專利名稱：植物基因表達的控制的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因植物并涉及一種制備帶有可控制基因的轉(zhuǎn)基因植物的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及已被修飾的轉(zhuǎn)基因植物，以便使所需的導入的基因的表達被限制于一個植物發(fā)育的特定時期，一種特定的植物組織，特定的環(huán)境條件，或者特定時間或位置，或者是這些情況的組合。
在一種或多種有機體中可操作的各種基因表達控制因子是已知的，例如，PCT申請WO90/08826(Bridges，et al)公開了一種對一種外源化學誘導物敏感的可誘導的基因啟動子，稱做“基因開關(guān)”。這個啟動子可以與一個基因相連接并導入一種植物，該基因可以通過應(yīng)用化學誘導物直接激活啟動子而有選擇地表達。
PCT申請WO94/03619(Bright et al)公開了由一個與阻遏物基因相連接的基因開關(guān)和一個與能夠破壞植物發(fā)育的破壞蛋白相連接的可阻遏操縱子組成的基因盒。通過應(yīng)用或抑制一種化學誘導物可以控制植物的生長。當誘導物存在時，阻遏物可被表達，附著于破壞基因的啟動子被遏制，破壞蛋白不表達，附著于破壞基因的啟動子被遏制，破壞蛋白不表達，從而允許植物正常生長。如果抑制化學誘導物，基因開關(guān)被關(guān)閉，阻抑型啟動子沒有被阻抑，所以破壞蛋白被表達并且植物發(fā)育受到破壞。據(jù)說這一系統(tǒng)通過依賴于連續(xù)應(yīng)用化學誘導物進行連續(xù)生長和發(fā)育而控制植物不進入野生狀態(tài)，并通過在種子發(fā)育的最后時期阻抑化學誘導物而緩和谷粒收獲前發(fā)芽的問題。
Gatz和Quail(1988)和Gatz et al(1992)(Hoppe-Seyler，372659-660(1991)，公開了一個由應(yīng)用四環(huán)素所控制的植物活化阻遏物-操縱子系統(tǒng)。該系統(tǒng)由Tn10tet阻遏物基因和一個花椰菜花葉病毒(Ca MV)35S啟動子組成，它修飾后含有二個tet操縱子并與氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(cat)基因相連接(Gatz和Quail，1988)，或者它修飾后含有三個tet操縱子并連接到β-葡糖醛酸酶(gus)基因上(Gatz et al.，1992)。只要Tn10 tet阻遏物基因是具活性的，修飾后的啟動子就被阻遏物與tet操縱子的相互作用所遏止，并且cat或gus基因不表達。四環(huán)素的存在抑制了阻遏物的結(jié)合，使cat或gus基因表達。
發(fā)明概述在一個實施方案中，本發(fā)明涉及制備一種含有其表達可通過應(yīng)用外部刺激物而控制的基因的轉(zhuǎn)基因植物。該系統(tǒng)采用一種外部刺激物對基因表達進行正調(diào)控，不需要連續(xù)應(yīng)用外部刺激物維持基因表達。在第二個實施方案中，本發(fā)明也涉及制備轉(zhuǎn)基因親代植物，它們通過雜交產(chǎn)生能表達在任一親本中均不表達的基因的子代。通過控制影響植物表型的基因的表達，可以使植物生長在使一種表型呈優(yōu)勢的一套條件或一種環(huán)境中，然后移植植物或種植它的種子到使另一表型呈優(yōu)勢的另一套條件或另一種環(huán)境中。這項技術(shù)在農(nóng)業(yè)和園藝應(yīng)用上有特殊用途。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，將一系列序列導入一種植物，所述序列包含有一個連接到結(jié)構(gòu)基因上的瞬時激活啟動子，該啟動子和結(jié)構(gòu)基因被一個兩側(cè)結(jié)合有特異切除序列的封阻序列所分開，還包含一個可操縱地連接到編碼能夠識別所述特異切除序列的位點特異性重組酶的基因的阻抑型啟動子，和一個編碼特異于所述阻抑型啟動子的阻遏物的基因，所述阻遏物對外部刺激物敏感。沒有應(yīng)用外部刺激物時，結(jié)構(gòu)基因不表達。應(yīng)用刺激物時，阻遏物功能被抑制，重組酶被表達并導致在特異切除序列去除封阻序列，從而將結(jié)構(gòu)基因和瞬時活化啟動子直接連接。
在該實施方案的修改方案中，將編碼重組酶的序列借助一個病毒載體單獨地導入植物中。
在另一種可選用的實施方案中，沒有使用阻遏物基因或阻抑型啟動子。而是將重組酶基因連接到一個萌發(fā)特異性的啟動子上并導入到不含其他序列的另一種植物中。含有瞬時活化啟動子，封阻序列和結(jié)構(gòu)基因的植物和含有重組酶基因的植物雜交，產(chǎn)生含有所有序列的子代。當?shù)诙€瞬時活化啟動子變?yōu)榛罨瘯r，重組酶在子代中將封阻序列去除，使結(jié)構(gòu)基因在子代中表達，而結(jié)構(gòu)基因在兩個親本中不表達。
在另一個實施方案中，重組酶基因簡單地與一個誘導型啟動子連接。把植物暴露于特異于誘導型啟動子的誘導環(huán)境中可導致重組酶基因的表達和封阻序列的切除。
在所有這些實施方案中，當瞬時活化啟動子在正常生長和發(fā)育過程中變成有活性時結(jié)構(gòu)基因被表達，并只要瞬時活化啟動子是有活性的，則結(jié)構(gòu)基因?qū)⒊掷m(xù)地表達，而不需要連續(xù)的外部刺激。這個系統(tǒng)對下述種子發(fā)育是特別有用的，即一個特定性狀僅在該種子生長成的植物的第一代中需要，或者僅在隨后的代中需要一個性狀。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中特定的植物性狀的表達主要受外部控制。在一個實施方案中，所述控制是通過應(yīng)用一種外部刺激物而獲得；在另一個實施方案中所述控制是通過雜交獲得，在又一個實施方案中控制是通過將一種重組酶或重組酶基因直接導入到一種植物而獲得。本發(fā)明中的轉(zhuǎn)基因植物是通過把一系列功能相關(guān)的DNA序列導入植物的基因組而制得的，所述DNA序列含有以下基本因子一個在植物發(fā)育特定時期或在特定環(huán)境條件下有活性的植物活化啟動子(“瞬時活化啟動子”)，一種其表達導致植物表型改變的基因，該基因借助一個將瞬時活化啟動子和該基因分隔開的封阻序列連接到瞬時活化啟動子上；封阻序列旁側(cè)的特異切除序列，其中特異切除序列由位點特異性重組酶識別，一個編碼位點特異性重組酶的基因，一種連接到該重組酶基因的另外的阻抑型啟動子，和一個編碼特異于阻抑型啟動子的阻遏物的另外的基因，阻遏物的行為對所應(yīng)用的或外在的刺激敏感。這些因子可以以任何順序排列，只要能獲得下面描述的相互作用即可。在一個實施例中，優(yōu)選地將它們按如下排列含有瞬時活化啟動子，第一個特異切除序列，封阻序列，第二個特異切除序列，其表達導致改變的植物表型的基因的第一個DNA序列；含有可操作地連接于重組酶基因的阻抑型啟動子和任選的增強子的第二個DNA序列；含有編碼特異于可阻遏啟動子的阻遏物的基因的第三個DNA序列，它本身連接于植物中有功能的組成型啟動子。第三個DNA序列可以方便地作為定位于第一個DNA序列的封阻序列，但也可以不改變系統(tǒng)功能而獨立地存在。可將該實施例進行修飾，即將重組酶序列借助一個病毒載體單獨地導入。在另一個的實施方案中，優(yōu)勢的排列如下所述含有第一個DNA序列的第一個植物，該DNA序列包括瞬時活化啟動子，第一個特異切除信號序列，封阻序列，第二個特異切除信號序列，和其表達導致一個改變的植物表型的基因；含有第二個DNA序列的第二個植物，所述DNA序列包含一個可操作地連接到重組酶基因上的組成型植物活化啟動子(兩個植物雜交產(chǎn)生的子代含有所有上述序列)。
當一種植物含有任何一個實施例的基本元件時，其表達導致一個改變的植物表型的基因是不活化的，因為其是通過封阻序列與它的啟動子相分隔的。在第一個實施方案中缺乏外部刺激，阻遏物是活化的并阻遏控制重組酶表達的啟動子；在另一個可選擇實施方案中，重組酶不與第一個DNA序列存在于同一植物中。這樣一種植物將不顯示改變的表型并將產(chǎn)生使所繁殖的植物也不顯示改變表型的種子。當將阻遏物敏感的刺激物應(yīng)用于這一種子或這種植物時，阻遏物不再有功能，使位點特異性重組酶表達，或者，當通過雜交將該重組酶導入時，它在種子發(fā)芽過程中被表達，這兩者都導致在特異性切除信號序列間的封阻序列被去除。由于封阻序列的去除，瞬時活化啟動子變成直接連接于其表達導致一個改變的植物表型的基因上。從處理的或雜交的種子生長的植物或者一個處理的植物，將仍然不展示改變的表型，直到瞬時活化啟動子在植物發(fā)育過程中變成活化的，在這之后它所連接的基因被表達，植物才顯示出改變的表型。
如本說明書中使用的，瞬時活化啟動子是在植物發(fā)育的一個特定時期或在特定環(huán)境條件下是活化的任何啟動子，并且在其他時期基本失活。
植物活化啟動子是在一個感興趣的植物細胞中是活化的任何啟動子，植物活化啟動子可以是病毒，細菌，真菌，動物或植物來源的。
導致產(chǎn)生一個改變的植物表型的基因是其表達導致植物顯示一種或多種使之區(qū)別于不表達該基因的同種類植物的性狀的任何基因。這種改變的表型的例子包括不同的生長習性，改變的花或果實的顏色或質(zhì)量，過早開花或晚開花，增加或減少產(chǎn)量，不育性，死亡率，感病性，改變的次生代謝物的產(chǎn)生，或者改變的作物特性如氣味或外觀。
如果基因和啟動子是在DNA的相同鏈上，在相同取向上，并且相對的定位是使啟動子指導基因的轉(zhuǎn)錄(也即順式)，則該基因和啟動子就被認為是可操作地連接。啟動子和基因之間存在插入DNA序列不排除可操作的關(guān)系。
封阻序列是阻止啟動子指導靶基因表達的任何長度的DNA序列。
特異切除序列是一個由位點特異性重組酶所識別的DNA序列。
重組酶是識別一個特異切除序列或一套特異切除序列并導致特異切除序列間的DNA的去除或者改變特異切除序列間的DNA的一種酶。
阻遏物元件是一種作用為阻止另一個可表達基因的表達的基因產(chǎn)物。阻遏物元件可以包括蛋白質(zhì)，RNA或DNA。
阻抑型啟動子是一種被阻遏物元件所影響的啟動子，以便使連接于阻抑型啟動子的基因的轉(zhuǎn)錄被阻止。
在一個優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因植物或種子，所述種子在用外部刺激物處理后產(chǎn)生的植物所產(chǎn)生的種子不能萌發(fā)(但其它方面不改變)。如果瞬時活化啟動子是只在胚胎發(fā)生晚期有活性，那么它所連接的基因?qū)⒅辉诜N子發(fā)育或成熟的最后階段被表達。如果連接于該啟動子上的基因是一個致死基因，它將使得該植物產(chǎn)生的種子不能萌發(fā)。在最初轉(zhuǎn)化的植物細胞中，這一致死基因是不表達的，這不僅是由于該啟動子本質(zhì)上是不活化的，而且也因為存在一個把致死基因與它的啟動子分開的封阻序列。同時在這些細胞的基因組內(nèi)還包括連接到一個阻抑型啟動子上的重組酶基因，和編碼阻遏物的基因，該阻遏物呈組成型地表達并阻遏重組酶的表達。這些植物細胞可以再生為一個完整的植株并能夠產(chǎn)生種子，成熟的種子接觸一種刺激物，如一種化學試劑，便抑制了阻遏物的功能。由于阻遏物被抑制，驅(qū)動重組酶基因的啟動子去阻遏并且重組酶基因被表達。所得到的重組酶識別側(cè)接于封阻序列的特異切除序列，并導致封阻序列的去除，晚期胚胎發(fā)生啟動子和致死基因就直接相連了。然而，由于啟動子在植物生命循環(huán)的這個時期不是活化的，致死基因不表達。將這一種子種植，并生長產(chǎn)生一個所期望的植物的作物，由于作物成熟并產(chǎn)生第二代種子，晚期胚胎發(fā)生啟動子變成活化的，致死基因在第二代種子成熟時被表達，從而使種子不能萌發(fā)。以這樣的方式，可以避免偶然的重播種，作物逃脫到耕作面積以外的區(qū)域或者貯存種子萌發(fā)。
