR引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；同時(shí)以人管家基因GAPDH作為參照物，進(jìn)行相對(duì)定量分析；2)用雙Delta法進(jìn)行相對(duì)定量分析，其計(jì)算公式為
其中，對(duì)照組目的基因指未轉(zhuǎn)染的H印G2細(xì)胞樣品，實(shí)驗(yàn)組目的基因指CYP2C8，管家基因指GAPDH基因。進(jìn)一步，所述CYP2C8基因特異Q-PCR引物，其上游引物為5，-agatcagaattttctcaccc-3，，其下游弓I物為5，-aacttcgtgtaagagcaaca-3，。進(jìn)一步，步驟I)中，PCR擴(kuò)增條件為:95°C，5 秒；57. 5°C，15 秒；72°C，20 秒；80°C，5秒；40個(gè)循環(huán)。
RIP140基因和/或HSP90在制備CYP2C8基因的介導(dǎo)基因中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明用免疫共沉淀方法鑒定了 TAP/MS策略獲得的7個(gè)候選蛋白中只有RIP140和HSP90蛋白是真正的RORy相互作用蛋白，并進(jìn)一步通過(guò)RNA干擾證實(shí)1 1 140和肥 90蛋白能上調(diào)1 ( ￥介導(dǎo)的CYP2C8基因的表達(dá)。這些結(jié)果支持了RORy與其相互作用蛋白結(jié)合形成復(fù)合體，進(jìn)而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄下游靶基因的作用。HSP90可能作為分子伴侶通過(guò)結(jié)合到RORY蛋白上，幫助RORy蛋白在肝臟代謝和其他生物活動(dòng)中執(zhí)行調(diào)節(jié)作用，而1 1 140在11印62細(xì)胞中則可能充當(dāng)1 ( ￥蛋白的轉(zhuǎn)錄輔活化因子。在某些病理?xiàng)l件下，對(duì)獲得的RORy相互作用蛋白進(jìn)行干擾或過(guò)表達(dá)，有可能成為臨床用藥的作用靶標(biāo)，具有良好的推廣應(yīng)用價(jià)值。


圖I為質(zhì)譜測(cè)得的RIP140(上)和HSP90 ( T )蛋白m/z圖譜。圖2為co-IP對(duì)候選ROR y相互作用蛋白的驗(yàn)證。圖3為針對(duì)ROR y、RIP140和HSP90基因各設(shè)計(jì)3個(gè)siRNA分子，轉(zhuǎn)染H印G2細(xì)胞后通過(guò)蛋白印跡分析檢測(cè)的各siRNA分子對(duì)靶基因ROR Y、RIP140和HSP90的抑制情況，C :HepG2 細(xì)胞(-);NC :irrelevant siRNA as negtive control ;#1, #2,和 #3 :分別代表ROR y、RIP140和HSP90基因?qū)?yīng)的3個(gè)siRNA雙鏈；tubulin :為核蛋白表達(dá)內(nèi)參對(duì)照。圖4為當(dāng)RIP140或/和HSP90的表達(dá)被抑制后，對(duì)CYP2C8基因mRNA水平的表達(dá)影響的分析圖。
具體實(shí)施例方式試劑配制I. 5X 裂解緩沖液(200ml) :250mM Tris pH7. 5，25 %甘油，I % NP40，7. 5mM 氯化鎂，625mM氯化鈉，125mM氟化鈉，5mM釩酸鈉。先在71ml超純水中溶解氟化鈉和釩酸鈉，然后再溶解除了甘油外的其他試劑。然后每支50ml容量的塑料試管盛裝IOml該緩沖液置于-80°C保存。使用前，加超純水到50ml，加入蛋白酶抑制劑，ImM DTT02. 10XTEV酶切緩沖液100mM Tris pH7. 5，IM氯化鈉，I % NP40，5mM EDTA。