專利名稱：一種成體干細(xì)胞的組織分解、細(xì)胞黏附與萃取及培養(yǎng)技術(shù)的制作方法
一種成體干細(xì)胞的組織分解、細(xì)胞黏附與萃取及培養(yǎng)技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明有關(guān)于制造一種生物制劑，藉由同時(shí)剝離切碎、分解消化及篩網(wǎng)過濾胎盤特定部位組織，經(jīng)特定物質(zhì)黏附及無血清培養(yǎng)萃取有效篩選大量成體干細(xì)胞的技術(shù)。
背景技術(shù)：
迄今，間葉干細(xì)胞已由各國著名專家經(jīng)臨床測(cè)試證實(shí)是一種有價(jià)值的干細(xì)胞，其具備有抑制免疫力、幫助修復(fù)組織與彌補(bǔ)造血功能等功能，此外亦有專家公開指出具備上述若干功能的間葉干細(xì)胞，其細(xì)胞數(shù)量與功能發(fā)揮程度有關(guān)，細(xì)胞數(shù)量越多，功能發(fā)揮程度越高；細(xì)胞數(shù)量越少，則反之。間葉干細(xì)胞來源包括有胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell) 與成體干細(xì)胞(adult stem cell)，其中成體干細(xì)胞存在于包括有骨髓、臍帶、胎盤及血管壁等，本領(lǐng)域技術(shù)人員，皆以相似的培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，可制成生物制劑產(chǎn)品，但現(xiàn)有技術(shù)中除取得成體干細(xì)胞的步驟過于繁瑣影響質(zhì)量無法一致性，亦無法有效篩選獲得大量的初代培養(yǎng)(PO)成體干細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致影響產(chǎn)量及產(chǎn)品功能性。
由于間葉干細(xì)胞具備有抑制免疫力、幫助修復(fù)組織與彌補(bǔ)造血功能等優(yōu)點(diǎn)，為達(dá)到上述已被證實(shí)的有效功能，所需的細(xì)胞數(shù)量將是關(guān)鍵因素之一，本領(lǐng)域技術(shù)人員通常需要將取得的干細(xì)胞于體外培養(yǎng)數(shù)代，以期達(dá)到增加細(xì)胞數(shù)量的目的，于是在培養(yǎng)過程中將培養(yǎng)液加入不等量的人類血清或動(dòng)物血清，因該血清內(nèi)容物復(fù)雜，易造成產(chǎn)品批次間難以進(jìn)行質(zhì)量管控，甚或難以管控該血清引起人畜共通疾病的危險(xiǎn)性，因此在產(chǎn)品應(yīng)用上將產(chǎn)生不可預(yù)測(cè)的風(fēng)險(xiǎn)存在。目前坊間市售標(biāo)榜以胎盤間葉干細(xì)胞為主的產(chǎn)品，實(shí)有購買者擔(dān)心該產(chǎn)品是使用含動(dòng)物血清培養(yǎng)液及混雜整體胎盤組織生產(chǎn)出來的，因購買者擔(dān)心若該產(chǎn)品的成份與來源過于混雜，則易降低購買產(chǎn)品的意愿。
由于現(xiàn)有細(xì)胞取得來源復(fù)雜，產(chǎn)品質(zhì)量保證難以落實(shí)，包括必須能夠在長(zhǎng)時(shí)間擴(kuò)增培養(yǎng)下，依然產(chǎn)生跟原本細(xì)胞一模一樣，另外亦必須能夠在長(zhǎng)時(shí)間擴(kuò)增培養(yǎng)下，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)后，依然具有分化形成特定形態(tài)及功能的成熟細(xì)胞，且為能達(dá)到大量取得自胎盤特定組織部位中純化成體干細(xì)胞，同時(shí)必須避免使用含人類血清或動(dòng)物血清培養(yǎng)液以隔絕污染風(fēng)險(xiǎn)，因此我們發(fā)明一種制造胎盤絨毛膜間葉干細(xì)胞(P Iacenta- chorion-membrane derived mesenchymal stem cell, pc_MSC)生物制劑的組織分解、細(xì)胞黏附與完全無血清 (serum-free)培養(yǎng)萃取生產(chǎn)技術(shù)。發(fā)明內(nèi)容
