一種堿性脂肪酶生產(chǎn)菌株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種堿性脂肪酶生產(chǎn)菌株及其應(yīng)用，本發(fā)明構(gòu)建的畢赤酵母工程菌能高效表達(dá)來源于圓弧青霉的堿性脂肪酶基因，搖瓶發(fā)酵酶活可達(dá)1630U/mL；本發(fā)明的重組堿性脂肪酶的最適作用pH為8.5，最適溫度為35℃。本發(fā)明所述的含有堿性脂肪酶的洗滌劑組合物去污力強，對環(huán)境的污染小，具有很高的推廣應(yīng)用價值。
【專利說明】一種堿性脂肪酶生產(chǎn)菌株及其應(yīng)用
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明屬于微生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種堿性脂肪酶生產(chǎn)菌株及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]脂肪酶(Lipase)，即三?；视王；饷?，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯類的水解、醇解、酯化、轉(zhuǎn)酯化及酯類的逆向合成反應(yīng)，除此之外還表現(xiàn)出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、膽固醇酯酶、酰肽水解酶活性等。脂肪酶不同活性的發(fā)揮依賴于反應(yīng)體系的特點，如在油水界面促進酯水解，而在有機相中可以酶促合成和酯交換。脂肪酶的基本組成單位僅為氨基酸，通常只有一條多肽鏈，其催化活性僅僅決定于它的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。
[0003]脂肪酶的性質(zhì)研究主要包括最適溫度與pH、溫度與pH穩(wěn)定性、底物特異性等幾個方面。迄今，已分離、純化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性質(zhì)，它們在分子量、最適pH、最適溫度、PH和熱穩(wěn)定性等方面存在不同。總體而言，微生物脂肪酶具有比動植物脂肪酶更廣的作用pH、作用溫度范圍、高穩(wěn)定性和活性，對底物的特異性，因此對微生物脂肪酶的開發(fā)具有重要的意義。
[0004]堿性脂肪酶是指在堿性條件下水解的脂肪酶，它能水解天然油脂，產(chǎn)生脂肪酸和甘油，是一種專門在異相系統(tǒng)油水接口上水解特殊酯類的酶。堿性脂肪酶是一種新型洗滌劑用酶，主要用途是作為洗滌劑的新酶種。它的特性是能分解衣物油污成甘油二酯、甘油單酯及脂肪酸等較易溶于 水的物質(zhì)，從而顯著提高洗滌劑的效果，尤其是去除黃斑的效果。此外，堿性脂肪酶還可應(yīng)用于紡織、食品、纖維及造紙工業(yè)領(lǐng)域。因此，堿性脂肪酶具有更廣的應(yīng)用價值，成為目前研究的熱點之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)問題，提供了一種堿性脂肪酶生產(chǎn)菌株及其應(yīng)用。本發(fā)明通過構(gòu)建含有圓弧青霉eye I opium")的脂肪酶基因的表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化入畢赤酵母中，從而獲得高效重組表達(dá)該堿性脂肪酶的畢赤酵母工程菌株，從而彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0006]本發(fā)明一方面提供了一種工程菌，其攜帶有表達(dá)脂肪酶的重組質(zhì)粒。
[0007]所述工程菌為畢赤酵母ALip {Pichia pastor is ALip)。
[0008]所述脂肪酶的氨基酸序列為SEQ ID NO:1。
[0009]所述脂肪酶的編碼核苷酸序列為SEQ ID NO: 2。
[0010]本發(fā)明另一方面提供了上述工程菌在生產(chǎn)脂肪酶中的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明構(gòu)建的畢赤酵母工程菌能高效表達(dá)來源于圓弧青霉的堿性脂肪酶基因，搖瓶發(fā)酵酶活可達(dá)1630U/mL ;本發(fā)明的重組堿性脂肪酶的最適作用pH為8.5，最適溫度為35°C。本發(fā)明所述的含有堿性脂肪酶的洗滌劑組合物去污力強，對國際污布EMPA116及EMPA117上的去污效果要好于競爭產(chǎn)品，且對環(huán)境的污染小，具有很高的推廣應(yīng)用價值?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0012]圖1為畢赤酵母工程菌ALip發(fā)酵上清液SDS-PAGE電泳檢測分析圖，其中泳道I為畢赤酵母工程菌ALip發(fā)酵上清液，泳道2為對照組，箭頭所指處的條帶即為本發(fā)明的重組脂肪酶。
【具體實施方式】
[0013]本發(fā)明用到了遺傳工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域使用的常規(guī)技術(shù)和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed.(Sambrook, 2001)和 CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻(xiàn)提供了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的定義和方法。但是，這并不意味著將本發(fā)明限定于所述的任何具體方法、實驗方案和試劑，因為它們可以改變。
[0014]除非在本文中另作限定，本文所用的全部技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通計數(shù)人員通常所理解的相同含義。DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULARBIOLOGY, 3nd Ed.(Singleton et al., 2006)和 COLLINS DICTIONARY BIOLOGY (Hale etal.，2003)為技術(shù)人員提供了本發(fā)明中所使用的許多術(shù)語的一般性解釋。
