專利名稱：對基因表達(dá)的改進(jìn)或有關(guān)基因表達(dá)的改進(jìn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種優(yōu)選在植物細(xì)胞中表達(dá)的核酸序列，并涉及含有該核酸序列的載體和植物細(xì)胞。本發(fā)明背景在酵母中，存在一個被稱為GAL4的基因，該基因的產(chǎn)物起著轉(zhuǎn)錄激活物的作用(Johnston,1987,Microbiol.Rev.51,458-476)。GAL4基因相當(dāng)大(3kb)，而所編碼的多肽包括一個N-末端DNA結(jié)合域，一個具有轉(zhuǎn)錄激活物功能的C-末端域，以及一個間插葡糖效應(yīng)因子“GRE”(在有葡萄糖時GAL4被抑制)。
對于GAL4蛋白的特征已了解的相當(dāng)清楚。該蛋白的1-147號氨基酸殘基以序列特異性方式與DNA結(jié)合(Keegan等1986 Science 231,699-704)。其轉(zhuǎn)錄激活功能與C末端功能域的兩個短的部分相關(guān)(Ma&Ptashne 1987 Cell 48,847-853)。已證實(shí)GAL4所結(jié)合的DNA序列是一個17聚體，它必須重復(fù)形式存在，以優(yōu)化GAL結(jié)合(Giniger等，1985 Cell 40,767-774)，并可以稱作GAL4效應(yīng)“上游激活序列”(UAS):GAL4通過所述DNA結(jié)合域與一個基因的UAS 5′端結(jié)合，并由其C-末端域引起該基因轉(zhuǎn)錄的上調(diào)。
最近，已開發(fā)出用于指導(dǎo)基因在果蠅(Drosopila melanogaster)中表達(dá)的雙因子系統(tǒng)。Brand和Perrimon(1993 Development 118∶401-415)使用一個以P-因子為基礎(chǔ)的載體將編碼所述GAL4的基因隨機(jī)插入果蠅屬基因組中。
已制備出大量穩(wěn)定的果蠅屬品系，這些品系分別以特定方式表達(dá)GAL4，其表達(dá)方式取決于相鄰基因組DNA的序列。然后將一個選擇的基因克隆于GAL4上游激活序列(UAS)的控制之下，分別轉(zhuǎn)化，并在缺少GAL4時保持沉默。所述單一品系與含有GAL4的品系的文庫中任一個的遺傳交配可以在很多不同類型的組織和細(xì)胞中激活所述靶基因的表達(dá)，并可以方便地研究包括使所述生物致死在內(nèi)的錯表達(dá)的表型后果。另外，含有GAL4的蒼蠅文庫還日益成為有特色的共享資源，并由它構(gòu)成各種“反向”遺傳學(xué)技術(shù)的共同進(jìn)入點(diǎn)。
十分希望一種可用于植物中的類似系統(tǒng)。不過，以往已證實(shí)異源真核基因在植物中的表達(dá)是很成問題的(例如，參見Green FluorescentPntein)，而GAL4的有效表達(dá)似乎同樣困難，而且，已證實(shí)這是因?yàn)镚AL4 mRNA在植物中的低效率的翻譯造成的(Reichel等，1995 PlantCell Reports 14,773-776)。Ma等(1988,Nature 334,631-633)能證實(shí)實(shí)現(xiàn)了改性的功能性GAL4衍生物在煙草葉子原生質(zhì)體中的瞬時表達(dá)，但未能證實(shí)功能性全長野生型GAL4的存在。類似地，已在玉米原生質(zhì)體中證實(shí)了GAL4的瞬時表達(dá)(McCarrty等，1991 Cell 66,895-905)，并在通過biolistic方法導(dǎo)入時在玉米糊粉組織或胚胎發(fā)生愈傷組織中證實(shí)了其表達(dá)(Goff等，1991 Genes & Dev.5,298-309；Goff等，1992,Genes & Dev.6,864-875)。不過，迄今為止尚未見到功能性GAL4或其衍生物在植物細(xì)胞中穩(wěn)定有效表達(dá)的報道。
本發(fā)明的目的是用GAL4基因的改性部分提供一種可用于植物中的新的表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明概述第一方面，本發(fā)明提供了一種可在植物細(xì)胞中表達(dá)的、至少編碼一種GAL 4 DNA結(jié)合域的至少一個有效部分的核酸序列，該序列的A/T堿基含量相對其野生型酵母序列明顯降低。
編碼GAL4的DNA結(jié)合域的野生型酵母序列的A/T含量大約為59％。當(dāng)本發(fā)明編碼所述GAL 4 DNA-結(jié)合域的有效部分的序列的A/T百分含量不足50％時可被視為顯著降低。優(yōu)選的是其A/T含量不足45％，更優(yōu)選的是不足40％。例如，本發(fā)明的序列可以通過定點(diǎn)誘變制備或通過化學(xué)方法從頭合成。
所述DNA結(jié)合域的“有效部分”是一個足以保持其全長DNA結(jié)合域的大部分(即50％以上)DNA結(jié)合活性的部分。通常，所述“有效部分”至少包括該DNA結(jié)合域全長序列的2/3。通常，所述核酸序列可大致編碼所述GAL 4 DNA結(jié)合域的全部(即其酵母多肽的1-147號氨基酸殘基)，不過，其明顯較小的部分(大約75個氨基酸殘基)也足以保留其大部分DNA結(jié)合活性(Kraulis等，1992 Nature 356,448-450；和Marmostein等，1992 Nature 356,408-414)，在一種特定實(shí)施方案中，所述序列可包括

圖1的5′部分(1-大約460號核苷酸)的核苷酸序列，相對其野生型酵母序列而言，其A/T含量(38％)明顯較低，仍編碼一種相同的氨基酸序列。
所述GAL 4 DNA結(jié)合域本身并無轉(zhuǎn)錄激活功能。因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，編碼所述GAL 4 DNA結(jié)合域的有效部分的序列可操作地連接于一個或幾個其它核酸序列上，該序列可以是結(jié)構(gòu)(即編碼功能性多肽)和/或調(diào)節(jié)序列。通常，編碼所述DNA結(jié)合域的序列可操作地連接于(即符合讀框的融合于)一個編碼一種具有調(diào)節(jié)功能的肽或多肽的序列上，所述肽優(yōu)選為一種轉(zhuǎn)錄激活物。該轉(zhuǎn)錄激活物可以是GAL4蛋白的激活域，編碼它的序列最好優(yōu)選在植物中表達(dá)(例如，通過降低其A/T含量)。另外，所述轉(zhuǎn)錄激活物可以是多種已知在植物中有活性的蛋白中的任一種，這些蛋白為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，以使本發(fā)明的序列可編碼一種嵌合多肽，該多肽至少包括所述GAL 4 DNA結(jié)合域的一個有效部分，和一個轉(zhuǎn)錄激活域。一種特別適用的轉(zhuǎn)錄激活物域可從單純皰疹病毒(HSV)VP-16中獲取(參見Greaves和O′Hare 1989 J.Virol.63,1641-1650；VP，又被稱作VMW65)。其它轉(zhuǎn)錄激活域包括由大腸桿菌(E.Coli)基因組DNA片段編碼的多肽(Ma & Ptashne1987 Cell 51,113-119)或被設(shè)計用于產(chǎn)生兩親性α-螺旋的合成肽(Giniger & Ptashne 1987 Natare 330,670-672)。一個共同的特征似乎是要求剩余的電荷，該剩余電荷或是正電荷(Gill & Ptashne 1987 Cell51,121-126)，或者特別是就植物激活域而言，要求剩余的負(fù)電荷(Estruch等，1994 Nucl.Acids Res.22,3983-3989)。在了解以上情況之后,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以方便地合成或?qū)ふ业教烊淮嬖诘木幋a在植物中具有轉(zhuǎn)錄激活活性的肽或多肽。所述激活序列在任何場合下均可修飾，以便在植物細(xì)胞中取得最佳活性。