由于胚胎干細(xì)胞的取得涉及倫理道德議題，本發(fā)明以成體干細(xì)胞為主，遂能避免這層障礙與產(chǎn)品購買者的疑慮。本發(fā)明提供了一種成體干細(xì)胞分離及增殖的方法，適用于不同個(gè)體胎盤絨毛膜間葉干細(xì)胞(pc-MSC)的分離及增殖，且經(jīng)過多次繼代培養(yǎng)增殖后，仍然可以保持穩(wěn)定的外觀形態(tài)與相同的識(shí)別度。未分化細(xì)胞，諸如組織前趨細(xì)胞、干細(xì)胞以及它們的類似物，具有使用于再生醫(yī)學(xué)或治療用組織工程的商業(yè)潛力，并且對(duì)于未分化細(xì)胞于再生醫(yī)學(xué)或治療用組織工程的應(yīng)用而言，在體外培養(yǎng)呈現(xiàn)未分化狀態(tài)的未分化細(xì)胞的便利的方法是必要的。本發(fā)明提供了一種分離方法萃取特定部位組織，具有高穩(wěn)定性，且培養(yǎng)過程中排除動(dòng)物血清，培養(yǎng)條件均為已知物質(zhì)，可確保臨床應(yīng)用時(shí)無動(dòng)物物質(zhì)污染的風(fēng)險(xiǎn)。
目前已發(fā)表的學(xué)術(shù)研究成果中，源自骨髓或胎盤等來源的間葉干細(xì)胞，其分離、取得與培養(yǎng)方式皆與本發(fā)明技術(shù)有所差異，本發(fā)明技術(shù)特征包括(I)使用分解液浸潤(rùn)組織且同時(shí)配合將胎盤特定的絨毛膜組織剝離切碎及篩網(wǎng)過濾程序，將切碎物置入涂固有特定物質(zhì)器皿使其黏附于上作為取得間葉干細(xì)胞來源、(2)簡(jiǎn)化現(xiàn)有技術(shù)中取得成體干細(xì)胞的步驟、(3)提供有效篩選胎盤絨毛膜間葉干細(xì)胞(pc-MSC)。本發(fā)明技術(shù)的實(shí)驗(yàn)證明如下內(nèi)容說明
(I)以涂固有不同物質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)皿進(jìn)行孵育相同初始細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)顯示，胎盤絨毛膜間葉干細(xì)胞(pc-MSC)對(duì)特定涂固物質(zhì)具有偏好性，其中以涂固有Human Collagen Type IV的細(xì)胞培養(yǎng)皿進(jìn)行孵育時(shí)，該物質(zhì)具備有效篩選非目標(biāo)細(xì)胞的效果，請(qǐng)參閱圖1。(2)取得全體細(xì)胞后，藉由本發(fā)明技術(shù)內(nèi)容所提的細(xì)胞增殖溶液進(jìn)行增殖，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示全體細(xì)胞數(shù)量越多，則初始細(xì)胞增殖越多，請(qǐng)參閱圖2。(3)以本發(fā)明技術(shù)從來自不同捐贈(zèng)者的胎盤中取得胎盤絨毛膜間葉干細(xì)胞(pc-MSC)，再以繼代培養(yǎng)方式完成不同繼代次數(shù)的實(shí)驗(yàn)顯示可以保持穩(wěn)定的外觀形態(tài)與相同的識(shí)別度的結(jié)果，請(qǐng)參閱圖3，因此本發(fā)明技術(shù)提供了一種成體干細(xì)胞分離及增殖方法，皆可適用于不同個(gè)體胎盤絨毛膜間葉干細(xì)胞 (pc-MSC)。(4)以本發(fā)明技術(shù)將胎盤絨毛膜間葉干細(xì)胞(pc-MSC)進(jìn)行繼代擴(kuò)增培養(yǎng)至二十代時(shí)，以細(xì)胞表面抗原鑒定技術(shù)進(jìn)行確認(rèn)鑒定，其中細(xì)胞標(biāo)記⑶73、⑶90、⑶105及HLA-G的測(cè)試呈陽性反應(yīng)；細(xì)胞標(biāo)記⑶14、⑶34、⑶45的測(cè)試呈陰性反應(yīng)，請(qǐng)參閱圖4。