在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及一對轉(zhuǎn)基因植物，它們雜交能產(chǎn)生顯示親本中沒有的表型的子代。在該優(yōu)選實施方案中，只在晚期胚胎發(fā)生活化的瞬時活化啟動子可以借助一個被特異切除序列在兩端結(jié)合的封阻序列連接到致死基因上。將這些遺傳序列導入到植物細胞，產(chǎn)生一個轉(zhuǎn)基因親本植物。將重組酶基因連接到一個萌發(fā)特異性啟動子并導入另外的植物細胞產(chǎn)生第二個轉(zhuǎn)基因親本植物。如果第一個和第二個轉(zhuǎn)基因親本植物雜交，子代將既含有被阻遏的致死基因也含有重組酶基因。在種子萌發(fā)時重組酶被表達并導致封阻序列的去除，正如第一個實施例，從而直接將致死基因和瞬時活化啟動子相連。正象在第一個實施例中，這個啟動子在第二代種子成熟過程中變得有活性，導致種子不能萌發(fā)。理想的情況是，第一個親本以一個雄性不育基因作為封阻序列，并包括一個除莠劑抗性基因。以這樣的方式，避免了第一個轉(zhuǎn)基因親本植物的自花傳粉。通過應(yīng)用除莠劑可消除自花傳粉的第二個轉(zhuǎn)基因親本植物，在雜交子代中，雄性不育基因由重組酶去除，導致產(chǎn)生能夠自花傳粉的雜交子代。
在另一個實施例中，將重組酶基因連接到一個可誘導的啟動子上。這樣的啟動子的例子包括銅，可控制的基因表達系統(tǒng)(Mett et.al.，1993)和甾類化合物誘導的基因系統(tǒng)(Schena et al.，1991)。把轉(zhuǎn)基因植物與特異于誘導型啟動子的誘導物相接觸導致重組酶基因的表達和封阻序列的切除。當瞬時活化啟動子變得有活性時導致一種改變的植物表型的基因被表達。
可以利用任何合適的瞬時活化啟動子，選擇一個合適的啟動子必須考慮植物類型和尋求控制的表型性狀。優(yōu)選地，瞬時活化啟動子不是一個“滲漏型”啟動子，意思是它基本上只在一個規(guī)定好的植物生長階段或特殊的環(huán)境條件下有活性，并在所有其他時期基本沒活性。這一性質(zhì)阻止了系統(tǒng)的未成熟“觸發(fā)”。已有大量已公開的瞬時活化啟動子的例子，它們可用于本系統(tǒng)。選擇一個合適的啟動子原則上考慮的是植物生命時期在此時期希望有改變的表型表達。如果期望在第一代后有該表型表達，優(yōu)選的是在種子產(chǎn)生期間是活化的啟動子，因為它在第一代植物生長的營養(yǎng)期將不活化。如果期望在第一代本身的某些時候有改變的表型表達，一個在較早期是活化的啟動子是合適的。對本領(lǐng)域內(nèi)熟練技術(shù)人員來說顯而易見的是，在那些應(yīng)用阻抑型啟動子系統(tǒng)的實施例中，對植物應(yīng)用外部刺觸來激發(fā)系統(tǒng)的時間應(yīng)該早于對于預(yù)期顯示改變的表型的植物的世代，所選擇的瞬時活化啟動子是活化的時期。如果期望在第一代之后出現(xiàn)改變的表型，則一個在胚胎發(fā)生晚期活化的啟動子，如LEA啟動子，Hughes和Galau，1989和1991，Galau，et al.1991，1992和1993是理想的，因為該啟動子僅在第一代植物完成一個營養(yǎng)生長季節(jié)之后，在種子中形成胚胎時活化(胚胎發(fā)生最終是在大多數(shù)其它果實和種子結(jié)構(gòu)形成之后的種子形成的最后時期)。
連接到植物發(fā)育啟動子上一個或多個基因可以是其表達導致產(chǎn)生一個所期望的可檢測的表型的任何基因。該表型可以是在一種情況下一種植物所期望的任何一種性狀，而在另一情況下不希望出現(xiàn)的性狀，如雄性不育，干旱抗性，昆蟲抗性，早或晚種子萌發(fā)或早或晚開花。通常一種植物可以擁有在某些條件下或以某些方式是有利的但是對植物有一定代價的性狀。例如，具昆蟲抗性的性狀可能涉及以植物的一定的代謝消耗產(chǎn)生次生植物代謝物或結(jié)構(gòu)。這在存在害蟲的環(huán)境是有利的，而在不存在害蟲時基本上是一個不必要的負擔。另一個例子是一年生瓜果作物的種子的生產(chǎn)，如西瓜。顯然，至少一代植物產(chǎn)生種子是必要的，所以一個種子公司可以生產(chǎn)種子，銷售給種植者，但是從那樣的種子生長的無籽瓜果作物是商業(yè)上需要的。還有另一個例子是在谷類作物中使種子容易而快速萌發(fā)的性狀，以最小的努力盡可能快地長成一種作物是有利的，但是如果它導致所收獲的谷物在谷物包里萌發(fā)卻是非常令人不滿意的。還有一個例子是在一個地方或季節(jié)是合乎需要的植物(象一種冬季飼料)，但是在另一地方被當作雜草。如果第二代種子不能萌發(fā)，那么就可防止收獲后的萌發(fā)，防止植物通過自然的種子散布“逃脫”進入不期望的位置，或者防止偶然的再播種。較有利的是這最后兩個例子可以利用致死基因(即一個其表達在一定程度上干擾植物生長或發(fā)育的基因)，以使第二代種子不萌發(fā)，或者最后的例子中可以采用任何導入能降低植物活力象易感病性，早開花，低種子生產(chǎn)或無籽的性狀的基因。核糖體抑制蛋白(“RIP”)基因是一種優(yōu)選的致死基因，皂草素6 RIP(Gen Bank IDSOSAPG，Accession NO.X15655)是特別優(yōu)選的。RIP直接干擾植物細胞中所有蛋白質(zhì)的表達，而對其他有機體沒有毒性。RIP在胚細胞中的表達將完全阻止種子的萌發(fā)。
封阻序列可以是任何阻止連接到瞬時活化啟動子上的基因的表達的序列，例如終止信號，但在那些利用阻抑型啟動子的實施例中優(yōu)選的是編碼阻遏物的序列。以這樣的方式，當封阻序列被切除，阻遏物基因就被消除，從而進一步使后期抑制該系統(tǒng)的機會降到最小。在雜交實施例中，優(yōu)選的是，封阻序列是一個產(chǎn)生雄性不育性的基因(如連接到一個花藥特異性啟動子上的致死基因)。以這樣的方式，雜交便容易進行，但是封阻序列被重組酶去除時，雜交子代將能自花授粉。
在那些利用阻抑型啟動子系統(tǒng)的實施例中，編碼阻遏物的基因?qū)ν獠看碳っ舾?，或編碼本身對一種外部刺激敏感的阻遏物元件，以便阻遏物功能可以受外部刺激所控制。這種刺激物優(yōu)選的是通常不與植物接觸的刺激物，例如一種特定的化學物質(zhì)，溫度休克，或滲透休克。以這樣的方式，簡單地利用刺激物將封阻重組酶的阻遏，當然會存在阻遏物被偶然封阻的低可能性。如果阻遏物對一種化學刺激物敏感，那么這種化學物質(zhì)較好的是對作物和非害蟲動物非毒性的。一種優(yōu)選的系統(tǒng)是Tn10 tet阻遏物系統(tǒng)，它對四環(huán)素敏感，見Gatz和Quail(1988)；Gatz，et al(1992)。在這個系統(tǒng)中，利用一種含有一個或多個，優(yōu)選三個tet操縱子的經(jīng)修飾的花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子；Tn10 tet阻遏物基因產(chǎn)生一個結(jié)合于tet操縱子的阻遏物蛋白并阻止了該啟動子所連接的基因的表達。四環(huán)素的存在抑制了Tn10 tet阻遏物結(jié)合到tet操縱子上，使連接的基因自由表達。由于刺激物四環(huán)素不是一種植物正常接觸的物質(zhì)，所以這個系統(tǒng)是優(yōu)選的，這樣它的運用是可以控制的。同時，由于四環(huán)素對植物或動物無有害影響，它的存在將不妨礙植物的正常生長發(fā)育，并且處理后在種子或植物中的殘留量將不會顯著地影響環(huán)境。其他阻抑型啟動子系統(tǒng)的例子由Lanzer和Bujard(1988)和Ptashne等人所描述。
重組酶/切除序列系統(tǒng)可以是任何在植物基因組中有選擇地去除DNA的系統(tǒng)。切除序列優(yōu)選地在植物中是唯一的，從而不會發(fā)生植物基因組中不期望發(fā)生的切割。這樣的系統(tǒng)的幾個例子由Sauer，U.S.專利4,959,317和Sadowski(1993)所討論。一種優(yōu)選的系統(tǒng)是細菌噬菌體CRE/LOX系統(tǒng)，其中CRE蛋白的作用為在LOX位點進行DNA位點特異重組。其他系統(tǒng)包括解離酶(Hall 1993)，F(xiàn)LP(Pan.et al1993)，SSV1編碼的整合酶(Muskhekishvili，et al.1993)，和玉米Ac/Ds轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)(Shen和Hohn，1992)。
用于靶植物實際轉(zhuǎn)化的方法對本發(fā)明不是關(guān)鍵。植物的轉(zhuǎn)化優(yōu)選的是永久的，例如通過在植物基因組中整合導入的序列，以使導入的序列通過連續(xù)的植物繁殖而傳遞。有許多本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員所熟知的植物轉(zhuǎn)化技術(shù)，并且新技術(shù)接連變得已知了，任何適合于靶植物的技術(shù)都可以用于本發(fā)明。例如可以以各種形式導入序列，如一條DNA鏈，在質(zhì)粒中或在人工染色體中。序列導入到靶植物細胞可以通過許多技術(shù)完成，例如磷酸鈣DNA共沉淀，電穿孔，顯微注射，土壤桿菌感染，脂質(zhì)體或微射彈轉(zhuǎn)化。本領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)可以參考文獻得到詳情，并不需要過分的實驗。
可用許多方法將重組酶基因?qū)氲睫D(zhuǎn)基因植物中。該基因可以和所有其它基本序列一起導入，如在上述的第一個優(yōu)選的實施例中。阻抑型啟動子/重組酶構(gòu)建體還可以直接借助一個病毒載體導入含有該系統(tǒng)的其它序列組分的轉(zhuǎn)基因植物。將所有必需序列導入一個單一植物的其他方法是上述的第二個優(yōu)選的實施例，包括含有瞬時活化啟動子/結(jié)構(gòu)基因序列和封阻序列的第一個轉(zhuǎn)基因植物，和包含連接到一個萌發(fā)特異性植物活化啟動子上的重組酶基因的第二個轉(zhuǎn)基因植物，兩種植物用常規(guī)方法雜交產(chǎn)生含有所有必需序列的雜交子代。
也可將重組酶以與一種化合物例如生物素的共軛物的形式直接導入到一種轉(zhuǎn)基因植物中，該共軛物被轉(zhuǎn)送到細胞中，見Horn，et al.(1990)。
用于將轉(zhuǎn)化細胞再生成整個植株的方法對本發(fā)明不是關(guān)鍵的，并且可以使用任何對靶植物合適的方法。文獻中描述了許多用于再生特定植物類型的技術(shù)(如，通過體細胞胚胎發(fā)生，Umbeck，et al.1987)，更多的技術(shù)正在變成已知的，本領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)可以參考文獻獲得詳情并選擇合適的技術(shù)而不需要過分的實驗。
本發(fā)明可以用來制備各種轉(zhuǎn)基因植物。該方法特別適用于由種子種成的一年生作物植物。這些植物包括，但不限于，纖維作物如棉花和亞麻；雙子葉種子作物如大豆，向日葵和花生，一年生觀賞花植物；單子葉谷類作物如玉米，小麥和高粱；葉子類作物如煙草；蔬菜類作物如萵苣，胡蘿卜，花莖甘藍，卷心菜和花椰菜；和蔬果料作物如西紅柿，小西葫蘆，西瓜，甜瓜和南瓜。
下面的例子用于闡明，但不限制所要求的發(fā)明。