另一方面，本發(fā)明提供了一種核酸構(gòu)建體，該構(gòu)建體含有上述核酸序列。在一種具體實(shí)施方案中，可將該核酸構(gòu)建體用作“增強(qiáng)子陷阱”，以釣取植物增強(qiáng)子序列(參見Sundaresan等，1995 Genes & Dev.9,1797-1810)。在該實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體優(yōu)選包括右和左Ti-DNA，以便可以隨機(jī)、穩(wěn)定地插入植物細(xì)胞宿主的基因組中。該構(gòu)建體優(yōu)選包括一個原始植物啟動子序列，該序列是指這樣一種啟動子(可用于植物細(xì)胞)它需要有合適的增強(qiáng)子序列，以導(dǎo)致高水平的轉(zhuǎn)錄。這樣一種“原始”啟動子可被視為“增強(qiáng)子依賴型”啟動子，并大致相當(dāng)于已知植物啟動子的TATA框片段?！爸参铩眴幼影ㄔ谥参锛?xì)胞中有活性的病毒和細(xì)菌啟動子序列(例如，CaMV35S啟動子的-48至+1號核苷酸)。所述原始啟動子通常明顯接近一個Ti邊界，該啟動子與編碼GAL 4 DNA結(jié)合域的序列呈感受態(tài)關(guān)系，該結(jié)合域與一個可在植物中起作用的轉(zhuǎn)錄激活域融合，以使插入植物宿主細(xì)胞基因組中的啟動子與一個增強(qiáng)子序列呈功能性關(guān)系，由該啟動子指導(dǎo)GAL 4 DNA結(jié)合域及所述轉(zhuǎn)錄激活域的表達(dá)。為方便起見，該構(gòu)建體還可以包括一個植物選擇標(biāo)記(例如，卡那霉素抗性)。
此外，所述構(gòu)建體可以包括一個在植物中有活性的報導(dǎo)基因(如Green熒光蛋白或β-葡糖醛酸酶“GUS”)，該基因可操作地連接于GAL4-效應(yīng)型上游激活序列(UAS)上，以使該報導(dǎo)基因隨著GAL 4DNA結(jié)合域/轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白的合成而被表達(dá)。優(yōu)選該報導(dǎo)基因是如在WO 96/27675中所披露的修飾GFP，或GUS(通常帶有一個核定位信號)。優(yōu)選該UAS包括所述17聚體的一個或幾個重復(fù)，而且它與GAL4結(jié)合(Giniger等，1985 Cell 40,767-774)。
作為將GAL4結(jié)合域/轉(zhuǎn)錄激活物序列導(dǎo)入植物宿主細(xì)胞基因組的方法，所述構(gòu)建體可以包括Ds(“解離”)因子，該因子隨后在瞬時表達(dá)的Ac(激活物)酶的作用下在其基因組中轉(zhuǎn)移(例如，Cocherel等，1996 Plant Mol Biol.30,539-551)。
再一方面，本發(fā)明提供了一種含有上述構(gòu)建體的植物或其部分(例如，植物宿主細(xì)胞或細(xì)胞系)。通常，該構(gòu)建體被整合到植物細(xì)胞基因組中，并且被穩(wěn)定地保持在其中。具體地講，本發(fā)明提供了含有一個文庫的若干植物或其部分(如分離的植物細(xì)胞或細(xì)胞系或組織培養(yǎng)物)，每一個植物或其部分含有一個如上文所述的編碼所述GAL 4 DNA結(jié)合域有效部分的穩(wěn)定維持的核酸序列。通常，該核酸序列可插入存在于所述文庫中的植物細(xì)胞基因組中。
因而由所述植物或其部分的文庫構(gòu)成一種十分有用的資源。例如，該文庫可以是擬南芥(Arabidopsis thaliana)或是常用于研究的任何其它植物。該文庫的每一個植物或其部分中整合的報道基因具有特殊的表達(dá)形式(例如，參見Sundaresan等，1995 Gene & Dev.9,1797-1810；Klimyuk等，1995 Molec.Gen.Genet.249,357-365)。因此，將具有GAL4效應(yīng)型UAS的另一個基因?qū)胨黾?xì)胞系，所導(dǎo)入的基因以與所述報導(dǎo)基因相同的時間/空間模式表達(dá)，使研究者可以在特定組織中和/或在特定時間以可預(yù)計的方式表達(dá)特定的基因。
因此，本發(fā)明提供了一種以已知的(可預(yù)計的)方式在植物或其部分中表達(dá)感興趣的基因的方法，該方法包括將所述感興趣的基因?qū)胫参锘蚱洳糠种校龈信d趣的基因具有一個GAL4效應(yīng)型上游激活序列(UAS)，其特征在于所述植物或其部分包括一個報道基因，該報導(dǎo)基因在一種轉(zhuǎn)錄激活物的影響下以已知方式表達(dá)，該轉(zhuǎn)錄激活物含有一個由上述本發(fā)明序列編碼的GAL 4 DNA結(jié)合域的有效部分，以便該轉(zhuǎn)錄激活物與UAS的結(jié)合可導(dǎo)致所述感興趣的基因的轉(zhuǎn)錄激活。
所導(dǎo)入的感興趣的基因表達(dá)的時間/空間方式將反映出所述報導(dǎo)基因的已知的表達(dá)形式。通常，所述植物或植物部分可以是擬南芥，但也可以是常用于研究的任何其它植物(例如，玉米、水稻、馬鈴薯等)。
一般，是通過讓GAL4-表達(dá)植物細(xì)胞系與含有和一個GAL4效應(yīng)UAS連鎖的感興趣的基因的植物細(xì)胞系雜交將所述感興趣的基因?qū)搿?br> 本發(fā)明的核酸序列除了用作“增強(qiáng)子陷阱”或指導(dǎo)感興趣的基因以預(yù)定方式表達(dá)之外，還具有其它用途。所述修飾過的GAL 4 DNA結(jié)合域/轉(zhuǎn)錄激活物還可用于協(xié)調(diào)若干感興趣基因的表達(dá)。在很多場合下，出于研究目的或農(nóng)業(yè)/工業(yè)目的(例如，研究代謝途徑或操作諸如植物染料或脂質(zhì)的理想產(chǎn)物的合成)，希望在一種植物中同時表達(dá)若干基因。
因此，本發(fā)明提供了一種用于協(xié)調(diào)若干感興趣的基因在植物或其部分中表達(dá)的方法，所述每一個感興趣的基因在功能上與GAL4效應(yīng)UAS相關(guān)，其特征在于所述植物或其部分含有如上文所定義的符合本發(fā)明第一方面的序列，并能夠表達(dá)含有GAL 4 DNA結(jié)合域的有效部分的轉(zhuǎn)錄激活物，以便該轉(zhuǎn)錄激活物與UAS的結(jié)合可導(dǎo)致所有感興趣基因的同時轉(zhuǎn)錄激活作用。
通常，所述若干感興趣的基因都可以一種多順反子排列形式與一個UAS相連，該UAS有利于將所述感興趣的基因?qū)胫参锘蚱洳糠种?所述感興趣的基因通常是在正常情況下不存在于植物或其部分中的基因，例如，哺乳動物或細(xì)菌基因，或來自不同植物的基因，或者可能是曾作為各種修飾的目標(biāo)的天然植物基因)。另外，一個或幾個基因能可操作地連接于各自UAS上。該轉(zhuǎn)錄激活物可以由一個已經(jīng)存在于植物或其部分中的序列編碼，或在導(dǎo)入所述若干感興趣的基因的同時(或之后)導(dǎo)入。
