組織特異性啟動(dòng)子及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種組織特異性啟動(dòng)子及其用途，組織特異性啟動(dòng)子的核苷酸序列包括如下（a）或（b）的序列：（a）同時(shí)具有SEQ?ID?NO:1的第920-932位核苷酸、第947-961位核苷酸、第1507-1519位核苷酸、第1963-1971位核苷酸和第2018-2028位核苷酸所示的核苷酸序列；（b）在嚴(yán)格條件下與（a）限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明組織特異性啟動(dòng)子首次分離自秈稻品種93-11的ABCG15基因；同時(shí)，能夠調(diào)控目的異源核苷酸序列特異性表達(dá)于植物花藥組織中，特別是絨氈層組織，為創(chuàng)制新型雄性不育系奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】組織特異性啟動(dòng)子及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種組織特異性啟動(dòng)子及其用途，特別是涉及一種花藥絨氈層組織特異性表達(dá)的秈稻ABCG15基因的啟動(dòng)子及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002]異源DNA序列在植物宿主中的表達(dá)依賴于具有在植物宿主中起作用的可操作地連接的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子序列的選擇將決定異源DNA序列在植物宿主中表達(dá)的時(shí)間和位置。因此，當(dāng)需要在植物優(yōu)選的組織中表達(dá)時(shí)，使用組織特異性啟動(dòng)子。相反，當(dāng)需要在全部植物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，使用組成型啟動(dòng)子。例如，通過對植物基因組的遺傳操縱，使之含有與異源抗蟲基因可操作連接的組織特異性啟動(dòng)子，使得抗昆蟲物質(zhì)在易感植物組織中特異地表達(dá)，可以實(shí)現(xiàn)植物對昆蟲侵襲的抗性增加。異源核苷酸序列在目標(biāo)組織中的優(yōu)先表達(dá)減少了組成型啟動(dòng)子在全部植物細(xì)胞中啟動(dòng)異源核苷酸序列轉(zhuǎn)錄所發(fā)生的植物資源消耗。 [0003]花藥是雄蕊產(chǎn)生花粉的主要部分，花藥的壁由表皮層、纖維層、中間層和絨氈層構(gòu)成。絨氈層為花粉囊周圍的特殊細(xì)胞層，具雙核或多核結(jié)構(gòu)，細(xì)胞內(nèi)含較多的RNA和蛋白質(zhì)，并有油脂和類胡蘿卜素等營養(yǎng)物質(zhì)，具有供應(yīng)花粉粒發(fā)育所需養(yǎng)料的作用。在某些情況下，人們希望某些重要的功能基因僅在花藥組織中特異表達(dá)。例如，在雜交制種過程中，花藥作為花粉的供給者使其成為創(chuàng)制新型雄性不育系的關(guān)鍵，因此需要有與影響花藥和花粉發(fā)育相關(guān)的異源核苷酸序列可操作連接的花藥組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子。
[0004]ABCG15屬于ABCXATP Binding cassette)轉(zhuǎn)移蛋白 G亞家族成員(Paul J.Verrieret al.Trends in Plant Science2008.13( 14):151_159)，已報(bào)道ABCG15基因的啟動(dòng)子作為花藥絨氈層組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子從粳稻中分離并進(jìn)行鑒定，至今未有來源于秈稻ABCG15基因啟動(dòng)子的相關(guān)研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種組織特異性啟動(dòng)子及其用途，即新的分離自秈稻品種93-11的ABCG15基因啟動(dòng)子，使目的異源核苷酸序列能夠在光合組織中高效特異表達(dá)。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種組織特異性啟動(dòng)子，其核苷酸序列包括如下(a)或(b)的序列:
[0007](a)同時(shí)具有SEQ ID NO:1的第920-932位核苷酸、第947-961位核苷酸、第1507-1519位核苷酸、第1963-1971位核苷酸和第2018-2028位核苷酸所示的核苷酸序列；
[0008](b)在嚴(yán)格條件下與(a)限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
[0009]進(jìn)一步地，所述組織特異性啟動(dòng)子的核苷酸序列包括如下(a)或(b)的序列:
[0010](a)具有SEQ ID NO:1的第900-2066位核苷酸所示的核苷酸序列；