實施例1致死(RIP)編碼序列的選擇目前存在有兩類生物技術(shù)上相關(guān)的編碼蛋白質(zhì)的基因，當它們在植物細胞中表達時導致細胞死亡。這些類別是1核酸酶；例如芽孢桿菌RNA酶(Barnase)和核糖核酸酶A和2催化致死蛋白；例如白喉毒素和核糖體抑制蛋白(RIP)。如果基因是在組織或細胞特異性轉(zhuǎn)錄啟動子的控制下，則可將來自于任何一類的蛋白質(zhì)(或者任何細胞毒素蛋白質(zhì)，或由這樣一種蛋白質(zhì)酶促產(chǎn)生的產(chǎn)物)成功地用于特異性細胞類型的遺傳脫離(ablation)。為了檢測煙草中的各種保護系統(tǒng)的效能，編碼任何已知的致死基因的序列是合適的。由于這些蛋白質(zhì)可以影響種子，致死基因表達的靶組織的最終質(zhì)量，在商品棉花中只有某些選擇的致死基因可以利用。核糖體抑制蛋白(該蛋白質(zhì)應(yīng)該是在臟器中敏感于蛋白酶抑制的)和核酸酶很可能是在棉花種子中表達的候選物。如果種子不是作物商業(yè)價值的一個因素(例如飼料作物，觀賞作物或為花工業(yè)培養(yǎng)的植物)任何致死基因應(yīng)該都可接受。在我們的實施例中我們已經(jīng)選擇核糖體抑制蛋白(RIP)皂草素和芽孢桿菌RNA酶(來自于解淀粉芽孢桿菌)作為在種子發(fā)育后期表達的細胞致死蛋白。
RIP編碼序列(CDS)在其5’末端(前RIP蛋白的N-末端)含有一個75個堿基對長的轉(zhuǎn)運信號序列。成熟的RIP的編碼序列起源于一個如Barthelemy等人(1993)所描述的從Saponaria officinalis種子cDNA文庫中分離得到的cDNA克隆，信號序列來源于一個完整的RIP基因，皂草素6(Gen Bank ID SOS AP6，入藏號X15655)的序列。將編碼信號序列的核苷酸與編碼成熟編碼區(qū)連接的構(gòu)建體作為一個EcoRI片段克隆到通用克隆載體pBluescriptIIKS+(Stratagene)。該構(gòu)建體被命名為Del3。修飾這個序列來構(gòu)建含有起始于ATG密碼子但是去除編碼信號序列的核苷酸的成熟的RIP編碼區(qū)的第二個質(zhì)粒。這個構(gòu)建體命名為Del 1。Del 3編碼帶有信號序列的RIP，其表達時導致蛋白質(zhì)從細胞中分泌出來，但不導致細胞死亡，所以用作系統(tǒng)的一個可檢測的對照。Del 1編碼一個當其表達時保留在細胞質(zhì)中并因此是細胞毒素的RIP。
為了制備用于特異性啟動子融合構(gòu)建體的RIP構(gòu)建體(Del 1和Del 3)，將一個NcoI位點導入在兩個RIP序列的每一個5引導末端的5′ATG序列中。這通過利用PCR誘變獲得。帶有在RIP序列中產(chǎn)生NcoI位點的突變并跨越pBluescriptIIKS+質(zhì)粒的多克隆位點部分的引物的3′-GAAGTAGTGATCGGTACCAGTGTAGTT-5′(用于Del 1)和3′-GTAGTGATCGGTACCTCTATATACAACATCG-5′(用于Del 3)與針對RIP序列下游的pBluescript序列的引物一起使用。將通過PCR產(chǎn)生的突變的RIP序列，Del 1Nco和Del 3Nco分別單獨地直接克隆到載體pCRII(In Vitrogen)得到源載體，pDel 1Nco和pDel 3Nco。完整的RIP序列可以從這些構(gòu)建體中分離，作為RIP盒亞克隆到啟動子構(gòu)建體。
實施例2Lea(晚期胚胎發(fā)生高豐度)啟動子的分離和誘變用于此實施例中的Lea啟動子來自于兩種Lea基因，Lea4A和Lea14。這些啟動子的選擇取決于他們的表達特征，如Hughes和Galat，1989和1991，Galau et al 1991，1992和1993所報道的，在胚胎發(fā)生過程中和在成熟的植物組織中，在棉花品種Coker201中的轉(zhuǎn)錄物積累水平的時間，和已公開基因序列的可用性(GenBank)。兩個基因在種子發(fā)育后期被表達并在成熟組織中似乎不脫落酸受控于植物激素脫落酸(ABA)。每個基因的啟動子序列是通過利用跨越Lea蛋白質(zhì)編碼區(qū)的5′末端到每個啟動子的轉(zhuǎn)譯起始位點上游大約2000堿基處的序列的嵌套引物，經(jīng)PCR從Coker 201基因組DNA產(chǎn)生而來的。對于Lea 4A，外部引物是在位置-2043(堿基1＝ATG的A)，5′-CCCCTCCTATGACCAAGTTACC-3′和+279，5′-CCCTTCAGTTCCTAGTTGTTGC-3′，內(nèi)部引物是在位置-2018，5′-GCTCCAAACGAGTTGACTTTGAC-3′和+258，5-ACTTTGTGCCTCCCTTTTCATC-3′。對于Lea14，外部引物是在位置-2113，5′CTAACTCCTCTTCTCAGGCAAATG-3′和+342，5′-TTGTGTCGCTGTCTTTCAATG-3′，并且內(nèi)部引物是在位置-1846，5′TCAGCTCGTCTGCTTCATACCAAC-3′和+172，5′-CAAATGGGGATGGAATGGCTGTAG-3′。在兩種情況下，初級擴增反應(yīng)利用外部引物來完成，并從這個反應(yīng)的產(chǎn)物中，利用內(nèi)部引物對從次級反應(yīng)中分離得到最后的啟動子片段。將Lea4A誘變的最后產(chǎn)物克隆到pCRII，將Lea14產(chǎn)物克隆到pBluescript IIKS+，以產(chǎn)生Lea啟動子源質(zhì)粒pCLea4p和pKSLea14p。
為了克隆的目的(也即將啟動子連接到RIP序列，以便將來自Lea啟動子片段的5′-未轉(zhuǎn)譯前導序列直接連接到RIP編碼序列的ATG)，利用誘變引物PCR使lea啟動子片段突變以便在5′前導序列的末端產(chǎn)生NcoI位點。利用上游內(nèi)部引物和新誘變的引物，通過PCR合成lea啟動子片段并克隆到pCRII以便產(chǎn)生突變的Lea啟動子源質(zhì)粒pCmLea4p和pCmLea14p。與相應(yīng)的上游內(nèi)部引物一起應(yīng)用的誘變引物對于Lea4A為5′-CTCTGACGCCATGGTTCTTCTTGC-3′，對于Lea14為5′-CCAACAACTGCGCCATGGCGTACAAAGTC-3′。
實施例3利用Lea啟動子和RIP構(gòu)建致死基因3.1編碼區(qū)將含有每個突變Lea啟動子片段和每個RIP編碼區(qū)結(jié)構(gòu)的嵌合部分基因組裝并置于貯用載體pBluescript，然后克隆進入一個植物轉(zhuǎn)化中間載體。對Lea4-Del1和Del3聯(lián)合體，從pCmLea4p中分離得到Sal I/NcoI片段形式的Lea4啟動子片段并連接到用同樣兩種酶切割的pDel 1Nco和pDel3 Nco。這產(chǎn)生了Lea4嵌合基因源質(zhì)粒pCmLea4 Del 1和pCmLea4 Del3。為了克隆，SalI片段形式的Lea4-Del1和Del3盒是可去除的。Del1和Del3裂縫(rip)序列可通過用NcoI和XbaI限制酶消化從pDel1Nco和pDel3Nco中分離得到并連接到用同樣兩種酶切割的突變的Lea14 pBluescript結(jié)構(gòu)中。這產(chǎn)生了Lea14嵌合部分基因源質(zhì)粒pKSmLea14Del1和pKSmLea14Del3。
為了產(chǎn)生完整的Lea Rip基因，將含有一個多聚腺苷酸化位點和一個轉(zhuǎn)錄終止序列(3′終止子)的3′非翻譯區(qū)加到RIP編碼序列的3′末端。對于所有構(gòu)建體這可通過將一個含有來自基因7的3′終止區(qū)序列盒(根瘤土壤細菌章魚堿T-左區(qū))和一個慶大霉素抗性基因(以使植物轉(zhuǎn)化能夠利用各種各樣的土壤細菌菌株和雙載體系統(tǒng))裝配來完成。gene7 Term/慶大霉素盒可通過將一個來自含有基因7序列的pAP2034(Velten和Schell，1985)的EcoRI-SalI片段亞克隆到pBluescriptKS+來產(chǎn)生pg7KS質(zhì)粒來構(gòu)建。將來自pTC182(Charles和Nester，1993)的慶大霉素抗性盒的PstI片段插入基因73-終止區(qū)序列下游的PstI位點來產(chǎn)生質(zhì)粒pg7KSGm。
3.2將嵌合基因?qū)胍粋€植物轉(zhuǎn)化中間載體和根瘤土壤桿菌對于Lea4啟動子RIP構(gòu)建物，在Lea4啟動子/RIP編碼區(qū)已經(jīng)以一個EcoRI片段形式克隆到中間載體(雙性)pBin19之后，在SmaI-XbaI位點的RIP編碼序列緊接著的下游導入SalI填充的XbaI片段形式的gene7 Term/慶大霉素盒。這個過程產(chǎn)生了質(zhì)粒pBLea 4Del1g 7Gm和pBLea4Del3g7Gm。
對于Lea14啟動子RIP構(gòu)建物，在pKSmLea14Del1和pK SmLea14Del3的RIP編碼序列緊接下游的EcoRV和XbaI位點導入SalI填充XbaI片段形式基因7Term/慶大霉素盒。從這些構(gòu)建體中，將完整的基因構(gòu)建體加慶大霉素抗性標記以一個SalI-XbaI片段形式切下并克隆到中間載體(二性)pBin19多克隆位點的SalI和XbaI位點。這個過程產(chǎn)生了質(zhì)粒pBLea14 Del 1g 7Gm和pBLea14 Del3g 7Gm。
正如Walker Peach和Velten(1994)所述的，通過直接轉(zhuǎn)化，將這些構(gòu)建體個別地導入二種根瘤土壤桿菌菌株，EHA101(Hood et al，(1986)和GV3850(Van Haute et al.1983)。然后通過土壤細菌轉(zhuǎn)染，通過一個標準的葉片轉(zhuǎn)化過程將這些構(gòu)建體導入煙草Nicotiana benthemiana(Horsch et al.1985)。并通過一個下胚軸轉(zhuǎn)化過程導入棉花并借助體細胞胚胎發(fā)生過程再生(Umbeck et al(1987)。
選擇那些成功地生長到成熟，開花和產(chǎn)生種子的植物作為以正確方式表達Lea RIP基因的植物。然而帶有Lea RIP嵌合基因的種子不能萌發(fā)。這些植物將用于完全保護系統(tǒng)中驗證RIP的效率和Lea啟動子的發(fā)育控制。如果啟動子證明有滲漏并引起在成熟之前或種子成熟早期植物或植物組織的成熟前死亡，那么啟動子可以被誘變或減少為在種子成熟的正確時間嚴格表達的一個序列。
3.3非滲漏基因構(gòu)建體的選擇非滲漏Lea啟動子是通過在RIP編碼區(qū)附著之前即通過用只含有Lea啟動子的質(zhì)粒pCmLea4p或pCmLea14p進行Lea4或Lea14啟動子的誘變來獲得的。誘變是以幾種方法中的一種獲得的；通過隨機的方法通過利用多義引物集合的PCR方法(如由Zhao et al 1993所描述)，或者是通過利用與誘變引物一起使用的內(nèi)切酶抗性的α-thio鏈進行位點特異性誘變的方法(Olsen et al.1993)。正如Botstein et al 1985所述，還可將Lea啟動子亞克隆到一個M13基礎(chǔ)的載體，以便生產(chǎn)單鏈DNA，以該DNA作為底物，利用二亞硫酸鈉進行隨機化學誘變。