下面將通過說明性實(shí)施例的形式并結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，在附圖中圖1表示編碼一個修飾的GAL 4 DNA結(jié)合域的本發(fā)明的核苷酸序列，該序列以符合讀框的形式與一個來自HSV VP16的一個編碼一種修飾的轉(zhuǎn)錄激活域的序列融合，圖中的豎線表示GAL 4 DNA結(jié)合域的末端；圖2是含有本發(fā)明序列的核酸構(gòu)建體的示意圖；圖3表示在圖2中示意性地示出的部分核酸構(gòu)建體的核苷酸序列；和圖4a-4d表示含有本發(fā)明序列的植物根部分顯微攝影。實(shí)施例本發(fā)明人采用了一種類似于Brand & Perrimon(1993，同上文)所披露的方法，但對該方法做過修改，以適用于擬南芥屬，用由根瘤土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化來產(chǎn)生“增強(qiáng)子陷阱”植物細(xì)胞系，該細(xì)胞系具有一種包括GAL 4 DNA結(jié)合域的轉(zhuǎn)錄激活物，其與HSV VP16的激活域融合(mGAL4-VP16)。例1-構(gòu)建mGAL4-VP16基因合成了8種與GAL 4 DNA結(jié)合區(qū)修飾序列相應(yīng)的寡核苷酸。GAL-5’(28-mer)GGC AAC AAT GAA GCT ACT GTC TTC TAT C(Seq.ID No.3)VP16-3’(31-mer)GGC AGA TCT ACC CAC CGT ACT CGT CAA TTC C(Seq.ID No.4)MGAL1(109-mer)GGC AAG CTT GGA TCC AAC AAT GAA GCT CCT GTC CTC CAT CGA GCAGGC CTG CGA CAT CTG CCG CCT CAA GAA GCT CAA GTG CTC CAA GGAGAA GCC GAA GTG CGC CAA G(Seq.ID No.5)MGAL2(108-mer)TCC TCT CGA GGG AAG ATC AGG AGG AAG AGC TGC TCC AGG CGC TCCAGG CGG GAC TCC ACT TCG GTG AGG TGG GCG CGG GTC AGC GGG GAGCGC TTG GTT TTG GGA GAG (Seq.ID No.6)MGAL3(81-mer)TTC CCT CGA GAG GAC CTC GAC ATG ATC CTG AAA ATG GAC TCC CTCCAG GAC ATC AAA GCC CTG CTC ACC GGC CTC TTC GTC (Seq.ID No.7)MGAL4(89-mer)GGG TGA GGG GCA TGT CGG TCT CCA CGG AGG CCA GGC GGT CGG TGACGG CGT CTT TGT TCA CGT TGT CCT GGA CGA AGA GGC CGG TGA GC(Seq.ID No.8)MGAL5(80-mer)GGA GAC CGA CAT GCC CCT CAC CCT GCG CCA GCA CCG CAT CAG CGCGAC CTC CTC CTC GGA GGA GAG CAG CAA CAA GGG CC(Seq.ID No.9)MGAL6(83-mer)AGT GGA GCT CGT CCC CCA GGC TGA CGT CGG TCG GGG GGG CCG TCGAGA CGG TCA ACT GGC GCT GGC CCT TGT TGC TGC TCT CC(Seq.ID No.10)通過在含有7M尿素和90mM Tris-硼酸1mM EDTA pH8.3(TBE)緩沖液的5％聚丙烯酰胺凝膠中電泳純化全長寡核苷酸。通過用濾過的0.05％甲苯胺藍(lán)染料進(jìn)行簡單的染色檢測分離的寡核苷酸，切除，并在37℃下在0.5M乙酸銨、0.1％SDS和0.1mM EDTA中洗脫過夜。使洗脫的DNA沉淀并用乙醇洗滌，用T4多聚核苷酸激酶磷酸化。將DNA(各0.5μg)分別懸浮于50mM Tris-HCl pH9.0,10mMMgCl2,10mM DTT中，其中含有1mM ATP和5個單位的T4多聚核苷酸激酶，并在37℃下培養(yǎng)30分鐘。
將質(zhì)粒pCMVGal 65(Cousens等，1989 EMBO J.8,2337-2342)用作使用未修飾密碼子的GAL 4 VP16序列的來源。從該質(zhì)粒中分離兩種內(nèi)切核酸酶片段。通過在1％低熔點(diǎn)(LGT)瓊脂糖凝膠上電泳分離和洗脫，純化一個含有編碼釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GAL 4蛋白的DNA結(jié)合因子的序列的SacⅠ-SacⅠ片段，和一個編碼單純皰疹病毒VP16蛋白的激活域的SacⅠ-KpnⅠ片段。
用所述GAL-5′和MGAL2寡聚體作引物，用所述SacⅠ-SacⅠGAL4DNA片段作模板，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增mGAL4-VP16序列的5′部分。在標(biāo)準(zhǔn)條件下用VENT DNA聚合酶(New EnglandBiolabs)溫育引物和模板，并進(jìn)行30輪反應(yīng)94℃下30秒，50℃下1分鐘，72℃下1分鐘。用XhoⅠ限制內(nèi)切核酸酶裂解所述產(chǎn)物，并在通過1.5％LGT瓊脂糖凝膠電泳后純化。
通過加熱至65℃并緩慢冷卻至室溫將MGAL4和MGAL5寡核苷酸退火。然后加入MGAL3和MGAL6，并對該混合物進(jìn)行退火。再在37℃下，在50mM Tris-HCl pH7.5,10mM MgCl2、10mM DTT、1mM dNTPs和1mM ATP中溫育所述寡核苷酸和DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段和T4 DNA連接酶。用限制性內(nèi)切核酸酶XhoⅠ和SacⅠ裂解所述產(chǎn)物，并在通過1.5％LGT瓊脂糖凝膠電泳后純化。
將3種凝膠純化的限制性片段(1)GAL-5′/MGAL 2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，相當(dāng)于GAL 4 DNA結(jié)合域的5′部分，(2)MGAL3-6退火和擴(kuò)增產(chǎn)物，相當(dāng)于GAL 4 DNA結(jié)合域的3′部分，和(3)源于pCMVGal 65的SacⅠ-KpnⅠ片段，相當(dāng)于VP16激活域混合，并在20℃下在50mM Tris-HCl pH7.5、10mM MgCl2、10MmM DTT和1mM ATP中用T4 DNA連接酶連接過夜。用MGAL 1和VP16-3′作引物對連接的產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(如上文所述)。用BamHⅠ裂解含有整個修飾過的GAL4-VP16序列的產(chǎn)物，并與用SacⅠ裂解過的PBI121(Jefferson等，EMBO J.6:3907,1987)連接，用T4 DNA聚合酶處理補(bǔ)平末端，用BamHⅠ再次裂解。該重組質(zhì)粒(pBIN 35S-mGAL4-VP16)含有組成型35S植物啟動子下游的mGAL 4-VP16基因。
