用于心臟組織保護(hù)的干細(xì)胞的組合物和方法【專利摘要】本公開內(nèi)容描述了通過在含有溶血磷脂酸，優(yōu)選還含有凝膠即，仿生凝膠的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞來增強(qiáng)造血干細(xì)胞，優(yōu)選來源于人臍帶或外周血的CD34+在低氧和去血清條件下的存活的方法和組合物。所述方法和組合物可用于醫(yī)學(xué)或化妝品應(yīng)用，特別地，用于治療心臟組織和/或心臟病，和/或用于治療傷口愈合即糖尿病傷口愈合?！緦＠f明】用于心臟組織保護(hù)的干細(xì)胞的組合物和方法【
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】[0001]本公開內(nèi)容涉及利用溶血磷脂酸處理的人造血干細(xì)胞的組合物和方法，所述組合物和方法增強(qiáng)在低氧和去血清條件下的存活并且在心肌梗塞后保護(hù)心臟組織。[0002]背景[0003]心臟病是發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家中死亡和失能的首要原因，約占全部人死亡數(shù)目的40%。許多存活的患者患上被稱為充血性心力衰竭（CHF)的心臟病的慢性形式，該疾病形式與心肌的進(jìn)行性退化、瘢痕形成、LV(左心室）擴(kuò)張和機(jī)能障礙相關(guān)。具有嚴(yán)重缺血性心力衰竭的患者具有高發(fā)病率和死亡率，而心臟移植是唯一可用的決定性療法。[0004]最近，在經(jīng)歷MI(心肌梗塞）的人患者中已測試了不同來源的干細(xì)胞，包括成人外周血干細(xì)胞（APBSC)和骨髓來源的干細(xì)胞（BMDSC)(Losordo,D.W.，等人,IntramyocardialtransplantationofautologousCD34+stemcellsforintractableangina:aphaseI/IIadouble-blind,randomizedcontrolledtrial.Circulation,2007.115(25):p.3165-72；Schachinger,V.,等人,Intracoronarybonemarrow-derivedprogenitorcellsinacutemyocardialinfarction.NEnglJMed，2006.355(12):p.1210-21)。已在大部分試驗(yàn)中報(bào)導(dǎo)了LV射血分?jǐn)?shù)的改善(Schachinger,V.,等人，Intracoronarybonemarrow-derivedprogenitorcellsinacutemyocardialinfarction.NEnglJMed,2006.355(12):p.1210-21；Passier,R.,L.ff.vanLaake,andC.L.Mummery,Stem-cell-basedtherapyandlessonsfromtheheart.Nature,2008.453(7193):p.322-9);然而，功能性改善仍然不明顯（射血分?jǐn)?shù)低于5%)。因此，需要替代的方法以（i)增強(qiáng)干細(xì)胞的治療作用和（ii)治療擁有具有削弱的生物活性的成體干細(xì)胞的老年患者（例如糖尿病患者，等）（Passier,R.，L.ff.vanLaake和C.L.Mummery,Stem-cell-basedtherapyandlessonsfromtheheart.Nature,2008.453(7193):p.322-9)。[0005]從人臍帶血分離的⑶34+細(xì)胞可以是用于心臟再生的有前景的細(xì)胞療法。這些干細(xì)胞可被自體地使用，可在體外或體內(nèi)分化成血管細(xì)胞（LeRicousse_Roussanne，S.，等人，Exvivodifferentiatedendothelialandsmoothmusclecellsfromhumancordbloodprogenitorshometotheangiogenictumorvasculature.CardiovascRes，2004.62(l):p.176-84)并且在心肌缺血的動(dòng)物模型中增強(qiáng)新生血管形成（Ma，N.，等A,HumancordbloodcellsinduceangiogenesisfollowingmyocardialinfarctioninNOD/scid-mice.CardiovascRes,2005.66(1):p.45-54；Hirata,Y.,等人,Humancordbloodbloodcellsimprovecardiacfunctionaftermyocardialinfarction.BiochemBiophysResCommun,2005.327(2):p.609-14)。從人胳帶血分離的CD34+細(xì)胞相較于APBSC和BMDSC具有幾個(gè)有利方面，包括更高的增生率、相對低的在體內(nèi)產(chǎn)生不想要的細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)（與對于BMDSC所描述的風(fēng)險(xiǎn)相反）以及用于經(jīng)歷MI并且具有功能受損的人外周血CD34+細(xì)胞的患者的適當(dāng)?shù)募?xì)胞療法[5,10]。為了獲得臨床功效，干細(xì)胞或其后代必須存活和移植入宿主組織。不幸地，許多細(xì)胞在遞送后數(shù)天死亡（Ma，N.，等A,HumancordbloodcellsinduceangiogenesisfollowingmyocardialinfarctioninNOD/scid-mice.CardiovascRes,2005.66(1):p.45-54；Hirata,Y.,等人，Humancordbloodbloodcellsimprovecardiacfunctionaftermyocardialinfarction.BiochemBiophysResCommun，2005.327(2):p.609-14;Henning，R.J·，等人，Humancordbloodprogenitorcellsareattractedtoinfarctedmyocardiumandsignificantlyreducemyocardialinfarctionsize.CellTransplant,2006.15(7):p.647-58)〇[0006]一般描述[0007]本公開內(nèi)容的一個(gè)方面描述了通過在含有溶血磷脂酸，優(yōu)選還含有凝膠（即，仿生凝膠）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞來增加造血干細(xì)胞，優(yōu)選來源于人臍帶或外周血的CD34+細(xì)胞在低氧和去血清條件下的存活的方法。