誘變之后，Lea啟動子的群體被分離并被亞克隆到一個pBin19中間轉(zhuǎn)化載體，從而產(chǎn)生一個突變Lea啟動子RIP/g 7Term嵌合基因構(gòu)建體的群體，按照Peach和Velten(1994)所描述的方法；采用直接轉(zhuǎn)化將它們導入合適的根瘤土壤桿菌(EHA101)菌株，得到的細菌培養(yǎng)物用作為接種物，用于轉(zhuǎn)化煙草。利用RIP作為可篩選的遺傳標記簡化了從突變?nèi)后w導找一個非滲漏的Lea啟動子的過程，其中如果一個轉(zhuǎn)基因植物能夠再生到成熟并從自身受精產(chǎn)生75％不能發(fā)育的種子那么它一定帶有一個Lea啟動子的非滲漏譯本。通過將植物生長過程中從用作樣品的葉子中分離得到的DNA進行PCR(利用已經(jīng)獲得的Lea引物)來回收突變啟動子，然后將這樣一個突變啟動子用于構(gòu)建用于煙草和棉花的完全系統(tǒng)。實施例4由35S啟動子驅(qū)動的tet阻遏物基因的構(gòu)建來自Tn10的四環(huán)素阻遏物基因的編碼序列可通過將含有附加體F′，1acq ZΔM15，proAB，Tn10(tetr)的一個E.coli細胞系中分離得到的總DNA進行PCR擴增分離得到。合成一組嵌套的PCR引物，即兩個外部和兩個內(nèi)部引物，以達到分離。5′內(nèi)部引物含有一個導致產(chǎn)生唯一的限制位點(Bgl II)的突變，有利于將阻遏物片段克隆到一個合適的載體。所用的外部引物是1)5′外部引物5′-GCAAGCAATACGCCAAAGTG-3′，來自于-234到-214(+1在ATG)位置，2)3′外部引物5′-GTCAACAGCAATGGATCACTGAA3′，來自于位置+859到+882(終止密碼子是在+621)。所用的內(nèi)部引物是1)5′突變內(nèi)部引物(含有一個在-2的Bgl II位點)5′-CAAAATTAGGAAGATCTGATGTCTAGATTAG-5′，來自位置-19到+13，和2)3′內(nèi)部突變引物5′-AGTGAACGCCGTTTCCATTTAGG-3′，來自位置+731到+754。在利用內(nèi)部引物組的第二次循環(huán)之后獲得的PCR片段被克隆進入pCRII來制備四環(huán)素阻遏物CDS源質(zhì)粒pCtetR。
為了產(chǎn)生一個被CaMV35S啟動子驅(qū)動的完整的嵌合四環(huán)素阻遏物基因，將四環(huán)素阻遏物CDS以一個Bgl II(在-2)-EcoRI(在+682)片段形式從pCtetR中移出并克隆在質(zhì)料pGG的BglII-EcoRI之間(Sutton et al，1992)。從而將四環(huán)素阻遏物CDS置于一個短的35S啟動子AMV 5′前導融合體和一個NOS3′終止序列之間來制備一個全長嵌合的四環(huán)素阻遏物基因。將得到的源質(zhì)粒命名為pGGtet Rl。為了重新構(gòu)建完整長度的35S啟動子，一個EcoRV到SalI片段(含有35S啟動子的116bp，AMV前導區(qū)，四環(huán)素阻遏物和NOS3′終止信號)被移到pMM23(Qin et al，1994)來制備pMM23tetR2。
將完整35S-AMV5′-tetR CDS-NOS3′Term基因以一個BamHI(NOS3′Term3′末端)-HindIII(35S啟動子的5′末端)片段形式從pMM3tet R2中切下并在多克隆位點的BamHI和HindIII位點克隆到中間載體(二性的)pBin19來產(chǎn)生pBintet1。將這個構(gòu)建物導入根癌土壤細菌的二個菌株EHA101和GV3850(如上所述)。為了在植物研究中評價在我們的構(gòu)建體中四環(huán)素阻遏物的活性和四環(huán)素阻遏35S啟動子的效率，利用一個標準葉片轉(zhuǎn)化過程(Horsch et al，1985)通過土壤細菌轉(zhuǎn)染將這些構(gòu)建體導入煙草種類Nicotiana benthemiana。這通過下面的過程來實現(xiàn)，tet操縱基因修飾的35S啟動子被用于代替在植物功能GUS質(zhì)粒pBI221(Clonetech實驗室Inc.)中的野生型35S啟動子。將得到的Op35S→GUS→NOS3′基因按照Nunberg和Thomas(1993)描述的方法電擊到轉(zhuǎn)基因煙草細胞系中表達tetR基因(內(nèi)標是一個野生型35S→Lux構(gòu)建體)?；钚缘乃沫h(huán)素阻遏將減少或消除電擊后的原生質(zhì)體中的GUS活性(相對于Lux)實施例5在四環(huán)素去阻遏35S啟動子控制下的CRE基因的構(gòu)建如Gatz et al.(1992)描述，將在同一位點含有三個tet操縱基因序列的一個35S啟動子構(gòu)建為一個在5′末端含有一個Eco RV位點和在3′末端為互補于XbaI5’突出端的3’突出端的雙鏈連接體形式。通過以一個步驟融合的方式將下面兩個寡聚核苷酸退火而構(gòu)建該連接體(按5′-3′描述)1ATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCC-CACTCTATCAGTGATAGAGTGTATATAAGACTCTATCAGTGATAGAGTGAACTC-TATCAGTGATAGAGTTAACGGTACCT and 2CTAGAGGTACCGTTAACTCTA-TCACTGATAGAGTTCACTCTATCACTGATAGAGTCTTATATACACTCTATCACT-GATAGAGTGGGATTGTGCGTCATCCCTTACGTCAGTGGAGAT將來自pMM23的完整35S啟動子以HindIII到XbaI片段形式亞克隆到HindIII和XbaI所切割的pBluescriptKS質(zhì)粒來產(chǎn)生pBSK35S。將35S啟動子/3tet操縱基因連接體克隆進入這個質(zhì)粒的未修飾的35啟動子內(nèi)的EcoRV和XbaI位點之間從而產(chǎn)生pBSK35S3O。含有這三個tet操縱基因位點的整個35S啟動子以HindIII到XbaI片段的形式從這個質(zhì)粒中分離并亞克隆回到pMM23來產(chǎn)生pMM23tet3O，這個質(zhì)粒因而含有了一個由35Stet操縱基因啟動子和NOS3′終止區(qū)序列所側(cè)接的CRE編碼序列。
完整的四環(huán)素可阻遏CRE嵌合基因以HindIII到SalI片段形式從pMM23tet3O中分離并克隆到中間載體(二性)pBin19的多克隆位點中的SalI和HindIII位點來產(chǎn)生pBin35S3OCRE。將這個構(gòu)建體導入兩種根癌土壤細菌的菌株EHA101和GV3850(如上所述)。然后將這個構(gòu)建體通過一個標準葉片轉(zhuǎn)化過程，(Horsch et al.，1985)，借助于土壤細菌感染導入煙草種類Nicotiana benthemiana。來自這個構(gòu)建體的CRE蛋白的表達以三種方式進行檢測；以CRE抗體免疫學測定CRE蛋白在轉(zhuǎn)化體中的水平；按照Sauer 1993所描述生化方法利用一個體外測定檢測CRE活性，或者第三，將一個表達可篩選酶活性的試驗質(zhì)粒通過電擊穿方法(Nunberg和Thomas 1993)直接地進入原生質(zhì)體內(nèi)(來自CRE被表達的任何植物，即對于后來的構(gòu)建體)。作為一個例子我們將一個LOX-tetR-LOX盒導入35S啟動子和GUSCDS之間的pBI221的BamHI位點(Clonetech實驗室Inc.)并篩選使tetR的NOS3′和pBI221的35S啟動子成一線的取向。CRE活性將移去P35S和GUS之間的LOX-tetr-LOX塊，激活GUS轉(zhuǎn)錄并因而產(chǎn)生可檢測的GUS活性。那些以高水平表達活性CRE蛋白質(zhì)的煙草植物可用于進行雜交來建立煙草中的完整的可切割-可阻遏的保護系統(tǒng)。
這個構(gòu)建體也可以如Umbeck et al 1987描述的方法通過下胚軸/土壤細菌轉(zhuǎn)化過程導入棉花和通過體細胞胚胎發(fā)生進行再生，這將產(chǎn)生作為CRE供體的棉花植物以在棉花中建立完整的可切割可阻遏的保護系統(tǒng)。同樣如所描述的測定煙草方法測定棉花的CRE表達。
實施例6將被阻遏的致死基因?qū)霟煵莺兔藁?.1將LOXL封阻序列加到Lea啟動子和RIP致死基因構(gòu)建體LOX位點僅可以一個方向用于這種類型的構(gòu)建體，因為在一種方向他們的導入將兩個ATG密碼子導入嵌合基因中的5′非轉(zhuǎn)譯前導序列，該嵌合基因暴露于CRE蛋白之后將不被切割。在一個5′-非翻譯前導序列中的這樣的ATG密碼子將抑制轉(zhuǎn)錄mRNA的轉(zhuǎn)譯，因而減少所期望的產(chǎn)物，在這個例子中是RIP，的水平。另外，由于期望把封阻序列放在幾個不同啟動子-CDS構(gòu)建體的5′非轉(zhuǎn)譯前導序列中，令人滿意的是將它克隆進入在所有構(gòu)建體的CDS的起始處的普通NcoI位點。這會導致在封阻序列克隆和切除之后，將另一個ATG序列也導入這個區(qū)域，所以一個導入的LOX連接體的5′末端的NcoI序列必須是在切割和除去之后額外的ATG不被導入該序列的序列。因而合成了下面的NcoI連接體以制備一個通過一系列不對稱限制性位點從RIP編碼序列分離而來的Lea啟動子，以便以一個指定的取向?qū)隠OX位點和封阻序列，并消除一個額外ATG序列導入的問題。連接體序列是上鏈5′-CATGTCTTCGAATTCGCCAC-3′，下鏈5′-CATGGTGGCGAATTCGAAGA-3′。在寡聚核苷酸退火之后，該連接體有5′和3′末端的NcoI特異性突出端，在中央的一個EcoRI位點和一個BgsI位點(補償切割)，該位點將除去過量的NcoI位點，在導入的LOX位點的CRE指導的切割過程中產(chǎn)生了過量NcoI位點。
全長的Lea啟動子/可切割填充片段(LOX-35S-tet R-g 7-LOX)/RIP-Nos3′構(gòu)建體的構(gòu)建由于其大小和在Lea啟動子中的不同位點變得更復(fù)雜化。下面的例子描述了Lea4和Lea14啟動子系統(tǒng)的構(gòu)建，但是，同樣的方法可以用于所有可能的能用于完全系統(tǒng)中的Lea或其它啟動子。6.1.1 Lea14-LOXL-Nos3′-tetR-35S-LOXR-RIP-g7構(gòu)建體的組裝通過PstI消化從pKSm Lea14 Del 1g 7Gm中去除慶大霉素抗性盒、片段純化和隨后的連接，獲得了一個起始質(zhì)粒pKSm Lea 14 Del1g7。然后將此質(zhì)粒用NcoI進行切割(在預(yù)先置于Lea14啟動子和Del 1 CDS之間的單一NcoI位點切割)并在一個上述的含有過量NcoI連接體的連接反應(yīng)中用作載體源來產(chǎn)生pKSm Lea14 NcoIad Del 1g 7。NcoI連接體的成功導入通過Eco RI消化進行檢測并采用序列分析證明。這個質(zhì)粒用BbsI和BamHI消化以移去Del 1/g 7區(qū)并產(chǎn)生一個載體-Lea14啟動子BbsI/BamHI片段，該片段經(jīng)凝膠純化后為LOXL(5′切除序列)連接體的一個靶。
通過將兩條合成的寡聚核苷酸上鏈5′-CGCCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATG-3′，下鏈5′-GATCCATAACTTCGTTATAATGTATGCTATACGAAGTTA T-3′退火構(gòu)建用于融合Lea14啟動子的一個LOXL連接體。這個連接體退火后產(chǎn)生一個BbsI特異性5′突出端和一個BamHI3′特異性突出端。將LOXL(Lea14)連接體連接到載體-Lea14啟動子BbsI/BamHI片段以產(chǎn)生源質(zhì)粒pKSm Lea14LOXL。
用NcoI和HindIII消化起始質(zhì)粒pKSm Lea14 Del 1g 7以去除Lea14啟動子并產(chǎn)生一個Del 1/g 7 NcoI/HindIII片段，該片段經(jīng)凝膠純化為LOXR(3′切除序列)連接體的靶。