過(guò)濾，保存于4°C冰箱。使用前，加ImM DTT0大規(guī)模擴(kuò)增細(xì)胞第I天，細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)于2只IOOmm培養(yǎng)皿中；第3天，培養(yǎng)的細(xì)胞更換新鮮完全培養(yǎng)基。在換液過(guò)程中，首先洗棄舊培養(yǎng)，接著用滴管吸取預(yù)孵熱的PBS輕輕沖刷細(xì)胞表面，去掉結(jié)合不牢的細(xì)胞及其他殘?jiān)詈蠹尤胄迈r的完全培養(yǎng)基;第4天，將2只100_培養(yǎng)皿中的細(xì)胞傳代至8只IOOmm培養(yǎng)皿中；第6天，8只培養(yǎng)皿中的細(xì)胞換液。同樣用PBS沖刷殘?jiān)?；?天，將8只IOOmm培養(yǎng)皿中的細(xì)胞傳代至32只IOOmm培養(yǎng)皿中；第10天準(zhǔn)備收獲細(xì)胞，可以獲得總量6 X IO8個(gè)細(xì)胞。
裂解細(xì)胞I)準(zhǔn)備細(xì)胞裂解液融解5X裂解緩沖液，加4倍體積的超純水使裂解液稀釋成IX裂解緩沖液。加入終濃度為ImM DTT到IX裂解緩沖液中，同時(shí)加入蛋白酶抑制劑藥片，4°C旋轉(zhuǎn)混勻；2)經(jīng)過(guò)大規(guī)模擴(kuò)增并收獲的細(xì)胞，每2X IO8個(gè)細(xì)胞給予IOml I X裂解緩沖液，用滴管吹吸輕柔混勻；3)冰上孵育30min,間或用滴管吹吸輕柔混勻；4)20000g離心20min ；5)上清即為裂解的總蛋白，冰上小心吸取上清到干凈的50ml EP管中。如不立刻使用，液氮或_80°C中凍存，直到用TAP方法操作前取出。串聯(lián)親和純化I)預(yù)冷下列試劑、材料和儀器到4°C :超速離心機(jī)，低溫旋轉(zhuǎn)孵育儀，足夠用來(lái)洗滌IgG珠子量的5X裂解緩沖液，超純水，超速離心管；準(zhǔn)備4X SDS和2X SDS上樣緩沖液；2)室溫融解液氮中取出的細(xì)胞總蛋白，當(dāng)融解到僅存少量冰凍狀態(tài)的總蛋白時(shí)，將整個(gè)總蛋白置于冰上繼續(xù)解凍；3)融解完全的總蛋白倒入一只30ml的超速離心管中，4°C 120000g超速離心40min ；4)在15ml離心管中用含ImM DTT和ImM EDTA的IX裂解緩沖液洗IgG珠子，X3次；5)離心的總蛋白加到200 u I IgG瓊脂糖珠子(用裂解緩沖液配成50%懸漿)中，4°C旋轉(zhuǎn)結(jié)合2hr ；6) 300g離心3min,吸取100 U I上清做后續(xù)WesternBlotting分析；7)將IgG瓊脂糖珠子轉(zhuǎn)移到一個(gè)小的過(guò)濾柱里。取下柱子上端塞子，接上一只IOml的注射器。往里加IOml裂解緩沖液，然后取下下端塞子，依靠重力流動(dòng)排掉柱子里的緩沖液；8)用5ml的酶切緩沖液洗IgG瓊脂糖珠子；9)當(dāng)酶切緩沖液依靠重力流動(dòng)從過(guò)濾柱中排盡后，重新合上柱子下端塞子。用400 ill含有IOOunits TEV蛋白酶的酶切緩沖液重懸IgG瓊脂糖珠子。合上柱子上端的塞子，于16°C旋轉(zhuǎn)結(jié)合Ihr ；10)在15ml離心管中用含ImM DTT的I XTAE緩沖液洗Streptavi din珠子，X3次；11)收集通過(guò)重力流動(dòng)洗脫下的柱子里的液體；12)用400 ill的裂解緩沖液重懸IgG瓊脂糖珠子。4°C，300g離心柱子3分鐘。吸取上清，和先前洗脫的液體混合。取其中20 Ul做后續(xù)分析；13)向上一步所得混合洗脫液中加A 50 u I 洗過(guò)的 Streptavidin 珠子,4°C旋轉(zhuǎn)孵育 2hr ；14)用 IOml 含 ImM DTT 的 IXTAE緩沖液洗Sti^ptavidin珠子，X3次；15)產(chǎn)物用在SDS上樣緩沖液中水煮洗脫。