專利名稱：獲自煙草的啟動子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由Nicotiana tabecum(煙草)中鑒定的啟動子。本發(fā)明還涉及運用所述啟動子控制外源目的DNA在不同植物種轉(zhuǎn)基因植物中的表達。
背景技術(shù)：
農(nóng)桿菌屬的細菌具有將特定DNA區(qū)段(T-DNA)轉(zhuǎn)入植物細胞，在其中的核染色體上穩(wěn)定整合的能力。對載有該T-DNA的植物所進行的分析表明該遺傳元件可以在多個位點整合，偶爾還能在基因內(nèi)找到。一種已經(jīng)利用來鑒定基因內(nèi)整合事件的策略是用特殊設(shè)計的T-DNA載體轉(zhuǎn)化植物細胞，所述載體含有一個缺少順式作用轉(zhuǎn)錄和翻譯表達信號(即“無啟動子”)并位于T-DNA末端的報告基因。整合時，無啟動子基因(報告基因)的起始密碼子將與植物序列并置。T-DNA鄰近基因啟動子元件下游插入的結(jié)果可能是報告基因表達的激活。產(chǎn)生的雜種基因，稱為T-DNA介導(dǎo)的基因融合體，包含有位于染色體中它們天然位點上的未知并因而未表征的植物啟動子，以及位于插入T-DNA上的標(biāo)記基因的編碼序列(Fobert等，1991,Plant Mol.Biol.17,837-851)。
無啟動子或無增強子標(biāo)記基因的激活通常假定是由于T-DNA在基因內(nèi)或緊鄰基因處的插入產(chǎn)生的。最近對于幾個T-DNA插入突變體的分離(Koncz等，1992,Plant Mol.Biol 20,963-976；Feldman的綜述，1991,Plant J.1,71-82；Van Lijsebettens等，1991,Plant Sci.80,27-37；Walden等，1991,Plant J.1:281-288；Yanofskg等，1990,Nature 346,35-39)，表明對于至少一些插入而言情況是這樣。但是，存在其它可能性。這些可能性之一是該T-DNA的整合激活了與基因無關(guān)聯(lián)的沉默調(diào)控序列。Lindsey等(1993,Transgenic Res.2,33-47)稱這樣的序列為“假啟動子”并暗示它們或許負責(zé)激活人為一些轉(zhuǎn)基因品系中的報告基因。Fobert等(1994,plant J.6,567-577)已經(jīng)克隆了這種序列，并將其稱為“隱蔽性啟動子”。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及由Nicotiuna tabacum(煙草)鑒定的啟動子。
轉(zhuǎn)基因煙草植株T1275含有包含2.15kb無啟動子GUS-nos基因和2.23kb 5’側(cè)翼煙草DNA(2225bp)的4.38kb的EcoRⅠ/XbaⅠ片段。此5’側(cè)翼DNA未顯示與已知序列有同源性。
因此，本發(fā)明包括一個特征為含有至少18bp SEQ ID NO:1的鄰接序列的啟動子。
用Southern印跡雜交法在大豆、番茄、向日葵、Arabidopsis，甘藍型油菜，甘藍，玉米、小麥或黑云杉中檢測不到此啟動子。所述克隆片段在轉(zhuǎn)基因煙草-煙草栽培品種Petit Havana,SRI以及轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜栽培品種Westar中的表達可在葉片、莖、根、發(fā)育中的種子以及花中觀察到。運用瞬時表達分析法，也在大豆、苜蓿、擬南芥屬、煙草、甘藍型油菜、碗豆的葉片組織以及燕麥、玉米、小麥和大麥的懸浮培養(yǎng)細胞中觀察到GUS活性。
因此本發(fā)明也提供組成型的啟動子。進而，此啟動子在克隆載體上導(dǎo)入時在不同植物種中發(fā)揮功能。
本發(fā)明還包括具有一段DNA序列、實質(zhì)上與SEQ ID NO:1同源的組成型啟動子。
轉(zhuǎn)基因煙草中導(dǎo)入的GUS基因的轉(zhuǎn)錄起始位點位于植物DNA中的所述插入位點上游。這在葉片、莖、根、種子和花中是相同的。另外，在未轉(zhuǎn)化煙草和轉(zhuǎn)基因煙草中所述天然位點均是沉默的。
因此按照本發(fā)明，提供來自煙草的隱蔽性組成型啟動子，當(dāng)它在克隆載體中導(dǎo)入時，在不同的植物物種發(fā)揮功能。
本發(fā)明也涉及嵌合型基因構(gòu)建物，它包括一段希望組成型表達的目的DNA以及一個含有至少18bp SEQ ID NO:1鄰接序列的組成型啟動子。
本發(fā)明還涉及包含所述嵌合型基因構(gòu)建物的克隆載體。
本發(fā)明也包括已經(jīng)用所述嵌合基因或所述克隆載體轉(zhuǎn)化的植物細胞。進而，本發(fā)明包括含有所述嵌合基因或所述克隆載體的轉(zhuǎn)基因植物。