通過將兩條合成的寡聚核苷酸上鏈；5′-AGCTTATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCCAC-3′，下鏈；5′-CATGGTGGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATA-3′退火而構(gòu)建用于融合到Del 1 CDS上的LOXR連接體。一旦退火這個連接體即產(chǎn)生一個HindIII特異性5′突出端和一個NcoI3′特異性突出端。將LOXR連接體連接到Del 1/g7 NcoI/HindIII片段以產(chǎn)生源質(zhì)粒pKSLOX RDel 1g 7。
通過來源于前面提到的源質(zhì)粒的凝膠純化片段的三片段連接將最后的構(gòu)建體，Lea14-LOXL-Nos3′-tetR-35S-LOXR-RIP-g7組裝在pBluescriptIIKS+載體上。三個片段如下；1.一個來自于含有全長35S-AMV5′tetRCDS-Nos 3′Term基因的pMM23tetR2的BamHI/HindIII片段；2.一個來自含有完整的LOXR-Del 1-g7序列的pKSLOXRDel1g7的HindIII/SacI片段；3.一個來自含有完整BluescriptIIKS+載體和Lea14啟動子-LOXL序列的pKSm Lea14LOXL的BamHI/SacI片段。連接反應(yīng)產(chǎn)生源質(zhì)粒pKSm Lea14LOXLNos3′tet R35SLOXRDel 1g 7。
全長的Lea14LOXLNos3′tetR35SLOXRDel 1g7構(gòu)建體以SmaI/SalI片段形式從ppKSm Lea14 LOXLNos3′tet R35SLOXRDel 1g 7中切下，并克隆進入中間載體(二元的)pBin19的多克隆區(qū)的SmaI和SalI位點以產(chǎn)生pBmLea14LOXLNos3′tet R35 SLOXRDel 1g 7，將此構(gòu)建體導入根瘤土壤細菌的GV3850菌株。然后通過一個標準葉片轉(zhuǎn)化過程(Horsch et al.1985)通過土壤細菌轉(zhuǎn)染將這個構(gòu)建體導入煙草種類Nicotiana benthemiana。對于棉花轉(zhuǎn)化，優(yōu)選使用土壤細菌菌株EHA101，然而由于此土壤細菌菌株攜帶了一個卡那霉素抗生素標記，所以使用卡那霉素的篩選含有帶有它自己的卡那霉素抗性基因的pBmLea14 LOXLNos3′tet R35SLOXRDel 1g 7轉(zhuǎn)化的EHA101變得復(fù)雜，因為確實不含質(zhì)粒的土壤細菌細胞也能在抗生素處理中存活。為了篩選僅含有pBmLa14 LOXLNos3′tet35SLOXRDel 1g 7的土壤細菌細胞，將一個慶大霉素抗性基因(Gm)盒導入這個質(zhì)粒，方便地是作為一個PstI片段導入。因而含有pBmLea14 LOXLNos3′tet R35SLOXRDel 1g 7Gm的轉(zhuǎn)化的土壤細菌細胞是通過慶大霉素處理而進行篩選。6.1.2 Lea4-LOXL-Nos3′-tetR-35S-LOXR-RIP-g7構(gòu)建體的組裝通過將一個EcoRI片段形式的來自pCmLea4的突變的Lea4啟動子亞克隆進入pBluescriptIIKS+，獲得一個起始質(zhì)粒pKSmLea4。將這個質(zhì)粒然后用NcoI(切割位于預(yù)先置于Lea14啟動子和Del 1 CDS之間的單一NcoI位點)切割，并用作含有一個上述的過量的NcoI連接體的一個連接反應(yīng)中的載體源，產(chǎn)生pKSmLea4NcoIad。NcoI連接體的成功的導入可通過EcoRI消化測試并可以采用序列分析證明。從這個質(zhì)粒中以EcoRI片段形式切下突變的Lea4啟動子/NcoI連接體序列，并克隆進入pUC18的EcoRI位點(以在突變Lea4啟動子的5′末端導入一個BamHI位點)以產(chǎn)生源質(zhì)粒pUC18mLaea4Ncoad。將這個質(zhì)粒用BbsI和BamHI消化產(chǎn)生載體-Lea4啟動子BbsI/BamHI片段，所述片段經(jīng)凝膠純化作為LOXL連接體的靶。
通過將兩條合成的低聚核苷酸，上鏈；5′-AACCATAACTTCGATATAGCATACATTATACGAAGTTATG-3′，下鏈；5′-GATCCATAACTTCGTTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3′退火，構(gòu)建一個用于融合到Lea4啟動子的LOXL連接體，一旦退火該連接體即產(chǎn)生一個BbsI特異的5′突出端和一個BamHI特異3′突出端。將此LOXL(Lea4)連接體連接到載體-Lea4啟動子BbsI/BamHi片段來產(chǎn)生源質(zhì)粒pUC18m Lea4LOXL。
最后的構(gòu)建體，Lea 4-LOXL-Nos3′-tetR-35S-LOXR-RIP-g7通過將來源于前面提到的源質(zhì)粒的凝膠純化片段的三片段連接而組裝在pUC18載體上。三個片段如下；1.一個來自含有全長的35S-AMV5′-tetR CDS-Nos3′Term基因的pMM23tet R2的BamHI/HindIII片段；2.一個來自含有完整的LOXR-Del 1-g7序列的pKSLOXRDel 1g 7的HindIII/PstI片段；和3.一個來自含有完整的pUC18載體和Lea4啟動子-LOXL序列的pUC18m Lea4LOXL的BamHI/PstI片段。這個連接反應(yīng)產(chǎn)生源質(zhì)粒pUC18m Lea4LOXLNos3′tet R35SLOXRDel 1g 7。
全長的Lea 4 LOXLNos3′tet R35SLOXRDel 1g 7構(gòu)建體以SmaI/SalI片段形式從pPKSm Lea4LOXLNos3’tet R35SLOXRDel 1g 7中移去并克隆進入中間載體(二元的)pBin19的多克隆區(qū)的SmaI和SalI位點來產(chǎn)生pBmLea4LOXLNos3′tetR35SLOXRDel 1g 7。將這個構(gòu)建體導入根癌土壤細菌的GV3850菌株。通過一個標準葉片轉(zhuǎn)化過程(Horscheta1.，1985)，通過土壤細菌轉(zhuǎn)染將構(gòu)建體導入煙草種類Nicotiana bentbemiana。同樣，對于棉花轉(zhuǎn)化，如果用到EHA101，那么為了轉(zhuǎn)化的土壤細菌的選擇方便，將一個慶大霉素抗性基因盒插入pBmLea4LOXLNos3′tetR35SLOXRDel 1g 7。
實施例7帶有功能系統(tǒng)的整個植株的產(chǎn)生將含有活性表達四環(huán)素阻遏物的Lea4啟動子-LOX-35StetRCDS-Nos3′末端-NcoI位點-RIP CDS-g7 Term-Gm構(gòu)建體并證實含有所有構(gòu)建體成分的轉(zhuǎn)基因煙草植物與受含有三個tet操縱基因序列的35S啟動子控制表達CRE蛋白質(zhì)的植物雜交。含有完整系統(tǒng)也即，含有Lea4啟動子-LOX-35StetR CDS-Nos3′末端-NcoI位點-RIP CDS-g7 Term-Gm和35StetO-CRE的子代將生長至成熟。含有這些構(gòu)建體的子代的篩選根據(jù)他們對卡那霉素和慶大霉素的抗性，四環(huán)素阻遏物的表達，他們的CRE的不表達但存在35S3TetO-CRE嵌合基因和通過帶有合適引物的PCR而證明系統(tǒng)所有其它組份來進行。含有完整系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因棉花植物將以和煙草同樣的方法或者通過含有帶有pBin35S3OCRE的Lea4啟動子-LOX-35StetR CDS-Nos3′末端-NcoI位點-RIP CDS-g7Term-Gm構(gòu)建體植物的再轉(zhuǎn)化而再生。
實施例8通過四環(huán)素切除激活來產(chǎn)生活性的Lea啟動子RIP嵌合基因通過利用四環(huán)素通過以幾種方法中的一種進行外源處理，通過與四環(huán)素形成復(fù)合物釋放四環(huán)素阻遏物來激活35S3tetO-CRE嵌合基因。首先轉(zhuǎn)基因煙草或棉花的種子可以在一個四環(huán)素的水溶液中吸脹，頂端分生組織和/或總芽可以噴灑一種四環(huán)素的水溶液，或者四環(huán)素可以通過根系統(tǒng)直接地導入。在所有的情況下激活所需的四環(huán)素的濃度是低的，恒定應(yīng)用0.01到2mg/l，證明在煙草中對四環(huán)素阻遏物阻遏的啟動子的誘導是有效的(Roderetal 1994，Gatzetal 1991，1992，和1Gatz和Quail，1998)。這一抗生素的水平具有的優(yōu)點是對這樣處理的植物所生長的環(huán)境的影響是可忽視的。在上述所討論的例子中，目的是通過在含有四環(huán)素的溶液中棉花和煙草種子的吸脹來誘導該系統(tǒng)。在兩種情況中需選擇四環(huán)素濃度來達到效率最大但可能的抗生素的環(huán)境積累最小。已證明最大量可以為5mg/l(這是在漂浮煙草葉片上顯示有效激活系統(tǒng)的濃度)。由于我們只把種子暴露于抗生素短時間來完成吸脹，在這之后將清除種子表面殘留的四環(huán)素(進一步減少對種植的生長環(huán)境的可能的污染)，所以需要較高的濃度。
吸脹四環(huán)素的靶細胞是增殖的頂端分生組織細胞的L2層。通過在這些細胞中驅(qū)動CRE表達的35S3tetO啟動子的去阻遏誘導該系統(tǒng)將保證所有未來種系的細胞將含有可表達的Lea-RIP嵌合基因，因而使來自不能萌發(fā)的處理種子的植物得到所有成熟種子。我們在棉花中已經(jīng)證明種子吸脹和四環(huán)素是類似的大小和復(fù)雜性的溶于5％DMSO溶液中的活性染料Terta Zolium紅，確實成功地滲透進入發(fā)育胚的所有細胞并真正地貫穿種子的所有組織。我們目前正在利用吸脹一種四環(huán)素溶液測試表達四環(huán)素阻遏物蛋白并含有一個35S3tetO啟動子控制下的細菌β-葡糖醛酸酶CDS(GUS)的轉(zhuǎn)基因煙草植物的GUS表達模式。這將確定誘導萌發(fā)胚的頂端分生組織的L2層中的CRE嵌合基因的去阻遏所必需的條件。
實施例9產(chǎn)生一種遺傳系統(tǒng)，通過該系統(tǒng)由通過病毒載體系統(tǒng)(或其它手段)導入的位點特異性重組酶切除封阻系列(填充序列)而激活發(fā)育控制的致死基因在上述特定的實施例中所描述的遺傳系統(tǒng)不需要通過一個外部信號的位點特異性重組酶的誘導，而是將它在合適時間導入轉(zhuǎn)基因植物的靶細胞。這可以以幾種方式達到，通過如Zhou et al 1983所述的在棉花種子中那樣，直接導入一個可表達DNA系統(tǒng)；如Horn et al；199所述的大豆細胞中那樣，將位點特異性重組酶附著于生物素分子上，或者利用下面所述的病毒載體系統(tǒng)。在完整植株水平上或者對我們建議的方案中所需要的批量處理的種子，還沒有證明前面兩種例子是蛋白質(zhì)或基因?qū)氲目煽糠椒??？梢岳煤笠粋€例子，病毒載體。下面描述了一個用于可以被煙草花葉病毒(TMV)感染的植物的系統(tǒng)但并不排除使用可以感染其它植物種類的其它病毒載體。這個方案的基本元素對于用于位點特異重組酶的釋放的任何病毒載體系統(tǒng)均是相同的。
