專利名稱：利用細胞治療心臟組織的組合物和方法
利用細胞治療心臟組織的組合物和方法相關(guān)申請交叉引用本申請要求于2008年5月27日提交的國際申請PCT/US2008/064895的優(yōu)先權(quán)權(quán) 本發(fā)明涉及用于獲得和使用心臟細胞的方法和材料。例如，本發(fā)明涉及用于向哺 乳動物心臟組織提供可作為功能性心肌細胞導(dǎo)入心臟組織的細胞(例如分化心肌祖細胞 (cardioprogenitor cell)或心臟修復(fù)細胞(cardiopoietic cell))的方法和材料。
背景技術(shù)：
盡管病人處理不斷進步，心血管疾病還是世界范圍內(nèi)發(fā)病和死亡的主要因素。與 具有高度修復(fù)能力的組織相比，心臟組織容易受到無法修復(fù)的損傷。因此在臨床環(huán)境中一 直在尋求基于細胞的再生心血管藥物。最近出現(xiàn)的干細胞生物學(xué)將現(xiàn)有的實踐模式的范圍由傳統(tǒng)的緩解擴展至治愈性 修復(fù)。通常而言，臨床經(jīng)驗基于由自體來源收集并以未改變的狀態(tài)進行輸送的成體干細胞。 第一代生物制劑是天然人體干細胞，被認為是易得的細胞類型。已顯示出經(jīng)輸送天然人體 干細胞使得特定患者得以改善。

發(fā)明內(nèi)容
定義在本說明書的框架范圍內(nèi)，除非有相反指示，以下引號內(nèi)的術(shù)語的定義如下。術(shù)語‘hMSCs，指人間充質(zhì)干細胞。細胞的‘心生成潛力’是指該細胞在注入受損心臟后能成功產(chǎn)生心臟細胞例如心 肌的能力。‘心臟修復(fù)細胞’ (CP)是指處于由未分化細胞分化的途徑中的細胞。“心臟修復(fù)細 胞”表現(xiàn)出由早期心轉(zhuǎn)錄因子Nkx2. 5和晚期心轉(zhuǎn)錄因子MEF2C的核轉(zhuǎn)位所確定的心分化 (Behfar ^,Derivation ofa cardiopoietic population from human mesenchymal stem yields progeny, Nature Clinical Practice, Cardiovascular Medicine, March 2006 vol. 3 supplement l,pagesS78-S82) 能觀察到心轉(zhuǎn)錄因子GATA4的核轉(zhuǎn)位。心臟修復(fù)細 胞可缺少肌節(jié)并缺少肌節(jié)蛋白的表達。心臟修復(fù)細胞保留自身分裂的能力。因為心臟修復(fù) 細胞可以分化為心肌細胞，所以也稱為“心肌細胞前體”或“心肌細胞祖細胞”。在本文的內(nèi) 容中，心臟修復(fù)細胞可來源于人成體間充質(zhì)干細胞(hMSC)?！瓹P-hMSCs’則指那些來源于人 成體間充質(zhì)干細胞的心臟修復(fù)細胞。‘雞尾酒式混合物’或‘心源性雞尾酒式混合物’指含有至少兩種心源性物質(zhì)的組 合物。‘心源性物質(zhì)’是改善細胞的心生成潛力的物質(zhì)。
‘雞尾酒式混合物-引導(dǎo)細胞’或‘引導(dǎo)心臟修復(fù)的細胞’是已經(jīng)與雞尾酒式混合 物相接觸并進而進入分化的細胞?！只禽^少特化細胞變?yōu)楦犹鼗毎倪^程?！溲謹?shù)’意指在一次心跳中泵出的血液的分數(shù)。未限定時，術(shù)語射血分數(shù)專指 左心室的射血分數(shù)(左心室射血分數(shù)或LVEF)?！溲謹?shù)變化’指在指定時間后測量的經(jīng)注射細胞至其梗塞心臟而治療的動物 的心臟的射血分數(shù)與注射前測量的射血分數(shù)之間的差別。除非另外定義，本文中所使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù) 人員所通常理解的含義相同。雖然與本文所描述的方法和材料相似或者等價的方法和材料 也能用于實現(xiàn)本發(fā)明，但適宜的方法和材料如下所述。本文中提到的公報、專利申請、專利 和其他參考文獻均以參考的方式整體引入。在矛盾的情況下，以本發(fā)明說明書包括定義為 準。此外，所述材料、方法和實例僅是描述性的，而不具有限制性。本發(fā)明涉及包含TGF β-1、ΒΜΡ4、α-凝血酶、選自心營養(yǎng)素(Cardiotrophin)和 IL-6的化合物、以及選自Cardiogenol C和視黃酸的化合物的組合物。在優(yōu)選實施方式中， 本發(fā)明的組合物包含TGFii -1、ΒΜΡ4、α -凝血酶、心營養(yǎng)素和Cardiogenol C。本發(fā)明的組 合物可以包含選自 FGF-2、IGF-1、活化素-A (Activin-A)、TNF-α、FGF-4、LIF、VEGF-A 及其 組合的至少一種化合物。本發(fā)明的組合物還可以包含F(xiàn)GF-2、IGF-I和活化素-Α。本發(fā)明 的其他優(yōu)選組合物包含活化素_A、FGF-2、IL-6、IGF-I和視黃酸。根據(jù)替代性實施方式，本 發(fā)明的組合物可以不包括選自TNF- α、FGF-4、LIF和VEGF-A的至少一種化合物。當在本發(fā)明的組合物中存在以下化合物中的一種時，其存在量如下所述 TGF^-I以lng/ml至5ng/ml的量存在，所述BMP4以lng/ml至10ng/ml的量存在，所述心 營養(yǎng)素以0. 5ng/ml至5ng/ml的量存在，所述α -凝血酶以0. 5單位/ml至5單位/ml的 量存在，所述Cardiogenol C以50nM至500nM的量存在，所述FGF-2以lng/ml至10ng/ml 的量存在，所述IGF-I以lOng/ml至lOOng/ml的量存在，所述活化素-A以lng/ml至50ng/ ml的量存在，所述TNF- α以lng/ml至50ng/ml的量存在，所述FGF-4以lng/ml至20ng/ml 的量存在，所述IL-6以lOng/ml至lOOng/ml的量存在，所述LIF以1單位/ml至10單位 /ml的量存在，所述VEGF-A以lng/ml至50ng/ml的量存在，所述視黃酸以每ml中0. 1 μ M 至Ι.ΟμΜ的量存在。本發(fā)明的優(yōu)選組合物包含以組合方式使用的重組TGFii-I (2. 5ng/ml)、BMP4(5ng/ ml)、心營養(yǎng)素(lng/ml)、Cardiogenol C(K)Oy Μ)。