[0008]該組合令人驚訝地增加了低氧和去血清條件下的存活，并且在心肌梗塞后保護(hù)心臟組織。該混合物，特別地在血纖蛋白中利用溶血磷脂酸處理的來源于人臍帶血的⑶34+，顯示改善的結(jié)果。[0009]在公開的方法的實(shí)施方案中，仿生凝膠可以是下列物質(zhì)的至少一種：血纖蛋白、透明質(zhì)酸、藻酸鹽、瓊脂糖、膠原、PEG衍生物及其混合物。優(yōu)選地血纖蛋白凝膠，更優(yōu)選地血纖蛋白凝膠以l-l〇〇mg/ml的終濃度包含血纖蛋白原以及以l-500U/ml的終濃度包含凝血酶。更優(yōu)選，血纖蛋白凝膠以10_30mg/ml的終濃度包含血纖蛋白原和以2-50U/ml的終濃度包含凝血酶。[0010]在公開的方法的實(shí)施方案中，溶血磷脂酸的濃度在1至1000μΜ之間變化，優(yōu)選為100μm〇toon]本公開內(nèi)容的一個(gè)方面描述了組合物，所述組合物包含：造血干細(xì)胞，優(yōu)選來源于人臍帶或外周血的⑶34+;以及溶血磷脂酸，優(yōu)選還包含凝膠，即仿生凝膠。[0012]該組合令人驚訝地增加低氧和去血清條件下的存活，并且在心肌梗塞后保護(hù)心臟組織。該混合物，特別地血纖蛋白中利用溶血磷脂酸處理的人臍帶血的⑶34+，顯示改善的結(jié)果。[0013]在公開的組合物的實(shí)施方案中，仿生凝膠可以是下列物質(zhì)的至少一種：血纖蛋白、透明質(zhì)酸、藻酸鹽、瓊脂糖、膠原、PEG衍生物及其混合物。優(yōu)選地血纖蛋白凝膠，更優(yōu)選地血纖蛋白凝膠以l-l〇〇mg/ml的終濃度包含血纖蛋白原以及以l-500U/ml的終濃度包含凝血酶。更優(yōu)選，血纖蛋白凝膠以10_30mg/ml的終濃度包含血纖蛋白原和以2-50U/ml的終濃度包含凝血酶。[0014]在公開的組合物的實(shí)施方案中，溶血磷脂酸的濃度在1與1000μΜ之間變化，優(yōu)選為100μΜ。[0015]公開的組合物的實(shí)施方案可包含IX105-1Χ106個(gè)⑶34+細(xì)胞和1-100μΜ的溶血磷脂酸，以及100_200mL的仿生凝膠。[0016]在其它方面，公開的組合物可用于醫(yī)學(xué)或化妝品應(yīng)用，即藥物組合物、醫(yī)藥組合物或化妝品組合物，即對于Cd34+細(xì)胞和LPA，先前的組分以治療有效量存在，并且還可包含足夠量的賦形劑。具體地，在心臟組織和/或心臟病的治療中，和/或在傷口愈合即糖尿病傷口愈合的治療中。[0017]在實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的組合物可以是可注射制劑。[0018]在本公開內(nèi)容中，顯示了利用溶血磷脂酸（LPA)處理的并且在低氧和去血清條件下培養(yǎng)的造血干細(xì)胞即CD34+細(xì)胞使它們的存活相對于未處理的細(xì)胞加倍。令人驚訝地，細(xì)胞增殖并且相較于對照，分泌高水平的細(xì)胞因子例如IL-4、IL-8和TNF-α。最后，LPA-處理的細(xì)胞在心肌梗塞后保護(hù)心臟功能但未處理的細(xì)胞不保護(hù)。[0019]附圖概述[0020]下列附圖提供了優(yōu)選實(shí)施方案來舉例說明本說明書，并且不應(yīng)當(dāng)被看作限定本發(fā)明的范圍。[0021]圖1-LPA的化學(xué)結(jié)構(gòu)。在具有或不具有藥物的無血清培養(yǎng)基中于低氧中培養(yǎng)24h的⑶34+細(xì)胞的存活、細(xì)胞凋亡和壞死。結(jié)果為平均值土SEM(η=2-13)。[0022]圖2-LPA增加在低氧和去血清條件下培養(yǎng)的細(xì)胞中的CD34+細(xì)胞存活。（Α)在常氧、低氧以及低氧和LPA處理中于無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h的CD34+細(xì)胞的存活、細(xì)胞凋亡和壞死。（B)LPA濃度對在低氧或常氧中于無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h的CD34+細(xì)胞的存活的作用。（C)LPA對在低氧中培養(yǎng)1(H1)或3天（H3)，在低氧中培養(yǎng)1天并在常氧中培養(yǎng)3天（H1+N3)，或在常氧中培養(yǎng)1(N1)或4天（N4)的細(xì)胞的存活的作用。在所有圖中，用或不用LPA(lOOyM)培養(yǎng)細(xì)胞。結(jié)果為平均值土SEM(n=4-50)。在所有圖中，*表示統(tǒng)計(jì)顯著性：*Ρ〈0·05,**Ρ〈0·01，***Ρ〈0·001。[0023]圖3-LPA影響細(xì)胞增殖并且對低氧和去血清條件下的細(xì)胞分化具有最低限度的影響。（A)在于低氧中培養(yǎng)1天和于常氧中培養(yǎng)3或6天后的細(xì)胞總數(shù)。（B)通過流式細(xì)胞術(shù)測量的細(xì)胞分化（n=1)。將細(xì)胞在低氧中培養(yǎng)1天，隨后在常氧中培養(yǎng)6天或不培養(yǎng)6天。在所有圖中，用或不用LPA(100μΜ)培養(yǎng)細(xì)胞。[0024]圖4-LPA影響被封裝在血纖蛋白凝膠中并且在低氧和去血清條件下培養(yǎng)的⑶34+細(xì)胞的細(xì)胞存活。（A.1)在具有或不具有LPAdOOyM)的無血清培養(yǎng)基中于低氧中培養(yǎng)細(xì)胞1天。（A.2)在具有或不具有LPAdOOyM)的無血清培養(yǎng)基中于低氧中培養(yǎng)細(xì)胞3天。在所有圖中，結(jié)果為平均值土SEM(n=3-6)。在所有圖中，*表示統(tǒng)計(jì)顯著性：*P〈0.05,#P〈0.01，#*P〈0.001。[0025]圖5-LPA主要通過過氧化物酶體增殖物激活物受體（PPAR)誘導(dǎo)⑶34+細(xì)胞存活。將細(xì)胞在具有LPA的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在于低氧和包含LPA(100μM)的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)之前，利用Rho激酶抑制劑（Υ-2762,50μΜ)、分裂原活化蛋白激酶（ΜΑΡΚ)抑制劑（PD98059,60μM)、LPA1-和LPA3-特異性抑制劑（Kil6425,10μΜ)或過氧化物酶體增殖物激活受體g(PPARg)抑制劑（GW9662,50μΜ)預(yù)處理細(xì)胞1小時(shí)。