[0011](b)在嚴(yán)格條件下與(a)限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
[0012]優(yōu)選地，所述組織特異性啟動(dòng)子的核苷酸序列包括如下(a)或(b)的序列:
[0013](a)具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；[0014](b)在嚴(yán)格條件下與(a)限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
[0015]上述嚴(yán)格條件可為在6 X SSC (檸檬酸鈉)、0.5%SDS (十二烷基硫酸鈉)溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC、0.1%SDS和I X SSC,0.1%SDS各洗膜I次。
[0016]為實(shí)現(xiàn) 上述目的，本發(fā)明還提供了一種包含與目的異源核苷酸序列可操作地連接的所述組織特異性啟動(dòng)子的表達(dá)盒。
[0017]進(jìn)一步地，所述目的異源核苷酸序列編碼目的蛋白質(zhì)。
[0018]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種包含所述表達(dá)盒的DNA構(gòu)建體。
[0019]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種包含所述DNA構(gòu)建體的重組載體。
[0020]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種包含所述重組載體的宿主細(xì)胞。
[0021]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種在其細(xì)胞中含有所述表達(dá)盒的植物的花藥組織。
[0022]進(jìn)一步地,所述植物為玉米、高粱、大麥、燕麥、水稻或小麥。
[0023]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種在植物中表達(dá)目的異源核苷酸序列的方法，包括:將與所述組織特異性啟動(dòng)子可操作地連接的目的異源核苷酸序列穩(wěn)定的整合進(jìn)植物細(xì)胞中。
[0024]進(jìn)一步地,所述植物為玉米、高粱、大麥、燕麥、水稻或小麥。
[0025]優(yōu)選地，所述目的異源核苷酸序列在花藥組織中表達(dá)。更優(yōu)選地，所述花藥組織為絨氈層組織。
[0026]進(jìn)一步地，所述目的異源核苷酸序列編碼目的蛋白質(zhì)。
[0027]優(yōu)選地，所述目的異源核苷酸序列編碼控制植物育性的蛋白質(zhì)。所述控制植物育性的蛋白質(zhì)為控制植物雄性不育的蛋白質(zhì)。所述控制植物雄性不育的蛋白質(zhì)為影響花藥和/或花粉發(fā)育的蛋白質(zhì)。
[0028]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種所述組織特異性啟動(dòng)子用于在植物花藥組織中優(yōu)先表達(dá)目的異源核苷酸序列的用途。
[0029]優(yōu)選地,所述植物為玉米、高粱、大麥、燕麥、水稻或小麥。
[0030]進(jìn)一步地，所述目的異源核苷酸序列編碼目的蛋白質(zhì)。
[0031]本發(fā)明中術(shù)語“啟動(dòng)子”是指DNA調(diào)節(jié)區(qū)，通常含有能夠引導(dǎo)RNA聚合酶II在特定編碼序列的適合轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)啟動(dòng)RNA合成的TATA盒。啟動(dòng)子可另外含有其它的識別序列，一般位于TATA盒的上游或5’端，稱作上游啟動(dòng)子元件，它們影響轉(zhuǎn)錄起始速率。公認(rèn)地，由于本發(fā)明啟動(dòng)子區(qū)域核苷酸序列己經(jīng)確定，從本發(fā)明具體啟動(dòng)子區(qū)域上游的5’非翻譯區(qū)內(nèi)進(jìn)一步分離和鑒定調(diào)節(jié)元件屬于現(xiàn)有技術(shù)。因此，本發(fā)明啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)一步包括上游調(diào)節(jié)元件，它賦予與本發(fā)明啟動(dòng)子序列可操作地連接的任何異源核苷酸序列組織特異性表達(dá)，優(yōu)選是在花藥組織中特異性表達(dá)，更優(yōu)選地在絨氈層組織中特異性表達(dá)。