本發(fā)明特別優(yōu)選的組合物包含所述化 合物，并還包含 α -凝血酶(lU/ml)、FGF-2 (10ng/ml)、IGF-I (50ng/ml)和活化素 _A(5ng/ ml) ο本發(fā)明的其他優(yōu)選組合物包含以組合方式使用的重組TGF β -1 0. 5ηg/m 1)、 BMP4(5ng/ml)、活化素 _A(5ng/ml)、FGF_2 (10ng/ml)、IL-6 (100ng/ml)、因子 IIa (h α -凝血 酶、lU/ml)、IGF-I (50ng/ml)和視黃酸(1 μ Μ)。優(yōu)選的是，本發(fā)明的組合物包含在培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基選自含有胎牛血清、人血 清、血小板裂解物及其混合物的培養(yǎng)基。本發(fā)明還涉及一種由最初的細胞獲得分化細胞的方法，所述分化細胞以提高水 平表達選自 MEF2c mRNA、MESP-ImRNA, Tbx-5mRNA, GATA4mRNA、Flk-lmRNA、GATA6mRNA、Fog-ImRNA及其組合的至少一種mRNA，和/或具有選自Nkx2. 5多肽、MEF2C多肽、Tbx-5多 肽、F0G-2多肽、GATA-4多肽、MESP-I多肽及其組合的至少一種多肽，其中所述至少一種多 肽與所述分化細胞的細胞核相關(guān)，其中所述方法包括在本發(fā)明的組合物的存在下培養(yǎng)初始 細胞。在所述方法中，所述分化細胞優(yōu)選表達提高水平的MEF2c mRNA和MESP-ImRNA。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，所述初始細胞是間充質(zhì)干細胞。這些細胞是骨髓來 源的干細胞。它們能在細胞表面表達⑶90、⑶105、⑶133、⑶166丄擬9和⑶44，并且在細胞 表面不表達CD14、CD34和CD45。最優(yōu)選的是，所述分化細胞是心臟修復(fù)細胞。本發(fā)明另一方面是將分化細胞輸送至哺乳動物的方法，其中所述方法包括(a)確定分化細胞群的細胞樣品包含這樣的細胞該細胞以提高水平表達選自 MEF2c mRNA、MESP-I mRNA,Tbx-5 mRNA、GATA4 mRNA,Flk-I mRNA、GATA6 mRNA、Fog-I mRNA 及其組合的至少一種mRNA，和/或具有選自Nkx2. 5多肽、MEF2C多肽、Tbx-5多肽、MESP-I 多肽、GATA-4多肽、F0G-2多肽及其組合的至少一種多肽，其中所述多肽與所述分化細胞的 細胞核相關(guān)，和(b)向所述哺乳動物施用來自所述分化細胞群的細胞?？梢杂稍诒景l(fā)明的任何一 種所述組合物的存在下培養(yǎng)的所述初始細胞獲得所述分化細胞群。在具體實施方式
中，所 述步驟(a)可以包括采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)或采用免疫細胞化學(xué)反應(yīng)。所述施用步驟 包括通過選自全身施用、心內(nèi)施用和冠脈內(nèi)施用的施用進行所述細胞的施用。本發(fā)明的另一個方面是向心臟組織提供心肌細胞的方法，其中所述方法包括向所 述心臟組織施用通過與本發(fā)明的組合物相接觸而得到的所述分化細胞。本發(fā)明的一個或多個實施方式的細節(jié)在附圖和以下描述中進行闡述。本發(fā)明的其 他特征、目的和優(yōu)點通過說明書和權(quán)利要求書是顯而易見的。
具體實施例方式本說明書提供了涉及心臟細胞(例如，分化心肌祖細胞)的方法和材料。例如， 本說明書提供了具有作為功能性心肌細胞導(dǎo)入心臟組織的能力的細胞，制造這種細胞的方 法，制造這種細胞的組合物，以及確定細胞群(例如分化心肌祖細胞)是否包含具有作為功 能性心肌細胞并入心臟組織的能力的細胞。本說明書還提供了向心臟組織(例如人心臟組 織)提供功能性心肌細胞的方法和材料。本文所提供的分化心肌祖細胞可來自于任何物種，包括但不限于人、猴、馬、狗、 貓、大鼠或小鼠。例如，分化心肌祖細胞可以是哺乳動物(例如人)分化心肌祖細胞。在一些情況下，本文提供的分化心肌祖細胞具有作為功能性心肌細胞并入心臟組 織的能力?？梢圆捎萌魏芜m宜的方法獲得分化心肌祖細胞。例如，分化心肌祖細胞可來源于 干細胞，諸如哺乳動物(例如，人)干細胞。在一些情況下，分化心肌祖細胞可來源于胚胎干細胞。在一些情況下，分化心肌祖 細胞可來源于間充質(zhì)干細胞。間充質(zhì)干細胞可由任何來源獲得。例如，間充質(zhì)干細胞可由 哺乳動物(例如人)組織，如骨髓和骨小梁獲得。間充質(zhì)干細胞可以體外培養(yǎng)。例如，間充 質(zhì)干細胞可以在體外增加數(shù)量。間充質(zhì)干細胞可在細胞表面表達或者不表達多肽標記物。例如，間充質(zhì)干細胞可在細胞表面表達⑶133、⑶90、⑶105、⑶166、⑶四和⑶44，并且可在 細胞表面不表達⑶14、⑶34和⑶45。可以采用任何合適的方法由干細胞(例如間充質(zhì)干細胞)得到分化心肌祖細胞。 例如，可以通過將間充質(zhì)干細胞與組合物(例如培養(yǎng)基)進行溫育從而由所述間充質(zhì)干細 胞得到分化心肌祖細胞。所述組合物可以是含有一種或多種因子的任何合適的組合物。所 述因子可以是任何類型的因子，如多肽、類固醇、荷爾蒙和小分子。這些因子的例子包括但 不限于TGF β、BMP、FGF-2、IGF-1、活化素-Α、心營養(yǎng)素、α -凝血酶和CardiogenolC。在一個實施方式中，可以采用含有TGFi3、BMP、心營養(yǎng)素、α-凝血酶和 Cardiogenol C的培養(yǎng)基由干細胞(例如間充質(zhì)干細胞)得到分化心肌祖細胞。在這些情 況下，可以在使用含有TGF β、ΒΜΡ、心營養(yǎng)素、α -凝血酶和Cardiogenol C的培養(yǎng)基進行的 最初培養(yǎng)期(例如一天或兩天)之后，在所述培養(yǎng)基中加入FGF-2、IGF-1、活化素-A或其 組合。TGF β可以是任何具有TGF β活性的多肽，諸如人TGF β。例如，TGF β可以是重 組TGFii或合成TGFii。在一個實施方式中，TGFii可以是TGFi3_l。可以使用任何適宜濃 度的TGF β。例如，可以使用lng/ml至10ng/ml的TGF-β (例如，約2. 5ng/ml的TGF β 1)。