本發(fā)明還涉及含有一個組成型啟動子的任何轉(zhuǎn)基因植物，所述啟動子具有實質(zhì)上與SEQ ID NO:1同源的一段DNA序列，有效連接于被轉(zhuǎn)錄成RNA的DNA區(qū)。
本發(fā)明也包括使基因在植物中組成型表達的方法，包括將一段希望組成型表達的外源目的DNA有效連接于一個含有至少18bp SEQID NO:1鄰接序列的組成型啟動子上，以產(chǎn)生嵌合型基因構(gòu)建物并將其導(dǎo)入能夠表達此嵌合型基因構(gòu)建物能夠表達的植物中。
附圖簡述通過參考以下附圖，本發(fā)明的這些或那些特征會更明顯

圖1表明GUS在植珠T1275所有組織中的組成型表達，所述組織包括葉片段(a)、莖剖面(b)、根(c)、花剖面(d)、子房剖面(e)、未成熟胚(f)、成熟胚(g)以及種籽剖面(h)。
圖2表示GUS的比活，它表明T1275中GUS表達的水平比得上葉片組織中表達CaWV 35S-GUS-nos基因的植物中的水平。
圖3是用GUS基因編碼區(qū)探針(泳道1)和nptⅡ基因編碼區(qū)探針(泳道2)對經(jīng)EcoRⅠ消化的T1275 DNA進行的Southern印跡雜交分析，表明植株T1275中的單一T-DNA插入位點。
圖4表明從pT1275克隆的GUS基因融合體。箭頭表示所述植物DNA序列中GUSmRNA起始位點。
圖5表明所述分離的植物DNA序列的限制性內(nèi)切酶圖譜。箭頭表示所述植物DNA序列中GUS mRNA的起始位點。
圖6表明在隨機選出的單獨、再生、溫室生長的煙草植物葉片中GUS的比活不同(圖6A)，并通常與用RNase保護試驗和放射自顯影譜光密度檢測法測量出的累積GUSmRNA水平有關(guān)(圖6B)。
圖7表明在未轉(zhuǎn)化(泳道U)或轉(zhuǎn)基因(泳道T25)煙草植株葉片中相應(yīng)于天然植物序列原位轉(zhuǎn)錄物不積累(3)；而與插入轉(zhuǎn)基因植物T25的T-DNA中的GUS基因融合的同一植物序列，其相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄物(泳道T25)出現(xiàn)在所示的被保護片段(2)中。泳道P中的未消化探針(1)作對照。
優(yōu)選實施方案的描述本發(fā)明涉及植物基因調(diào)控序列。更確切地說，本發(fā)明涉及一個啟動子，該啟動子是通過用無啟動子的β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)作為T-DNA標(biāo)簽，以產(chǎn)生組成型表達GUS活性的轉(zhuǎn)基因煙草植物鑒定的。
本發(fā)明亦涉及含有SEQ ID NO:1的至少18bp相鄰核苷酸序列的啟動子。不低于18bp的寡核苷酸可用于構(gòu)建包含如SEQ ID NO:1中所定義的啟動子片段的異源啟動子。這樣的異源啟動子的運用已在文獻中較好建立。例如，已復(fù)制35S CaMV啟動子中的特殊元件片段或?qū)⑵渑c其它啟動子片段結(jié)合以產(chǎn)生具有所需性質(zhì)的嵌合啟動子(如U.S.5,491,288、5,424,200、5,322,938、5,196,525、5,164,316)。另外，18bp或更長的寡核苷酸在鑒別或擴增其它組織或生物中有關(guān)DNA或RNA序列中可用作探針或PCR引物。
在本說明書的上下文中，名詞“啟動子”或“啟動子區(qū)”是指通常在結(jié)構(gòu)基因編碼序列的上游(5’)的一段DNA序列，它通過為RNA聚合酶和/或從特殊位點起始轉(zhuǎn)錄所需的其它因子提供識別來控制編碼區(qū)的表達。
通常有兩種類型的啟動子，即誘導(dǎo)型啟動子和組成型啟動子。誘導(dǎo)型啟動子是一種能夠直接或間接地響應(yīng)誘導(dǎo)物而激活一個或多個DNA序列或基因的轉(zhuǎn)錄的啟動子。當(dāng)缺乏誘導(dǎo)物時，所述DNA序列或基因?qū)⒉晦D(zhuǎn)錄。特異性地結(jié)合于誘導(dǎo)型啟動子以激活轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)因子通常以無活性形式出現(xiàn)，然后它被所述誘導(dǎo)物直接或間接地轉(zhuǎn)化為活性形式。所屬誘導(dǎo)物可以是化學(xué)試劑，如蛋白、代謝物、生長調(diào)節(jié)劑、除草劑或酚類化合物或直接由熱、冷、鹽、或有毒元素或間接通過病原體或諸如病毒之類的致病因素作用而施加的生理脅迫。含有誘導(dǎo)型啟動子的植物細胞可通過諸如噴灑、澆水、加熱或類似方法從外部提供誘導(dǎo)物給細胞或植物使其暴露于誘導(dǎo)物。