[0015]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細(xì)的描述。
[0016]實施例1堿性脂肪酶基因的克隆
將圓弧青霉eye I opium)過夜培養(yǎng)，取適量菌體置于離心管中，13000rpm 離心 5 min，棄上清；加入 400 ii I 抽提緩沖液(100 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 250mM NaCl, 1%SDS);然后加IOOmg石英砂或玻璃珠，在珠打儀劇烈振蕩2min左右；65°C水浴20min后，加入200 u I 10M NH4AC,冰浴IOmin ;13000rpm離心lOmin，取上清；加入2倍體積的無水乙醇，_20°C放置30min ； 13000 rpm離心lOmin，棄上清；用70%乙醇洗滌2次；晾干，加入水溶解，于_20°C保存 。利用OMEGA公司的E.Z.N.A.Fungal RNA Kit制備草酸青霉的mRNA，其制備過程參照試劑盒的操作手冊。
[0017]以提取的圓弧青霉基因組總DNA為模板，設(shè)計引物進行PCR擴增。PCR擴增條件為950C 4min ；94°C 30S ；55°C 40S，72°C Imin 30 個循環(huán)；72°C，7min。利用凝膠回收試劑盒回收PCR擴增產(chǎn)物。
[0018]將回收的擴增產(chǎn)物分別連接到pMD18-T載體，獲得克隆載體命名pT-ALip，送至北京華大基因研究中心進行測序分析，獲得的核苷酸序列為SEQ ID N0:2，其編碼氨基酸序列為為SEQ ID NO:1。通過NCBI Blast比對分析，該序列與圓弧青霉的堿性脂肪酶基因的序列相似性為90%，為一新的等位基因。
[0019]實施例2表達(dá)載體的構(gòu)建
以質(zhì)粒pT- ALip為模板，利用引物進行PCR擴增，PCR擴增條件是94°C 5min ；94°C30S ；55°C 30S，72°C 2min 30個循環(huán)；72°C lOmin。凝膠回收擴增產(chǎn)物，進行XbaI和Kpn I雙酶切；對表達(dá)質(zhì)粒PPIC9K也進行XbaI和Kpn I雙酶切；用T4連接酶把雙酶切產(chǎn)物和表達(dá)載體4°C連接過夜；把連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌DH5 a。獲得相應(yīng)的陽性克隆表達(dá)質(zhì)粒命名為 pPIC-ALip。
[0020]實施例3畢赤酵母工程菌的構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pPIC- ALip用Sac I酶切電泳鑒定；乙醇沉淀濃縮，測定DNA濃度，以3 y g/UL濃度稀釋質(zhì)粒片段保存?zhèn)溆谩?br> [0021]制備畢赤酵母GS115電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，重懸于I mL預(yù)冷的電泳緩沖液中(配方:lmM MgCl2, IOmM HEPES, 250mM 蔗糖，pH 7.8)。在 80 y L 感受態(tài)細(xì)胞中加入 5 y L 線性化重組質(zhì)粒pPIC- ALip ;電轉(zhuǎn)化(條件為1500V、200Q、25iiF);最后涂布于MM平板(MM培養(yǎng)基組分:1.34%YNB，4X 10_5%生物素，0.5%甲醇)，挑選其中一株重組菌株命名為畢赤酵母 ALip {Pichia pas toris ALip
[0022]實施例4發(fā)酵和酶學(xué)性質(zhì)測定
將上述畢赤酵母工程菌ALip接種于5ml BMGY ( I %酵母提取物，2%蛋白陳，1.34 %YNB, 4X10_5%生物素，1%甘油)，30°C培養(yǎng)過夜，離心收集菌體，把菌體加入50ml BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基(I %酵母提取物，2%蛋白陳，1.34 % YNB, 4X10_5%生物素，0.5%甲醇)，每12小時補加50 ii L甲醇，誘導(dǎo)培養(yǎng)5天，取上清液進行SDS-PAGE電泳檢測。結(jié)果如圖1所示，箭頭所指31kDa處有一明顯的蛋白條帶，分子量大小與預(yù)測一致，說明本發(fā)明構(gòu)建的畢赤酵母工程菌株能有效重組表達(dá)堿性脂肪酶。
[0023]脂肪酶活力單位
Ig固體酶粉(或Iml液體酶),在一定溫度和pH條件下，Imin水解底物產(chǎn)生I U mo I的可滴定的脂肪酸，即為一個酶活力單位，以u/g(u/ml)表示。
[0024]酶活測定方法:
取兩個100ml三角瓶，分別于 空白瓶(A)和樣品瓶(B)中各加入底物溶液4.0Oml和磷酸緩沖液5.00ml，再于A瓶中假如95%乙醇15.00ml，于40°C ±0.2°C水浴中預(yù)熱5min，然后于A、B瓶中各加待測酶液1.0Oml，立即混勻計時，準(zhǔn)確反應(yīng)15min后，于B瓶中立即補加95%乙醇15.0Oml終止反應(yīng)，取出；于空白和樣品溶液中各加酚酞指示液兩滴，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，直至微紅色并保存30s，不褪色為滴定終點，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。
[0025]脂肪酶的酶活力按下列公式計算:
【權(quán)利要求】
1.一種工程菌，其攜帶有表達(dá)脂肪酶的重組質(zhì)粒。
2.如權(quán)利要求1所述工程菌，其特征在于，所述工程菌為畢赤酵母ALip{Pichiapas toris ALip)。
3.如權(quán)利要求1或2所述工程菌，其特征在于，所述脂肪酶的氨基酸序列為SEQID NO:1o
4.如權(quán)利要求1或2所述工程菌，其特征在于，所述脂肪酶的編碼核苷酸序列為SEQIDNO: 2。
5.權(quán)利要求1或2所述的工程菌在生產(chǎn)脂肪酶中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12R1/84GK103667091SQ201310654578
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月5日
【發(fā)明者】李佩佩, 張青, 王華明, 黃亦鈞 申請人:青島蔚藍(lán)生物集團有限公司