[0032]本發(fā)明中術(shù)語“基因”是指在適宜的調(diào)控區(qū)域(例如植物可表達(dá)性啟動(dòng)子區(qū)域)控制下在細(xì)胞內(nèi)含有被轉(zhuǎn)錄成RNA分子(例如mRNA)的DNA區(qū)域(“轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域”)的任何DNA片段。因此，基因可能含有幾種可操作性連接的DNA片段，例如啟動(dòng)子、5’非翻譯前導(dǎo)序列、編碼區(qū)域和含有多聚腺苷酸化位點(diǎn)的3’非翻譯區(qū)域。內(nèi)源植物基因是在植物物種中天然發(fā)現(xiàn)的基因。嵌合基因是通常不在植物物種中發(fā)現(xiàn)的任何基因，或者是在天然情況下其啟動(dòng)子與部分或全部轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域或者與該基因的至少另一調(diào)控區(qū)域無關(guān)的任何基因。[0033]本發(fā)明分離的啟動(dòng)子序列的特征是提供目的異源核苷酸序列的花藥組織特異性表達(dá)。所述花藥組織為花絲頂端膨大呈囊狀的部分，是雄蕊產(chǎn)生花粉的主要部分，花藥的壁由表皮層、纖維層、中間層和絨氈層構(gòu)成。絨氈層為花粉囊周圍的特殊細(xì)胞層，具雙核或多核結(jié)構(gòu)，細(xì)胞內(nèi)含較多的RNA和蛋白質(zhì)，并有油脂和類胡蘿卜素等營養(yǎng)物質(zhì)，具有供應(yīng)花粉粒發(fā)育所需養(yǎng)料的作用。本發(fā)明中術(shù)語“花藥組織特異性”是指為特定目的，目的異源核苷酸序列在植物(例如水稻植物(“水稻花藥組織特異性”))花藥組織細(xì)胞中的高度特異性表達(dá)。換言之，目的異源核苷酸序列主要在植物的花藥組織中表達(dá)，植物的非花藥組織中的DNA轉(zhuǎn)錄物水平是無法檢測到的或是非常低的(每微克總RNA低于約0.2皮克)。
[0034]本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)相同目的能夠容易地鑒定并利用功能上等價(jià)的啟動(dòng)子。具有本質(zhì)上與含有本發(fā)明SEQ ID NO:1的第920-932位核苷酸、第947-961位核苷酸、第1507-1519位核苷酸、第1963-1971位核苷酸和第2018-2028位核苷酸所示的核苷酸序列、或SEQ ID NO:1的第900-2066位核苷酸所示的核苷酸序列、或SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列、或具有啟動(dòng)子活性部分的核苷酸序列的秈稻ABCG15基因啟動(dòng)子相似的啟動(dòng)子活性的DNA序列，是這些啟動(dòng)子的功能等價(jià)物。這些功能等價(jià)啟動(dòng)子能在嚴(yán)格條件下與含有上述核苷酸序列的秈稻ABCG15基因啟動(dòng)子區(qū)域雜交。
[0035]在雜交技術(shù)中，己知核苷酸序列的全部或部分被用作探針，與來自被選生物體的克隆基因組DNA片段或cDNA片段(如基因組文庫或cDNA文庫)群體中存在的其它對應(yīng)核苷酸序列選擇性地雜交。雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，可以被可探測的基團(tuán)如32P或其它任何可探測標(biāo)記物標(biāo)記。因此，例如，通過標(biāo)記根據(jù)本發(fā)明序列的合成寡核苷酸可以制備雜交探針。制備雜交探針和構(gòu)建cDNA和基因組文庫的方法為本領(lǐng)域己知并公開于SambiOOk等人(1989)分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)。
[0036]序列的雜交可在嚴(yán)格條件下進(jìn)行。所述“嚴(yán)格條件”是指探針將與其靶序列雜交至可探測程度超過與其它序列雜交(如至少2倍于背景)的條件。嚴(yán)格條件具有序列依賴性，且因環(huán)境的不同而不同。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴(yán)格性，可以鑒定與探針100%互補(bǔ)的靶序列(同源探測)?？蛇x擇地，可以調(diào)節(jié)嚴(yán)格條件以允許一些序列錯(cuò)配，使得探測到較低程度的相似性(異源探測)。通常，探針長度短于大約1000個(gè)核苷酸，優(yōu)選地短于500個(gè)核苷酸。
[0037]典型地，嚴(yán)格條件是在pH7.0至8.3下鹽濃度低于大約1.5M Na離子，典型地大約0.01至1.0M Na離子濃度(或其它鹽類)，溫度對短探針(如10至50個(gè)核苷酸)至少大約30°C，對長探針(如超過50個(gè)核苷酸)至少大約60°C。通過添加去穩(wěn)定劑如甲酰胺也可獲得嚴(yán)格條件。低嚴(yán)格條件，例如，包括在30-35%甲酰胺、IM NaCl、l%SDS (十二烷基磺酸鈉)的緩沖溶液中37°C雜交，在IX至2XSSC (20XSSC=3.0M NaCl/0.3M檸檬酸三鈉)中50-55°C洗滌。中度嚴(yán)格條件，例如，包括在40-45%甲酰胺、1.0M NaCl、l%SDS的緩沖溶液中37°C雜交，在0.5X至1父55(:中55-601:洗滌。高度嚴(yán)格條件，例如，包括在50%甲酰胺、IMNaCl、l%SDS的緩沖溶液中37°C雜交，在0.1XSSC中60_65°C洗滌。非必要地，洗滌緩沖液可含有大約0.1%至1%的SDS。雜交時(shí)間一般少于大約24小時(shí)，通常大約4至12小時(shí)。