組成型啟動子指導(dǎo)基因在整個植物的各個部分表達，并在整個植物發(fā)育過程連續(xù)表達。已知的組成型啟動子的例子包括與以下有關(guān)的那些啟動子CaMV 35S轉(zhuǎn)錄子(Odell等，1985,Nature,313:810-812)、水稻肌動朊1(Zhang等，1991,Plant Cell,3:1155-1105)和磷酸丙糖異構(gòu)酶1(Xu等，1994,Plant Physiol.106:459-467)基因；玉米遍在蛋白質(zhì)1基因(Comejo等，1993,Plant Mol.Biol.29:637-646)、擬南芥屬遍在蛋白質(zhì)1和6基因(Holtorf等，1995,Plant Mol.Biol.29:637-646)和煙草翻譯起始因子4A基因(Mandel等，1995,Plant Mol.Biol.29:995-1004)。本發(fā)明涉及含有一個能夠指導(dǎo)基因表達的啟動子的一段DNA序列。所述啟動子最好從煙草分離出的組成型啟動子。
用于此處的名詞“組成型”不必表明基因在所有細胞類型中有相同表達水平，而是表明所述基因在廣泛細胞類型中表達，雖然?？捎^察到豐度的某些變化。
本發(fā)明還涉及含有有效連接于本發(fā)明啟動子的目的DNA的嵌合基因構(gòu)建物。可以按照本發(fā)明使用和操作任何外源基因，以產(chǎn)生所述外源基因的表達。目的基因可以是包括(但不限于)編碼蛋白質(zhì)的基因、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生反義RNA的DNA或者介導(dǎo)其它DNA表達的某種方式起作用(如導(dǎo)致其它DNA共抑制或類似功能)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
本發(fā)明的嵌合型基因構(gòu)建物可以還包括一段3’非翻譯區(qū)。3’非翻譯區(qū)是指基因的一部分，該部分包括含有多腺苷酸化信號的DNA片段或能夠?qū)崿F(xiàn)mRNA加工或基因表達的任何其它調(diào)控信號的DNA區(qū)段。多腺苷酸化信號通常的特征為實現(xiàn)朝mRNA前體的3’末端添加聚腺苷酸。多腺苷酸化信號一般以出現(xiàn)典型的5’AATAAA-3’形式的同源性而被識別，雖然變異并非不普遍。
適合的3’區(qū)例子是含有農(nóng)桿菌腫瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?例如胭脂堿合酶(Nos基因))和植物基因(如大豆儲藏蛋白基因以及1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(ssRUBISCO)基因的小亞基)的多腺苷酸化信號的3’轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)。因此，來自本發(fā)明結(jié)構(gòu)基因的3’端非翻譯區(qū)可以用于構(gòu)建在植物中表達的嵌合基因。
若需要的話，本發(fā)明的嵌合型基因構(gòu)建物也可以還包括增強子，或者是翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子。這些增強子是本領(lǐng)域技術(shù)人士熟知的，可以包括ATG起始密碼子及鄰近序列。起始密碼子必須與編碼序列的可讀框架相協(xié)調(diào)以保證翻譯全部序列。所述翻譯控制信號和起始密碼子可以是多種來源，天然的和合成的均可。翻譯起始區(qū)可由轉(zhuǎn)錄起始區(qū)提供，或來自結(jié)構(gòu)基因。其序列亦可來源于選擇表達該基因的啟動子，并可以進行特殊修飾以增強mRNA的翻譯。
為了有助于轉(zhuǎn)化植物細胞的鑒別，本發(fā)明的構(gòu)建物可進一步操作以包括植物選擇標(biāo)記。有用的選擇標(biāo)記包括可提供對如慶大霉素、潮霉素、卡那霉素等等的抗生素抗性的酶。同樣地，也可使用提供可通過顏色變化(如GUS(β-葡萄糖苷酸酶))或發(fā)光(如熒光素酶)鑒別的化合物的酶，或為一個復(fù)合物產(chǎn)物。
本發(fā)明也考慮的部分是含有包含本發(fā)明啟動子的嵌合基因構(gòu)建物的轉(zhuǎn)基因植物。從植物細胞再生成整株植物的方法是本領(lǐng)域公知的，獲得轉(zhuǎn)化和再生植物的方法對于本發(fā)明并不重要。通常，將轉(zhuǎn)化植物細胞培養(yǎng)于適合的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基可含有如抗生素的選擇劑，這里使用選擇標(biāo)記以便于轉(zhuǎn)化植物細胞的鑒別。一旦形成愈傷組織，按已知的方法可通過施加適當(dāng)?shù)闹参锛に匾源龠M苗形成，并將苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基以再生植株。所述植株繼而可用于從種籽或用營養(yǎng)增殖技術(shù)建立重復(fù)世代。