蛋白印跡(WesternBlot)I)胞漿蛋白和核蛋白的提取①胰酶消化培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞，計(jì)數(shù)按細(xì)胞數(shù)加入預(yù)冷的CERI (含蛋白酶抑制劑)，輕柔混勻，冰浴IOmin 往上步反應(yīng)液中加入11 預(yù)冷的CER II，渦旋5sec，冰浴Imin ’④禍旋5sec, 16000g離心5min !⑤將上清(衆(zhòng)蛋白)迅速轉(zhuǎn)移至干凈的預(yù)冷的EP管中，冰浴待用或分裝_80°C凍存；⑥用100 u I預(yù)冷的NER重懸沉淀，渦旋15sec充分重懸沉淀，冰浴40min。每IOmin潤(rùn)旋反應(yīng)液15sec ’⑦16000g離心IOmin 上清為核蛋白，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的EP管中，冰浴待用或分裝_80°C凍存；⑨蛋白濃度檢測(cè)。2)蛋白質(zhì)凝膠電泳
①電泳凝膠為NuPAGE4Novex 4-12% Bis-Tris Gel ;②在樣品蛋白中加入上樣緩沖液，水煮IOmin -’③12000g離心5min,取上清蛋白在凝膠加樣孔中按實(shí)驗(yàn)分組要求加上蛋白樣品和預(yù)染分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白電泳。條件為恒壓200V，I小時(shí)；⑥電泳結(jié)束，卸下凝膠，用鑷子撬開塑料夾板，取出凝膠；3)電轉(zhuǎn)膜①取出的凝膠置于電轉(zhuǎn)緩沖液中平衡15min ;②PVDF膜依次處理甲醇，浸泡15sec ;超純水，漂洗3min ;電轉(zhuǎn)緩沖液中平衡15min ;③電轉(zhuǎn)“三明治”由正極向負(fù)極依次疊放順序?yàn)闉V紙一凝膠一PVDF膜一濾紙；④電轉(zhuǎn)條件30V，Ihr ;⑤電轉(zhuǎn)結(jié)束，取出PVDF膜，甲醇短暫漂洗后再在超純水中漂洗Imin去掉電轉(zhuǎn)緩沖液。 4)封閉PVDF膜放入塑料封閉袋中，加入封閉液(含0. 05% Tween 20的BlockingBuffer)，室溫?fù)u床上緩慢孵育I. 5-2hr或4°C過(guò)夜；5)孵一抗用封閉液按最適比例稀釋一抗后，在封閉袋中對(duì)PVDF膜進(jìn)行一抗結(jié)合孵育，室溫2hr或或4°C過(guò)夜；6)洗一抗取出PVDF膜，于平皿中用TBST (含0. 05% Tween20的TBS)洗滌6min/次X5次；7)孵二抗用封閉液按I : 20000比例稀釋二抗后，在封閉袋中對(duì)PVDF膜進(jìn)行二抗結(jié)合孵育，室溫Ihr ；8)洗二抗取出PVDF膜，于平皿中用TBST (含0. 05% Tween20的TBS)洗滌6min/次X5次；9)顯色將結(jié)合有一抗二抗的PVDF膜置于顯色底物ECL發(fā)光液中，避光孵育5min ；10)曝光擠除發(fā)光液，在暗室內(nèi)用X光片曝光。一般曝光時(shí)間點(diǎn)設(shè)為8sec，30sec，lmin，5min等，具體曝光時(shí)間隨條帶的熒光強(qiáng)度改變；11)顯影定影曝光過(guò)的X光片于首先置于顯影液中顯影2min，經(jīng)過(guò)自來(lái)水充分漂洗，最后置于定影液中定影2min。自來(lái)水漂洗后，掛于通風(fēng)處晾干，掃描膠片結(jié)果。銀染I)固定50%甲醇、5%乙酸固定20min;2)洗滌50%甲醇洗滌lOmin，然后超純水洗滌2h或0. N. ；3)致敏0. 02%硫代硫酸鈉致敏Imin ；4)洗滌超純水洗滌2 X Imin ；5)銀染:0. 