(5)以本發(fā)明技術(shù)將胎盤絨毛膜間葉干細(xì)胞(pc-MSC)進(jìn)行繼代擴(kuò)增培養(yǎng)至十代時(shí)，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后，細(xì)胞分化潛力的實(shí)驗(yàn)顯示胎盤絨毛膜間葉干細(xì)胞(pc-MSC)仍然保持具有分化多種胚層細(xì)胞的能力，其中，A與D為成骨細(xì)胞分化試驗(yàn)，A為對(duì)照組，D為試驗(yàn)組；B與E為軟骨細(xì)胞分化試驗(yàn)，B為對(duì)照組，E為試驗(yàn)組；C與F為脂肪細(xì)胞分化試驗(yàn)，C為對(duì)照組，F(xiàn)為試驗(yàn)組，請(qǐng)參閱圖5。


圖1 :以不同涂固材料的培養(yǎng)皿培養(yǎng)胎盤絨毛膜間葉干細(xì)胞(pc-MSC)的結(jié)果，由圖可見胎盤絨毛膜間葉干細(xì)胞(pc-MSC)對(duì)特定材料具有偏好性，于材料E上具有最佳的生長(zhǎng)效率，本發(fā)明分離與培養(yǎng)方式與目前已發(fā)表學(xué)術(shù)成果中有關(guān)的間葉干細(xì)胞(源自骨髓或胎盤 等不同來源)不同。
圖2 :不同全體細(xì)胞數(shù)量對(duì)胎盤絨毛膜間葉干細(xì)胞生長(zhǎng)影響的結(jié)果。
圖3 :不同捐贈(zèng)者不同繼代次數(shù)生長(zhǎng)情形的結(jié)果，由圖可見以此分離方法所得的細(xì)胞，來自不同捐贈(zèng)者胎盤具有類似的形態(tài)，且經(jīng)多次繼代培養(yǎng)仍能保持穩(wěn)定的外觀形態(tài)。
圖4 :細(xì)胞表面抗原鑒定的結(jié)果，由圖可見符合一般對(duì)間葉細(xì)胞表面抗原信號(hào)的定義，其中具有⑶73、⑶90、⑶105的表達(dá)，并有HLA-G細(xì)胞表面抗原的表達(dá)且未偵測(cè)到 CD14、CD34、CD45 的信號(hào)。
圖5 :干細(xì)胞分化潛能試驗(yàn)的結(jié)果，由圖可見胎盤絨毛膜間葉干細(xì)(pc-MSC)具有分化多種胚層細(xì)胞的能力，其中，A與D為成骨細(xì)胞分化試驗(yàn)，A為對(duì)照組，D為試驗(yàn)組；B與 E為軟骨細(xì)胞分化試驗(yàn)，B為對(duì)照組，E為試驗(yàn)組；C與F為脂肪細(xì)胞分化試驗(yàn)，C為對(duì)照組，F(xiàn)為試驗(yàn)組。
附圖中符號(hào)簡(jiǎn)單說明
材料A:老鼠第一型膠原蛋白(Mouse CollagenTypeI);
材料B:層粘連蛋白(Laminin)；
材料C:纖維連接蛋白素(Fibronectin)；
材料D:人類第一型膠原蛋白(Human CollagenTypeI);
材料E:人類第四型膠原蛋白(Human CollagenTypeIV)；
材料F:無任何物質(zhì)黏附(None Coating)。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明將藉由下列實(shí)施方式做進(jìn)一步的說明，這些實(shí)施方式并不限制本發(fā)明前面所揭示的內(nèi)容。本發(fā)明所列實(shí)施方式除無菌操作、離心分離、細(xì)胞增殖培養(yǎng)、細(xì)胞表面抗原鑒定，可簡(jiǎn)化現(xiàn)有技術(shù)中取得成體干細(xì)胞的步驟，亦可增加現(xiàn)有技術(shù)中起始PO (初代培養(yǎng)) 成體干細(xì)胞數(shù)量，本領(lǐng)域技術(shù)人員，雖可做些許的改良與修飾，但仍不脫離本發(fā)明的范疇。 本發(fā)明實(shí)施方式步驟如下說明
(一 )取自生物體經(jīng)分娩后排出體外的胎盤，以組織潔凈溶液進(jìn)行清潔洗凈，其中該溶液包含有HBSS配方培養(yǎng)基及濃度介于O. 9%至1. 1%的磷酸鹽緩沖液。
( 二)完成上述步驟后，于無塵環(huán)境空間內(nèi)實(shí)施本步驟，以無菌操作方式使用手術(shù)刀剝離該胎盤的羊膜組織及絨毛膜組織。
(三)完成上述步驟后，于無塵環(huán)境空間內(nèi)實(shí)施本步驟，以無菌操作方式使用步驟 (一)組織潔凈溶液清潔洗凈附著于該絨毛膜組織的血塊，清潔洗凈完畢后，將該絨毛膜組織移至細(xì)胞專用培養(yǎng)皿內(nèi)。