本發(fā)明構(gòu)建物可使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接的DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電穿孔等導(dǎo)入植物細胞。此類方法的綜述可參見如Weissbach和Weissbach，植物分子生物學(xué)方法，學(xué)術(shù)出版社，紐約Ⅷ，第421-463頁(1988)；以及Geierson和Corey，植物分子生物學(xué)，第二版(1988)，本發(fā)明還包括含有所述嵌合基因構(gòu)建物的適合載體。
當(dāng)本發(fā)明中提到特定序列時，可理解為這些序列包括在其與所述特定序列“實質(zhì)性同源”的序列范圍之內(nèi)。當(dāng)至少約70％、優(yōu)選至少約80％、最優(yōu)選至少90％的所述核苷酸與限定長度的該分子相匹配時，這些序列即為“實質(zhì)性同源”?！皩嵸|(zhì)性同源”的序列包括該序列內(nèi)的任何置換、缺失或加入。實質(zhì)性同源的DNA序列可在Southern雜交實驗中，例如在嚴(yán)格的雜交條件下(參見Maniatis等，分子克隆(實驗手冊)，冷泉巷實驗室(1982)，第387-389頁)得以鑒別。
本發(fā)明中所指的特定序列也包括與所述特定序列“功能相同”的序列。本發(fā)明中功能相同的序列是指雖與所所述特定序列不一致，但提供相同或大致相同功能的序列。功能相同的DNA序列包括該序列內(nèi)的任何置換、缺失或加入。參照本發(fā)明，功能相同的序列將指導(dǎo)外源基因的組成型表達。
盡管以優(yōu)選實施方案作特定參考詳細地描述本發(fā)明，但提供所述實施方案是為了說明，而不是限制本發(fā)明。
實施例組成型啟動子-GUS融合體的表征將雙構(gòu)建物轉(zhuǎn)移入農(nóng)桿菌以及煙草SR1葉圓盤的轉(zhuǎn)化按Fobert等(1991,Plant Mol.Biol.17,837-851)的描述進行。在體外培養(yǎng)的全過程中植物組織保持在100μg/ml硫酸卡那霉素(Sigma)上。
從產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物中，選擇其中之一的T1275以進行詳細的研究，由于它高水平地組成型表達GUS。
熒光團檢測和組織學(xué)GUS檢測按Jefferson(Plant Mol.Biol.Rep.,1987,5,387-405)方法，按Fobert等(Plant Mol.Biol.,1991,17,837-851)的修改法進行。對于初次篩選，從體外生長的小植株采摘葉片。之后，從生長于溫室中的植物收集并分析九種不同組織葉片(L)、莖(S)、根(R)、花藥(A)、花瓣(P)、子房(O)、萼片(Se)、以及開花后10天齡的種子(S1)和開花后20天齡的種子(S2)。詳細地說，從體外生長的卡那霉素抗性F1子代收集葉片、莖和根組織，進行GUS活性的定量分析。在第8-10發(fā)育階段(Kdtunow等，1990,Plant Cell 2,1201-1224)，從原始轉(zhuǎn)基因植株采摘花組織。也將花貼上標(biāo)鑒并從開花后10天和20天的蒴果(capsule)中收集發(fā)育中的種子。在所有情況下，稱量組織，立刻在液氮中冷凍，并貯藏于-80℃。
用組織學(xué)檢測分析的組織處于與以上所列組織相同的發(fā)育階段。對分析每個器官的不同手切切片。對每株植物，至少兩個不同的時期進行組織學(xué)檢測以保證重復(fù)性。除花器官之外，所有組織均參照Jefferson(1987,Plant Mol.Biol.Rep.5,387-405)法，在磷酸緩沖液中以1mM X-Glnc(Sigma)作為底物進行檢測。花在含有20％(v/v)甲醇的相同緩沖液中檢測(Kosugi等，1990,Plant Sci.70,133-140)。
在植株T1275的所有組織中發(fā)現(xiàn)了GUS活性。圖1表明用X-Gluc對T1275進行組織化學(xué)染色后(顯示)GUS的組成型表達，包括葉片(a)、莖(b)、根(c)、花(d)、子房(e)、胚(f和g)和種子(h)。