BMP可以是任何具有BMP活性的多肽，諸如人BMP。例如，BMP可以是重組BMP或 合成BMP。在一個實施方式中，BMP可以是BMP4。可以使用任何濃度的BMP。例如，可以使 用 lng/ml 至 20ng/ml 的 BMP (例如，約 5ng/ml 的 BMP4)。FGF-2可以是任何具有FGF-2活性的多肽，諸如人FGF-2。例如，F(xiàn)GF-2可以是重 組FGF-2或合成FGF-2?？梢允褂萌魏螡舛鹊腇GF-2。例如，可以使用lng/ml至20ng/ml 的 FGF-2 (例如，約 5ng/ml 的 FGF-2)。IGF-I可以是任何具有IGF-I活性的多肽，諸如人IGF-1。例如，IGF-1可以是重 組IGF-I或合成IGF-1?？梢允褂萌魏螡舛鹊腎GF-1。例如，可以使用lOng/ml至lOOng/ml 的 IGF-I (例如，約 50ng/ml 的 IGF-1)?；罨?A可以是任何具有活化素-A活性的多肽，諸如人活化素-A。例如，活化 素-A可以是重組活化素-A或合成活化素-A?？梢允褂萌魏螡舛鹊幕罨?A。例如，可以 使用lng/ml至50ng/ml的活化素-A (例如，約10ng/ml的活化素-A)。α -凝血酶可以是任何具有α -凝血酶活性的多肽，諸如人α -凝血酶。例如， α-凝血酶可以是重組α-凝血酶或合成α-凝血酶。可以使用任何濃度的α-凝血酶。 例如，可以使用0. 5單位/ml至10單位/ml的α -凝血酶(例如，約1單位/ml的α -凝 血酶)。心營養(yǎng)素可以是任何具有心營養(yǎng)素活性的多肽，諸如人心營養(yǎng)素-1。例如，心營養(yǎng) 素可以是重組心營養(yǎng)素或合成心營養(yǎng)素?？梢允褂萌魏螡舛鹊男臓I養(yǎng)素。例如，可以使用 0. 5ng/ml至10ng/ml的心營養(yǎng)素(例如，約lng/ml的心營養(yǎng)素_1)。IL-6可以是任何具有IL-6活性的多肽，諸如人IL_6。例如，IL_6可以是重組IL_6 或合成IL-6?？梢允褂萌魏螡舛鹊腎L-6。例如，可以使用100ng/ml至200ng/ml的IL-6。可以使用任何濃度的Cardiogenol C或其可藥用鹽(例如鹽酸Cardiogenol C)。 例如，可以使用 IOnM 至 IOOOnM 的 Cardiogenol C(例如，約 IOOnM 的 Cardiogenol C)。視黃酸可以是任何具有視黃酸活性分子，諸如合成視黃酸、天然視黃酸、維生素A代謝物、維生素A的天然衍生物或維生素A的合成衍生物。可以使用任何濃度的視黃酸。例 如，可以使用1 X ΙΟ— μ M至2 X 10_6 μ M的視黃酸。在一些情況下，可以使用補充有TGF^-I (例如，2. 5ng/ml)、BMP4 (例如，5ng/ml)、 FGF-2 (例如，5ng/ml)、IGF-I (例如，50ng/ml)、活化素-A (例如，10ng/ml)、心營養(yǎng)素(例 如，lng/ml)、α -凝血酶(例如，1單位/ml)和Cardiogenol C (例如，IOOnM)的含有血清 或不含有血清的培養(yǎng)基由干細胞(例如，間充質(zhì)干細胞)得到分化心肌祖細胞。在一些情 況下，所述培養(yǎng)基(例如含有血清或不含有血清的培養(yǎng)基)可含有血小板裂解物(例如，人 血小板裂解物)。在一些情況下，用以由間充質(zhì)干細胞獲得分化心肌祖細胞的組合物可含有其他可 選的因子，諸如TNF- α、LIF和VEGF-A。TNF- α可以是任何具有TNF- α活性的多肽，諸如人TNF- α。例如，TNF- α可以 是重組TNF-α或合成TNF-α。可以使用任何濃度的TNF-α。例如，可以使用5ng/ml至 50ng/ml 的 TNF- α。LIF可以是任何具有LIF活性的多肽，諸如人LIF。例如，LIF可以是重組LIF或 合成LIF0可以使用任何濃度的LIF0例如，可以使用2. 5ng/ml至100ng/ml的LIF0VEGF-A可以是任何具有VEGF-A活性的多肽，諸如人VEGF-A。例如，VEGF-A可以 是重組VEGF-A或合成VEGF-A?？梢允褂萌魏螡舛鹊腣EGF-A。例如，可以使用5ng/ml至 200ng/ml 的 VEGF-A。本文提供的組合物可含有任意組合的因子。例如，本文提供的組合物可含有 TGF β -1、ΒΜΡ4、活化素-Α、心營養(yǎng)素、α -凝血酶和CardiogenolC。在一些情況下，本文提 供的組合物可含有TGF3 -1、BMP4、FGF-2、IGF-1、心營養(yǎng)素、α -凝血酶和Cardiogenol C。 在一些情況下，本文提供的組合物可含有TGFii -1、ΒΜΡ4、FGF-2、IGF-1、心營養(yǎng)素、α -凝 血酶和Cardiogenol C。在一些情況下，本文提供的組合物可不含有TNF-α、IL_6、LIF、 VEGF-A、視黃酸或其任何組合(例如，IL-6、LIF、VEGF-A和視黃酸；LIF、VEGF-A和視黃酸； 或 TNF- α、IL-6、LIF 禾口 VEGF-A)。本文提供的組合物可以采用任何適宜的方法進行制備。例如，可以使用商售因子 制備本文提供的組合物。在一些情況下，本文提供的組合物經(jīng)制備可包含細胞裂解物(例 如血小板裂解物)或來自諸如心肌細胞或TNF-α刺激的內(nèi)胚層細胞等細胞的條件培養(yǎng)基。 例如，可以使用補充有商售因子的血小板裂解物制備本文提供的組合物。在一些情況下，可 以使用分離自條件培養(yǎng)基的因子制備本發(fā)明提供的組合物。在一些情況下，所述因子可以 溶解于培養(yǎng)基，如含有血清或者不含有血清的細胞培養(yǎng)基?？梢允褂萌魏魏线m的方法將干細胞(例如，間充質(zhì)干細胞)與本文提供的組合物 進行溫育，從而得到具有作為功能性心肌細胞并入心臟組織的能力的分化心肌祖細胞。例 如，間充質(zhì)干細胞可以與本文提供的組合物共同溫育1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45 或 50 天。在一些情況下，本文所提 供的用以與間充質(zhì)干細胞共同溫育的組合物可以每天或者每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45 或 50 天更換。在一些情況下，可以在血清存在或不存在的情況下，將間充質(zhì)干細胞與本文提供 的組合物一起溫育。