如圖1所示，下面的DNA序列是融合基因(序列1)的DNA序列，它編碼GAL 4 DNA-結(jié)合域的5′部分，并編碼源于HSV VP16的轉(zhuǎn)錄激活域的3′部分。為比較起見，在其上方示出了野生型序列。可以看出，野生型GAL 4 DNA結(jié)合域編碼序列是富含A/T的(在每一行序列的右邊示出了A/T的百分含量)，并且，據(jù)信這是導(dǎo)致其在植物中低效率表達(dá)的原因。具體地講，據(jù)信富含A/T的DNA含有一個或幾個這樣的區(qū)段該片段轉(zhuǎn)錄之后在植物細(xì)胞中被作為mRNA剪接位點(diǎn)識別。改變了的核苷酸在圖1中劃線示出。其所編碼的多肽序列在下面示出(序列2)。對核苷酸序列的修飾要認(rèn)真選擇，以確保在所編碼的氨基酸序列上不會發(fā)生變化。序列上方面的數(shù)字表示在該位點(diǎn)上核苷酸或氨基酸的數(shù)目。還示出了某些限制性內(nèi)切核酸酶的位點(diǎn)。
通過用限制性內(nèi)切核酸酶HinDⅢ和EcoRⅠ消化切除35S啟動子和mGAL 4-VP16基因，通過1％LGT瓊脂糖凝膠電泳純化，并亞克隆到含有一種GAL4-效應(yīng)型mgfp5-ER標(biāo)記基因的載體上(見下面的例2)。所得到的構(gòu)建體如圖2所示，其中，R和L表示右側(cè)和左側(cè)Ti質(zhì)粒邊界序列。將位于CaMV 35S基因的TATA框片段(第-48至+1號核苷酸)下游的GAL4-VP16融合基因插入接近右側(cè)Ti邊界處。該質(zhì)粒還含有卡那霉素抗性(Kan R)選擇標(biāo)記，而一個報導(dǎo)基因(GUS或GFP)可操作地連接于一種合成GAL4-UAS啟動子序列上。還示出了某些內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)。
圖3表示通過Ti質(zhì)粒右側(cè)邊界、CaMV 35S TATA框、和GAL 4 DNA結(jié)合域編碼區(qū)的起點(diǎn)的核苷酸序列(序列15)。
在通過土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法(Valvekens等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5536-5540,1988)轉(zhuǎn)化的擬南芥屬植物中直接測定mGAL4-VP16基因的活性。例2構(gòu)建GAL-GFP增強(qiáng)子陷阱載體修飾T-DNA右側(cè)邊界。
用限制性內(nèi)切核酸酶SacⅡ消化質(zhì)粒pBIN 19(Bevan,M.Nuc.AcidsRes.12:8711-8721,1984)，并將一個含有土壤桿菌屬T-DNA右側(cè)邊界序列的2.6kb的片段亞克隆到SacⅡ裂解過的pGEM 5Zf(Genbank入藏號X65308；由Promega出售)上。用輔助噬菌體對含有所述重組噬粒的細(xì)菌進(jìn)行超感染，以得到單鏈?zhǔn)闪NA。
對一種合成的突變寡核苷酸(“TR+”:ATA TCC TGT CAA ACACTG GAT CCG AGC TCC AAT TCA TAG TTT AAA CTG AAG GCGGG；序列11)進(jìn)行激酶處理，并與純化的粘粒DNA退火，用T7 DNA聚合酶在模板上延伸，并用T4 DNA連接酶連接。將該DNA轉(zhuǎn)入細(xì)菌中，篩選在緊鄰T-DNA右側(cè)邊界插入了限制性內(nèi)切核酸酶BamHⅠ、SmaⅠ和EcoRⅠ的新位點(diǎn)的重組質(zhì)粒(pTr+)。
插入TATA框片段。
用互補(bǔ)于35S啟動子的-48區(qū)(寡核苷酸Δ35S BgⅢ；GGC AGATCT TCG CAA GAC CCT TCC TCT ATA TAA GG；序列12)和下游β-葡糖醛酸酶基因(寡核苷酸GUSSnaBI；CAC ACA AAC GGT GATACG TA；序列13)的寡核苷酸通過PCR由pBI121擴(kuò)增所述35S啟動子的TATA框區(qū)。用限制性內(nèi)切酶BgⅢ和BamHⅠ裂解所述PCR產(chǎn)物，并連接于BamHⅠ裂解過的pTr+上。所得到的重組質(zhì)粒(pTr+Δ35S)含有一個位于接近所述T-DNA右側(cè)邊界的最小(原始)啟動子。
插入驅(qū)動mGAL4-VP16基因的35S啟動子。
在未成功的實(shí)驗(yàn)中，將使用未修改過的密碼子的GAL4衍生物插入了pTr+Δ35S質(zhì)粒中，而且，上述構(gòu)建體之一(插入源于pMA236的截短的GAL4基因；Ma等，1988 Nature 334,631-633)已造成一個HindⅢ位點(diǎn)插入緊鄰pTR+Δ35S中的BamHⅠ位點(diǎn)處。用限制性內(nèi)切核酸酶HindⅢ和EcoRⅠ消化質(zhì)粒pTr+ΔGAL4，并與源于pBIN 35S-mGAL4-VP16的HinDⅢ-EcoRⅠ片段連接，以導(dǎo)入35S-驅(qū)動的mGAL4-VP16基因。然后將源于該質(zhì)粒(pTr+35S-mGAL4-VP16)的土壤桿菌序列再克隆到一種二元植物轉(zhuǎn)化載體中，該載體含有一個用于在植株中測驗(yàn)的GAL4-效應(yīng)型標(biāo)記基因(見下文)。
構(gòu)建一種合成的GAL4-效應(yīng)型啟動子。
從質(zhì)粒pUAST(Brand & Perrimon,1993 Development,118,401-415)上切除一個含有5個GAL4的優(yōu)化結(jié)合位點(diǎn)的HinDⅢ-XbaⅠ限制內(nèi)切核酸酶片段，并將其連接到HinDⅢ-XbaⅠ裂解的pBI 101(Jefeersen等，1987 EMBO J.6,3901-3907)上，位于GUS基因上游(以形成pBINΔUAS-GUS)。用寡核苷酸DELAS1(GAA CTC TAGAAG CTA CTC CAC GTC CAT AAG GGA CAC ATC ACA ATC CCA CTATCC TTC GC；序列14)和GUSSnaBI(同上)通過PCR擴(kuò)增相當(dāng)于35S啟動子的-90區(qū)。用XbaⅠ-BamHⅠ裂解所得到的產(chǎn)物，并克隆至作過類似裂解的pBIN ΔUAS-GUS。所得到的質(zhì)粒(pBIN UAS(-90-AS1)GUS)含有一個合成的β-葡糖醛酸酶(GUS)編碼序列的GAL4啟動子上游。然后用綠色熒光蛋白(GFP)取代所述GUS基因。
GAL4-效應(yīng)mgfp5-ER基因。
我們已對綠色熒光蛋白基因作過各種誘變，以優(yōu)化其在植物中的表達(dá)。所優(yōu)化的基因被稱為mgfp5-ER(Siemering等，Current Biology6:1653-1663,1996；WO 96/27675)。
已將mgfp5-ER基因克隆到植物轉(zhuǎn)化載體pBI 121中，而且，我們已切除一個BamHⅠ-SacⅠ片段，該片段含有所述編碼序列，并且已被插入BamHⅠ-SacⅠ裂解過的pBINUAS(-90-AS1)GUS上，以取代GUS基因。用SacⅡ裂解該質(zhì)粒(pBIN UAS(-90-AS1)mgf5-ER)，并與含有修飾的T-DNA右側(cè)邊界和源于pTr+35S-mGAL4-VP16的mGAL4-VP16基因的SacⅡ片段連接，以得到pBIN 35S-GAL4-VP16+UAS-mgfp5-ER(縮寫為pBIN 35S-GAL-GFP)。
檢驗(yàn)pBIN 35S-GAL-GFP載體。