GUS的組成型表達用轉(zhuǎn)化植株T1275植物組織的更靈敏的熒光團檢測法所確認。這些結(jié)果示于圖2。GUS在包括葉片(L)、莖(S)、根(R)、花藥(A)、雌蕊(P)、子房(O)、萼片(Se)、10天齡種子(S1)和20天齡種子(S2)的所有組織中表達明顯。并且，GUS的表達水平可與含有GUS-nos融合體中組成型啟動子CaMV 35S的轉(zhuǎn)化植物的表達水平相比。據(jù)Fokert等(1991,Plant Molecular Biology,17:837-851)的報道，在含有包含CaMV 35S-GUS-nos嵌合基因的PBⅠ121(Clontech)的轉(zhuǎn)化植物中，GUS活性高達18,770±2450(pmole MU每分鐘每毫克蛋白)。轉(zhuǎn)基因植株T1275的遺傳學(xué)分析所述T-DNA含有卡那霉素抗性基因。將自花授粉轉(zhuǎn)基因植物的種子置于70％乙醇中1分鐘和未稀釋的Javex漂白劑(6％次氯酸鈉)中25分鐘進行表面消毒。然后用無菌蒸餾水將種子漂洗數(shù)次，在層流下干燥，并如MiKi等所述(1993,Methods in Plant Molecular Biologyand Biotechnology,Eds.,B.R.Glick和J.E.Tompson,CRC Press,BocaRaton,67-88)置于含有補充了100μg/ml卡那霉素的MSO培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。每一轉(zhuǎn)化體至少計數(shù)90株小植株。4-6周后計數(shù)綠色小植株(卡那霉素抗性)和白化植株(卡那霉毒敏感)的數(shù)目，并用Chi2測試法在顯著性P＜0.05下的進行分析。
遺傳學(xué)分析結(jié)果示于下列表1，它表明T-DNA座位以單個插入座位分離。
表1轉(zhuǎn)基因植物T1275的遺傳學(xué)分析
Southern印跡分析運用GUS基因編碼區(qū)探針或nptⅡ基因編碼區(qū)探針對轉(zhuǎn)基因植物T1275中的T-DNA進行分析。
用Sanders等的方案(1987,Nucleic Acid Res.15,1543-1558)從凍干葉片中分離基因組DNA。用生產(chǎn)商所提供的補充有2.5mM亞精胺的適合緩沖液，以EcoRⅠ酶切數(shù)小時消化10mg T1275 DNA。在通過0.8％TEA瓊脂糖凝膠電泳后，以標(biāo)準(zhǔn)程序進行Southern印跡分析。由于來自含有組成型啟動子-GUS-nos構(gòu)建物的構(gòu)建物的T-DNA只包含單一EcoRⅠ識別位點，因此所述雜交片段由T-DNA和側(cè)翼煙草DNA序列組成。所述片段長度將根據(jù)最近的EcoRⅠ位點的位置而變動。用GUS基因作探針(圖3-泳道1)，將可探測出在植物DNA中最近EcoRⅠ位點近旁的片段。用T1275定位一個這樣的片段。用nptⅡ編碼區(qū)作探針(圖3-泳道2)，它與所述EcoRⅠ位點對側(cè)的序列雜交，又僅有一條雜交帶明顯。正如從圖3也可以看出的，所述T-DNA內(nèi)未發(fā)生重大的重排。所述組成型啟動子-GUS融合體的克隆和分析按Hattori等的方法(1987,Anal.Biochem.165,70-74)從葉片分離基因組DNA。按生產(chǎn)商的操作要求用EcoRⅠ和XbaⅠ消化10μgT1275總DNA。消化后的DNA在0.7％瓊脂糖凝膠上進行大小分級分離。用Elu-Quick試劑盒(Schleicher和Schnell)從該凝膠中分離出約4-6kb的DNA片段，將其與預(yù)先用EcoR和XbaⅠ消化并用磷酸酶處理的λGEM-2臂相連接。基本上如Rutledge等(1991,Mel.Gen.Genet.229,31-40)所述，將約40,000個噬菌斑轉(zhuǎn)至尼龍膜(Hybond,Amersham)上，用32p標(biāo)記的分離自PBI121的2kb GUS插入片段進行篩選。分離出陽性克隆。從λ噬菌體分離出XbaⅠ-EcoRⅠ片段(參見圖4和圖5的限制性圖譜)，將其克隆進預(yù)先用XbaⅠ和EcoRⅠ消化并用小牛腸磷酸酶處理的pTZ19R中。
該克隆中的植物DNA序列先前尚未在序列數(shù)據(jù)庫中報道過。也未在多個物種中觀察到，因為Southern印跡在大豆、土豆、向日葵、擬南芥屬、甘藍型油菜、甘藍、玉米、小麥或黑云杉(數(shù)據(jù)未顯示)中未顯示與該片段雜交的帶。在煙草中，Southern印跡未揭示在T-DNA插入位點處或其上游有顯著重排的證據(jù)(數(shù)據(jù)未顯示)。
為了分析生物發(fā)射(biolistics)(Sandford等，1983，Methods Enzymol,217:483-509)介導(dǎo)的GUS活性的瞬時表達，將XbaⅠ-EcoRⅠ片段亞克隆進PUC 19，如上所述用X-Glnc染色檢測到了GUS活性。檢查了溫室生長的植物葉片或細胞懸浮培養(yǎng)物的染成藍色斑點的數(shù)目。如表2所示，在所檢查的多個物種中所述T1275啟動子-GUS nos基因均有活性。
表2多個植物種組織中GUS活性的瞬時表達