當將干細胞與本文提供的組合物進行溫育時，可以采用任何適宜的細胞密度。例如，可以將約1000個至2000個間充質(zhì)干細胞/cm2 (例如，約1500個至2000個 細胞/cm2)與本文提供的組合物共同溫育，從而得到分化心肌祖細胞。一旦干細胞(例如，間充質(zhì)干細胞)已經(jīng)與本文提供的組合物一起溫育或相反地 與分化因子一起溫育，可以監(jiān)測分化狀態(tài)以確定所述干細胞是否分化為具有作為功能性心 肌細胞并入心臟組織的能力的分化心肌祖細胞。例如，可以收集細胞樣品并采用諸如蛋白 印跡、熒光激活細胞分選(FACS)、免疫染色、激光共聚焦顯微鏡和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng) (RT-PCR)技術(shù)(例如，定量RT-PCR)等技術(shù)進行評估。在一些情況下，可以選擇經(jīng)發(fā)現(xiàn)表達 提高水平的 MEF2c、MESP-I、Tbx-5、Nkx2. 5、GATA6、Flk_l、Fog 1 和！7Og 2 多肽或 mRNA 的細 胞，以施用到哺乳動物中從而治療心臟組織。如本文所述，由用含有TGF3 -1、BMP4、FGF_2、IGF-1、活化素-A、心營養(yǎng)素、α -凝 血酶和Cardiogenol C的血小板裂解物培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞產(chǎn)生的分化心肌祖細胞的 MEF2c mRNA、MESP-ImRNA、Tbx-5mRNA、GATA6 mRNA、Flk_l 或 Fogl mRNA 的水平，與處理前的 間充質(zhì)干細胞中觀察到的水平相比，表現(xiàn)出2至5倍的提高。這些分化心肌祖細胞在進行心 肌內(nèi)、皮下或血管內(nèi)注射時也表現(xiàn)出作為功能性心肌細胞并入心臟組織的能力，以及與缺 血環(huán)境和非缺血環(huán)境中結(jié)構(gòu)修復(fù)均直接相關(guān)的心泵功能改善。活體超聲心動圖和通過人類 特定蛋白染色進行的組織學(xué)尸檢均證實了功能性益處。還如本文所述，由用含有TGFii -1、 BMP4、FGF-2、IGF-1、活化素-A、心營養(yǎng)素、α -凝血酶和Cardiogenol C的血清培養(yǎng)的間充 質(zhì)干細胞所產(chǎn)生的分化心肌祖細胞的MEF2c mRNA、MESP-I mRNA、Tbx_5 mRNA的水平，與處 理前的間充質(zhì)干細胞中觀察到的水平相比，表現(xiàn)出5至10倍的提高。這些分化心肌祖細胞在進行心肌內(nèi)注射(例如，通過心內(nèi)膜或心外膜途徑)、向冠 狀動脈內(nèi)注射、灌輸?shù)叫呐K中或者全身施用(例如，皮下施用)時還表現(xiàn)出作為功能性心肌 細胞并入心臟組織的能力，以及與缺血環(huán)境和非缺血環(huán)境中結(jié)構(gòu)修復(fù)均直接相關(guān)的心泵功 能改善?；铙w心超聲和通過人類特定蛋白染色進行的組織學(xué)尸檢均證實了功能性益處。因 此，在施用至哺乳動物之前，可以采用諸如MEF2c、MESP-I、Tbx-5、GATA6、Flk-I、Fog 1、FOG 2或其組合的多肽或mRNA水平提高等釋放標準來評估細胞。關(guān)于細胞種群中MEF2c、MESP-I、Tbx-5、GATA6、Flk-I 或!7Og (例如對 mRNA 而言為 FOG 1，對多肽而言為FOG 2)的多肽或mRNA水平，在本文中使用的術(shù)語“提高水平”是指高 于該多肽或mRNA的基準水平的任何水平。關(guān)于細胞種群中MEF2c、MESP-I、Tbx-5、GATA6、Flk-I 或!7Og (例如對 mRNA 而言為 FOG 1，對肽而言為FOG 2)的多肽或mRNA水平，在本文中使用的術(shù)語“基準水平”是指通常 在處理前的細胞(例如處理前的間充質(zhì)干細胞)中發(fā)現(xiàn)的水平。例如，MEF2c mRNA基準水 平、MESP-ImRNA基準水平、Tbx-5 mRNA基準水平、GATA6 mRNA基準水平和FOGl mRNA基準 水平可以分別是在未用本文提供的組合物處理的或用分化因子處理的間充質(zhì)干細胞的隨 機取樣中存在的MEF2c、MESP-I、 3χ-5、6ΑΤΑ6、Flk-I和FOG 1 mRNA的平均水平。應(yīng)當理 解的是，在確定特定水平是否為提高水平時，可以采用可比樣品的水平。MEF2c、MESP-I、Tbx-5、GATA 4、GATA6、Flk-1、Fog 2 或 FOG 1 的多肽和 / 或 mRNA 的提高水平可以是任何水平，只要該水平大于相應(yīng)的基準水平即可。例如，Tbx-5 mRNA的提高水平可以比在未經(jīng)處理的間充質(zhì)干細胞中觀察到的 Tbx-5 mRNA的基準水平高1. 5、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多倍。應(yīng)注意，基準水平可以是任何量。例如，Tbx-5 mRNA的基準水平可以是零。在此情況下，任何大于零的Tbx_5 mRNA水 平都是提高水平。在一些情況下，鑒別標準可以包括向哺乳動物施用前的細胞顯微分析。該顯微分 析可以包括針對與細胞核相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子多肽對細胞進行評估。例如，可以在釋放進入哺 乳動物前，通過與細胞核相關(guān)的Nkx2. 5、MEF2c、GATA4、MESP-l、F0G 2,Tbx-5或其任意組合 的存在，而評估適于釋放進入哺乳動物的細胞?？梢允褂萌魏芜m宜的方法向心臟組織提供具有作為功能性心肌細胞而并入心臟 組織的能力的分化心肌祖細胞。例如，分化心肌祖細胞可以心肌內(nèi)注射(例如，通過心內(nèi)膜 或心外膜途徑)、向冠狀動脈內(nèi)注射、灌輸?shù)叫呐K中或者全身施用(例如，皮下施用)?？梢韵蛉魏涡呐K組織提供分化心肌祖細胞。例如，可以向哺乳動物(例如人)心 臟組織提供分化心肌祖細胞。在一些情況下，可以向受缺血性心肌病、心肌梗塞或心力衰竭 損害的心臟組織提供分化心肌祖細胞?？梢韵蛐呐K組織施用任何類型的分化心肌祖細胞。例如，可以向心臟組織施用自 體或異源分化心肌祖細胞。在一些情況下，可以向心臟組織施用與本文提供的組合物共同 溫育過的干細胞(例如，間充質(zhì)干細胞)?？