將無任何預(yù)處理并且在具有或不具有LPA的無血清培養(yǎng)基中于低氧中培養(yǎng)24h的細(xì)胞分別用作陽性和陰性對照。結(jié)果為平均值土SEM(n=3-6)。*表示統(tǒng)計(jì)顯著性：*P〈0.05,#P〈0.01，*#P〈0.001。[0026]圖6-LPA-處理的⑶34+細(xì)胞在心肌梗塞后保護(hù)心臟功能。通過冠狀動(dòng)脈左前降支（LAD)的永久性結(jié)扎誘發(fā)心肌梗塞。（A)具有（假處理組（sham)、凝膠+⑶34+細(xì)胞、凝膠+LPA-處理的CD34+細(xì)胞）或不具有LAD結(jié)扎（正常）的動(dòng)物的心臟縮短分?jǐn)?shù)。在LPA-處理的⑶34細(xì)胞中，在移植前l(fā)h利用100μΜ的LPA處理細(xì)胞。將細(xì)胞（lxlO6個(gè)細(xì)胞）于血纖蛋白凝膠前體溶液（100mL)中遞送入裸大鼠的梗塞的心臟。（B)針對第1周標(biāo)準(zhǔn)化的第3周的心臟縮短分?jǐn)?shù)。在所有圖中，結(jié)果為平均值土SEM(η=6-10)。*表示統(tǒng)計(jì)顯著性：*Ρ〈0.05,#Ρ〈0.01，*#Ρ〈0.001。[0027]發(fā)明詳述[0028]在本公開內(nèi)容中，顯示了造血干細(xì)胞，即在低氧和去血清條件下培養(yǎng)的利用溶血磷脂酸（LPA)處理的CD34+細(xì)胞，令人驚訝地使它們的存活相對于未處理的細(xì)胞加倍。優(yōu)選，細(xì)胞增殖并且相較于對照分泌高水平的細(xì)胞因子例如IL-4、IL-8和TNF-α。結(jié)果顯示CD34+細(xì)胞存活主要通過過氧化物酶體增殖物激活物受體介導(dǎo)。最后，本公開內(nèi)容顯示LPA處理的細(xì)胞在心肌梗塞后保護(hù)心臟功能但未處理的細(xì)胞不保護(hù)。[0029]本發(fā)明使得造血干細(xì)胞（即CD34+細(xì)胞）的存活、（在數(shù)量和量級上）細(xì)胞增殖和對組織再生的治療作用能夠令人驚訝地增強(qiáng)，并且維持溶血磷脂酸的作用。[0030]在低氧和去血清條件下意外地觀察到該作用，并且還令人驚訝地觀察到干細(xì)胞，具體地⑶34+細(xì)胞表達(dá)LPAR(LPA-受體），并且上文所列的作用可通過用溶血磷脂酸（LPA)處理⑶34+來實(shí)現(xiàn)。[0031]實(shí)施方案[0032]從UCB分離CD34+細(xì)胞。在實(shí)施方案中，從依照葡萄牙法律簽訂知情同意書的供體采集所有人臍帶血（UCB)。采集被MaternidadeDanieldeMatos的倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。樣品被貯存在裝有35mL檸檬酸鹽-磷酸鹽-葡萄糖抗凝劑溶液的無菌袋中。從在Ficoll(優(yōu)選地，Histopaque_1077HybriMax;優(yōu)選地，Sigma-Aldrich，St.Louis，USA)密度梯度分離后獲自UCB樣品的單核細(xì)胞分離⑶34+細(xì)胞。按照制造商的推薦，使用mini-MACS免疫磁化分離系統(tǒng)（優(yōu)選地，MiltenyiBiotec,BergischGladbach,Germany,http://www.miltenyibiotec.com)陽性選擇（2次）0)34+細(xì)胞。將⑶34+細(xì)胞立即用于細(xì)胞封裝研究或體內(nèi)實(shí)驗(yàn)而無需進(jìn)一步處理。分離的細(xì)胞對于⑶34抗原的純度高于95%，如通過FACS確認(rèn)的。這些細(xì)胞是CD34+CD45+CD31+KDR-vWF-CD14-(Pedroso，D.C.，等人，Improvedsurvival,vasculardifferentiationandwoundhealingpotentialofstemcellsco-culturedwithendothelialcells.PLoSOne,2011.6(1):p.el6114)〇[0033]細(xì)胞處理。在實(shí)施方案中，將UCB⑶34+細(xì)胞（IX106個(gè)細(xì)胞/mL)在藥理學(xué)藥物存在或不存在的情況下在低氧室（〇.5%的02和5%的C02)中于X-Vivo培養(yǎng)基（Lonza)中溫育24h，以分別通過膜聯(lián)蛋白V和PI的表達(dá)的FACS分析進(jìn)一步評估細(xì)胞存活/凋亡和壞死。優(yōu)選地，在進(jìn)行低氧培養(yǎng)前用各自藥物預(yù)處理細(xì)胞1小時(shí)，在低氧培養(yǎng)過程中維持處理。[0034]免疫染色。在實(shí)施方案中，用4%(v/v)多聚甲醛（優(yōu)選地，EMS，Hatfield,USA)在室溫固定細(xì)胞15-20分鐘。在用1%(w/v)牛血清白蛋白（BSA)溶液（優(yōu)選，Sigma-Aldrich)封閉30分鐘后，用抗人單克隆抗體PPARY和CD34對細(xì)胞染色lh。在每一個(gè)免疫熒光實(shí)驗(yàn)中，使用同種型匹配的IgG對照。利用抗小鼠IgGCy3綴合物（優(yōu)選地，Sigma-Aldrich)檢測一抗對特定細(xì)胞的結(jié)合。利用4'，6_二脒基-2-苯基吲哚（優(yōu)選地，DAPI;Sigma-Aldrich)對細(xì)胞的核進(jìn)行染色。在間接標(biāo)記后，優(yōu)選用Zeiss突光顯微鏡檢查細(xì)胞。[0035]流式細(xì)胞術(shù)。在實(shí)施方案中，在FACSCalibur細(xì)胞計(jì)數(shù)器（優(yōu)選地，BectonDickinson)上進(jìn)行祖細(xì)胞和干細(xì)胞分型的多色分析。用APC或太平洋藍(lán)抗人⑶45(優(yōu)選地，e-Bioscience)、FITC抗小鼠CD45(優(yōu)選地，-Bioscience)、PeCy7抗人CD33(優(yōu)選地，BDBioscience)、PE抗人CDllb(優(yōu)選地，BDBioscience)、FITC抗人CD19(優(yōu)選地，BDBioscience)、PeCy7抗人CD3(優(yōu)選地，BDBioscience)、PE抗人GlycophorinA(優(yōu)選地，BDBioscience)、FITC抗人CD41(優(yōu)選地，e-bioscience)和PeCy7抗人CD56(優(yōu)選地，BDBioscience)對細(xì)胞染色lh，用染色培養(yǎng)基進(jìn)行洗滌，隨后進(jìn)行分析。