[0038]特別典型地是雜交后洗滌的函數(shù)，關(guān)鍵因素是最終洗滌溶液的離子強(qiáng)度和溫度。對于 DNA-DNA 雜交體，T111 可以從 Meinkoth 和 Wahl (1984) Anal.Biochem.138:267-284 的方程估算:1=81.5°C+16.6 (1gM) +0.41 (%GC) -0.61 (%form)-500/L ;其中 M 是單價(jià)陽離子的摩爾濃度，%GC是鳥嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸在DNA中的百分比，％form是甲酰胺在雜交溶液中的百分比，L是雜交體在堿基對中的長度。Tm是50%互補(bǔ)靶序列與完全配對探針雜交的溫度(在規(guī)定的離子強(qiáng)度和pH下)。每1%的錯(cuò)配需Tm降低大約廣匕因此，、雜交和/或洗滌條件可被調(diào)節(jié)以與所需同一性的序列雜交。例如，如果探尋的序列具有> 90%的同一性，^可以降低10°C。一般地，選擇的嚴(yán)格條件是低于特定序列的熱解鏈溫度(Tm)大約5°C，且其在規(guī)定的離子強(qiáng)度和pH下互補(bǔ)。但是，高度嚴(yán)格條件可以應(yīng)用低于熱解鏈溫度(Tm) 1、2、3或4°C的雜交和/或洗滌；中度嚴(yán)格條件可以應(yīng)用低于熱解鏈溫度(Tm) 6、7、8、9或I (TC的雜交和/或洗滌；低度嚴(yán)格條件可以應(yīng)用低于熱解鏈溫度(Tm)IU 12、13、14、15或20°C的雜交和/或洗滌。應(yīng)用此方程、雜交和洗滌組合物和所需的Tm，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)理解雜交和/或洗滌溶液的條件隨嚴(yán)格度的變化而變化。如果所需的錯(cuò)配程度使Tm低于45°C (水溶液)或32°C (甲酰胺溶液)，優(yōu)選增加SSC濃度以能夠使用較高的溫度。核酸雜交的指南見于Tijssen (1993)生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)-用核酸探針雜交，第
I部分，第2章(Elsevier, New York);和Ausubel等人編輯(1995)分子生物學(xué)現(xiàn)代方法第
2章(Greene Publishing and ffiley-1nterscience, New York)。見 Sambrook 等人(1989)分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NewYork)。
[0039]因此，具有啟動(dòng)子活性并在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明啟動(dòng)子序列或其片段雜交的分離序列包括在本發(fā)明中。這些序列與本發(fā)明序列至少大約40%-50%同源，大約60%、65%或70%同源，甚至至少大約 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多同源。即序列同一性的范圍分布在至少大約40%-50%、大約60%、65%或70%同源，甚至至少大約 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更大的序列同一性。
[0040]其它功能等價(jià)啟動(dòng)子含有這樣的核苷酸序列，即能用含有SEQ ID N0:1的第920-932位核苷酸、第947-961位核苷酸、第1507-1519位核苷酸、第1963-1971位核苷酸和第2018-2028位核苷酸所示的核苷酸序列、或SEQ ID NO:1的第900-2066位核苷酸所示的核苷酸序列、或SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的至少約25、優(yōu)選至少約50、特別是至少約100個(gè)連續(xù)核苷酸的寡核苷酸引物在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中擴(kuò)增的核苷酸序列。
[0041]還可以構(gòu)建人工啟動(dòng)子，其包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的5’調(diào)控區(qū)域的決定啟動(dòng)子的花藥組織特異性的內(nèi)部序列。所述人工啟動(dòng)子可能包含能在植物中表達(dá)的另一啟動(dòng)子的“核心啟動(dòng)子”或“TATA盒區(qū)域”，例如W093/19188中所述的CaMV35S “TATA盒區(qū)域”。含有所述人工啟動(dòng)子的啟動(dòng)子區(qū)域的適用性可以通過它們與目的異源核苷酸序列的適當(dāng)融合以及目的異源核苷酸序列在適宜組織、適當(dāng)發(fā)育階段的表達(dá)的檢測進(jìn)行鑒定。