(四)完成上述步驟后，于無塵環(huán)境空間內(nèi)實(shí)施本步驟，以無菌操作方式使用組織分解消化溶液分解消化步驟(三)培養(yǎng)皿內(nèi)的絨毛膜組織，并且應(yīng)同時(shí)用手術(shù)刀切碎，其中該溶液包含有SMEM配方培養(yǎng)基、濃度介于O. 9mg/ml至1. lmg/ml的Protease 14、濃度介于 O. 9mg/ml 至1. lmg/ml 的 Collagenase B 及濃度介于1. 9mg/ml 至 2. lmg/ml 的 DNase I , 接著放置該培養(yǎng)皿于4攝氏度的環(huán)境空間，持續(xù)其消化時(shí)間介于12小時(shí)至16小時(shí)。
(五)完成上述步驟后，于無塵環(huán)境空間內(nèi)實(shí)施本步驟，以無菌操作方式使用孔徑介于70微米至100微米的篩網(wǎng)過濾步驟(四)培養(yǎng)皿內(nèi)的所有物質(zhì)，接著藉由離心分離方式取得該過濾液中的全體細(xì)胞。
(六)完 成上述步驟后，于無塵環(huán)境空間內(nèi)實(shí)施本步驟，以無菌操作方式使用未混合任何血清的細(xì)胞增殖溶液增殖步驟(五)全體細(xì)胞，增殖培養(yǎng)間期每三日更換新鮮的細(xì)胞增殖溶液直至細(xì)胞濃度介于IX IOfVcm2至9X IOfVcm2，其中該溶液包含有MCDB201配方培養(yǎng)基、濃度介于O. 9%至1. 1%的ITS及濃度介于O. 9%至1. 1%的磷酸鹽緩沖液。
(七)完成上述步驟后，于無塵環(huán)境空間內(nèi)實(shí)施本步驟，以無菌操作方式使用涂固有濃度介于O. lmg/cm2至lmg/cm2的Human Collagen 4的細(xì)胞培養(yǎng)皿孵育篩選步驟(六) 細(xì)胞，持續(xù)孵育24小時(shí)后，接著藉由移除未貼附該培養(yǎng)皿的細(xì)胞，有效篩選獲得初代(PO) 胎盤絨毛膜間葉干細(xì)胞，濃度介于IX IOVcm2至9X 104/cm2。
(八)完成上述步驟后，以細(xì)胞表面抗原鑒定技術(shù)，確認(rèn)鑒定步驟(七)胎盤絨毛膜間葉干細(xì)胞表面抗原特征，其中該細(xì)胞特征為細(xì)胞標(biāo)記CD73、CD90、CD105及HLA-G的測(cè)試呈陽性反應(yīng)，細(xì)胞標(biāo)記⑶14、⑶34、⑶45的測(cè)試呈陰性反應(yīng)。
(九)接續(xù)步驟(七)，于無塵環(huán)境空間內(nèi)實(shí)施本步驟，以無菌操作細(xì)胞增殖培養(yǎng)方式使用未混合任何血清的干細(xì)胞增殖溶液增殖步驟(七)初代細(xì)胞的繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)間期每三日更換新鮮的干細(xì)胞增殖溶液，其中該溶液包含有MCDB201配方培養(yǎng)基、濃度介于 O. 9%至1. 1%的ITS、濃度介于O. 9%至1. 1%的磷酸鹽緩沖液及濃度介于9ng/ml至llng/ml 的 EGF。
(十)接續(xù)步驟(九)，于無塵環(huán)境空間內(nèi)實(shí)施本步驟，以無菌操作細(xì)胞繼代培養(yǎng)方式使用未混合任何血清的干細(xì)胞增殖溶液進(jìn)行增殖至二十代(P20)時(shí)，以細(xì)胞表面抗原鑒定技術(shù)，再確認(rèn)鑒定該胎盤絨毛膜間葉干細(xì)胞表面抗原特征，其中該細(xì)胞特征為細(xì)胞標(biāo)記⑶73、⑶90、⑶105及HLA-G的測(cè)試呈陽性反應(yīng)，細(xì)胞標(biāo)記⑶14、⑶34、⑶45的測(cè)試呈陰性反應(yīng)。
另外，本發(fā)明實(shí)施方式要求限于以下說明
(十一)僅限萃取胎盤絨毛膜的部位，必須移除胎盤絨毛膜以外組織。
(十二)以本發(fā)明技術(shù)取得全體細(xì)胞的任何過程中，其中該過程包含必須添加組織分解消化溶液且同時(shí)用手術(shù)刀細(xì)切至適當(dāng)?shù)拇笮【?，再以孔徑介?0微米至100微米的篩網(wǎng)過濾雜質(zhì)及收集濾液，藉由離心分離方式，移除所有溶液，即可取得全體細(xì)胞，該過程中不可以使用研磨及/或震蕩方式處理。