>*藍色斑點數(shù)目1-10(+),10-100(++),100-400(+++)用HindⅢ和EcoRⅠ消化pTZ-T1275，分離含有約2.2kb的T1275啟動子與GUS基因和nos 3’端融合的4.2kb片段。將所分離的片段連接進預(yù)先用HindⅢ和EcoRⅠ消化并用小牛腸磷酸酶處理的pRD400載體(Datla等，1992,Gene,211:383-384)中。如上所述將雙載體轉(zhuǎn)移入根癌農(nóng)桿菌并進行煙草SR1的葉圓盤轉(zhuǎn)化。檢查多個獨立轉(zhuǎn)基因品系的多種器官中的GUS活性。在未轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因組織中均用圖譜分析所述mRNA 5’末端的探針以RNA酶保護法(Melton等，1984,Nucleic AcidsRes.121:7035-7056)也對相同器官中的GUS mRNA作了檢查。用TRIZOL試劑(Life Technologies)按生產(chǎn)商所描述的方法從冷凍研磨的組織中提取RNA。每次試驗取10-30μg總RNA與相應(yīng)于T1275序列的600堿基及GUS基因的400堿基的反義RNA探針雜交。用RPAⅡ試劑盒(Ambion CA)按生產(chǎn)商所述方法進行試驗。在5％大范圍丙烯酰胺(Long Ranger acrylamide)(J.J.Baker,N.J.)變性凝膠上分離被保護片段，將凝膠干燥并用Kodak X-RP膠片曝片。
對隨機挑選的溫室生長的由培養(yǎng)物再生植株的葉片所進行的分析，表明了廣泛的GUS特殊活性(圖6A)。用含有35S-GUS-nos基因的PBI121(CLONETECH)轉(zhuǎn)化的植株產(chǎn)生了類似的比活水平(數(shù)據(jù)未示)。通常，葉片中GUS mRNA的水平(圖6B)與GUS比活相關(guān)。并且，所有樣品中出現(xiàn)約600個堿基的單一條帶表明GUS轉(zhuǎn)錄起始位點位于植物DNA序列中T-DNA插入位點的上游約180堿基處。
為分析不同器官中的GUS表達，詳細地檢查了得自以上品系子代的品系。表3表明這些植株之一中的GUS比活。它在葉片、莖、根、發(fā)育中的種子和花器官、萼片、花瓣、花藥、雌蕊以及子房中以不同水平表達，確認為組成型表達。將相同載體導(dǎo)入甘藍型油菜也在這些器官中(資料未示)顯示GUS活性的表達，表明組成型表達并非煙草特有的。對煙草各器官中GUSmRNA的檢查表明，每一個的轉(zhuǎn)錄起始位點都相同，并且mRNA水平除在花芽中較低外均相似(表3)。
使用與以上相同的探針對未轉(zhuǎn)化煙草的葉片、莖、根、發(fā)育中的種子和花中的RNA所進行的測試沒有顯示出被保護片段(圖7)。因此假定所述插入位點在未轉(zhuǎn)化煙草中是轉(zhuǎn)錄沉默的并被T-DNA插入所激活。所以所述插入位點的上游區(qū)是另一例植物隱蔽型啟動子(Fobert等，1994,Plant J,6:568-577)。
表3轉(zhuǎn)基因品系T64子代器官中的GUS比活和相對RNA水平
*未做一切科學(xué)出版物及專利文件包括都通過引用結(jié)合到本文中。
已參考優(yōu)選實施方案對本發(fā)明作了說明。但是，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，很明顯，可作一些不偏離以下權(quán)利要求書中所說明的本發(fā)明范圍的變化和修改。
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請人(A)姓名HER MAJESTY IN RIGHT OF CANADA,REPRESENTED BY THE MINISTER OFAGRICULTURE AND AGRI-FOOD CANADA(B)街道Central Experimental Farm(C)城市Ottawa(D)省安大略省(E)國家加拿大(F)郵政編碼(ZIP):K1A 0C6(A)姓名PIERRE FOBERT(B)街道707 Tobin Terrace(C)城市Saskatoon(D)省Saskatchewan(E)國家加拿大(F)郵政編碼(ZIP):S7N 4P4(A)姓名VENKATRAN N.IYER(B)街道2595 Maqumna Road(C)城市Kelowna(D)省British Columbia(E)國家加拿大(F)郵政編碼(ZIP):VIW 2R9(ⅱ)發(fā)明名稱獲自煙草的啟動子