梢詫⒏杉毎c本文提供的組合物共同溫育任意長的時間，然后施用至心臟組 織。例如，可以將干細胞與本文提供的組合物共同溫育6小時至M小時(例如8、10、12、18 或 22 小時)或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、30、35、40、45或50天，然后施用至心臟組織。在一些情況下，可以將已經(jīng)與本文提供的 組合物共同溫育的干細胞與本文提供的組合物一起施用于心臟組織。可以將干細胞與本文提供的組合物共同溫育任意長的時間，然后與本文提供的組 合物一起施用至心臟組織。例如，可以將干細胞與本文提供的組合物共同溫育6小時至M 小時(例如 8、10、12、18 或 22 小時)或者 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、M、25、30、35、40、45或50天，然后與本文提供的組合物一起施用至心 臟組織。在一些情況下，可以在施用至哺乳動物之前評估分化心肌祖細胞以確定它們是否 符合具體釋放標準。例如，可以利用RT-PCR評估分化心肌祖細胞以確定所述分化心肌祖細 胞在施用于哺乳動物之前表達提高水平的MEF2c、MESP-I、Tbx-5、GATA6、Flk-I、(例如 對mRNA而言為FOG 1，對肽而言為FOG 2)或其組合的多肽或mRNA。在以下實施例中對進一步對本發(fā)明進行描述，所述實施例并不限制權(quán)利要求書中 所述的本發(fā)明的范圍。


圖1表示在用來源于11名冠狀動脈疾病患者的骨髓的天然人間充質(zhì)干細胞 (hMSC)治療之前和之后以％表示的射血分數(shù)變化(AEF)。圖2是在用DAPI免疫染色后通過共聚焦顯微鏡獲得的，顯示了治療之后未表現(xiàn)出 正射血分數(shù)變化的患者2 (左圖)和表現(xiàn)出正射血分數(shù)變化的患者9 (右圖)的心肌轉(zhuǎn)錄因 子含量的蛋白表達。圖3顯示了 11名患者的hMSC中兩種重要的心肌轉(zhuǎn)錄因子mRNA的mRNA表達。
圖4顯示了以任意單位(A. U.)表示的未經(jīng)處理的天然hMSC(左側(cè))和用心源性 雞尾酒式混合物處理的CP-hMSC (右側(cè))中分別為Nkx2. 5mRNA、GATA-6 mRNA和Fog-I mRNA 的心肌轉(zhuǎn)錄因子的mRNA表達。圖5所示的通過共聚焦顯微鏡獲得的圖像顯示，與天然hMSC (左側(cè))相比較，用心 源性雞尾酒式混合物處理的CP-hMSC (右側(cè))中的Nkx2. 5、MEF2C、F0G-2和GATA4多肽的核 轉(zhuǎn)位。圖6描述了由天然hMSC向“雞尾酒式混合物引導(dǎo)的” CP-hMSC的漸進轉(zhuǎn)變(于DO 天、D5天、D15天和D20天)，并最終轉(zhuǎn)化為心肌細胞(CM)。圖7顯示了天然hMSC和雞尾酒式混合物引導(dǎo)的心肌細胞的透射電子顯微鏡超微結(jié)構(gòu)。圖8顯示了光學(xué)顯微鏡下的雞尾酒式混合物引導(dǎo)的心肌細胞。圖9中左側(cè)第一幅圖表示來自于圖1各患者的天然hMSC和CP-hMSC的Tbx_5 mRNA 表達(AU)，天然細胞的結(jié)果位于直方圖右側(cè)，CP細胞的結(jié)構(gòu)位于直方圖左側(cè)。位于中間的 第二幅圖表示MEF2C mRNA表達，位于右側(cè)的第三幅圖表示MESP-I mRNA表達。所有患者的 天然細胞的平均值和所有患者的CP細胞的平均值在直方圖背景中給出。圖10表示在用不同量的天然hMSC(十二名患者中的各患者直方圖的右側(cè)部分) 進行心臟治療后，與用CP-hMSC，即雞尾酒式混合物引導(dǎo)的hMSC(CP-hMSC)進行心臟治療后 相比的射血分數(shù)變化(Δ射血分數(shù))。圖11表示未治療的(左圖)和用心臟修復(fù)細胞治療(右圖)的梗塞心臟的超聲 心動圖，顯示了經(jīng)CP-hMSC治療后好得多的前壁恢復(fù)。圖12是與圖5相似的圖，顯示了在梗塞心肌膜中注入天然細胞(左側(cè))和心臟修 復(fù)細胞(右側(cè))之后射血分數(shù)變化(AEF)。假治療組沒有細胞的注入。圖13顯示了治療開始的六個月以后用天然hMSC和CP-hMSC治療的鼠梗塞心臟。 動脈瘤和瘢痕在天然hMSC治療的心臟中未得到修復(fù)，而在誘導(dǎo)了重新肌化的CP-hMSC治療 中都得到消解。圖14顯示了共聚焦解析所揭示的，通過人特異性核纖層蛋白免疫染色驗證，在心 臟修復(fù)hMSC治療的鼠心肌中，廣泛存在對人類物種具有特異性的h-ALU DNA序列為正染色 的人源性細胞，所有這些在梗塞對照中均不存在。圖15顯示了在經(jīng)心臟修復(fù)hMSC治療的心臟中通過人心肌肌鈣蛋白-I和α -輔 肌動蛋白共定位來追蹤的人源的心肌細胞。在經(jīng)天然hMSC治療的心臟中不存在人源的心 肌細胞。梗塞前壁內(nèi)的量化揭示了經(jīng)天然hMSC治療的心臟相比經(jīng)CP-hMSC治療的心臟中 心肌細胞核為3士2%和25士5%，意味著經(jīng)心臟修復(fù)hMSC治療可增強移植并入。圖16包含針對人肌鈣蛋白、心室肌球蛋白輕鏈mlC2V和DAPI染色的天然和CP hMSC的照片。通過經(jīng)修復(fù)的前壁中心室肌球蛋白輕鏈mlC2V免疫染色對人類肌鈣蛋白陽性 細胞的進行的對比染色(如圖15所示)，或者如圖17中所示的消解的瘢痕，從而證實了心 室細胞表型。圖17是針對人肌鈣蛋白、心室肌球蛋白輕鏈mlC2V和DAPI染色的的殘余瘢痕的 照片。圖18包含經(jīng)CP-hMSC治療的再生心肌的照片，這證實了堵塞冠狀血管遠端的血管生成。圖19通過心肌脈管系統(tǒng)中人PECAM-I (⑶-31)的表達證實了 CP_hMSC有助于新血管生成。圖20是描繪了在細胞輸送之后相對于假治療組的Δ射血分數(shù)(％ )對比時間 (以月計)的圖。跟蹤CP-hMSC治療的長期影響超過1年，或者鼠壽命的三分之一，可換算 為25年的人類壽命。相對于假治療組，天然hMSC的治療在6個月和12個月時分別顯示了 5%和2. 5%射血分數(shù)效果。相比而言，心臟修復(fù)hMSC治療的梗塞小鼠于6個月和12個月 時表現(xiàn)出相對于假治療組25%的顯著射血分數(shù)提高。