(十三)組織分解消化溶液的組成成分，僅限使用SMEM配方培養(yǎng)基、PiOtease14、 Collagenase B及DNase I四種成分組成。
(十四)以本發(fā)明技術(shù)取得全體細(xì)胞過程中，僅限使用孔徑介于70微米至100微米的篩網(wǎng)進(jìn)行過濾。
(十五)以本發(fā)明技術(shù)獲得的初始細(xì)胞，僅限使用涂固HumanCollagen Type IV 的細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)，才能有效篩選獲得初代(PO)胎盤絨毛膜間葉干細(xì)胞。
(十六)本發(fā)明技術(shù)實(shí)施過程中，僅限使用無人類血清及/或動(dòng)物血清，亦不含任何未知成分血清的各種溶液。
(十七)以本發(fā)明技術(shù)擴(kuò)增培養(yǎng)初代(PO)胎盤絨毛膜間葉干細(xì)胞，于培養(yǎng)期間使用干細(xì)胞增殖溶液的組成成分，僅限使用MCDB201配方培養(yǎng)基、ITS、EGF及磷酸鹽緩沖液四種成分組成。
權(quán)利要求
1.一種生物材料，其為胎盤絨毛膜間葉干細(xì)胞，并已保藏于臺(tái)灣財(cái)團(tuán)法人食品工業(yè)發(fā)展研究所，保藏編號(hào)為BCRC960408。
2.一種促進(jìn)組織再生、組織修復(fù)、血管新生、造血功能及輔助免疫調(diào)節(jié)的生物制劑，由權(quán)利要求1的生物材料與繼代培養(yǎng)以擴(kuò)增該生物材料的溶液組成，其為可進(jìn)行重復(fù)繼代培養(yǎng)仍可保持該生物材料穩(wěn)定的外觀形態(tài)及同時(shí)具備分化多種細(xì)胞的能力。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的生物制劑，其中該生物材料獲自哺乳動(dòng)物分娩后的胎盤絨毛膜組織。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的生物制劑，其中該胎盤絨毛膜組織選自豬、牛、羊、犬、兔、鼠及人類的胎盤絨毛膜組織。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的生物制劑，其中該胎盤絨毛膜組織為人類的胎盤絨毛膜組織。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的生物制劑，其經(jīng)連續(xù)步驟處理，包括(a)將胎盤清潔洗凈并以手術(shù)刀手動(dòng)剝離該胎盤的絨毛膜組織；(b)將附于該絨毛膜組織的血塊清潔洗凈；(c)分解消化并同時(shí)以手術(shù)刀手動(dòng)切碎該絨毛膜組織；(d)以篩網(wǎng)過濾該絨毛膜組織進(jìn)而取得含該組織分離出來的細(xì)胞的濾液；(e)將該濾液以無血清細(xì)胞培養(yǎng)溶液進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；(f)再將該細(xì)胞均勻分布于涂固有生物物質(zhì)的培養(yǎng)載體，持續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，移除未貼附該培養(yǎng)皿的細(xì)胞，最后，篩選獲得初代(PO)胎盤絨毛膜間葉干細(xì)胞以供使用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的生物制劑，其中步驟(a)與(b)中，該清潔洗凈溶液選自HBSS培養(yǎng)基，以及進(jìn)一步包含O. 9% 1. 1%(ν/ν)磷酸鹽緩沖液。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的生物制劑，其中步驟(c)中，該組織分解消化溶液系選自SMEM培養(yǎng)基，以及進(jìn)一步包含 O. 9mg/ml 1. lmg/ml Protease 14、0· 9mg/ml 1. lmg/mlCollagenase B 及 L 9mg/ml 2. lmg/ml DNase I。