1% AgN03(冰硝酸銀溶液)4°C染色20min ；6)洗滌:超純水洗滌2 X Imin (第二次水洗前換盤)；7)顯色0.04<%甲醛、2%似20)3顯色；顯色過(guò)程中顯色液變渾濁后更換I次顯色液以降低背景；8)終止5%乙酸終止顯色，中途更換液體一次。最終的捕獲產(chǎn)物為蛋白復(fù)合物，利用SDS-PAGE對(duì)其進(jìn)行分離，電泳過(guò)程中盡可能擴(kuò)大這些復(fù)合物蛋白中的各蛋白成分在凝膠上的間距。對(duì)分離后的蛋白，用銀染方法在凝膠中將差異顯著的蛋白條帶顯示出來(lái)。結(jié)果如圖2-2顯示，通過(guò)TAP方法捕獲到HepG2細(xì)胞中8個(gè)差異顯著的候選ROR Y相互作用蛋白條帶。免疫共沉淀I)正常培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞用胰酶消化后，計(jì)數(shù)取5X IO6個(gè)細(xì)胞；2)配置RIPA裂解液往裂解液中加入蛋白酶抑制劑和憐fe酶抑制劑，使抑制劑在裂解液中完全溶解；3)冰上裂解細(xì)胞，30min，間或渦旋混勻；4)細(xì)胞裂解物4°C，IOOOOg離心20min，取上清即為提取的總蛋白；5)BCA方法進(jìn)行總蛋白定量；6)取2X500 iig蛋白總量(其中一個(gè)為同型IgG對(duì)照組)，用加了各種蛋白酶抑制劑的裂解液或PBS補(bǔ)足到500 iil，使總蛋白濃度為Iii g/U I ；7)結(jié)合RORy抗體的ProteinA/G瓊脂糖珠的準(zhǔn)備7. IProteinA/G 瓊脂糖珠洗漆①取ProteinA/G瓊脂糖珠50 ii I (50%懸衆(zhòng))X 2,用于預(yù)清除蛋白樣品；②取該瓊脂糖珠90 ill X 2，用于結(jié)合一抗；③每樣用Iml預(yù)冷PBS洗瓊脂糖珠3次4°C旋轉(zhuǎn)混合IOmin/次,3000g離心2min。
最后一次凈棄上清；7. 2結(jié)合ROR y抗體ProteinA/G瓊脂糖珠的制備 ①加500 U I預(yù)冷PBS和5 ii I ROR y抗體(濃度為0. 2 ii g/ ii I,每管一抗總量約
0.5-2 V- g)到洗好的45 u I ProteinA/G瓊脂糖珠中，室溫旋轉(zhuǎn)結(jié)合Ihr ；②Iml預(yù)冷PBS洗珠子4次4°C旋轉(zhuǎn)混合IOmin/次,接著3000g離心2min。最后一次盡棄上清；8)總蛋白中非特異結(jié)合蛋白預(yù)清除①將500 ill濃度為liig/ill的總蛋白X 2，加入到約22. 5 ii L洗過(guò)的Protein A/G瓊脂糖珠X 2中，4°C旋轉(zhuǎn)結(jié)合I小時(shí)；②4°C，3000g離心2min，上清為預(yù)清除的總蛋白；9)經(jīng)過(guò)預(yù)清除的總蛋白溶液加入到結(jié)合ROR Y抗體的ProteinA/G瓊脂糖珠中，4 °C旋轉(zhuǎn)結(jié)合過(guò)夜。10) Iml預(yù)冷PBS洗珠子4次4°C旋轉(zhuǎn)混合IOmin/次，接著3000g離心2min。11)用干凈的微量注射器徹底吸棄上清，瓊脂糖珠上結(jié)合的蛋白即為RORy抗體最終捕獲的產(chǎn)物。RNA 干擾I)干擾引物的設(shè)計(jì)上海英俊生物公司設(shè)計(jì)并合成ROR y、RIP140和HSP90小干擾RNA雙鏈，每個(gè)基因設(shè)計(jì)3個(gè)干擾片段，如下
權(quán)利要求