通過電穿孔法將pBIN 35S-GAL-GFP質(zhì)粒導(dǎo)入根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA4044(Jefferson等，EMBOJ.6:3901-3907,1987)，然后在含有卡那霉素的平板上選擇。用下面所述的方法將上述土壤桿菌屬菌株轉(zhuǎn)化擬南芥屬。在轉(zhuǎn)化之后對植物的GAL-4依賴型GFP熒光誘導(dǎo)進(jìn)行計分。
構(gòu)建GAL-GFP增強(qiáng)子陷阱載體用BamHⅠ處理pTR+35S-mGAL-VP16質(zhì)粒(以切除所述35S啟動子序列)，并用T4 DNA連接酶進(jìn)行重新連接。該質(zhì)粒(pTR+mGAL4-VP16)含有修飾過的GAL4-VP16，有一個最小啟動子位于T-DNA右側(cè)邊緣。然后通過用SacⅡ消化切除所述T-DNA序列，并與用同一種酶裂解的pBIN UAS(-90-AS1)mgfp5-ER連接。由此產(chǎn)生的pBIN GAL-GFP含有活性很高的mGAL-4-VP16轉(zhuǎn)錄激活物，該激活物響應(yīng)于相鄰的增強(qiáng)子因子，并包括一個GAL4-依賴型GFP基因。GFP熒光是因?yàn)镚AL4-VP16的激活而產(chǎn)生的。
增強(qiáng)子陷阱篩選。
將增強(qiáng)子陷阱載體pBIN GAL-GFP導(dǎo)入根瘤土壤桿菌(詳見下文)LBA4044中，并將其用于制備7,500個以上的轉(zhuǎn)化擬南芥屬幼苗。直接篩選轉(zhuǎn)基因幼苗的GAL4-介導(dǎo)的GFP表達(dá)，并從表達(dá)植株上采集種子。我們擁有一個超過250個擬南芥屬品系的文庫，這些品系在其根部表現(xiàn)出由GAL4介導(dǎo)的GFP表達(dá)的穩(wěn)定遺傳的形式。
反式激活。
為了證實(shí)由GAL4介導(dǎo)的外源基因的反式激活作用，我們制備了含有源于pBIN UAS(-90-AS1)GUS)的T-DNA序列的轉(zhuǎn)基因擬南芥。缺乏GAL4-VP16時，這些植物不表達(dá)GUS基因。不過，在與表達(dá)mGAL′4-VP16基因的品系進(jìn)行遺傳雜交時，該GUS基因以表達(dá)的方式被激活，這準(zhǔn)確地反映出該mGAL4-VP16基因源于所述供體親本(見下面的例3)。例3構(gòu)成上述文庫一部分的一個穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的擬南芥系(J2302)，可在其根尖末端的細(xì)胞中表達(dá)修飾的GFP(受mGAL4-VP16激活物的影響)(參見圖4a和4b)。
圖4a是表示在根尖部位由GFP-介導(dǎo)的落射熒光(400nm激勵光)的低倍顯微照片。圖4b是更詳細(xì)地顯示GFP-介導(dǎo)的落射熒光的較大放大倍數(shù)的共焦顯微照片(488nm激勵光)。
讓所述擬南芥系J2302與另一個擬南芥系雜交，該另一個系包括一個穩(wěn)定的沉默維持的GUS報道基因；該基因可操作地連接于GAL4-效應(yīng)UAS上。正如所預(yù)料的，所述雜交的產(chǎn)物可在GAL4-VP16轉(zhuǎn)錄激活物的影響下表達(dá)GUS，與GFP報導(dǎo)基因在J2302中的表達(dá)方式相似(即在根尖末端表達(dá))。在圖4c和4d中示出了經(jīng)適當(dāng)染色的樣品，通過明視野顯微術(shù)成像，并驗(yàn)證在根尖部位的GUS報導(dǎo)基因活性(染色最深的部分)。
這表明修飾的GAL 4 DNA結(jié)合域序列可以(ⅰ)成功地用于構(gòu)建增強(qiáng)子陷阱載體；(ⅱ)以可預(yù)計的方式表達(dá)感興趣的基因(例如GUS)；和(ⅲ)協(xié)調(diào)若干感興趣基因的同時表達(dá)(例如GFP和GUS基因)。例4轉(zhuǎn)化擬南芥所使用的方法基于由Valvekens等(1988,Proc.Natl.Acad.Sci.85,5536-5540)最初所披露的方法。培養(yǎng)基除非另加說明，一切過程均是用無菌溶液和設(shè)備在無菌條件下完成。所有培養(yǎng)基均用于標(biāo)準(zhǔn)的塑料一次性培養(yǎng)皿中，或是在后期用于Magenta CA7瓶(Magenta Corp.USA)中。以1000倍母液形式將激素溶于二甲基亞砜(DMSO)中。在加入激素和抗生素后對所述培養(yǎng)基進(jìn)行高壓滅菌并冷卻至65℃。
1．萌芽培養(yǎng)基(GM)含有1×Murashige和Skoog鹽混合物；1％蔗糖；100mg/l肌醇；1.0mg/l硫胺素；0.5mg/l吡哆醇；0.5mg/l煙酸；0.5g/l 2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)；(用1M KOH調(diào)至pH5.7)；和0.8％Difco Bacto瓊脂(用于固體GM培養(yǎng)基)。
1a. GM K50用GM，但補(bǔ)充了50mg/l卡那霉素(Sigma)2．愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(CIM)含有1×Gamborg′s B5培養(yǎng)基；2％葡萄糖；0.5g/l MES(pH5.7，用1N KOH調(diào)節(jié))；0.5mg/l 2,4-D(Sigma)；0.05mg/l細(xì)胞分裂素(Sigma)；和0.8％瓊脂(用于固體CIM培養(yǎng)基)。
3．含有萬古霉素的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(SIM V750 K50)，它含有Gamborg′s B5培養(yǎng)基；2％葡萄糖；0.5g/l MES(pH5.7)；0.8％瓊脂；5mg/l N6-(2-異戊烯)腺嘌呤(2ip)；0.15mg/l吲哚-3-乙酸(IAA)；750mg/l萬古霉素；和50mg/l卡那霉素。
3a. SIM V500 K50同SIM，但補(bǔ)充了500mg/l萬古霉素；和50mg/l卡那霉素。
4．根誘導(dǎo)培養(yǎng)基(RIM)，含有Gamborg′s B5培養(yǎng)基；2％葡萄糖；0.5g/l MES(pH5.7)；0.8％瓊脂；12.5mg/l吲哚丁酸(IBA)；和50mg/l頭孢噻肟。植物生長(ⅰ)將種子放入一個15ml的聚丙烯離心管中。
(ⅱ)加入乙醇保持2分鐘。用移液管除去乙醇。
(ⅲ)用5％的市售漂白粉(約含0.25％可利用氯)取代乙醇，其中，每50ml含有1滴NP40。放置15分鐘，有規(guī)律地?fù)u動。
(ⅳ)在無菌蒸餾水中至少洗滌種子3次。
(ⅴ)在經(jīng)過最后一次洗滌之后，將無菌的種子放入裝在錐形燒瓶中的100ml GM中。在20-25℃的培養(yǎng)室中搖動培養(yǎng)2-4周。由土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。
1．第1天(ⅰ)用解剖刀片切除小植株的所有綠色部分(上部)，僅留下根系。
(ⅱ)將所述根系分布在裝有固體CIM的平板上。輕輕下壓每一束根，以保證其與所述瓊脂表面的接觸。
(ⅲ)在生長室中培養(yǎng)3天(22℃，連續(xù)光照)。
2．第4天(ⅰ)在保證無可見的污染跡象之后，將誘導(dǎo)出愈傷組織的根系收集到一個空的培養(yǎng)皿中。
(ⅱ)將上述根系切成0.5cm長的外植體。
(ⅲ)將3-5ml在28℃下生長過夜的土壤桿菌屬培養(yǎng)物加入Luria肉湯中，并離心洗滌。用平頭鑷子攪拌。讓其共培養(yǎng)2分鐘。