9.根據(jù)權(quán)利要求6的生物制劑，其中該步驟(c)中，將該絨毛膜組織浸泡于4攝氏度環(huán)境持續(xù)消化分解12 16小時(shí)而形成糜粥狀。
10.根據(jù)權(quán)利要求6的生物制劑，其中步驟(d)中，該過濾篩網(wǎng)選自70 100微米孔徑。
11.根據(jù)權(quán)利要求6的生物制劑，其中步驟(e)中，該細(xì)胞培養(yǎng)溶液選自MCDB201培養(yǎng)基，以及進(jìn)一步包含O. 9% 1. l%(v/v) ITS及O. 9% 1. 1%(ν/ν)磷酸鹽緩沖液。
12.根據(jù)權(quán)利要求6的生物制劑，其中該步驟(e)中，以每三日更換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)溶液直至形成細(xì)胞濃度為I 9X IOfVcm2。
13.根據(jù)權(quán)利要求6的生物制劑，其中步驟(f)中，該細(xì)胞選自由胎盤間葉干細(xì)胞、組織前驅(qū)細(xì)胞、母細(xì)胞、組織特化細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、組織前趨細(xì)胞、間葉細(xì)胞、脂肪衍生基質(zhì)細(xì)胞、脂肪衍生干細(xì)胞及胎盤衍生干細(xì)胞所組成的群。
14.根據(jù)權(quán)利要求6的生物制劑,其中步驟(f)中，該生物物質(zhì)組份系選自由Laminin、Fibronectin> Human Collagen Type1、Human Collagen Type IV 及它們的衍生物所構(gòu)成的群組。
15.根據(jù)權(quán)利要求6的生物制劑，其中步驟(f)中，該生物物質(zhì)組分選自由HumanCollagen Type IV及其衍生物所構(gòu)成的群組。
16.根據(jù)權(quán)利要求6的生物制劑，其中該步驟(f)中，以數(shù)量O.1 1. Omg/cm2的生物物質(zhì)組分涂布固定于培養(yǎng)載體。
17.根據(jù)權(quán)利要求6的生物制劑，其中該步驟(f)中，有效提供I 9XIOVcm2生物材料即初代胎盤絨毛膜間葉干細(xì)胞以供使用。
18.根據(jù)權(quán)利要求2的生物制劑，其中該溶液選自MCDB201培養(yǎng)基，以及進(jìn)一步包含O.9% 1. l%(v/v) ITS、0. 9% 1. 1%(ν/ν)憐酸鹽緩沖液及 9ng/ml llng/ml EGF,使得該干細(xì)胞持續(xù)繼代培養(yǎng)。
19.根據(jù)權(quán)利要求2的生物制劑，其特征為至少包含重復(fù)進(jìn)行該繼代培養(yǎng)的重復(fù)次數(shù)達(dá)到20次仍可保持該生物材料穩(wěn)定的外觀形態(tài)，其中至少包含重復(fù)次數(shù)達(dá)到10次仍可保持該生物材料穩(wěn)定的外觀形態(tài)及同時(shí)具備分化多種細(xì)胞的能力。
20.根據(jù)權(quán)利要求14至17任一所述的生物制劑，其特征為有效篩選目標(biāo)細(xì)胞，選自無血清培養(yǎng)基的黏附型未分化干細(xì)胞。
21.一種根據(jù)權(quán)利要求2至20任一所述的促進(jìn)組織再生、組織修復(fù)、血管新生、造血功能及輔助免疫調(diào)節(jié)的生物制劑，其用途為應(yīng)用于醫(yī)學(xué)美容領(lǐng)域、再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、組織工程領(lǐng)域及醫(yī)藥領(lǐng)域。