在本實施例中使用相同于內(nèi)源的誘導系統(tǒng)中的基因排列，其中Lea啟動子(或任何其它啟動子)是由一個可切除的封阻序列與所期望的編碼序列，在這里是一個RIP CDS分隔開。在本實施例中封阻序列是35S啟動子-TMV外殼蛋白CDS-Nos3′Term嵌合基因，因此全長構(gòu)建體具有下述結(jié)構(gòu)Lea4啟動子-LOX-35S啟動子-TMV外殼蛋白CDS-Nos3’Term-LOX-NcoI位點-RIP CDS-g7 Term。通過許多植物轉(zhuǎn)化技術(shù)中的任何一種將其插入基因組以產(chǎn)生僅生產(chǎn)病毒外殼蛋白的轉(zhuǎn)基因植物。病毒外殼蛋白這種表達將沒有可見的表型也不影響植物的生產(chǎn)能力。
CRE蛋白質(zhì)是作為攜帶于包裝到病毒外殼蛋白質(zhì)中的重組病毒基因組中的表達基因而被輸送到植物種子細胞中(頂端分生組織的L2層以保證發(fā)育植物的所有結(jié)構(gòu)均可以表達CRE)。在這個例子中這可以以下面的方式來完成。將TMV野生株(也即一個在靶植物中不引起癥狀的)的RNA基因組的cDNA拷貝中的外殼蛋白編碼序列去除并用CRE CDS替代。在病毒基因組的3′部分的外殼蛋白附著位點必須留在位置上。將該工程cCDNA克隆進入pBluescript并且在體外利用T7或T3聚合酶合成全長突變的TMV RNA。然后將全長的RNA在體外用外殼蛋白包裝并用于感染一個正表達TMV外殼蛋白的轉(zhuǎn)基因植物，也即，含有活化的35S外殼蛋白-Nos3′嵌合基因或等同物的轉(zhuǎn)基因植物。在體外沒有包裝的全長RNA的感染將產(chǎn)生類似但效率較低的結(jié)果，為了批量接種含有摻入的Lea4啟動子-LOX-35S啟動子-TMV外殼蛋白CDS-Nos3′-Term-LOX-NcoI位點-RIP CDS-g7 Term構(gòu)建體的種子，將突變TMV(含有CRE蛋白質(zhì)CDS)擴增到足夠水平這一步驟是必需的。一旦在源植物中進行擴增，即將突變病毒分離并采用真空輔助吸收方法用于接種靶種子。一旦病毒進入種子中，在種子表面的病毒可以被除去和失活。在萌發(fā)基礎(chǔ)上，發(fā)育的秧苗將被感染，并由于細胞正表達TMV外殼蛋白，突變的病毒應(yīng)該傳播到整個發(fā)育的植物。在感染期間，CRE CDS將作為病毒mRNA釋放、翻譯，并合成CRE蛋白。然后CRE從Lea4啟動子-LOX-35S啟動子-TMV外殼蛋白CDS-Nos3′Term-LOX-NcoI位點-RIP CDS-g7 Term序列中移去封阻序列，因而使RIP編碼序列處于Lea啟動子控制下。在種子成熟過程中RIP將在這種植物中被表達使它不能產(chǎn)生子代。只要初級分生組織的L2層被感染了并且在它們中產(chǎn)生了CRE蛋白質(zhì)，發(fā)育植物其余部分將具有其中Lea-RIP基因是活化的細胞，特別是所有將來發(fā)育的胚芽細胞。
由于封阻序列是35S-外殼蛋白-Nos3′嵌合基因或等同物，這些植物將顯示外殼蛋白產(chǎn)生能力的急劇喪失，而這種喪失則抑制突變病毒增殖。這具有減少靶植物用作突變病毒的有效儲藏庫的的能力的優(yōu)點，并減少能量從光合作用向病毒復(fù)制和增殖的轉(zhuǎn)移，從而使系統(tǒng)對植物生產(chǎn)能力的可能的影響降到最小。這個系統(tǒng)另一個有感染力的特征是在植物組織中突變病毒不能復(fù)制和移動，除非細胞中存在TMV外殼蛋白。所以非轉(zhuǎn)基因植物(和不含表達TMV外殼蛋白基因的轉(zhuǎn)基因植物)不能被這種病毒感染。因而這種突變病毒在環(huán)境中的傳播可被忽略。
實施例10對實施例7的轉(zhuǎn)化植物生產(chǎn)不能生長發(fā)育的種子的評價轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)的有效性的評價是在對Lea4啟動子-LOX-35Stet阻遏物CDS-Nos3′末端-NcoI位點-RIP CDS-g7 Term-Gm和35StetOCRE構(gòu)建體是純合的或者是真正的再生的完整植株中進行的。進行兩種類型評價。對轉(zhuǎn)基因植物的正常生長和在沒有用四環(huán)素處理時系統(tǒng)的非功能能力進行一系列評價。第二類評價測試了當將四環(huán)素用于種子時功能系統(tǒng)的有效性。
在第一系列重復(fù)的試驗中，在一個重復(fù)的設(shè)計中，在溫室和田間環(huán)境中將未處理的轉(zhuǎn)基因植物的種子種植在非轉(zhuǎn)基因親本植物的種子旁邊。主要的目的是評價轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植物的表型的相似性。一種所需要的轉(zhuǎn)基因植物(沒有用四環(huán)素處理)具有與非轉(zhuǎn)基因親本植物基本相同的表型。
對如發(fā)芽能力，活力，生長習性，成熟性，產(chǎn)物產(chǎn)量和產(chǎn)物質(zhì)量這樣的性狀進行評價。對于所測試任一性狀轉(zhuǎn)基因植物與非轉(zhuǎn)基因親本植物的顯著的負偏差表明下列情況之一或其結(jié)合在所期望的基因活性中的機能障礙或者在植物染色體上的構(gòu)建體插入位點的正效應(yīng)。通過制備和評估來源于涉及Lea4啟動子-LOX-35Stet阻遏物CDS-Nos3′末端-NcoI位點-RIPCDS-87Term-GM和35S3teto-CRE構(gòu)建體的幾種插入事件的植物提出了后一問題。
第二類測試包含通過用四環(huán)素處理轉(zhuǎn)基因種子，在CRE激活基礎(chǔ)上對所期望基因型的有效性進行估價。這系列測試涉及在種子吸脹四環(huán)素之后的轉(zhuǎn)基因植物與非處理，非轉(zhuǎn)基因親本植物比較。轉(zhuǎn)基因植物預(yù)期的效果包括正常生長和發(fā)育，正常成熟和正常產(chǎn)物產(chǎn)量和質(zhì)量。從該植物產(chǎn)生的種子不能生長發(fā)育也是預(yù)期到的。
不僅在受控的環(huán)境條件下，而且在各種各樣的田間環(huán)境下的評價也是預(yù)期的。具有特殊興趣的是對任何可能引起早熟或不期望的35S3teto-CRE基因的激活的特異環(huán)境條件的鑒定。評價包括生長在各種環(huán)境條件下的非處理轉(zhuǎn)基因植物的種子子代的萌發(fā)。另外，封阻序列切除后LEA啟動子的后胚胎發(fā)生后期的激活或者“滲漏”之前作評價。任何‘滲漏’導致除植物產(chǎn)生的種子胚以外的植物或植物組成部分的死亡。
一旦這些估價指出了系統(tǒng)的完全的功能能力，轉(zhuǎn)基因植物就通過回交方式導入一個種類內(nèi)的各種基因型。再對回交的基因型的功能能力以及經(jīng)濟潛力進行評估。
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權(quán)利要求
1.一種制備遺傳學修飾的植物的方法，包括將第一個DNA序列、第二個DNA序列和第三個DNA序列導入一種植物細胞，所述的第一個DNA序列含有其表達導致產(chǎn)生改變的植物表型的第一個基因和一個瞬時活化啟動子，第一個基因和瞬時活化啟動子可操作地相互連接，但由一個旁側(cè)具有特異切除序列的封阻序列分開，封阻序列的存在阻止第一個基因的表達，所述的第二個DNA序列含有編碼一種重組酶的第二個基因和一個可操作地以功能關(guān)系連接到第二個基因上的阻抑型啟動子，所述的重組酶特異于第一個DNA序列的封阻序列旁側(cè)的特異切除序列，所述的第三個DNA序列含有編碼特異于第二個DNA序列的阻抑型啟動子的阻遏物的第三個基因；從所述的植物細胞再生一個完整植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的封阻序列包含第三個DNA序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中瞬時活化啟動子選自包含在晚期胚胎發(fā)生，在種子發(fā)育，在花發(fā)育，在葉發(fā)育，在根發(fā)育，在維管組織發(fā)育，在花粉發(fā)育，在傷害后，在熱或冷脅迫時，在水脅迫時，或在暴露于重金屬過程中或之后活化的啟動子的一組，第一個基因選自包含致死基因，殺蟲基因，抑真菌基因，殺真菌基因，殺細菌基因，干旱抗性基因，蛋白質(zhì)產(chǎn)物基因或改變次生代謝的基因的一組，特異切除序列選自包含LOX序列和被flippase，解離酶，F(xiàn)LP，SSV1編碼的整合酶或者轉(zhuǎn)座酶所識別的序列的一組，第二個基因編碼選自于包含CRE，flippase，解離酶，F(xiàn)LP，SSV1編碼的整合酶和轉(zhuǎn)座酶的一組的特異性重組酶，第三個基因編碼選自于包括Tn10tet阻遏物和Lac操縱基因-阻遏物系統(tǒng)的一組的阻遏物，阻抑型啟動子選自包括修飾為含有一或多個tet操縱子的35S啟動子，修飾的遍在蛋白啟動子，修飾的MAS啟動子和修飾的NOS啟動子的一組。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中瞬時活化啟動子是LEA啟動子。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中第一個基因編碼核糖體抑制蛋白(RIP)。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中特異切除序列是LOX序列并且第二個基因編碼CRE。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中第三個基因編碼Tn10tet阻遏物。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中阻抑型啟動子是修飾為含有三個tet操縱子的35S啟動子。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中植物是棉花，瞬時活化啟動子是LEA啟動子，特異切除序列是LOX序列，第一個基因編碼核糖體抑制蛋白(RIP)，阻抑型啟動子是修飾為含有三個tet操縱子的35S啟動子，第二個基因編碼CRE，第三個DNA序列是Tn10 tet阻遏物基因。
10.產(chǎn)生不能萌發(fā)的種子的方法，包括將第一個DNA序列、第二個DNA序列和第三個DNA序列導入一種植物細胞，所述的第一個DNA序列含有致死基因和一個在晚期胚胎發(fā)生中活化的啟動子，致死基因和在晚期胚胎發(fā)生啟動子功能性相互連接，但由一個旁側(cè)具有特異切除序列的封阻序列分開，封阻序列的存在阻止致死基因的表達，所述的第二個DNA序列含有編碼一種重組酶的基因和一個以功能關(guān)系連接到特異性重組酶基因上的阻抑型啟動子，所述的重組酶特異于第一個DNA序列的封阻序列旁側(cè)的特異切除序列，所述的第三個DNA序列含有編碼特異于第二個DNA序列的阻抑型啟動子的阻遏物的基因；從所述的植物細胞再生完整植株；使再生的完整植株產(chǎn)生第一代種子；將第一代種子與阻抑陽遏物功能的一種刺激物接觸，以使阻遏物元件不再抑制特異性重組酶基因的表達，從而允許特異性重組酶表達并在特異切除序列切除第一個DNA序列的封阻序列，導致晚期胚胎發(fā)生啟動子與致死基因的直接功能性連接；萌發(fā)第一代種子以產(chǎn)生表達晚期胚胎發(fā)生啟動子/致死基因序列的第一代植物；使所述植物產(chǎn)生第二代種子，其中在胚胎發(fā)生過程中晚期胚胎發(fā)生啟動子活化，使致死基因在第二代種子中表達，從而使第二代種子不能萌發(fā)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中封阻序列包含第三個DNA序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的方法，其中種子是棉花種子；晚期胚胎發(fā)生啟動子選自包括LEA啟動子和在晚期胚胎發(fā)生期活化但不是LEA的啟動子的一組，致死基因選自于包括核糖體抑制蛋白(RIP)和芽孢桿菌RNA酶的一組，特異切除序列選自于包括LOX序列和可以被flippase，解離酶，F(xiàn)LP，SSV1編碼的整合酶或轉(zhuǎn)座酶識別的序列的一組，特異性重組酶選自于包括CRE，flippase，解離酶，F(xiàn)LP，SSV1編碼的整合酶和轉(zhuǎn)座酶的一組，阻遏物基因編碼選自于包括Tn10 tet阻遏物和Lac操縱基因-阻遏物系統(tǒng)的一組中的阻遏物，并且阻抑型啟動子選自于包括修飾為含有一或多個的tet操縱子的35S啟動子和修飾為含有Lac操縱基因序列的啟動子的一組。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中晚期胚胎發(fā)生啟動子是LEA啟動子。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中致死基因編碼核糖體抑制蛋白(RIP)。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中特異切除序列是LOX序列，并且特異性重組酶基因編碼CRE。