[0036]血纖蛋白凝膠的制備。在實(shí)施方案中，通過在凝血酶存在的情況下交聯(lián)血纖蛋白原（兩者都來自Sigma-Aldrich)形成血纖蛋白凝膠。通過將人血纖蛋白原溶解于Tris緩沖鹽溶液（TBS)(優(yōu)選地，Sigma-Aldrich)，pH7.4(20mg/mL)中，隨后通過經(jīng)過0.22μm注射器式濾器（Acrodisc，Pall，NY，USA)的過濾進(jìn)行滅菌來制備血纖蛋白原溶液。通過將人凝血酶以50U/mL的濃度溶解于pH7.4的TBS來制備新鮮凝血酶溶液。通過將3種不同的組分：血纖蛋白原（10mg/mL)、CaCl2(優(yōu)選地，Merck,NJ，USA)(2.5μM)和凝血酶（0·2U/mL)混合來制備血纖蛋白凝膠（200μL，除非另有所述）。使該溶液在37°C和100%相對濕度膠化。[0037]血纖蛋白凝膠的降解。在實(shí)施方案中，通過將AlexaFluor?488人血纖蛋白原綴合物（優(yōu)選地，Invitrogen)(0.156mg)與未標(biāo)記血纖蛋白原（9.844mg)在lmL的TBS中混合來制備凝膠前體溶液。通過它們的熒光的減少來間接評估隨時(shí)間過去具有或不具有細(xì)胞的血纖蛋白凝膠的降解速率。在〇時(shí)間點(diǎn)和期望的時(shí)間點(diǎn)上立即測量它們的熒光。通過在37°C利用200μL的TBS中的人纖溶酶（優(yōu)選地，Sigma-Aldrich)(0·006U/凝膠）溶液溫育過夜來誘導(dǎo)凝膠的完全降解。離心后，在SPECTRAmaxGeminiEM熒光微量板讀數(shù)器（優(yōu)選地,MolecularDevices,Sunnyvale,CA,USA,www.moleculardevices.com)中于520nm測量上清液級分的熒光。[0038]細(xì)胞因子分泌分析。在實(shí)施方案中，按照制造商的說明書，在Bio-Plex200系統(tǒng)(Bio-Rad,www.bio-rad.com)中，使用Bio-PlexProHumanCytokine17-PlexPanel測定（優(yōu)選地，Bio-Rad,Hercules,CA，USA)評價(jià)細(xì)胞培養(yǎng)上清液的細(xì)胞因子的存在和濃度。人組I17-PlexPanel由下列分析物組成：白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8;IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-17、粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF)、粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)、干擾素-γ(IFN-γ)、單核細(xì)胞趨化蛋白（單核細(xì)胞趨化活化因子[MCP-l(MCAF)]、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-β(MIP-Ιβ)和腫瘤壞死因子-a(TNF-α)。收集上清液培養(yǎng)基樣品，離心以除去沉淀，隨后冷凍。使用〇.2至3,200pg/mL的標(biāo)準(zhǔn)范圍。將樣品和對照以一式三份運(yùn)行，將標(biāo)準(zhǔn)和空白對照以一式兩份運(yùn)行。[0039]定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR)分析。在實(shí)施方案中，按照制造商的說明書，使用RNeasyMini試劑盒（優(yōu)選地，Qiagen,Valencia,USA)提取細(xì)胞的總RNA。首先離心細(xì)胞，將其在Trizol中勻化。在所有情況下，使用Taqman逆轉(zhuǎn)錄試劑（優(yōu)選地，AppliedBiosystems,FosterCity,USA)從1μg總RNA制備cDNA。使用PowerSYBRGreenPCRMasterMix(優(yōu)選地，AppliedBiosystems)進(jìn)行定量PCR(qPCR)，在7500FastReal-TimePCR系統(tǒng)（優(yōu)選地，AppliedBiosystems,www.appliedbiosystems.com)中進(jìn)行檢測。相對于參照（人或小鼠，取決于分析的細(xì)胞類型）GAPDH基因進(jìn)行靶基因的定量：相對表達(dá)=2[_(Ct樣品-CtGADPH)]。從4個(gè)獨(dú)立反應(yīng)計(jì)算平均最小循環(huán)閾值（Ct)。將引物序列公布為支持信息（表S1)。[0040]心肌梗塞動(dòng)物模型。在實(shí)施方案中，用氯胺酮（75mg/kg，IP)和右美托咪啶(0.375mg/kg，IP)麻醉裸大鼠。提供利用平衡氧中2-3%的異氟醚的麻醉。用聚維酮碘擦洗腹部和前胸，隨后用70%乙醇擦拭（進(jìn)行數(shù)輪聚維酮碘擦洗、隨后進(jìn)行乙醇漂洗和施用聚維酮碘溶液的循環(huán)）。通過在動(dòng)物的背部輕輕地在軟毛巾上展開下的橫向剖腹術(shù)（隔肌切口）或側(cè)向地通過肋間隙4-5抵達(dá)心臟。利用高壓滅菌器對儀器進(jìn)行消毒。產(chǎn)生小的隔肌切口以產(chǎn)生心包開窗。利用11-0解剖刀在心包中產(chǎn)生5_切口。通過在動(dòng)脈起端下2-3mm用6-OProline縫線永久性結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支來誘發(fā)心肌梗塞。左心室的蒼白和局部室壁運(yùn)動(dòng)異常確認(rèn)阻塞。讓心包打開，或取出心包以避免填塞。在縫合胸膜腔后，利用18-規(guī)格的消毒針和3-ml注射器抽空胸膜腔。用Vicryl4-0縫合腹壁和皮下組織，隨后用Vicryl4-0進(jìn)行表皮下縫合。給動(dòng)物拔管，隨后讓其恢復(fù)。在手術(shù)過程中維持每一只動(dòng)物，讓其在溫暖的墊子下恢復(fù)直至蘇醒和能夠走動(dòng)。在從該過程恢復(fù)后2天，動(dòng)物在氯胺酮/咪達(dá)唑侖麻醉下經(jīng)歷超聲心動(dòng)圖評估。將滿足超聲心動(dòng)圖納入標(biāo)準(zhǔn)（低于50%的縮短分?jǐn)?shù)）的動(dòng)物分層至4組之一。