(ⅲ)序列數(shù)1(ⅳ)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MSDOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本1.30(EPO)(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)順序特征(A)長度2224個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學(xué)線性(ⅹⅰ)順序描述；SEQ ID NO:1:TCTAGACTTA CAGAAAGTCT CTAACACGTG AGGGAATGAT CCCTTTCCTT ACCTCCCTGT60AGAGATATTG GCTTTTCAAC AACTAGTACA TAAATATGCG ACTTTGACCG TGTATCCCCA 120GTCAAAAGGG AACTTCACCC TCCTAGTTCT TTATTTCCAA CATACATGGG GAGTAATGCT 180AAATTTACAT AGAAGAATAA TAAAATGAAC TGTAACTAAT GATGTACTGT TCCAAAGAGA 240TGAGGACGTC AACATATTTA TTCCTTCAGC CCTTTTCAGA ATAATACCAT AAGTAGAAGA 300AATGGCACAT AAAATGAAGT CCTCGGCAAG TCAAATGTAA ATCTGAACCC ACCCAGCTAA 360CCCAGTGAAC TCAACTTTCC TGGATAGATC AGCACTCCTT CATGACATTG CATGCCTTCT 420CTTTAAAGAG CCGCTTGATC TCTGAAAACC AAATGAATCT CCACAGAGAG ATTTCGAGCT 480CCATGAGACG CCTTTTGGTT CTTGATTTAC TAAACCTATA AAAATGAAAG GAAGTAGGAC 540AACTGCATTT TGCCGCTTAA GATGCTTCGG CGCTTTGTGA ATTTTAAGTC ATGAGAAAGT 600ACAATGTTGG AATCTCACAT TAGAACAATG TATTTGTAAT AACCTAGGAA AGCAAAGCTA 660GAAGGGAGGT GCAGCTAAAT CTTCTTCTAC CTTGTTATCC TTGCATTTCT TGAGGAGGAG 720GAACTGTCCT CGCAGGTGCA AAATCTGCAG TCGCCCAAAA GGATATTCAG AAGTATATTA 780CAACATGTTT AATGGTTAAC CAAGTGAAAG ATCAAAATAG TCATTAGAAC AAAATGCGTG 840CTCAGAGCGT ATCTACTAGT TCATCAACCC AGTACACATC TCTGAATTTC ATCTCTTGCC 900GTTGAACTAA GTCAATTGGT CAAAGACGCA TAACATGAGA GACACTCATA AAACGGCTGA 960ATAACATGCA GAAGACGTCA TGCGCCTTAG GTCTCATTAT GCATGAGATT ATTAGTTATA 1020TGCTCCTTCA GTTTGACTAG AAATGAAAAA TCAGTTAAGC CTGTAACGAA ATGATAACCT 1080GCTTCAAGAA GATTAGACTA TTTTTCATAA AATATGCAGT GCCGTGAAAT AGATACTTAA 1140TCTTAGGCAG GAAAAATCTT CTATTGGGCC ATAATAAGAA CTACCAATTA GAAAGGAGGT 1200AGAAAGCTCC GATACTGTTA TGAAGGCCAT TCTAAGTGCT GATGTGAATT TCCCAATACA 1260AAATGACAAC AAAAACAAAA GCCTCAATCC TAAGCTAGTT GGGGTCGCTA TATAAATCCT 1320CGACATCCAT TTAACTCCAC TTGGACTCCT TTCTTTCCAA TATTTTAATA TTGTTAGATT 1380AATCATAAAA TTGCTTAGCT TTCTACTGGC ACTTAACCTA CTGCAACCCT CCTCTTCTGG 1440GATTCCAACA CAAACAACTA AGAGGAATTT GAAAAAAGAA AAGCAAATGT GAGAAGAGAC 1500AAAATGTACA ATGATACCTC TTCTTGCAGC AAAGGAGGCA GGTTCTCTGC TGAGACAAGG1560TTCTCTATTT CCTGCAAGAC CTTCGTATCT TTTATTCGAG ACCATGTATG TGGAGGTAAC1620GCCAGCAATA GTGCTGTCAG CACATCGTTG CTTGCAGGGG ATCTTCTGCA AGCATCTCTA1680TTTCCTGAAG GTCTAACCTC GAAGATTTAA GATTTAATTA CGTTTATAAT TACAAAATTG1740ATTCTAGTAT CTTTAATTTA ATGCTTATAC ATTATTAATT AATTTAGTAC TTTCAATTTG1800TTTTCAGAAA TTATTTTACT ATTTTTTATA AAATAAAAGG GAGAAAATGG