1.抑制CYP2C8基因表達(dá)的方法，其特征在于將RIP140的siRNA轉(zhuǎn)染入靶細(xì)胞I中，所述RIP140的干擾片段如SEQ ID NO USEQ ID NO 2和SEQ IDNO 3中任一所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于將HSP90的siRNA轉(zhuǎn)染入靶細(xì)胞II中，所述RIP140的干擾片段如SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 6中任一所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于所述靶細(xì)胞為HepG2細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法還包括陽(yáng)性對(duì)照組，所述陽(yáng)性對(duì)照組具體為將RORy的siRNA轉(zhuǎn)染入H印G2細(xì)胞中，所述RIP140的干擾片段如SEQ IDNO :7、SEQ ID NO 8 或 SEQ ID NO 9 中任一所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于在轉(zhuǎn)染H印G2細(xì)胞后，還包括鑒定步驟，具體為 1)提取未轉(zhuǎn)染siRNA的HepG2細(xì)胞中的總RNA，再逆轉(zhuǎn)錄成cDNA為模板；以CYP2C8基因特異Q-PCR引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；同時(shí)以人管家基因GAPDH作為參照物，進(jìn)行相對(duì)定量分析； 2)用雙Delta法進(jìn)行相對(duì)定量分析，其計(jì)算公式為
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述CYP2C8基因特異Q-PCR引物，其上游引物為 5’ -agatcagaattttctcaccc-3’，其下游引物為5’ _aacttcgtgtaagagcaaca_3’。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟I)中，PCR擴(kuò)增條件為95°C，5秒；57. 5°C, 15 秒；72°C, 20 秒；80°C，5 秒；40 個(gè)循環(huán)。
8.RIP140基因和/或HSP90在制備CYP2C8基因的介導(dǎo)基因中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因領(lǐng)域，特別涉及抑制CYP2C8基因表達(dá)的方法，具體為將RIP140的siRNA轉(zhuǎn)染入靶細(xì)胞中，所述RIP140的干擾片段如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3中任一所示，所述RIP140的核苷酸序列如SEQ IDNO10所示；本發(fā)明證實(shí)RIP140和HSP90蛋白是真正的RORγ相互作用蛋白，進(jìn)一步通過(guò)RNA干擾證實(shí)RIP140和HSP90蛋白能上調(diào)RORγ介導(dǎo)的CYP2C8基因的表達(dá)。這些結(jié)果支持了RORγ與其相互作用蛋白結(jié)合形成復(fù)合體，進(jìn)而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄下游靶基因的作用。
文檔編號(hào)C12N15/87GK102732562SQ20121021584
公開日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月27日
發(fā)明者倪東京, 倪兵, 吳玉章, 唐艷, 張軼, 田志強(qiáng), 田易, 黃澤民 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)