22.一種制造促進(jìn)組織再生、組織修復(fù)、血管新生、造血功能及輔助免疫調(diào)節(jié)的生物制劑的方法，該方法包括下述連續(xù)步驟(a)將胎盤清潔洗凈并以手術(shù)刀手動(dòng)剝離該胎盤的絨毛膜組織；(b)將附于該絨毛膜組織的血塊清潔洗凈；(c)分解消化并同時(shí)以手術(shù)刀手動(dòng)切碎該絨毛膜組織；(d)以篩網(wǎng)過濾該絨毛膜組織進(jìn)而取得含該組織分離出來的細(xì)胞的濾液；(e)將該濾液以無血清細(xì)胞培養(yǎng)溶液進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；(f)再將該細(xì)胞均勻分布于涂固有生物物質(zhì)的培養(yǎng)載體，持續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，移除未貼附該培養(yǎng)皿的細(xì)胞，將篩選取得初代(PO)胎盤絨毛膜間葉干細(xì)胞以供使用；(g)提供無血清細(xì)胞繼代培養(yǎng)溶液進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中步驟(a)與(b)中，該清潔洗凈溶液選自HBSS培養(yǎng)基，以及進(jìn)一步包含O. 9% 1. 1%(ν/ν)磷酸鹽緩沖液。
24.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中步驟(c)中，該組織分解消化溶液系選自SMEM培養(yǎng)基，以及進(jìn)一步包含 O. 9mg/ml 1. lmg/ml Protease 14、0· 9mg/ml 1. lmg/mlCollagenase B 及 L 9mg/ml 2. lmg/ml DNase I。
25.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中該步驟(c)中，將該絨毛膜組織浸泡于4攝氏度環(huán)境持續(xù)消化分解12 16小時(shí)而形成糜粥狀。
26.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中步驟(d)中，該過濾篩網(wǎng)選自70 100微米孔徑。
27.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中步驟(e)中，該細(xì)胞培養(yǎng)溶液選自MCDB201培養(yǎng)基，以及進(jìn)一步包含O. 9% 1. l%(v/v) ITS及O. 9% 1. 1%(ν/ν)磷酸鹽緩沖液。
28.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中該步驟(e)中，以每三日更換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)溶液直至形成細(xì)胞濃度為I 9X IOfVcm2。
29.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中步驟(f)中，該細(xì)胞選自由胎盤間葉干細(xì)胞、組織前驅(qū)細(xì)胞、母細(xì)胞、組織特化細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、組織前趨細(xì)胞、間葉細(xì)胞、脂肪衍生基質(zhì)細(xì)胞、月旨肪衍生干細(xì)胞及胎盤衍生干細(xì)胞所組成的群。
30.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中步驟(f)中，該生物物質(zhì)組份系選自由Laminin、Fibronectin、Human Collagen Type1、Human Collagen Type IV 及它們的衍生物所構(gòu)成的群組。
31.根據(jù)權(quán)利要求22的方法,其中步驟(f)中，該生物物質(zhì)組分選自由HumanCollagenType IV及其衍生物所構(gòu)成的群組。
32.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中該步驟(f)中，以數(shù)量O.1 1. Omg/cm2的生物物質(zhì)組分涂布固定于培養(yǎng)載體。
33.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中該步驟(f)中，有效提供I 9XIOVcm2生物材料即初代胎盤絨毛膜間葉干細(xì)胞以供使用。