16.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中阻遏物基因編碼Tn10 tet阻遏物。
17.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中阻抑型啟動子是一個修飾為含有三個tet操縱子的35S啟動子。
18.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中種子是棉花種子，晚期胚胎發(fā)生啟動子是LEA啟動子，特異切除序列是LOX序列，封阻序列是第三個DNA序列，致死基因編碼檢糖體抑制蛋白(RIP)，阻抑型啟動子是一個修飾成含有二個tet操縱子的35S啟動子，特異性重組酶基因編碼CRE，第三個DNA序列是Tn10 tet阻遏物基因。
19.一種轉(zhuǎn)基因植物，在它的基因組DNA序列中包含含有其表達導致改變的植物表型的第一個基因和一個瞬時活化啟動子的第一個DNA序列，第一個基因和瞬時活化啟動子有相互的功能關(guān)系，但是被一個旁側(cè)具有特異切除序列的封阻序列所分開，從而封阻序列的存在阻止第一個基因的表達，含有編碼特異于第一個DNA序列的封阻序列旁側(cè)的特異切除序列的重組酶的第二個基因和一個以功能關(guān)系連接于第二個基因的阻抑型啟動子的第二個DNA序列，和含有編碼特異于第二個DNA序列的阻抑型啟動子的阻遏物元件的第三個基因的第三個DNA序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中封阻序列包含第三個DNA序列。
21.根據(jù)權(quán)利的要求19或20所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中瞬時活化啟動子選自于包括在晚期胚胎發(fā)生期，在種子發(fā)育，在花發(fā)育，在葉發(fā)育，在根發(fā)育，在維管組織發(fā)育，在花粉發(fā)育，在傷害后，在熱或冷脅迫過程中，在水脅迫過程中，或者在暴露于重金屬過程中或之后活化的啟動子的一組，第一個基因選自包含致死基因，殺蟲基因，抑真菌基因，殺真菌基因，殺細菌基因，干旱抗性基因，蛋白質(zhì)產(chǎn)物基因或改變次生代謝的基因的一組，特異切除序列選自包含LOX序列和被flippase，解離酶，F(xiàn)LP，SSV1編碼的整合酶或者轉(zhuǎn)座酶所識別的序列的一組，第二個基因編碼選自于包含CRE，flippase，解離酶，F(xiàn)LP，SSV1編碼的整合酶和轉(zhuǎn)座酶的一組的特異性重組酶，第三個基因編碼選自于包括Tn10 tet阻遏物和Lac操縱基因-阻遏物系統(tǒng)的一組的阻遏物，阻抑型啟動子選自包括修飾為含有一或多個tet操縱子的35S啟動子，修飾的遍在蛋白啟動子，修飾的MAS啟動子和修飾的NOS啟動子的一組。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中瞬時活化啟動子是LEA啟動子。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中第一個基因編碼核糖體抑制蛋白(RIP)。
24.根據(jù)權(quán)利要求21所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中特異切除序列是LOX序列并且第二個基因編碼CRE。
25.根據(jù)權(quán)利要求21所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中第三個基因編碼Tn10tet阻遏物。
26.根據(jù)權(quán)利要求21所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中阻抑型啟動子是一個修飾成含有三個tet操縱子的35S啟動子。
27.根據(jù)權(quán)利要求20所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中植物是棉花，瞬時活化啟動子是LEA啟動子，特異切除序列是LOX序列，第一個基因編碼核糖體抑制蛋白(RIP)，阻抑型啟動子是一個修飾成含有三個tet操縱子的35S啟動子，第二個基因編碼CRE，第三個DNA序列是Tn10 tet阻遏物基因。
28.含有外源DNA的植物種子，所述外源DNA包括含有其表達導致改變的植物表型的第一個基因和一個瞬時活化啟動子的第一個DNA序列，第一個基因和瞬時活化啟動子有相互的功能關(guān)系，但是被一個旁側(cè)具有特異切除序列的封阻序列所分開，從而封阻序列的存在阻止第一個基因的表達，含有編碼特異于第一個DNA序列的封阻序列旁側(cè)的特異切除序列的重組酶的第二個基因和一個以功能關(guān)系連接于第二個基因的阻抑型啟動子的第二個DNA序列，和含有編碼特異于第二個DNA序列的阻抑型啟動子的阻遏物元件的第三個基因的第三個DNA序列。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的植物種子，其中封阻序列包含第三個DNA序列。
30.根據(jù)權(quán)利要求28或29的植物種子，其中植物種子是棉花種子，瞬時活化啟動子選自包含在晚期胚胎發(fā)生，在種子發(fā)育，在花發(fā)育，在葉發(fā)育，在根發(fā)育，在維管組織發(fā)育，在花粉發(fā)育，在傷害后，在熱或冷脅迫時，在水脅迫時，或在暴露于重金屬過程中或之后活化的啟動子的一組，第一個基因選自包含致死基因，殺蟲基因，抑真菌基因，殺真菌基因，殺細菌基因，干旱抗性基因，蛋白質(zhì)產(chǎn)物基因或改變次生代謝的基因的一組，特異切除序列選自包含LOX序列和被flippase，解離酶，F(xiàn)LP，SSV1編碼的整合酶或者轉(zhuǎn)座酶所識別的序列的一組，第二個基因編碼選自于包含CRE，flippase，解離酶，F(xiàn)LP，SSV1編碼的整合酶和轉(zhuǎn)座酶的一組的特異性重組酶，第三個基因編碼選自于包括Tn10 tet阻遏物和Lac操縱基因-阻遏物系統(tǒng)的一組的阻遏物，阻抑型啟動子選自包括修飾為含有一或多個tet操縱子的35S啟動子，修飾的遍在蛋白啟動子，修飾的MAS啟動子和修飾的NOS啟動子的一組。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的植物種子，其中瞬時活化啟動子是LEA啟動子。
32.根據(jù)權(quán)利要求30的植物種子，其中第一個基因編碼核糖體抑制蛋白(RIP)。
33.根據(jù)權(quán)利要求30的植物種子，其中特異切除序列是LOX序列并且第二個基因編碼CRE。
34.根據(jù)權(quán)利要求30的植物種子，其中第三個基因編碼Tn10 tet阻遏物。
35.根據(jù)權(quán)利要求30的植物種子，其中阻抑型啟動子是一個修飾成含有三個tet操縱子的35S啟動子。
36.根據(jù)權(quán)利要求29所述的植物種子，其中植物種子是棉花種子，瞬時活化啟動子是LEA啟動子，特異切除序列是LOX序列，第一個基因編碼核糖體抑制蛋白(RIP)，阻抑型啟動子是一個修飾成含有三個tet操縱子的35S啟動子，第二個基因編碼CRE，第三個DNA序列是Tn10 tet阻遏物基因。
37.含有外源DNA的植物組織，所述的DNA包括含有其表達導致改變的植物表型的第一個基因和一個瞬時活化啟動子的第一個DNA序列，第一個基因和瞬時活化啟動子有相互的功能關(guān)系，但是被一個旁側(cè)具有特異切除序列的封阻序列所分開，從而封阻序列的存在阻止第一個基因的表達，含有編碼特異于第一個DNA序列的封阻序列旁側(cè)的特異切除序列的重組酶的第二個基因和一個以功能關(guān)系連接于第二個基因的阻抑型啟動子的第二個DNA序列，和含有編碼特異于第二個DNA序列的阻抑型啟動子的阻遏物元件的第三個基因的第三個DNA序列。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的植物組織，其中封阻序列包含第三個DNA序列。
39.根據(jù)權(quán)利要求37或38所述的植物組織，其中植物組織是棉花組織，瞬時活化啟動子選自包含在晚期胚胎發(fā)生，在種子發(fā)育，在花發(fā)育，在葉發(fā)育，在根發(fā)育，在維管組織發(fā)育，在花粉發(fā)育，在傷害后，在熱或冷脅迫時，在水脅迫時，或在暴露于重金屬過程中或之后活化的啟動子的一組，第一個基因選自包含致死基因，殺蟲基因，抑真菌基因，殺真菌基因，殺細菌基因，干旱抗性基因，蛋白質(zhì)產(chǎn)物基因或改變次生代謝的基因的一組，特異切除序列選自包含LOX序列和被flippase，解離酶，F(xiàn)LP，SSV1編碼的整合酶或者轉(zhuǎn)座酶所識別的序列的一組，第二個基因編碼選自于包含CRE，flippase，解離酶，F(xiàn)LP，SSV1編碼的整合酶和轉(zhuǎn)座酶的一組的特異性重組酶，第三個基因編碼選自于包括Tn10 tet阻遏物和Lac操縱基因-阻遏物系統(tǒng)的一組的阻遏物，阻抑型啟動子選自包括修飾為含有一或多個tet操縱子的35S啟動子，修飾的遍在蛋白啟動子，修飾的MAS啟動子和修飾的NOS啟動子的一組。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的植物組織，其中瞬時活化啟動子是LEA啟動子。
41.根據(jù)權(quán)利要求39的植物組織，其中第一個基因編碼核糖體抑制蛋白(RIP)。
42.根據(jù)權(quán)利要求39的植物組織，其中特異切除序列是LOX序列并且第二個基因編碼CRE。
43.根據(jù)權(quán)利要求39的植物組織，其中第三個基因編碼Tn10 tet阻遏物。
44.根據(jù)權(quán)利要求39的植物組織，其中阻抑型啟動子是一個修飾成含有三個tet操縱子的35S啟動子。
45.根據(jù)權(quán)利要求38的植物組織，其中瞬時活化啟動子是LEA啟動子，特異切除序列是LOX序列，第一個基因編碼核糖體抑制蛋白(RIP)，阻抑型啟動子是一個修飾成含有三個tet操縱子的35S啟動子，第二個基因編碼CRE，第三個DNA序列是Tn10 tet阻遏物基因。