隨后將大鼠經(jīng)歷第二胸廓切開術(shù)，隨后使用漢密爾頓氏注射器（優(yōu)選地HamiltonCompany)和30-規(guī)格的針直接注射100μL治療劑。在第二天中，通過超聲心動(dòng)描記術(shù)監(jiān)控動(dòng)物。在植入后2周，再次通過超聲心動(dòng)描記術(shù)分析存活的大鼠。在第3周，通過無痛致死術(shù)處死動(dòng)物。收集心臟和各種器官，將其在甲基Carnoy溶液中固定，處理，以進(jìn)行組織學(xué)分析。[0041]LPA在低氧和去血清條件下誘導(dǎo)⑶34+細(xì)胞存活[0042]在優(yōu)選實(shí)施方案中，為了鑒定在低氧和去血清條件下促進(jìn)CD34+細(xì)胞存活的分子，我們開發(fā)了使用懸浮于X;ivo培養(yǎng)基（用于臨床試驗(yàn)（Schachinger,V.，等人,Intracoronarybonemarrow-derivedprogenitorcellsinacutemyocardialinfarction.NEnglJMed,2006.355(12):p.1210-21))中并在0.5%02,37°C下于低氧室中溫育24h的人臍帶血來源的⑶34+細(xì)胞（2X105個(gè)細(xì)胞/96孔板的孔）的測定。一些選擇的藥物已被FDA批準(zhǔn)用于治療心血管疾?。ɡ鏝ebivololLombardo，R.M.，等人,Effectsofnebivololversuscarvedilolonleftventricularfunctioninpatientswithchronicheartfailureandreducedleftventricularsystolicfunction.AmJCardiovascDrugs,2006.6(4):p.259-63；IbersatanMassie,B.M.,等人，Irbesartaninpatientswithheartfailureandpreservedejectionfraction.NEnglJMed,2008.359(23):p.2456-67)，其它選擇的藥物正就改善具有心力衰竭的患者/模型的心臟功能在臨床前/臨床測定中接受評價(jià)（例如IN01001(Szabo，G.，等A,IN0-1001anovelpoly(ADP-ribose)polymerase(PARP)inhibitorimprovescardiacandpulmonaryfunctionaftercrystalloidcardioplegiaandextracorporalcirculation.Shock,2004.21(5):p.426-32);紅細(xì)胞生成素（Belonje,A.M·,等A,Effectsoferythropoietinafteranacutemyocardialinfarction:rationaleandstudydesignofaprospective,randomized,clinicaltrial(HEBEIII)〇AmHeartJ,2008.155(5):p.817-22);裡黑激素（Chen,Z·,等人，Protectiveeffectofmelatoninonmyocardialinfarction.AmJPhysiolHeartCircPhysiol,2003.284(5):p.H1618-24);VX_702(Ma，X.L·，等人，Inhibitionofp38mitogen_activatedproteinkinasedecreasescardiomyocyteapoptosisandimprovescardiacfunctionaftermyocardialischemiaandreperfusion.Circulation,1999.99(13):p.1685-91)),其它選擇的藥物是在人體中發(fā)現(xiàn)的天然物質(zhì)（LPA)。使用膜聯(lián)蛋白V/普羅匹定碘化物（PI)染色，通過流式細(xì)胞術(shù)評價(jià)細(xì)胞活力。膜聯(lián)蛋白V是具有針對磷脂酰絲氨酸的特異性的磷脂結(jié)合蛋白，其為至細(xì)胞凋亡狀態(tài)的細(xì)胞轉(zhuǎn)變的最早標(biāo)志物之一。該磷脂被從質(zhì)膜的內(nèi)葉轉(zhuǎn)移至外葉（Koopman，G·，等人，AnnexinVforflowcytometricdetectionofphosphatidylserineexpressiononBcellsundergoingapoptosis.Blood，1994.84(5):p.1415-20.)。PI進(jìn)入壞死細(xì)胞并結(jié)合雙鏈核酸，但被從具有正常完整性的細(xì)胞排除[20]。根據(jù)圖1，未處理的⑶34+細(xì)胞顯示極差的存活，僅?31%的存活細(xì)胞，?31%的凋亡細(xì)胞（膜聯(lián)蛋白V+/PI-)，大部分細(xì)胞?39%處于壞死階段（PI+)。在10種測試的藥物中，LPA、前列腺素E2(PGE2)和紅細(xì)胞生成素顯著（P〈0.001)增加細(xì)胞存活。LPA(10μM)是具有最高促存活作用的（?69%的活細(xì)胞）的藥物，從而對其進(jìn)行進(jìn)一步研究（圖1和2Α)。令人驚訝地，LPA通過逆轉(zhuǎn)（特別地在低氧和去血清條件下）⑶34+細(xì)胞的壞死和凋亡增加細(xì)胞存活。[0043]LPA的促存活作用是濃度依賴性的（從1至100μΜ)，在1μΜ的LPA上⑶34+細(xì)胞的存活相較于對照（未處理的細(xì)胞）已經(jīng)在統(tǒng)計(jì)上是顯著的（Ρ〈〇·001，η=6)(圖2Β)。重要地，在利用1μMLPA處理并且在低氧條件下培養(yǎng)的⑶34+中活細(xì)胞的百分比與在常氧條件下培養(yǎng)的未處理的細(xì)胞相似。LPA的促存活作用按低氧時(shí)間的函數(shù)減小（圖2C)。在LPA處理的⑶34+細(xì)胞中活細(xì)胞的百分比從第1天的78%下降至第3天的40%。綜上所述，獲得的結(jié)果令人驚訝地表明LPA是CD34+細(xì)胞的促存活分子并且其作用是時(shí)間和濃度依賴性的。[0044]LPA誘導(dǎo)細(xì)胞增殖而無需早期多能祖細(xì)胞的擴(kuò)增[0045]LPA對于靜止細(xì)胞是高度促有絲分裂的[21]。