34.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中步驟(g)中，該細(xì)胞繼代培養(yǎng)溶液選自MCDB201培養(yǎng)基，以及進(jìn)一步包含O. 9% 1. l%(v/v) ITS、0. 9% 1. 1%(ν/ν)磷酸鹽緩沖液及9ng/ml llng/ml EGF0
35.根據(jù)權(quán)利要求30至33任一所述的方法，其特征為有效篩選目標(biāo)細(xì)胞，選自無血清培養(yǎng)基的黏附型未分化干細(xì)胞。
36.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，至少包含重復(fù)進(jìn)行該繼代培養(yǎng)的重復(fù)次數(shù)達(dá)到20次仍可保持該篩選取得的初代胎盤絨毛膜間葉干細(xì)胞穩(wěn)定的外觀形態(tài)，其中系至少包含重復(fù)次數(shù)達(dá)到10次仍可保持該干細(xì)胞穩(wěn)定的外觀形態(tài)及同時(shí)具備分化多種細(xì)胞的能力。
37.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中篩選取得的細(xì)胞特征為對(duì)至少一種選自由CD73、⑶90、⑶105及HLA-G組成的群組中的細(xì)胞標(biāo)記的測(cè)試呈陽性反應(yīng)；對(duì)至少一種選自由⑶14、⑶34、⑶45組成的群組中的細(xì)胞標(biāo)記的測(cè)試呈陰性反應(yīng)。
38.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中繼代培養(yǎng)的細(xì)胞特征為對(duì)至少一種選自由CD73、⑶90、⑶105及HLA-G組成的群組中的細(xì)胞標(biāo)記的測(cè)試呈陽性反應(yīng)；對(duì)至少一種選自由⑶14、⑶34、⑶45組成的群組中的細(xì)胞標(biāo)記的測(cè)試呈陰性反應(yīng)。
39.權(quán)利要求36至38任一所述的方法，其特征為進(jìn)行重復(fù)繼代培養(yǎng)仍可保持該干細(xì)胞穩(wěn)定的外觀形態(tài)及同時(shí)具備分化多種細(xì)胞的能力。
40.一種根據(jù)權(quán)利要求22至39任一所述的方法，其應(yīng)用于醫(yī)學(xué)美容領(lǐng)域、再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、組織工程領(lǐng)域及醫(yī)藥領(lǐng)域。
全文摘要
本發(fā)明揭示一種簡(jiǎn)易的由胎盤特定組織中取得大量成體干細(xì)胞制成生物制劑的方法，其主要特征在于使用分解液浸潤(rùn)組織且同時(shí)配合全體組織剝離切碎及篩網(wǎng)過濾程序，將切碎物置入涂固有特定物質(zhì)的器皿使其黏附于上。本發(fā)明亦揭示含有一種無血清的培養(yǎng)液進(jìn)行成體干細(xì)胞培養(yǎng)的方法，其特征在于培養(yǎng)全程使用適當(dāng)?shù)臒o血清培養(yǎng)液，可將該未分化的成體干細(xì)胞培養(yǎng)于涂固有特定物質(zhì)的器皿，藉此成體干細(xì)胞的增生及分化潛力得以被保持，此方法可以被用于體外擴(kuò)增成體干細(xì)胞而不會(huì)喪失其復(fù)制及分化能力。因此，本發(fā)明的方法可以被應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)、組織工程以及使用在其它來源的干細(xì)胞須具備有抑制免疫力、修復(fù)組織與造血功能需求上。
文檔編號(hào)A61L27/38GK103031273SQ20121028648
公開日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2012年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月28日
發(fā)明者林泰元, 陳耀昌, 其他發(fā)明人請(qǐng)求不公開姓名 申請(qǐng)人:林泰元, 陳耀昌