46.含有外源DNA的一種植物細胞，所述的DNA包括含有其表達導致改變的植物表型的第一個基因和一個瞬時活化啟動子的第一個DNA序列，第一個基因和瞬時活化啟動子有相互的功能關(guān)系，但是被一個旁側(cè)具有特異切除序列的封阻序列所分開，從而封阻序列的存在阻止第一個基因的表達，含有編碼特異于第一個DNA序列的封阻序列旁側(cè)的特異切除序列的重組酶的第二個基因和一個以功能關(guān)系連接于第二個基因的阻抑型啟動子的第二個DNA序列，和含有編碼特異于第二個DNA序列的阻抑型啟動子的阻遏物元件的第三個基因的第三個DNA序列。
47.根據(jù)權(quán)利要求46的植物細胞，其中封阻序列含有第三個DNA序列。
48.根據(jù)權(quán)利要求46或47所述的植物細胞，其中植物細胞是棉花細胞，瞬時活化啟動子選自包含在晚期胚胎發(fā)生，在種子發(fā)育，在花發(fā)育，在葉發(fā)育，在根發(fā)育，在維管組織發(fā)育，在花粉發(fā)育，在傷害后，在熱或冷脅迫時，在水脅迫時，或在暴露于重金屬過程中或之后活化的啟動子的一組，第一個基因選自包含致死基因，殺蟲基因，抑真菌基因，殺真菌基因，殺細菌基因，干旱抗性基因，蛋白質(zhì)產(chǎn)物基因或改變次生代謝的基因的一組，特異切除序列選自包含LOX序列和被flippase，解離酶，F(xiàn)LP，SSV1編碼的整合酶或者轉(zhuǎn)座酶所識別的序列的一組，第二個基因編碼選自于包含CRE，flippase，解離酶，F(xiàn)LP，SSV1編碼的整合酶和轉(zhuǎn)座酶的一組的特異性重組酶，第三個基因編碼選自于包括Tn10 tet阻遏物和Lac操縱基因-阻遏物系統(tǒng)的一組的阻遏物，阻抑型啟動子選自包括修飾為含有一或多個tet操縱子的35S啟動子，修飾的遍在蛋白啟動子，修飾的MAS啟動子和修飾的NOS啟動子的一組。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的植物細胞，其中瞬時活化啟動子是LEA啟動子。
50.根據(jù)權(quán)利要求48的植物細胞，其中第一個基因編碼核糖體抑制蛋白(RIP)。
51.根據(jù)權(quán)利要求48的植物細胞，特異切除序列是LOX序列并且第二個基因編碼CRE。
52.根據(jù)權(quán)利要求48所述的植物細胞，第三個基因編碼Tn10 tet阻遏物。
53.根據(jù)權(quán)利要求48所述的植物細胞，其中阻抑型啟動子是一個修飾成含有三個tet操縱子的35S啟動子。
54.據(jù)權(quán)利要求47所述的植物細胞，其中瞬時活化啟動子是LEA啟動子，特異切除序列是LOX序列，封阻序列是第三個DNA序列，第一個基因編碼核糖體抑制蛋白(RIP)，阻抑型啟動子是一個修飾成含有三個tet操縱子的35S啟動子，第二個基因編碼CRE，第三個DNA序列是Tn10 tet阻遏物基因。
55.產(chǎn)生不能生長發(fā)育的種子的方法，包括向一種植物細胞或細胞培養(yǎng)物中導入含有致死基因和一個在晚期胚胎發(fā)生期活化的啟動子的第一個DNA序列，致死基因和晚期胚胎發(fā)生啟動子具有相互的功能關(guān)系，但是被一個旁側(cè)具有特異切除序列的封阻序列分開，從而封阻序列的存在阻止致死基因的表達，還導入第二個DNA序列，其含有編碼特異于第一個DNA序列的封阻序列旁側(cè)的切除序列的重組酶的基因序列，和一個以功能關(guān)系連接于特異性重組酶基因的誘導型啟動子；從所述的植物細胞或細胞培養(yǎng)物再生完整植株；使再生的完整植株產(chǎn)生第一代種子；將第一代種子與誘導第二個DNA序列搭誘導型啟動子的一種刺激物接觸，以誘導特異性重組酶基因的表達，從而在特異切除序列切除第一個DNA序列的封阻序列，導致晚期胚胎發(fā)生啟動子與第一個基因的直接功能性連接；萌發(fā)第一代種子以產(chǎn)生組成型表達晚期胚胎發(fā)生啟動子/第一個基因序列的植物；使所述植物產(chǎn)生第二代種子，其中在胚胎發(fā)生過程中晚期胚胎發(fā)生啟動子活化，使致死基因在第二代種子中表達，從而使第二代種子不能萌發(fā)。
56.生產(chǎn)一種表達在親本中不被表達的性狀的雜交植物的方法，包含向第一種植物細胞或細胞培養(yǎng)物中導入含有其表達導致一個改變的植物表型的第一個基因和一個瞬時活化啟動子的第一個DNA序列，第一個基因和瞬時活化啟動子可操作地相互連接，但是由一個旁側(cè)具有特異切除序列的封阻序列分開，從而封阻序列的存在阻止第一個基因的表達；向第二種植物細胞或細胞培養(yǎng)物中導入第二個DNA序列，所述DNA序列含有編碼特異于第一個DNA序列的封阻序列旁側(cè)的特異切除序列的重組酶的第二個基因，和一個在種子萌發(fā)過程中活化的啟動子，該啟動子可操作地以功能關(guān)系連接于第二個基因；再生第一和第二種細胞或細胞培養(yǎng)物使之成為第一和第二種植物；雜交第一和第二種植物產(chǎn)生含有第一和第二個DNA序列的雜交種子；使雜交種子生長成為雜交植物。
57.根據(jù)權(quán)利要求56的方法，其中封阻序列是引起雄性不育的序列。
58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中瞬時活化啟動子選自包含在晚期胚胎發(fā)生，在種子發(fā)育，在花發(fā)育，在葉發(fā)育，在根發(fā)育，在維管組織發(fā)育，在花粉發(fā)育，在傷害后，在熱或冷脅迫時，在水脅迫時，或在暴露于重金屬過程中或之后活化的啟動子的一組，第一個基因選自包含致死基因，殺蟲基因，抑真菌基因，殺真菌基因，殺細菌基因，干旱抗性基因，蛋白質(zhì)產(chǎn)物基因或改變次生代謝的基因的一組，特異切除序列選自包含LOX序列和被flippase，解離酶，F(xiàn)LP，SSV1編碼的整合酶或者轉(zhuǎn)座酶所識別的序列的一組，第二個基因編碼選自于包含CRE，flippase，解離酶，F(xiàn)LP，SSV1編碼的整合酶和轉(zhuǎn)座酶的一組的特異性重組酶，引起雄性不育的序列選自于包括可操作地連接于一種花藥特異性啟動子的致死基因和可操作地連接于一種花粉特異性啟動子的致死基因的一組。
59.根據(jù)權(quán)利要求58的方法，瞬時活化啟動子是LEA啟動子。
60.根據(jù)權(quán)利要求58的方法，其中第一個基因編碼核糖體抑制蛋白(RIP)。
61.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中特異切除序列是LOX序列并且第二個基因編碼CRE。
62.根據(jù)權(quán)利要求58的方法，引起雄性不育的序列是連接到花藥特異性啟動子的RIP基因。
63.根據(jù)權(quán)利要求58的方法，其中植物是棉花植物，瞬時活化啟動子是LEA啟動子，特異切除序列是LOX序列，第一個基因編碼RIP，第二個基因編碼CRE，引起雄性不育的序列是連接到花藥特異性啟動子的RIP基因。
64.產(chǎn)生不能萌發(fā)的種子的方法，包括向第一種植物細胞或細胞培養(yǎng)物中導入含有致死基因和一個在胚胎發(fā)生晚期活化的啟動子的第一個DNA序列，致死基因和晚期胚胎發(fā)生啟動子可操作地相互連接，但是由一個旁側(cè)具有特異切除序列的封阻序列分開，從而封阻序列的存在阻止致死基因和重組酶基因的表達；向第二種植物細胞或細胞培養(yǎng)物中導入第二個DNA序列，所述DNA序列含有編碼特異于第一個DNA序列的封阻序列旁側(cè)的特異切除序列的重組酶的基因，和一個在種子萌發(fā)過程中活化的啟動子，該啟動子可操作地以功能關(guān)系連接于第二個基因；再生第一和第二種細胞或細胞培養(yǎng)物使之成為第一和第二種植物；雜交第一和第二種植物產(chǎn)生含有第一和第二個DNA序列的雜交種子；使雜交種子萌發(fā)產(chǎn)生雜交植物；使雜交植物產(chǎn)生第二代雜交種子，其中在胚胎發(fā)生過程中，晚期胚胎發(fā)生啟動子活化，使致死基因在第二代雜交種子中表達，從而使第二代雜交種子不能萌發(fā)。
65.根據(jù)權(quán)利要求64的方法，其中封阻序列是引起雄性不育的序列。
66.根據(jù)權(quán)利要求65的方法，其中特異切除序列選自包含LOX序列和被flippase，解離酶，F(xiàn)LP，SSV1編碼的整合酶或者轉(zhuǎn)座酶所識別的序列的一組，重組酶基因編碼選自于包含CRE，flippase，解離酶，F(xiàn)LP，SSV1編碼的整合酶和轉(zhuǎn)座酶的一組的特異性重組酶，引起雄性不育的序列選自于包括可操作地連接于一種花藥特異性啟動子的致死基因和可操作地連接于一種花粉特異性啟動子的致死基因的一組。
67.根據(jù)權(quán)利要求66的方法，其中瞬時活化啟動子在晚期胚胎發(fā)生期活化。
68.根據(jù)權(quán)利要求66的方法，其中致死基因編碼核糖體抑制蛋白(RIP)。
69.根據(jù)權(quán)利要求66的方法，其中特異切除序列是LOX序列并且第二個基因編碼CRE。
70.根據(jù)權(quán)利要求66的方法，引起雄性不育的序列是連接到花藥特異性啟動子的RIP基因。
71.根據(jù)權(quán)利要求66的方法，其中植物是棉花植物，啟動子在晚期胚胎發(fā)生時活化，特異切除序列是LOX序列，致死基因編碼RIP，重組酶基因編碼CRE，引起雄性不育的序列是連接于花藥特異性啟動子的RIP基因。
72.制備一種遺傳學修飾的植物的方法，包括向一種植物細胞中導入第一個DNA序列和任選的第二個DNA序列，所述的第一個DNA序列包括其表達導致改變的植物表型的第一個基因和一個瞬時活化啟動子，第一個基因和瞬時活化啟動子可操作地相互連接，但是被一個旁側(cè)具有特異切除序列的封阻序列分開，從而封阻序列的存在阻止第一個基因的表達，所述的第二個DNA序列包括編碼特異于第三個DNA序列的阻抑型啟動子的阻遏物的第二個基因，向一種植物病毒中導入第三個DNA序列，所述的DNA序列包括編碼特異于第一個DNA序列的封阻序列旁側(cè)的特異切除序列的重組酶的第三個基因，和一個以功能關(guān)系連接于第三個基因的啟動子，該啟動子任選地是阻抑型啟動子；從該植物細胞再生一個完整植株；用植物病毒感染植物，從而使第一，第二，第三個DNA序列都存在于植物中。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備遺傳學修飾的植物的方法，包括從被下述DNA序列轉(zhuǎn)染的植物細胞再生完整的植株，所述的DNA序列包括與瞬時活化啟動子相連接的其表達產(chǎn)生一個改變的植物表型的第一個基因，該基因和啟動子通過旁側(cè)具有特異切除序列的封阻序列分隔開，該DNA序列還包括編碼特異于與阻抑型啟動子的相連的特異切除序列的重阻酶的第二個基因，以及編碼特異于該阻抑型啟動子的阻遏物的第三個基因。還公開了制備遺傳學修飾的雜交植物的方法，該方法是將第一種植物與第二種植物進行雜交，并從雜交種子生長雜交植物，所述的第一種植物是從用下述DNA序列轉(zhuǎn)染的植物細胞再生得到，所述的DNA序列包括與瞬時活化啟動子相連接的其表達產(chǎn)生一個改變的植物表型的第一個基因，該基因和啟動子通過旁側(cè)具有特異切除序列的封阻序列分隔開；所述的第二種植物是從用下述DNA序列轉(zhuǎn)染的第二種植物細胞再生得到，所述的DNA序列包括編碼特異于與萌發(fā)活化啟動子的相連的特異切除序列的重阻酶的第二個基因。還公開了含有上述DNA序列的植物細胞、植物組織、植物種子以及完整植株。
文檔編號C12N15/29GK1161717SQ95194442
公開日1997年10月8日 申請日期1995年7月31日 優(yōu)先權(quán)日1994年8月1日
發(fā)明者梅爾文·約翰·奧利弗, 杰里·埃德溫·奎森伯里, 諾瑪·李·格羅薇爾·特羅林德, 唐李·凱姆 申請人:德爾塔和潘蘭德公司, 由美國農(nóng)業(yè)部長代表的美國政府