LPA的促有絲分裂作用牽涉百日咳毒素不敏感性G蛋白的激活和隨后的Ca2+動(dòng)員以及蛋白激酶C的刺激，花生四烯酸以GTP依賴性方式的釋放，和介導(dǎo)腺苷酸環(huán)化酶的抑制的百日咳毒素敏感性Gi蛋白的激活（vanCorven，E.J·，等人，Lysophosphatidate-inducedcellproliferation:identificationanddissectionofsignalingpathwaysmediatedbyGproteins.Cell,1989.59(1):p.45-54)。為了確定LPA是否可誘導(dǎo)CD34+細(xì)胞的增殖，將未處理的或LPA處理的細(xì)胞的懸浮液（2X105個(gè)細(xì)胞于200μL的X-vivo培養(yǎng)基中）暴露于低氧24h，隨后在常氧條件下培養(yǎng)另外6天。LPA處理的細(xì)胞在7天的時(shí)間中使其數(shù)目增加約3倍，然而未處理的細(xì)胞減少至它們初始數(shù)目的一半（圖3A)。[0046]為了檢查LPA在⑶34+細(xì)胞自我更新/分化中的作用，將未處理的和LPA處理的CD34+細(xì)胞在低氧條件下于X-vivo培養(yǎng)基中培養(yǎng)1天，隨后于常氧中培養(yǎng)6天或不進(jìn)行所述常氧培養(yǎng)，最后通過FACS進(jìn)行表征。在1天的低氧后，未處理的或LPA處理的⑶34+細(xì)胞都開始分化成肥大細(xì)胞（14至17%)和嗜中性粒細(xì)胞（5至8%)(圖3B)。僅78%和72%的未處理的或LPA處理的⑶34+細(xì)胞表達(dá)⑶34標(biāo)志物。⑶34表達(dá)在已暴露于低氧的細(xì)胞中比常氧條件中的細(xì)胞更高，因?yàn)閮H6%的在常氧條件下培養(yǎng)24h的細(xì)胞表達(dá)CD34標(biāo)志物。在低氧中培養(yǎng)1天，隨后在常氧中培養(yǎng)6天的細(xì)胞進(jìn)一步分化成數(shù)個(gè)細(xì)胞譜系，包括樹突細(xì)胞（DC)、嗜堿性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞。對于未處理的和LPA處理的細(xì)胞觀察到相似的分化特征譜。[0047]LPA在于血纖蛋白凝膠中封裝的且在低氧和去血清條件下培養(yǎng)的細(xì)胞中誘導(dǎo)⑶34+細(xì)胞存活[0048]可注射支架是非常有前景的遞送干細(xì)胞以用于再生醫(yī)學(xué)的媒介物，因?yàn)樗鼈優(yōu)榧?xì)胞存活和增殖提供了有利的結(jié)構(gòu)支持（Pedroso,D.C.，等人，Improvedsurvival，vasculardifferentiationandwoundhealingpotentialofstemcellsco-culturedwithendothelialcells.PLoSOne,2011.6(1):p.el6114；Kraehenbuehl,T.P.,R.Langer和LS.Ferreira，Three-dimensionalbiomaterialsforthestudyofhumanpluripotentstemcells.NatMethods，2011.8(9):p.731-6;Nakamuta，J.S·，等人，Celltherapyattenuatescardiacdysfunctionpostmyocardialinfarction:effectoftiming,routesofinjectionandafibrinscaffold.PLoSOne,2009.4(6):p.e6005.)。幾個(gè)研究已顯示通過支架移植入心臟裝置的細(xì)胞增加細(xì)胞存活，誘導(dǎo)血管生成以及在梗塞后保護(hù)心臟功能（Nakamuta，J.S.，等人，Celltherapyattenuatescardiacdysfunctionpostmyocardialinfarction:effectoftiming,routesofinjectionandafibrinscaffold.PLoS0ne，2009.4(6):p.e6005;Christman，K.L·，等人，F(xiàn)ibringluealoneandskeletalmyoblastsinafibrinscaffoldpreservecardiacfunctionaftermyocardialinfarction.TissueEng,2004.10(3-4):p.403-9；Kraehenbuehl,T.P.，等人，Humanembryonicstemcell-derivedmicrovasculargraftsforcardiactissuepreservationaftermyocardialinfarction.Biomaterials,2011.32(4):p.1102-9;Kutschka，I.，等人，Collagenmatricesenhancesurvivaloftransplantedcardiomyoblastsandcontributetofunctionalimprovementofischemicrathearts.Circulation，2006.114(lSuppl):ρ·1167-73)。最近，我們顯示CD34+細(xì)胞對血纖蛋白凝膠相較于對聚苯乙烯皿、膠原和纖連蛋白具有更大的初始附著力（Pedroso,D.C.，等人，Improvedsurvival,vasculardifferentiationandwoundhealingpotentialofstemcellsc〇-culturedwithendothelialcells.PLoSOne，201L6(1):p.el6114)〇此外，顯示了血纖蛋白凝膠支持CD34+細(xì)胞存活至少10天，并且凝膠抗金屬蛋白酶的降角軍(Pedroso,D.C.,等人，Improvedsurvival,vasculardifferentiationandwoundhealingpotentialofstemcellsco-culturedwithendothelialcells.PLoSOne，2011.6(1):p.el6114)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，為了檢查血纖蛋白凝膠是否支持⑶34+細(xì)胞在低氧和去血清條件下的存活，將未處理的或LPA處理的細(xì)胞（2X105個(gè)）封裝在血纖蛋白凝膠（200μL)中，并在0.5%02,37°C于低氧室中溫育1和3天。使用膜聯(lián)蛋白V/普羅匹定碘化物（PI)染色，通過流式細(xì)胞術(shù)評價(jià)細(xì)胞活力。未處理的CD34+細(xì)胞在血纖蛋白凝膠具有差的存活（23.2±2.8%的活細(xì)胞，η=3,第1天；12.6±1.2%的活細(xì)胞，η=5，第3天），這顯示了單獨(dú)的基質(zhì)不具有任何促存活作用（圖4)。