[0042]本發(fā)明所述的啟動(dòng)子序列及其片段，當(dāng)組裝進(jìn)DNA結(jié)構(gòu)使啟動(dòng)子序列與目的異源核苷酸序列可操作地連接時(shí)，用于遺傳性操控任何植物。所述“可操作地連接”是指本發(fā)明的啟動(dòng)子序列與第二個(gè)序列之間的功能性連接，其中啟動(dòng)子序列啟動(dòng)和調(diào)節(jié)對應(yīng)于第二個(gè)序列的DNA序列的轉(zhuǎn)錄。一般地，可操作地連接是指被連接的核酸序列是連續(xù)的，必要時(shí)相鄰地結(jié)合兩個(gè)蛋白編碼區(qū)，并在同一個(gè)閱讀框內(nèi)。以此方式，啟動(dòng)子核苷酸序列與目的異源核苷酸序列構(gòu)成所述嵌合基因在表達(dá)盒中一起提供，以在目的植物中表達(dá)。這種表達(dá)盒提供了大量限制性位點(diǎn)以插入目的異源核苷酸序列，所述目的異源核苷酸序列將受到包含本發(fā)明啟動(dòng)子序列的調(diào)節(jié)區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。表達(dá)盒可另外含有至少一個(gè)將共轉(zhuǎn)化進(jìn)生物體的附加基因。可選擇地，附加基因可以在多個(gè)表達(dá)盒上被提供。
[0043]表達(dá)盒可另外含有可選擇的標(biāo)記基因。一般地，表達(dá)盒將包含用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇性標(biāo)記基因。所述選擇性標(biāo)記基因用于選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織。所述選擇性標(biāo)記基因包括但不限于，編碼抗生素抗性的基因(如編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(NPT))、磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)的基因和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)的基因，以及賦予除草劑抗性的基因如草胺磷、溴苯腈、咪唑啉酮類和2，4_ 二氯苯氧乙酸(2，4-D)。
[0044]表達(dá)盒包括沿5’_3’方向轉(zhuǎn)錄的本發(fā)明的啟動(dòng)子序列、翻譯起始區(qū)、目的異源核苷酸序列和在植物中起作用的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)。目的異源核苷酸序列可以是天然的或?qū)χ参锼拗魍庠吹幕虍愒吹?。可選擇地，目的異源核苷酸序列可以是天然序列或選擇性合成序列?！巴庠础笔侵冈趯?dǎo)入轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的天然植物中不存在所述的導(dǎo)入轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。例如，嵌合基因包含本發(fā)明的啟動(dòng)子序列，本發(fā)明的啟動(dòng)子序列可操作地與不同于本發(fā)明的啟動(dòng)子序列的編碼序列連接。
[0045]終止區(qū)可來源于本發(fā)明的啟動(dòng)子序列，也可來源于可操作連接的目的異源核苷酸序列，或可來源于另外的來源。傳統(tǒng)的終止區(qū)可從土壤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒獲得，如肉堿合成酶和胭脂堿合成酶(NOS)終止區(qū)。
[0046]在表達(dá)盒制備中，可以操控不同的DNA片段以提供適當(dāng)方向的DNA序列，并在適合的時(shí)候提供適當(dāng)?shù)拈喿x框。所以，可應(yīng)用接受子或連接子結(jié)合DNA片段，或可進(jìn)行其它操控以提供方便的限制性位點(diǎn)、去除多余的DNA、去除限制性位點(diǎn)等。為此目的，可能涉及體外誘變、引物修復(fù)、限制、退火、再取代，如轉(zhuǎn)變和轉(zhuǎn)換。
[0047]在適合的情況下，目的異源核苷酸序列可被優(yōu)化以增加在轉(zhuǎn)化植物中的表達(dá)量。即可用植物優(yōu)選的密碼子合成基因以改善表達(dá)。
[0048]本領(lǐng)域公知的，另外的序列修飾可提高細(xì)胞宿主中的基因表達(dá)水平。這些包括但不限于，去除編碼假性聚腺苷信號、外顯子-內(nèi)含子剪接位點(diǎn)信號、轉(zhuǎn)座子的重復(fù)序列，以及其它充分表征出可能不利于基因表達(dá)的序列。序列的G-C含量可調(diào)節(jié)到指定宿主細(xì)胞的平均水平，引用宿主細(xì)胞中己知的基因表達(dá)水平進(jìn)行計(jì)算?？赡艿兀揎椥蛄幸员苊忸A(yù)測的發(fā)夾式mRNA 二級結(jié)構(gòu)。
[0049]在表達(dá)盒或重組載體中，表達(dá)盒可另外含有5’前導(dǎo)序列。所述前導(dǎo)序列可以起改進(jìn)轉(zhuǎn)錄效率的作用。所述前導(dǎo)序列為本領(lǐng)域已知的，包括但不限于，細(xì)小核糖核酸病毒前導(dǎo)序列，例如EMCV前導(dǎo)序列(腦心肌炎5’非編碼區(qū))；馬鈴薯病毒組前導(dǎo)序列，例如煙草蝕刻病毒(TEV)前導(dǎo)序列、玉米矮小花葉病毒(MDMV)前導(dǎo)序列和人免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BiP);來自紫花苜?；ㄈ~病毒包被蛋白mRNA (AMV RNA4)的非翻譯前導(dǎo)序列；煙草花葉病毒(TMV)前導(dǎo)序列；和玉米萎黃病斑點(diǎn)病毒(MCMV)前導(dǎo)序列。還可以使用其它己知的改進(jìn)轉(zhuǎn)錄效率的元件，例如內(nèi)含子等。