圖21是描繪了細胞移植后Δ射血分數(shù)(％ )對比時間(以月計)的圖。將梗塞 組分類以評價在干預(yù)時患有經(jīng)證實的明顯心力衰竭(射血分數(shù)<45%)的小組中的效力。 盡管治療前射血分數(shù)均相等為35%，但僅有心臟修復(fù)hMSC治療于6個月和12個月時使絕 對射血分數(shù)提高10%，相比之下在天然hMSC治療組中射血分數(shù)下降5%。圖22是描繪了所標明小組的小鼠的存活率(％ )的柱狀圖。在后續(xù)400天時，明 顯心力衰竭小組中，在假治療組中沒有存活者，用天然hMSC進行的治療經(jīng)記錄有>50%的 死亡率。相反，利用心臟修復(fù)hMSC治療得到> 80%的存活率。圖23描述了用病理檢查和心電圖確定的CP-hMSC治療的安全性。實施例隨機選擇針對缺血性心臟病進行冠狀動脈搭橋術(shù)的患者進行骨髓采集。他們提供 了告知同意書，研究方案也得到相關(guān)倫理委員會和動物管理使用委員會的批準。值得注意 的是未對患者進行注射而僅僅對小鼠進行了注射。實施例1間充質(zhì)干細胞來源于抽取自18至45周歲的健康個體的骨盆的后髂嵴的人類骨髓 (Cambrex, East Rutherford, New Jersey)?；诹魇郊毎g(shù)分析，所述間充質(zhì)干細胞表達 CD90、CD133、CD105、CD166、CD29 和 CD44，并且不表達 CD14、CD34 和 CD45。人骨髓來源的間充質(zhì)干細胞在補充有TGF β -1 (2. 5ng/ml)、BMP4 (5ng/ml)、 FGF-2 (5ng/ml)、IGF-I (50ng/ml)、活化素-A(10ng/ml)、心營養(yǎng)素(lng/ml)、α -凝血酶(1 單位/ml)和Cardiogenol C(IOOnM)的血小板裂解物或血清中培養(yǎng)。以約1000個至2000 個細胞/cm2的密度在含有血小板裂解物的培養(yǎng)基中4天至10天后，發(fā)現(xiàn)所述細胞表達的 MEF2cmRNA、MESP-l mRNA、Tbx_5 mRNA、GATA6 mRNA、Flk_l 或 FOG ImRNA 比未經(jīng)處理的間充 質(zhì)干細胞多2倍至5倍。以約1000個至2000個細胞/cm2的密度在含有血清的培養(yǎng)基中5天至15天后，發(fā) 現(xiàn)所述細胞表達的 MEF2c mRNA、MESP-l mRNA、Tbx_5mRNA、GATA 4 mRNA、GATA6 mRNA、Flk_l 或FOG 1 mRNA比未經(jīng)處理的間充質(zhì)干細胞多5倍至10倍。用于RT-PCR分析的引物對是商購自Applied Biosystems的標準引物。于跳動的心臟內(nèi)得到的體內(nèi)結(jié)果和隨后尸檢得到的體外結(jié)果均證實所述分化心 肌祖細胞具有作為功能性心肌細胞并入心臟組織的能力。經(jīng)過伴隨長軸上的二維M-模式 探測的短軸上的超聲心動圖、多普勒脈沖波分析和12導(dǎo)聯(lián)心電圖的監(jiān)測，異氟烷麻醉下活 體內(nèi)將心肌祖細胞直接心肌輸送至患病心臟改善了心功能。收集的心臟組織在3%多聚甲醛中固定，切片并進行針對人類細胞示蹤的免疫探測。在用滿足釋放標準(艮口 MEF2c mRNA、MESP-I mRNA、Tbx-5 mRNA、GATA 4 mRNA、GATA6 mRNA、Flk-l或FOG 1 mRNA的提高表達水平)的心肌祖細胞治療的小鼠中的分析則證實了 新生的人類來源心肌細胞和脈管系統(tǒng)，伴隨功能改善和瘢痕消解，相比之下，利用未達到釋 放標準的細胞沒能獲得益處。為了擴大用于患者自體注射的心臟修復(fù)細胞的生產(chǎn)規(guī)模，由于免疫熒光耗時、定 性并且可能依賴于操作者，因此考慮其他替代方法。一種供選擇的方法是實時定量逆轉(zhuǎn)錄 聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-qPCR)。該方法更快地(一天之內(nèi))給出不依賴于操作者且相對于基 準標準定量的結(jié)果。此外，當需要對免疫染色樣品一個接一個地進行熒光顯微評價時，使用 96孔板可以通過RT-qPCR —式兩份地測試多達48個不同的樣品(或條件)。為了鑒別RT-qPCR的適宜標記物，由獲得自心臟病患者(n = 7)的骨髓樣品獲得 心臟修復(fù)細胞。通過針對MEF2C和Nkx2. 5的免疫熒光染色評價細胞。由這些細胞提取RNA， 通過實時定量PCR測量Nkx2. 5和MEF2C的表達?；鶞蕵藴视蓙碜杂谙嗤⑽丛谛脑措u尾酒式混合物存在下進行培養(yǎng)的細胞 構(gòu)成。采用雙Δ-Ct方法計算結(jié)果，將由經(jīng)處理的細胞獲得的數(shù)據(jù)對由未經(jīng)處理的細胞 得到的數(shù)據(jù)進行標準化。當與天然細胞相比時，qPCR和免疫熒光(核轉(zhuǎn)位)均將MEF2C鑒別為心臟修復(fù)細 胞的適宜標記。相反，通過免疫熒光(核轉(zhuǎn)位)于蛋白水平看到的Nkx2. 5的定性變化并未 初始地轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄬τ谖唇?jīng)處理的細胞的RNA水平的定量變化。隨后研究了 Nkx2. 5下游的 基因，因為它們的表達的誘導(dǎo)將依賴于Nxk2. 5的核轉(zhuǎn)位。這導(dǎo)致將MESP-l、Flk-l和Tbx5 鑒別為可用于QPCR鑒別的其他適宜的基因。在胸骨切開術(shù)之后的冠狀動脈搭橋術(shù)過程中獲得人骨髓抽出物(15ml至20ml)。 骨髓低溫保存在基于DMSO的不含有血清的冷凍溶液中。通過將原骨髓置于塑料盤中，并且 于12h時洗滌選擇粘附細胞從而募集間充質(zhì)干細胞，并且通過使用⑶347⑶457⑶133+標 記物組的熒光激活細胞分選(FACS)分析進行了確認。細胞于37°C在補充有5%人血小板 裂解物的 DMEM(Mayo Clinic Blood Bank, Rochester, MN)中培養(yǎng)。在免疫功能不全的裸鼠(Harlan，Indianapolis, IN)中制造心肌梗塞。根據(jù)盲法 設(shè)計，在梗塞后一個月，將懸浮在12. 5μ 1增殖培養(yǎng)基中的總數(shù)600，000的天然hMSC或心 臟修復(fù)引導(dǎo)的hMSC在顯微鏡觀察下注入左心室前壁上的五個心外膜位點。