相反地，封裝于血纖蛋白凝膠中的LPA處理的CD34+細(xì)胞顯示可與在未封裝于血纖蛋白凝膠中的LPA處理的細(xì)胞中觀察到的值相當(dāng)?shù)母叽婊睿ǖ?天：69.0±0.7%對76.7±1.5%，分別地對于封裝的和未封裝的；第3天：51.1±0.8%對37.2±6.6%，分別地對于封裝的和未封裝的）。[0049]LPA主要通過過氧化物酶體增殖物激活物受體（PPAR)誘導(dǎo)⑶34+細(xì)胞存活[0050]LPA的生物作用是多樣的，包括發(fā)育、生理和病理生理作用（Lin，Μ.E.，D.R.Heir和J.Chun，Lysophosphatidicacid(LPA)receptors:signalingpropertiesanddiseaserelevance.ProstaglandinsOtherLipidMediat，2010.91(3-4):p.130-8)。迄今為止已鑒定了達(dá)到5種LPA受體（LPAR):LPA1_LPA5(Choi，J.W.，等人，LPAreceptors:subtypesandbiologicalactions.AnnuRevPharmacolToxicol，2010.50:p.157-86)〇受體為G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR)并且可在多個(gè)組織中發(fā)現(xiàn)它們的存在。LPA1、LPA2和LPA3廣泛地在大多數(shù)組織中表達(dá)（Ishii,I.，等人，F(xiàn)unctionalcomparisonsofthelysophosphatidicacidreceptors,LP(Al)/VZG-l/EDG-2,LP(A2)/EDG-4,andLP(A3)/EDG-7inneuronalcelllinesusingaretrovirusexpressionsystem.MolPharmacol,2000.58(5):p.895-902)。LP4在特定器官例如胰腺、卵巢和胸腺中表達(dá)（Lee,C.W.,等人，LPA(4)/GPR23isalysophosphatidicacid(LPA)receptorutilizingG(s)-,G(q)/G(i)-mediatedcalciumsignalingandG(12/13)-mediatedRhoactivation.JBiolChem,2007·282(7):ρ·4310-7)。LPA5以低水平在多個(gè)組織中表達(dá)（Lee,C.W·，等人，GPR92asanewG12/13_andGq-coupledlysophosphatidicacidreceptorthatincreasescAMP,LPA5.JBiolChem,2006.281(33):p.23589-97)〇為了鑒定介導(dǎo)LPA(100μM)的促存活作用的受體，使用LPA1-和LPA3-特異性拮抗劑Kil6425(10μM)和過氧化物酶體增殖物激活物受體γ(PPARγ)的拮抗劑GW9662(50μM)。研究表明LPA對后一種受體具有高親和力（McIntyre,Τ·Μ.，等人，Identificationofanintracellularreceptorforlysophosphatidicacid(LPA):LPAisatranscellularPPARgammaagonist.ProcNatlAcadSciUSA,2003.100(1):p.131-6；Gustin,C.,M.VanSteenbrugge和M.Raes,LPAmodulatesmonocytemigrationdirectlyandviaLPA-stimulatedendothelialcells.AmJPhysiolCellPhysiol,2008.295(4):p.C905-14)。該方法通過使用Υ-2762(50μΜ)和Η)98059(60μΜ)拮抗劑分別抑制受體的下游靶包括Rho激酶和分裂原活化蛋白激酶（ΜΑΡΚ)來補(bǔ)充。已知所有LPAR偶聯(lián)G蛋白并激活其，這進(jìn)而激活MAPK(LPA1、LPA2、LPA3和LPA4)和Rho激酶（LPA1、LPA2、LPA4和LPA5)(Choi,J.W.,等人，LPAreceptors:subtypesandbiologicalactions.AnnuRevPharmacolToxicol,2010.50:p.157-86)。將細(xì)胞在包含特定拮抗劑的X-Vivo培養(yǎng)基中處理lh，隨后在低氧條件下培養(yǎng)24h。在膜聯(lián)蛋白V/PI染色后，通過FACS分析評估細(xì)胞存活。結(jié)果表明在測試條件下，PPARY主要介導(dǎo)LPA的促存活作用（圖5B)。PPARY的拮抗劑顯著減少（P〈〇.〇〇1，η=11)LPA誘導(dǎo)的活細(xì)胞的數(shù)目，從?77%降至?53%;然而，其沒有完全阻斷LPA的促存活作用，因?yàn)闊oLPA的細(xì)胞具有39%的存活率（Ρ〈0.01)。Kil6425對LPA1和LPA3的抑制在CD34+細(xì)胞的存活中具有相對小的作用（圖5B)?；罴?xì)胞的數(shù)目從77%(+LPA)降至67%(P〈0.01，n=19)。重要地，MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制以比Rho激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制更高的水平抑制LPA的促存活作用。因?yàn)閮蓚€(gè)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是不同LPAR的下游靶（參見上文），這可能表明LPAR在⑶34+細(xì)胞的存活中的不同貢獻(xiàn)。綜上所述，數(shù)據(jù)顯示LPA能夠主要通過PPARY的激活在低氧和去血清條件下促進(jìn)⑶34+細(xì)胞存活。[0051]LPA調(diào)節(jié)⑶34+細(xì)胞的細(xì)胞因子釋放[0052]為了測定LPA在CD34+細(xì)胞釋放信號轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞因子和生長因子中的作用，使用細(xì)胞因子珠粒陣列。將細(xì)胞在LPA(100μM)存在或不存在的情況下，在常氧或低氧條件下于無血清培養(yǎng)基X-Vivo中溫育24h。常氧中未處理的⑶34+細(xì)胞表達(dá)高水平（>100pg/mL)的IL-8和MIP-lb，中等水平（100至lpg/mL)的IL-6、TNF-α和GM-CSF，以及低水平（〈lpg/mL)的IL-1β、IL-4和IL-17(圖5C)。