CTATTTAAAT1860ACTAGCCTAT TTTATTTCAA TTTTAGCTTA AAATCAGCCC CAATTAGCCC CAATTTCAAA1920TTCAAATGGT CCAGCCCAAT TCCTAAATAA CCCACCCCTA ACCCGCCCGG TTTCCCCTTT1980TGATCCAGGC CGTTGATCAT TTTGATCAAC GCCCAGAATT TCCCCTTTTC CTTTTTTAAT2040TCCCAAACAC CCCTAACTCT ATCCCATTTC TCACCAACCG CCACATATGA ATCCTCTTAT2100CTCTCAAACT CTCTCGAACC TTCCCCTAAC CCTAGCAGCC TCTCATCATC CTCACCTCAA2160AACCCACCGG AATACATGGC TTCTCAAGCC GTGGAAACCT TATACTCACC TCCCTTTGCT2220CTTA 222權(quán)利要求
1．分離的啟動子，包含含有SEQ ID NO:1的至少18bp鄰接序列的核苷酸序列。
2．權(quán)利要求1的分離啟動子，含有特征為圖5中從XbaⅠ至SalⅠ的限制性圖譜的DNA片段。
3．權(quán)利要求1的分離啟動子，其中所述啟動子是組成型啟動子。
4．權(quán)利要求1的分離啟動子，其中所述啟動子是隱蔽型啟動子。
5．權(quán)利要求3的分離組成型啟動子，其中所述啟動子具有與SEQID NO:1實質(zhì)性同源的核苷酸序列。
6．權(quán)利要求3的分離的組成型啟動子，其中所述啟動子具有與SEQ ID NO:1功能相同的核苷酸序列。
7．含有SEQ ID NO:1核苷酸序列的分離DNA分子。
8．嵌合基因構(gòu)建物，含有期望組成型表達的目的DNA和按照權(quán)利要求3所述的組成型啟動子的。
9．權(quán)利要求8所述的嵌合基因構(gòu)建物，其中所述組成型啟動子具有與SEQ ID NO:1實質(zhì)性同源的核苷酸序列。
10．含有權(quán)利要求7的分離DNA分子的嵌合基因構(gòu)建物。
11．含有權(quán)利要求9的嵌合基因構(gòu)建物的載體。
12．含有權(quán)利要求10的嵌合基因構(gòu)建物的載體。
13．在植物中賦予基因組成型表達的方法，包括將期望組成型表達的目的DNA有效連接于來自煙草的組成型啟動子，所述的組成型啟動子包括SEQ ID NO:1的至少18bp鄰接序列，以產(chǎn)生一個嵌合基因構(gòu)建物，并將所述嵌合基因構(gòu)建物導(dǎo)入能夠表達所述基因構(gòu)建物的植物中。
14按權(quán)利要求13的方法，其中所述的組成型啟動子具有與SEQID NO:1實質(zhì)性同源的核苷酸序列。
15．含有權(quán)利要求8中的嵌合基因構(gòu)建物的轉(zhuǎn)基因植物細胞。
16．按照權(quán)利要求15的轉(zhuǎn)基因植物細胞，其中所述的組成型啟動子具有與SEQ ID NO:1實質(zhì)性同源的核苷酸序列。
17．含有權(quán)利要求10的嵌合基因構(gòu)建物的轉(zhuǎn)基因植物細胞。
18．按照權(quán)利要求16的轉(zhuǎn)基因植物細胞，選自煙草、甘藍型油菜、大豆、苜蓿、擬南芥屬、玉米、小麥以及大麥。
19．含有權(quán)利要求8的嵌合基因構(gòu)建物的轉(zhuǎn)基因植物。
20．按照權(quán)利要求19的轉(zhuǎn)基基植物，其中所述的組成型啟動子具有與SEQ ID NO:1實質(zhì)性同源的核苷酸序列。
21．含有權(quán)利要求10的嵌合基因構(gòu)建物的轉(zhuǎn)基因植物。
22．按照權(quán)利要求21中的轉(zhuǎn)基因植物，選自煙草、甘藍型油菜、大豆、苜蓿、擬南芥屬、玉米、小麥以及大麥。
全文摘要
用無啟動子的β－葡萄糖苷酸酶(GUS)基因作為T－DNA標(biāo)鑒產(chǎn)生了組成型表達GUS活性的轉(zhuǎn)基因煙草植株。已經(jīng)克隆并測序了該基因融合體。已經(jīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將其重插入煙草。所述GUS基因上游的煙草DNA大約長2kb并且未顯示與已知序列同源。含有組成型啟動子的該DNA可用于控制外源基因在多種植物物種的轉(zhuǎn)基因植物中的表達。
文檔編號C12N15/09GK1214736SQ97193391
公開日1999年4月21日 申請日期1997年1月31日 優(yōu)先權(quán)日1996年2月1日
發(fā)明者皮雷·福伯特, 文卡特拉姆N·伊耶爾, B·米基, J·哈托里, H·拉貝, T·奧埃勒特, E·E·杰梅斯, E·福斯特-阿特金森 申請人:加拿大農(nóng)業(yè)及農(nóng)業(yè)食品部, 皮雷·福伯特, 文卡特拉姆N·伊耶爾