假治療組進行 相同的手術(shù)過程但沒有細胞注入。對該慢性梗塞模型進行的骨髓hMSC的心肌注入證實了 細胞移植結(jié)果的異質(zhì)性，11個研究個體中僅有2個在超聲心動圖中改善了射血分數(shù)?；颊?和9經(jīng)鑒別為具有高心生成潛力的個體。首先由圖1觀察到用分別來自于 患者3和9的hMSC治療的小鼠(n = 3)中射血分數(shù)的變化是顯著陽性的，而其他各患者的 變化則不是。如圖2所示，用共聚焦顯微鏡在hMSC中觀察到心肌轉(zhuǎn)錄因子的蛋白表達。代表性 地對于所有圖，條棒對應(yīng)于20 μ m。在3%多聚甲醛中固定并用Triton X_100透化，之后以對下述分子特異性 的抗體進行免疫染色MEF2C(1 400，Cell Signaling Technologies, Danvers, ΜΑ), Nkx2. 5(1 : 150, Santa Cruz Biotechnology Inc. , Santa Cruz, CA)、GATA4(Santa CruzBiotechnology Inc. ) > Phospho-AKTser473 ( 1 100, Cell Signaling Technologies)、 Tbx5(l 5000, Abeam, Cambridge, MA) > Mesp-I (1 250, Novus Bio, Littleton, CO) > Fog-2(l 100，Santa Cruz Biotechnology)、肌節(jié)蛋白 α -輔肌動蛋白(1 500， Sigma-Aldrich)和人特異性肌鈣蛋白-1(1 100，Abeam)、mlC2v(1 500，Synaptic Systems, Gottigen, Germany)> Sca-I (1 : 100, R&D Systems, Minneapolis, MN)、CD-31/ PECAM-I (1 500，Beckman Coulter，F(xiàn)ullerton，CA)、α-平滑肌肌動蛋白(Abeam)、人特 異性肌鈣蛋白-1(1 100，Abeam)、人核纖層蛋白 A/C(l 50, Novacastra, New Castle, UK)和Ki67 (1 500，Abeam)，并進行DAPI染色以使細胞核在用LSM 510激光掃描共聚焦 顯微鏡(Carl Zeiss Inc. , Jena, Germany)進行的共聚焦顯微術(shù)中可見。在DAPI染色下觀察到早期心肌轉(zhuǎn)錄因子Nkx 2. 5、Tbx_5和MESP1，晚期心肌轉(zhuǎn)錄 因子MEF2C?；颊?的結(jié)果位于左側(cè)，患者9的結(jié)果位于右側(cè)。所得圖像顯示，對于來自患 者2的hMSC，心肌轉(zhuǎn)錄因子的表達較弱，而對于來自患者9的則較強。這證實了來自患者9 的hMSC給出有效治療益處而來自患者2的hMSC則不能給出有效治療益處的事實。DAPI提 供的顏色為藍色。在圖2中，針對Nkx2. 5的第一系列圖像顯示了對于患者2的hMSC (左圖)，細胞核 僅被DAPI染為藍色(左圖)。還出現(xiàn)了對應(yīng)于在細胞質(zhì)中存在的Nkx 2. 5的弱綠色染色。 患者9的相應(yīng)圖像(右圖)顯示了 Nkx2. 5在細胞質(zhì)中以及在細胞核中更高地表達(綠色)。第二系列圖像顯示了患者2的心肌轉(zhuǎn)錄因子Tbx_5(綠色)和MESP-I (紅色)，細 胞核經(jīng)DAPI染為藍色，沒有見到綠色或紅色，這對應(yīng)于沒有表達TbX-5和MESP-I。對于患 者2，細胞質(zhì)染為紅色，細胞核為綠色，這對應(yīng)于兩種心肌轉(zhuǎn)錄因子的強表達和Tbx-5核轉(zhuǎn) 位至細胞核。第三系列圖像給出了與Nkx 2. 5相似的MEF2C的結(jié)果。圖3顯示了在qPCR中研究的mRNA表達，揭示了對于本研究的11名患者的hMSC 的心肌轉(zhuǎn)錄因子表達(MEF2C和Tbx-5)。使用TaqMan PCR 試劑盒，通過 Applied Biosystems 7，900HT 序列檢測系統(tǒng) (Applied Biosystems, Foster City, CA)進行定量聚合酶鏈式反應(yīng)(qPCR)。TaqMan 基因 表達反應(yīng)在96孔板中溫育，并一式三份地進行。循環(huán)閾值(Ct)定義為熒光超過固定閾值 時的循環(huán)分數(shù)。TaqMan Ct值換算為用2_Δ 法確定的相對變化倍數(shù)，標準化為GAPDH(P/ Ν435, 2662-0506003)表達。評價了表1中所列的基因，它們代表性地具有心肌轉(zhuǎn)錄活性。在用含有人重組TGF0-K2.5ng/ml)、BMP4(5ng/ml)、心營養(yǎng)素(lng/ml)、α-凝 血酶(lU/ml)和Cardiogenol C(IOOyM)的心源性雞尾酒式混合物進行5天刺激之前和之 后，在mRNA和蛋白水平上評價細胞?；颊?和9的hMSC的MEF2C mRNA和Tbx_5 mRNA表 達(任意單位AU)，比任一個其他患者，都要高得多。表權(quán)利要求
1.一種組合物，所述組合物包含TGFii -1、BMP4、α -凝血酶、選自由心營養(yǎng)素和IL-6 組成的組的化合物、以及選自由Cardiogenol C和視黃酸組成的組的化合物。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，所述組合物包含TGFii-1、ΒΜΡ4、α -凝血酶、心營養(yǎng)素 禾口 Cardiogenol C0
3.如權(quán)利要求1所述的組合物，所述組合物包含選自由FGF-2、IGF-1、活化素-Α、 TNF- α、FGF-4、LIF、VEGF-A及其組合組成的組的至少一種化合物。
4.如前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，所述組合物包含F(xiàn)GF-2、IGF-I和活化 素-A。
5.如前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，所述組合物包含活化素-A、FGF-2、IL-6、 IGF-I和視黃酸。
6.如權(quán)利要求1所述的組合物，所述組合物不包含選自由TNF-α、FGF-4、LIF和 VEGF-A組成的組的至少一種化合物。