(ⅳ)用放在培養(yǎng)皿中的雙層厚無菌濾紙(Whatman No.1)將所述根吸干。
(ⅴ)將所述外植體放在裝在培養(yǎng)皿中的固化CIM培養(yǎng)基上，并將其輕壓至培養(yǎng)基的表面上，以確保其接觸培養(yǎng)基。
(ⅵ)在生長室中培養(yǎng)所述平皿2天時間，以完成土壤桿菌屬的共培養(yǎng)。
3．第6天(ⅰ)將所述外植體轉(zhuǎn)移至裝在一個培養(yǎng)皿中的20-25ml水中。
用平頭鑷子攪動，以洗去所述土壤桿菌。洗滌培養(yǎng)基會略微變濁。將所述根段轉(zhuǎn)移到篩網(wǎng)上，并重復(fù)以上洗滌步驟。然后將所述篩網(wǎng)從緩沖液中抬起并瀝干。將所述外植體下壓至網(wǎng)眼上，以便除去盡可能多的緩沖液和土壤桿菌。將所述半干燥的外植體擠壓在一起形成團(tuán)塊。
(在用土壤桿菌屬感染和洗滌根系外植體期間將定做的、可高壓滅菌和再利用的篩網(wǎng)用于固定所述外植體。所述篩網(wǎng)是由100ml的塑料三角燒瓶和100μm的尼龍網(wǎng)制成。將該燒瓶的頂部3-4cm切除，將所述尼龍網(wǎng)固定在該切除部分的底部，其做法是將從該燒瓶底部上方切下的一個2cm高的環(huán)壓入所述上部的下部。通過將熱金屬棒在幾處位置上插入二者之間將以上兩部分密封在一起。)(ⅱ)用放在培養(yǎng)皿中的雙層厚無菌濾紙吸干小的根系材料束，并將其轉(zhuǎn)移到固化的SIM V750 K50培養(yǎng)基上，留意根系外植體與所述培養(yǎng)基保持密切接觸。
(ⅲ)在生長室中培養(yǎng)。再生(ⅰ)在生長室中，在生長3周以后的黃色根部外植體上出現(xiàn)極小的綠色抗卡那霉素愈傷組織。
(ⅱ)每隔2周將外植體轉(zhuǎn)移到新鮮的SIM V750 K50上。在隨后的幾周中，會斷斷續(xù)續(xù)地在所述綠色愈傷組織上出現(xiàn)芽(起初通常為透明的)。
(ⅲ)將所述芽轉(zhuǎn)移到RIM中，在這里將用2-3周時間長出根。
(ⅳ)在形成根以后，將這樣的小植株轉(zhuǎn)移至通風(fēng)的Magenta GA 7盆中或直接移栽到土壤中。確保濕度保持較低，以保證結(jié)實(shí)良好。
(ⅴ)在種子變成黃褐色并因而成熟之后，收獲種子莢。F1代的萌發(fā)和篩選。
為了檢驗(yàn)轉(zhuǎn)化，在GM K50上萌發(fā)F1幼苗。
(ⅰ)將種子放在GM K50上(如果必要，對種子進(jìn)行表面消毒)。
(ⅱ)將培養(yǎng)皿在4℃下(冰箱中)于黑暗中放置3-5天，以打破種子的休眠。如果種子已存放1月以上，則不必這么做。
(ⅲ)在生長室中將培養(yǎng)皿培養(yǎng)2周。敏感的幼苗不能形成根或葉，并具有白色子葉。轉(zhuǎn)化的幼苗在表型上是正常的。
(ⅳ)用一臺裝有一種濾光裝置(Leitx-D excitation BP355-425,dichroic 455,emission LP 460)的倒置熒光顯微鏡(Leitz DM-IL)篩選轉(zhuǎn)基因愈傷組織和芽中GFP的表達(dá)，所述濾光裝置適用于GFP的395nm的主激勵光和509nm的發(fā)射峰。使用一個具有4×物鏡的7mm螺紋加長管(EF4/0.12)可以產(chǎn)生更大的工作距離，并能夠方便地直接觀察倒置的密封培養(yǎng)皿中的組織。還用一個100瓦特的長波長手持式UV燈(UV Products,B100AP)對轉(zhuǎn)基因芽和植株進(jìn)行日常監(jiān)測。讓轉(zhuǎn)基因的擬南芥屬F1幼苗在無菌瓊脂培養(yǎng)物中生長5天，并在水中將其裝在玻璃蓋片下面，以便作顯微觀察。用一臺裝有氪-氬激光和濾光裝置的BioRad MRC-600激光掃描共焦顯微鏡檢查樣品，所述裝置適于檢測熒光素和德克薩斯紅染料(BioRad K1/K2)，所述顯微鏡還包括一個Nikon60×PlanApo N.A.1.2水浸物鏡。
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請人(A)名稱Medical Research Council(B)街道20 Park Crescent(C)城市London(E)國家United Kingdom(F)郵編WIN 4AL(G)電話(0171)636 5422(H)電傳(0171)323 1331(ⅱ)發(fā)明名稱對基因表達(dá)的改進(jìn)或有關(guān)基因表達(dá)的改進(jìn)(ⅲ)序列數(shù)15(ⅳ)計算機(jī)可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0.Version#1.30(EPO)(2)序列1資料(ⅰ)序列特征(A)長度701bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅸ)特征(A)名稱/鍵詞CDS(B)位置17..694(ⅹⅰ)序列描述序列1AAGCTTGGAT CCAACA ATG AAG CTC CTG TCC TCC ATC GAG CAG GCC TGC 49Met Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys1 5 10GAC ATC TGC CGC CTC AAG AAG CTC AAG TGC TCC AAG GAG AAG CCG AAG97Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys15 20 25TGC GCC AAG TGT CTG AAG AAC AAC TGG GAG TGT CGC TAC TCT CCC AAA 145Cys Ale Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys30 35 40ACC AAG CGC TCC CCG CTG ACC CGC GCC CAC CTC ACC GAA GTG GAG TCC 193Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Vel Glu Ser45 50 55CGC CTG GAG CGC CTG GAG CAG CTC TTC CTC CTG ATC TTC CCT CGA GAG 241Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu60 65 70 75GAC CTC GAC ATG ATC CTG AAA ATG GAC TCC CTC CAG GAC ATC AAA GCC 289Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala80 85 90CTG CTC ACC GGC CTC TTC GTC CAG GAC AAC GTG AAC AAA GAC GCC GTC 337Leu Leu Thr Gly Leu Phe Vel Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala Val95 100 105ACC GAC CGC CTG GCC TCC GTG GAG ACC GAC ATG CCC CTC ACC CTG CGC 385Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg110 115 120CAG CAC CGC ATC AGC GCG ACC TCC TCC TCG GAG GAG AGC AGC AAC AAG 433Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys125 130 135GGC CAG CGC CAG TTG ACC GTC TCG ACG GCC CCC CCG ACC GAC GTC AGC 481Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val 5er Thr Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser140 145 150 155CTG GGG GAC GAG CTC CAC TTA GAC GGC GAG GAG GTG GCG ATG GCG CAT 529Leu Gly Asp Glu Leu His Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His160 165 170GCC GAC GCG CTA GAC GAT TTC GAT CTG GAC ATG TTG GGG GAC GGG GAT 577Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp175 180 185TCC CCG GGG CCG GGA TTT ACC CCC CAC GAC TCC GCC CCC TAC GGC GCT 625Ser Pro Gly Pro Gly Phe Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala190 195 200CTG GAT ATG GCC GAC TTC GAG TTT GAG CAG ATG TTT ACC GAT GCC CTT 673Leu Asp Met Ala Asp Phe Glu Phe Glu Gln Met Phe Thr Asp Ala Leu205 210 215GGA ATT GAC GAG TAC GGT GGG TAGATCT 701Gly Ile Asp Glu Tyr Gly Gly220 225(2)序列2資料(ⅰ)序列特征(A)長度226個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白(ⅹⅰ)序列描述序列2Met Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu1 5 10 15Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu20 25 30Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro35 40 45Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu50 55 60Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile65 70 75 80Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu85 90 95Phe Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala100 105 110Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser115 120 125Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu130 135 140Thr Val Ser Thr Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu Gly Asp Glu Leu145 150 155 160His Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala Asp Ala Leu Asp165 170 175Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser Pro Gly Pro Gly180 185 190Phe Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu Asp Met Ala Asp195 200 205Phe Glu Phe Glu Gln Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly Ile Asp Glu Tyr210 215 220Gly Gly225(2)序列3資料(ⅰ)序列特征(A)長度28bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述序列3GGCAACAATG AAGCTACTGT CTTCTATC 28(2)序列4資料(ⅰ)序列特征(A)長度31bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述序列4GGCAGATCTA CCCACCGTAC TCGTCAATTC C 31(2)序列5資料(ⅰ)序列特征(A)長度109bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述序列5GGCAAGCTTG GATCCAACAA TGAAGCTCCT GTCCTCCATC GAGCAGGCCT GCGACATCTG 60CCGCCTCAAG AAGCTCAAGT GCTCCAAGGA GAAGCCGAAG TGCGCCAAG 109(2)序列6資料(ⅰ)序列特征(A)長度108bp
(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述序列6TCCTCTCGAG GGAAGATCAG GAGGAAGAGC TGCTCCAGGC GCTCCAGGCG GGACTCCACT 60TCGGTGAGGT GGGCGCGGGT CAGCGGGGAG CGCTTGGTTT TTGGGAGAG 108(2)序列7資料(ⅰ)序列特征(A)長度81bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述序列7TTCCCTCGAG AGGACCTCGA CATGATCCTG AAAATGGACT CCCTCCAGGA CATCAAAGCC 60CTGCTCACCG GCCTCTTCGT C 81(2)序列8資料(ⅰ)序列特征(A)長度89bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述序列8GGGTGAGGGG CATGTCGGTC TCCACGGAGG CCAGGCGGTC GGTGACGGCG TCTTTGTTCA60CGTTGTCCTG GACGAAGAGG CCGGTGAGC 89(2)序列9資料(ⅰ)序列特征(A)長度80bp(B)類型核酸