[0050]本發(fā)明的啟動(dòng)子序列可用來啟動(dòng)與目的異源核苷酸序列的信使RNA (mRNA)至少部分互補(bǔ)的反義結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄。構(gòu)建反義核苷酸序列以與相應(yīng)的mRNA雜交。只要反義序列長到可與相應(yīng)的mRNA雜交并干擾其表達(dá)，就可進(jìn)行反義序列的修飾。以此方式，可以使用與相應(yīng)的反義序列具有70%,優(yōu)選的80%,更優(yōu)選的85%序列同一'丨生的反義結(jié)構(gòu)。此外，反義核苷酸序列的一部分可被用來破壞祀基因的表達(dá)。一般，可使用至少50個(gè)核苷酸、100個(gè)核苷酸、200個(gè)核苷酸或更多個(gè)核苷酸的序列。
[0051]本發(fā)明的啟動(dòng)子序列還可用于啟動(dòng)正義方向的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄以抑制植物中內(nèi)源性基因的表達(dá)。應(yīng)用正義方向的核苷酸序列在植物中抑制基因表達(dá)的方法為本領(lǐng)域己知。該方法通常涉及用含啟動(dòng)子的DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化植物，啟動(dòng)子可操作地連接至少一部分相當(dāng)于內(nèi)源性基因轉(zhuǎn)錄體的核苷酸序列，并驅(qū)動(dòng)其在植物中表達(dá)。典型地，所述核苷酸序列與內(nèi)源性基因轉(zhuǎn)錄體的序列具有實(shí)質(zhì)上地序列同一性，優(yōu)選地超過大約65%序列同一性，更優(yōu)選地超過大約85%序列同一性，最優(yōu)選地超過大約95%序列同一性。
[0052]本發(fā)明的啟動(dòng)子序列被用于目的異源核苷酸序列的組織特異性表達(dá)?！爱愒春塑账嵝蛄小笔侵阜翘烊坏嘏c啟動(dòng)子序列一起存在的序列。雖然所述核苷酸序列與啟動(dòng)子序列是異源的，但對植物宿主可能是同源的或天然的或異源的或外源的?？刹僮鞯嘏c本發(fā)明的啟動(dòng)子連接的異源核苷酸序列可編碼目的蛋白質(zhì)。這種異源核苷酸序列的實(shí)例包括但不限于，編碼賦予以下抗性多肽的核苷酸序列:非生物應(yīng)激如干旱、溫度、鹽度、臭氧和除草劑，或生物應(yīng)激如病原體侵襲，包括昆蟲、病毒、細(xì)菌、真菌和線蟲類，并防止產(chǎn)生這些生物體伴隨的疾??；還可以編碼控制植物育性的蛋白質(zhì)，優(yōu)選控制植物雄性育性的蛋白質(zhì)。
[0053]對于雄性育性來說關(guān)鍵的基因很多，包括中止孢子發(fā)育(Aborted Microspores,即AMS)基因、NEFl基因、AtGPATl基因、dde2_2突變(其顯示出丙二烯氧化合酶基因的缺陷)、flpl (faceless pollen-1)基因、雄性母細(xì)胞死亡 I (Male Meiocyte Deathl)基因、絨氈層特異性鋅指基因TAZ1、絨氈層決定因子I (Tapetum Determinantl)基因、MSl基因、DPff (MS2)基因、MS3基因、MS5基因、MS7基因、MS8基因、MS9基因、MSlO基因、MSll基因、MS12基因、MS13基因、MS14基因、MS17基因、MS20基因、MS22基因、MS23基因、MS24基因、MS25基因、MS26基因、MS27基因、MS28基因、MS29基因、MS30基因、MS31基因、MS32基因、MS33基因、MS34基因、MS36基因、MS37基因、MS38基因、MS43基因、MS45基因、MS48基因、MS50基因。
[0054]此外，本發(fā)明中在植株雄性組織中表達(dá)的影響雄性生育力的核苷酸序列還可編碼碳水化合物降解或修飾酶、淀粉酶、脫支酶和果膠酶，例如α淀粉酶基因、植物生長素、rolB、細(xì)胞毒素、白喉毒素、DAM甲基化酶、親和素或者可選自原核調(diào)控系統(tǒng)。舉例而言，米曲霉(Aspergillus oryzae)的 RNase-Tl 或解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的RNase (被命名為“barnase”)在絨氈層中的表達(dá)誘導(dǎo)了絨氈層細(xì)胞的破裂，導(dǎo)致雄性不育。農(nóng)桿菌(Arobacterium rhizogenes)的rolB基因編碼通過從吲哚酹-β -式釋放游離吲哚從而干擾生長素代謝的酶。有研究表明，煙草中rolB基因的花粉囊特異性表達(dá)產(chǎn)生了花粉囊枯萎的植株，其中，花粉的產(chǎn)生大大減少，因此rolB基因是可用于控制花粉產(chǎn)生的基因的示例。