7.如權(quán)利要求1至6中任一項所述的組合物，其中當一種化合物存在于所述組合物中 時，其存在量為所述TGF β -1以lng/ml至5ng/ml的量存在，所述BMP4以lng/ml至IOng/ ml的量存在，所述心營養(yǎng)素以0. 5ng/ml至5ng/ml的量存在，所述α -凝血酶以0. 5單位/ ml至5單位/ml的量存在，所述Cardiogenol C以50nM至500nM的量存在，所述FGF-2以 lng/ml至10ng/ml的量存在，所述IGF-1以10ng/ml至100ng/ml的量存在，所述活化素-A 以lng/ml至50ng/ml的量存在，所述TNF- α以lng/ml至50ng/ml的量存在，所述FGF-4 以lng/ml至20ng/ml的量存在，所述IL-6以10ng/ml至100ng/ml的量存在，所述LIF以1 單位/ml至10單位/ml的量存在，所述VEGF-A以lng/ml至50ng/ml的量存在，所述視黃 酸以每ml中0. 1 μ M至1. O μ M的量存在。
8.如權(quán)利要求1所述的組合物，所述組合物包含以組合方式使用的重組 TGF β -1 (2. 5ng/ml)、BMP4 (5ng/ml)、心營養(yǎng)素(lng/ml)、Cardiogenol C (100 μ Μ)。
9.如權(quán)利要求8所述的組合物，所述組合物還包含α-凝血酶(lU/ml)、FGF-2 (lOng/ ml)、IGF-1 (50ng/ml)和活化素 _A(5ng/ml)。
10.如權(quán)利要求1所述的組合物，所述組合物包含以組合方式使用的重組 TGF β -1 (2. 5ng/ml)、BMP4 (5ng/ml)、活化素-A (5ng/ml)、FGF-2 (10ng/ml)、IL-6 (lOOng/ ml)、因子 11&010-凝血酶、川/1111)、16卩-1(50叫/1111)和視黃酸(1 μ Μ)。
11.如權(quán)利要求1至10中任一項所述的組合物，所述組合物包含在培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng) 基選自由含有胎牛血清、人血清、血小板裂解物及其混合物的培養(yǎng)基組成的組。
12.—種由初始細胞獲得分化細胞的方法，所述分化細胞以提高水平表達選自由MEF2c mRNA、MESP-I mRNA、Tbx-5 mRNA、GATA4mRNA、Flk-I mRNA、GATA6 mRNA、Fog-I mRNA 及其 組合組成的組的至少一種mRNA，和/或具有選自由Nkx2. 5多肽、MEF2C多肽、Tbx-5多肽、 F0G-2多肽、GATA-4多肽、MESP-I多肽及其組合組成的組的至少一種多肽，其中所述至少一 種多肽與所述分化細胞的細胞核相關(guān)，其中所述方法包括在權(quán)利要求1至11中任一項的組 合物的存在下培養(yǎng)初始細胞。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述分化細胞表達提高水平的MEF2cmRNA和 MESP-I mRNAο
14.如權(quán)利要求12和13中任一項所述的方法，其中所述初始細胞是間充質(zhì)干細胞。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述間充質(zhì)干細胞是骨髓來源的干細胞。
16.如權(quán)利要求14和15中任一項所述的方法，其中所述間充質(zhì)干細胞在細胞表面表達 CD90、CD105、CD133、CD166、CD29 和 CD44，并且在細胞表面不表達 CD14、CD34 和 CD45。
17.如權(quán)利要求12至16中任一項所述的方法，其中所述分化細胞是心臟修復(fù)細胞。
18.通過權(quán)利要求12至17中任一項所述的方法獲得的細胞。
19.如權(quán)利要求18所述的細胞，其中所述細胞是心臟修復(fù)細胞。
20.將分化細胞輸入哺乳動物的方法，其中所述方法包括(a)確定來自分化細胞群的細胞樣品包含這樣的細胞該細胞以提高水平表達選自由 MEF2c mRNA、MESP-I mRNA、Tbx_5 mRNA、GATA4 mRNA、Flk_l mRNA、GATA6 mRNA、Fog-I mRNA 及其組合組成的組的至少一種mRNA，和/或具有選自由Nkx2. 5多肽、MEF2C多肽、Tbx_5多 肽、MESP-I多肽、GATA-4多肽、F0G-2多肽及其組合組成的組的至少一種多肽，其中所述多 肽與所述分化細胞的細胞核相關(guān)，和(b)向所述哺乳動物施用來自所述分化細胞群的細胞。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中由在權(quán)利要求1至11中任一項所述的組合物存在 下培養(yǎng)的權(quán)利要求12至16中任一項所述的初始細胞獲得所述分化細胞群。
22.如權(quán)利要求20和21中任一項所述的方法，其中所述步驟(a)包括采用逆轉(zhuǎn)錄聚合 酶鏈式反應(yīng)。
23.如權(quán)利要求20至22中任一項所述的方法，其中所述施用步驟包括通過選自由全身 施用、心臟內(nèi)施用和冠脈內(nèi)施用組成的組的施用對所述細胞進行施用。
24.如權(quán)利要求20至23中任一項所述的方法，其中所述步驟(a)包括采用免疫細胞化學(xué)反應(yīng)。
25.向心臟組織提供心肌細胞的方法，其中所述方法包括向所述心臟組織施用通過與 權(quán)利要求1至11中任一項所述的組合物相接觸而得到的權(quán)利要求12至16中任一項所述 的分化細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有心源性因子的組合物，還涉及通過在這些因子的存在下培養(yǎng)初始細胞從而獲得細胞的方法，以及將所獲得的細胞施用于心臟組織的方法。
文檔編號C12N5/077GK102046193SQ200980118954
公開日2011年5月4日 申請日期2009年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月27日
發(fā)明者安德烈·泰爾齊奇, 阿塔·貝法爾 申請人:梅奧醫(yī)學(xué)教育和研究基金會