低氧和去血清條件下培養(yǎng)的CD34+細(xì)胞比在常氧條件下表達(dá)顯著更高的水平的IL-1β(?8倍）、IL-4(?2倍）、IL-6(?1.2倍）、IL-8(?10倍）、IL-17(?4倍）和GM-CSF(?2倍）。有趣地，在低氧和去血清條件下但在LPA存在的情況下培養(yǎng)的CD34+細(xì)胞相較于在相同條件下但在LPA不存在的情況下培養(yǎng)的細(xì)胞增加IL-4(從?0·9至?2.7pg/mL)、IL-8(從?10,000至?17,OOOpg/mL)和TNF-α(從?3至?15pg/mL)的分泌，和減少IL-1β(從?9至?2pg/mL)、IL-6(從?4至?2pg/mL)和GM-CSF(從?4至?lpg/mL)的分泌。[0053]LPA處理的⑶34+細(xì)胞在心肌梗塞后保護(hù)心臟功能[0054]已顯示梗塞后人⑶34+細(xì)胞在心臟中的移植改善了左心室射血分?jǐn)?shù)并且保護(hù)心臟組織。為了評價(jià)LPA處理的⑶34+細(xì)胞的治療潛能，將利用LPA(100μM)處理的細(xì)胞(1Χ106個(gè)細(xì)胞）于血纖蛋白凝膠前體溶液（ιοομυ中遞送至裸大鼠的梗塞的心臟。通過冠狀動(dòng)脈左前降支（LAD)的永久性結(jié)扎誘發(fā)心肌梗塞。將無任何處理的（假處理組）或利用懸浮于血纖蛋白凝膠前體溶液中的⑶34+細(xì)胞處理的梗塞的心臟用作對照。植入后2周，通過超聲心動(dòng)描記術(shù)評價(jià)心臟的功能性質(zhì)。對照大鼠的左心室在第1天和第2周分別具有42.7±1.6(η=10)和41.6±3.8(η=10)的平均縮短分?jǐn)?shù)；利用封裝在血纖蛋白凝膠前體溶液中的CD34+細(xì)胞處理的大鼠在第1天和第2周分別具有36.7±3.4(η=6)和44.5±3.0(η=6)的平均縮短分?jǐn)?shù)；最后利用LPA處理的并且封裝在血纖蛋白凝膠前體溶液中的⑶34+細(xì)胞處理的大鼠在第1天和第2周分別具有37.5±1.2(η=6)和47.0±2.0(η=6)的平均縮短分?jǐn)?shù)（圖6Α)。因?yàn)槌跏伎s短分?jǐn)?shù)在實(shí)驗(yàn)組間是不同的，因此使用第2周和第1天的縮短分?jǐn)?shù)之差來比較處理的治療功效（圖6Β)。在LPA處理的細(xì)胞+凝膠組和假處理組中縮短分?jǐn)?shù)的差異的中位數(shù)分別為7.5和2.6,差異在統(tǒng)計(jì)上是顯著的（Ρ〈0.05)。在利用⑶34+細(xì)胞與假處理處理的心臟之間未觀察到統(tǒng)計(jì)差異（Ρ>0.05)。綜上所述，LPA處理的⑶34+細(xì)胞至梗塞的心臟內(nèi)的遞送改善了心臟縮短分?jǐn)?shù)，并且作用優(yōu)于未處理的⑶34+細(xì)胞。[0055]本發(fā)明當(dāng)然絕不以任何方式限定于上述實(shí)施方案，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將預(yù)見其修飾的許多可能性而不背離所附權(quán)利要求中定義的本發(fā)明的基本概念。[0056]下列權(quán)利要求顯示了本發(fā)明的特定實(shí)施方案?！緳?quán)利要求】1.一種通過在包含溶血磷脂酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)造血干細(xì)胞來增強(qiáng)造血干細(xì)胞在低氧和去血清條件下的存活的方法。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述造血干細(xì)胞為⑶34+細(xì)胞。3.權(quán)利要求2的方法，所述造血干細(xì)胞為從臍帶血或外周血分離的⑶34+。4.前述權(quán)利要求的方法，其中所述溶血磷脂酸的濃度在1至1000μΜ之間變化。5.前述權(quán)利要求的方法，其中所述溶血磷脂酸的濃度為100μΜ。6.-種包含造血干細(xì)胞和溶血磷脂酸的組合物。7.權(quán)利要求6的組合物，其中所述造血干細(xì)胞為⑶34+細(xì)胞。8.權(quán)利要求7的組合物，其中所述造血干細(xì)胞為從臍帶血或外周血分離的⑶34+。9.權(quán)利要求6-8的任一項(xiàng)的組合物，其中所述溶血磷脂酸的濃度在1至1000μΜ之間變化。10.權(quán)利要求9的組合物，其中所述溶血磷脂酸的濃度為100μΜ。11.權(quán)利要求6-10的任一項(xiàng)的組合物，其還包含凝膠，特別是仿生凝膠。12.權(quán)利要求6-11的任一項(xiàng)的組合物，其包含IX105-1Χ106個(gè)⑶34+細(xì)胞，和1-100μΜ的溶血磷脂酸，以及100-200mL的仿生凝膠。13.權(quán)利要求6-12的任一項(xiàng)的組合物，其中所述凝膠為下列物質(zhì)的至少一種：血纖蛋白、透明質(zhì)酸、藻酸鹽、瓊脂糖、膠原或PEG衍生物。14.權(quán)利要求6-13的任一項(xiàng)的組合物，其中所述凝膠為血纖蛋白。15.權(quán)利要求6-14的任一項(xiàng)中描述的組合物，其中所述組合物為藥物組合物、醫(yī)藥組合物或化妝品組合物。16.權(quán)利要求6-14的任一項(xiàng)的組合物，其中先前的組分以治療有效量存在。17.權(quán)利要求6-16的任一項(xiàng)中描述的組合物，其用于藥劑或化妝品。18.權(quán)利要求17的組合物，其用于細(xì)胞療法，即用于心臟組織。19.權(quán)利要求17的組合物，其用于治療心臟病。20.權(quán)利要求17的組合物，其用于治療傷口愈合。21.權(quán)利要求17的組合物，其用于治療糖尿病傷口愈合。22.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的組合物，其還包含足夠量的賦形劑。23.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物是可注射制劑。【文檔編號】A61P17/02GK104254602SQ201380021644【公開日】2014年12月31日申請日期:2013年4月24日優(yōu)先權(quán)日:2012年4月24日【發(fā)明者】L·達(dá)席爾瓦費(fèi)雷拉,I·M·費(fèi)達(dá)爾戈多斯桑托斯席爾瓦卡瓦爾霍申請人:克瑞奧埃斯塔麥諾健康與技術(shù)股份有限公司