[0055]轉(zhuǎn)化方案以及將核苷酸序列導(dǎo)入植物的方案依定向轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞類型而異，即單子葉植物或雙子葉植物。將核苷酸序列導(dǎo)入植物細(xì)胞并隨后插入植物基因組中的適合方法包括但不 限于，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、微量發(fā)射轟擊、直接將DNA攝入原生質(zhì)體、電穿孔或晶須硅介導(dǎo)的DNA導(dǎo)入。
[0056]已經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可按照常規(guī)的方式生長成植物。這些植物被培育，用相同的轉(zhuǎn)化株或不同的轉(zhuǎn)化株授粉，得到的雜交體表達(dá)所需的被鑒定的表現(xiàn)型特征?？膳嘤蚨啻员ＷC穩(wěn)定地保持和遺傳所需表現(xiàn)型特征的表達(dá)，然后收獲可保證得到所需表現(xiàn)型特征表達(dá)的種子。
[0057]本發(fā)明提供了一種組織特異性啟動(dòng)子及其用途，具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0058]1、首次分離。本發(fā)明組織特異性啟動(dòng)子首次分離自秈稻品種93-11的ABCG15基因。
[0059]2、組織特異性表達(dá)。本發(fā)明組織特異性啟動(dòng)子能夠調(diào)控目的異源核苷酸序列特異性表達(dá)于植物花藥組織中，特別是絨氈層組織，為創(chuàng)制新型雄性不育系奠定了基礎(chǔ)。
[0060]下面通過附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0061]圖1為本發(fā)明組織特異性啟動(dòng)子及其用途的重組克隆載體pT-prOsATSl構(gòu)建流程圖； [0062]圖2為本發(fā)明組織特異性啟動(dòng)子及其用途的重組表達(dá)載體DBN-prOsATSl構(gòu)建流程圖；
[0063]圖3為本發(fā)明組織特異性啟動(dòng)子及其用途的突變體植株Osatsl的形態(tài)學(xué)觀察圖；
[0064]圖4為本發(fā)明組織特異性啟動(dòng)子及其用途的突變體植株Osatsl的花粉發(fā)育圖；
[0065]圖5為本發(fā)明組織特異性啟動(dòng)子及其用途的轉(zhuǎn)基因水稻植株-ATSl的花粉發(fā)育圖。
【具體實(shí)施方式】
[0066]下面通過具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明組織特異性啟動(dòng)子及其用途的技術(shù)方案。
[0067]第一實(shí)施例、Osatsl突變體植株的獲得和形態(tài)學(xué)觀察
[0068]突變體植株Osatsl (四川農(nóng)業(yè)大學(xué)合作項(xiàng)目獲得)是在秈稻雜交選育過程中鑒定發(fā)現(xiàn)的自然突變材料，該材料在植株?duì)I養(yǎng)生長階段與野生型沒有顯著差異(圖3)，但是花藥在發(fā)育早期受到抑制，在花發(fā)育后期花藥呈現(xiàn)白色，瘦癟，最終無法產(chǎn)生花粉，表現(xiàn)為完全的雄性不育(圖4)。
[0069]第二實(shí)施例、花藥特異性表達(dá)啟動(dòng)子prOsATSl的獲得及分析
[0070]通過精細(xì)定位發(fā)現(xiàn)Osatsl突變體植株由ABCG15基因(Loc_0s06g40550 ;如序列表中SEQ ID NO: 2所示)中刪除12bp引起的功能缺失突變體，突變體植株Osatsl的序列如序列表中SEQ ID N0:3所示。
[0071]分析發(fā)現(xiàn)，位于精細(xì)定位的ABCG15基因上游2066bp具有RNA聚合酶識別位點(diǎn)，如序列表中SEQ ID NO:1所示，命名為prOsATSl。該啟動(dòng)子特異地表達(dá)在花藥中，特別是絨氈
層組織。
[0072]通過NSITE-PL在線預(yù)測發(fā)現(xiàn)prOsATSl (SEQ ID NO:1)上包括5個(gè)核心調(diào)控元件(http://linuxl.softberry.com/berry.phtml?topic=nsitep&group=programs&subgroup=promoter),具體信息見表1:
[0073]表1:pr0sATSl的核心調(diào)控元件預(yù)測表
[0074]
【權(quán)利要求】