(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述序列9GGAGACCGAC ATGCCCCTCA CCCTGCGCCA GCACCGCATC AGCGCGACCT CCTCCTCGGA 60GGAGAGCAGC AACAAGGGCC 80(2)序列10資料(ⅰ)序列特征(A)長度83bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述序列10AGTGGAGCTC GTCCCCCAGG CTGACGTCGG TCGGGGGGGC CGTCGAGACG GTCAACTGGGC 60GCTGGCCCTT GTTGCTGCTC TCC 83(2)序列11資料(ⅰ)序列特征(A)長度56bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述序列11ATATCCTGTC AAACACTGGA TCCGAGCTCC AATTCATAGT TTAAACTGAA GGCGGG 56(2)序列12資料(ⅰ)序列特征(A)長度35bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ⅹⅰ)序列描述序列12GGCAGATCTT CGCAAGACCC TTCCTCTATA TAAGG 35(2)序列13資料(ⅰ)序列特征(A)長度20bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述序列13CACACAAACG GTGATACGTA 20(2)序列14資料(ⅰ)序列特征(A)長度59bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述序列14GAACTCTAGA AGCTACTCCA CGTCCATAAG GGACACATCA CAATCCCACT ATCCTTCGC 59(2)序列15資料(ⅰ)序列特征(A)長度91bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述序列15TAGGTTTACC CGCCAATATA TCCTGTCAAA CACTGGATCT TCGCAAGACC CTTCCTCTAT 60ATAAGGAAGT TCATTTCATT TGGAGAGGAC A9權(quán)利要求
1．一種可在植物細(xì)胞中表達(dá)的、至少編碼一種GAL 4 DNA-結(jié)合域的一個有效部分的核酸序列，與其野生型酵母序列相比，該序列的A/T堿基百分含量顯著降低。
2．如權(quán)利要求1的序列，還包括一個可操作地與編碼所述GAL 4DNA結(jié)合域的有效部分的序列連接的結(jié)構(gòu)和/或調(diào)控序列。
3．如權(quán)利要求1或2的序列，其中，所述核酸編碼一種具有轉(zhuǎn)錄激活活性的肽或多肽，該序列可操作地與編碼所述GAL 4 DNA結(jié)合域的有效部分的序列連接。
4．如權(quán)利要求1、2或3的序列，其中，所述序列編碼一種在植物細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)錄激活活性的肽或多肽，其為GAL 4、VP16、GCN4的修飾部分或是一種非天然存在的設(shè)計序列。
5．一種核酸構(gòu)建體，含有一個如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的序列。
6．如權(quán)利要求5的構(gòu)建體，可以把如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的序列插入一種植物宿主細(xì)胞的基因組中。
7．如權(quán)利要求5或6的構(gòu)建體，還包括一個可操作地與一個GAL 4-效應(yīng)上游激活序列(UAS)連接的報導(dǎo)基因。
8．如權(quán)利要求5、6或7中任一項(xiàng)的構(gòu)建體，包括一個適于在植物細(xì)胞中表達(dá)的編碼GUS或綠色熒光蛋白(GFP)的序列。
9．如權(quán)利要求5-8中任一項(xiàng)的構(gòu)建體，含有T-DNA邊界或Ds因子。
10．如權(quán)利要求5-9中任一項(xiàng)的構(gòu)建體，其中，權(quán)利要求1-4中所述的序列的表達(dá)是受一個增強(qiáng)子依賴型植物啟動子的控制。
11．如權(quán)利要求5-10中任一項(xiàng)的構(gòu)建體，還包括一個選擇標(biāo)記基因。
12．一種植物或其部分，含有一種如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的核酸序列或是用權(quán)利要求5-11中任一項(xiàng)所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化過。
13．如權(quán)利要求12的植物或其部分，其中，所述序列被穩(wěn)定保持于植物基因組中。
14．一種包括若干植物或其部分的文庫，每個植物或部分包括一個穩(wěn)定整合的如權(quán)利要求3或4所述的核酸序列，該序列可導(dǎo)致一個報導(dǎo)基因以已知的時間和/或空間模式表達(dá)。
15．如權(quán)利要求14的文庫，該文庫是通過將權(quán)利要求6-11中任一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建體導(dǎo)入若干植物或其部分中制成的。
16．如權(quán)利要求14或15的文庫，包括若干擬南芥(Arabidopsisthaliana)植株。
17．一種以已知方式在植物或其部分中表達(dá)一個感興趣的基因的方法，該方法包括將所述感興趣的基因?qū)胨鲋仓昊蚱洳糠种校龈信d趣的基因具有一個GAL4-效應(yīng)上游激活序列(UAS)，其特征在于所述植物或其部分包括一個以已知方式表達(dá)的報導(dǎo)基因，該基因的表達(dá)受一種轉(zhuǎn)錄激活物的影響，該激活物含有一種GAL 4 DNA結(jié)合域的有效部分，該部分由權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的序列編碼，以便所述轉(zhuǎn)錄激活物與UAS的結(jié)合可導(dǎo)致所述感興趣的基因的轉(zhuǎn)錄激活。
18．如權(quán)利要求17的方法，其中，所述感興趣的基因被導(dǎo)入來自如權(quán)利要求14、15或16中任一項(xiàng)所述文庫的一個或幾個植株或其部分。
19．一種協(xié)調(diào)若干感興趣的基因在植物或其部分中表達(dá)的方法，每一個感興趣的基因在功能上與GAL4-效應(yīng)USA相關(guān)，其特征在于所述植物或其部分含有一個如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的序列，并能夠表達(dá)一種轉(zhuǎn)錄激活物，該激活物含有一個GAL 4 DNA結(jié)合域的有效部分，以使該轉(zhuǎn)錄激活物與UAS的結(jié)合可導(dǎo)致所有感興趣基因的同時轉(zhuǎn)錄激活。
20．如權(quán)利要求19的方法，其中，所述感興趣的基因中的至少某一些是呈多順反子排列，并與一個GAL4-效應(yīng)UAS相關(guān)。
21．如權(quán)利要求19的方法，其中，感興趣的基因在功能上與相應(yīng)的GAL4效應(yīng)UASs相關(guān)。
全文摘要
披露了一種可在植物細(xì)胞中表達(dá)、至少編碼一種GAL4 DNA－結(jié)合域的一個有效部分的核酸序列,該序列的A/T堿基百分含量相對其野生型酵母序列顯著降低。
文檔編號C12N15/09GK1216067SQ9719368
公開日1999年5月5日 申請日期1997年2月14日 優(yōu)先權(quán)日1996年2月14日
發(fā)明者J·P·哈瑟羅夫, S·霍德格 申請人:英國技術(shù)集團(tuán)有限公司