1.一種組織特異性啟動(dòng)子，其特征在于，其核苷酸序列包括如下(a)或(b)的序列: (a)同時(shí)具有SEQID NO:1的第920-932位核苷酸、第947-961位核苷酸、第1507-1519位核苷酸、第1963-1971位核苷酸和第2018-2028位核苷酸所示的核苷酸序列； (b)在嚴(yán)格條件下與(a)限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述組織特異性啟動(dòng)子，其特征在于，所述組織特異性啟動(dòng)子的核苷酸序列包括如下(a)或(b)的序列: Ca)具有SEQ ID NO:1的第900-2066位核苷酸所示的核苷酸序列； (b)在嚴(yán)格條件下與(a)限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述組織特異性啟動(dòng)子，其特征在于，所述組織特異性啟動(dòng)子的核苷酸序列包括如下(a)或(b)的序列: Ca)具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列； (b)在嚴(yán)格條件下與(a)限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
4.一種包含與目的異源核苷酸序列可操作地連接的權(quán)利要求1所述組織特異性啟動(dòng)子的表達(dá)盒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述表達(dá)盒，其特征在于，所述目的異源核苷酸序列編碼目的蛋白質(zhì)。
6.一種包含權(quán)利要求4或5所述表達(dá)盒的DNA構(gòu)建體。
7.一種包含權(quán)利要求6所述DNA構(gòu)建體的重組載體。
8.—種包含權(quán)利要求7所述重組載體的宿主細(xì)胞。
9.一種在其細(xì)胞中含有權(quán)利要求4或5所述表達(dá)盒的植物的花藥組織。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述花藥組織，其特征在于，所述植物為玉米、高粱、大麥、燕麥、水稻或小麥。
11.一種在植物中表達(dá)目的異源核苷酸序列的方法,其特征在于,包括:將與權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述組織特異性啟動(dòng)子可操作地連接的目的異源核苷酸序列穩(wěn)定的整合進(jìn)植物細(xì)胞中。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述在植物中表達(dá)目的異源核苷酸序列的方法，其特征在于，所述植物為玉米、高粱、大麥、燕麥、水稻或小麥。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述在植物中表達(dá)目的異源核苷酸序列的方法，其特征在于，所述目的異源核苷酸序列在花藥組織中表達(dá)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述在植物中表達(dá)目的異源核苷酸序列的方法，其特征在于，所述花藥組織為絨氈層組織。
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述在植物中表達(dá)目的異源核苷酸序列的方法，其特征在于，所述目的異源核苷酸序列編碼目的蛋白質(zhì)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述在植物中表達(dá)目的異源核苷酸序列的方法，其特征在于，所述目的異源核苷酸序列編碼控制植物育性的蛋白質(zhì)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述在植物中表達(dá)目的異源核苷酸序列的方法，其特征在于，所述控制植物育性的蛋白質(zhì)為控制植物雄性育性的蛋白質(zhì)。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述在植物中表達(dá)目的異源核苷酸序列的方法，其特征在于，所述控制植物雄性育性的蛋白質(zhì)為影響花藥和/或花粉發(fā)育的蛋白質(zhì)。
19.一種權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述組織特異性啟動(dòng)子用于在植物花藥組織中優(yōu)先表達(dá)目的異源核苷酸序列的用途。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述組織特異性啟動(dòng)子用于在植物花藥組織中優(yōu)先表達(dá)目的異源核苷酸序列的用途 ，其特征在于，所述植物為玉米、高粱、大麥、燕麥、水稻或小麥。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述組織特異性啟動(dòng)子用于在植物花藥組織中優(yōu)先表達(dá)目的異源核苷酸序列的用途，其特征在于，所述目的異源核苷酸序列編碼目的蛋白質(zhì)。
【文檔編號】C12N15/84GK103725677SQ201310581104
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年11月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月18日
【發(fā)明者】于彩虹 申請人:北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司, 北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司生物技術(shù)中心