專利名稱：Epas1抑制劑的組合物和用途的制作方法
EPAS1抑制劑的組合物和用途相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考本申請(qǐng)要求2008年4月4日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列案61/123，069的權(quán)益。上 面參考的申請(qǐng)的所有教導(dǎo)通過引用合并入本文。背景轉(zhuǎn)錄復(fù)合物低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor, HIF)是氧氣動(dòng)態(tài)平衡中 的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)子。低氧誘導(dǎo)參與許多細(xì)胞和生理過程的基因的表達(dá)，這些過程包括氧氣 運(yùn)輸和鐵代謝、紅細(xì)胞生成、血管生成、醣酵解和葡萄糖攝取、轉(zhuǎn)錄、代謝、PH調(diào)節(jié)、生長(zhǎng)因子 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、對(duì)應(yīng)激的應(yīng)答和細(xì)胞粘著。此類基因產(chǎn)物參與增加向含氧量低的組織的氧氣運(yùn) 送或激活不需要氧的備選代謝途徑(糖酵解)。低氧誘導(dǎo)的途徑除了為正常細(xì)胞過程所需 要外，還可通過允許或幫助血管生成、永生化、遺傳不穩(wěn)定性、組織侵襲和轉(zhuǎn)移來幫助腫瘤 H (Harris, Nat. Rev. Cancer 2 38-47,2002 ；Maxwe 11 等)κ, Curr. Opin. Genet. Dev. 11 293-299,2001)。HIF是由α亞基與β亞基復(fù)合組成的異二聚體，所述2個(gè)亞基都是基本的螺 旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子。HIF的β亞基是一種組成性的核蛋白。HIF的α亞基是特異于氧 應(yīng)答途徑的調(diào)節(jié)亞基，并且可以是3種亞基HIFl α、2 α或3 α (分別地HIFl α、HIF2 α和 HIF3 α )之一(Maxwell 等人，Curr. Opin. Genet. Dev. 11 :293_299，2001 ；Safran 和 Kaelin， J. Clin. Invest. Ill :779_783，2003)。在腫瘤建立血液供給之前，低氧條件限制腫瘤生長(zhǎng)。HIFl α活性的隨后增加導(dǎo)致 靶基因例如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)增加。VEGF的表達(dá)是大多數(shù)實(shí)體瘤中血管化 和血管生成的建立所必需的(Iyer等人，Genes Dev. 12 149-162，1998)。也在人多形性膠 質(zhì)母細(xì)胞瘤(lioblastoma multiforme)(最高級(jí)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤，其中患者平均存活時(shí)間短 于1年)中觀察到HIFl α、VEGF的過表達(dá)與腫瘤分級(jí)之間的顯著關(guān)聯(lián)性?？焖僭鲋车哪[ 瘤生長(zhǎng)超過了其血液供給，從而導(dǎo)致大片壞死，并且這些區(qū)域表達(dá)高水平的HIFl α蛋白和 VEGF mRNA，表明 了腫瘤對(duì)低氧的應(yīng)答(Zagzag 等人，Cancer 88 =2606-2618,2000) 編碼HIF2a (也稱為內(nèi)皮PAS結(jié)構(gòu)域蛋白1、EPAS1、M0P2、低氧誘導(dǎo)因子2、HIF 相關(guān)因子、HRF、HIFl a -樣因子、HLF)的基因最初被鑒定為在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子 (Ema 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 94 :4273_4278，1997 ；Flamme 等人，Mech. Dev. 63 51-60，1997 ；Hogenesch 等人，J. Biol. Chem. 272 :8581_8593，1997 ；Tian 等人，Genes Dev. 11 :72-82，1997)。已通過實(shí)驗(yàn)證明了升高的EPASl活性與血管生成之間的聯(lián)系，該實(shí) 現(xiàn)顯示HIF活性如何調(diào)控VEGF的表達(dá)。正常的人腎細(xì)胞通常具有低水平的EPAS1，但在將 編碼EPASl的載體引入這些細(xì)胞后，VEGF mRNA和蛋白質(zhì)水平顯著增加(Xia等人，Cancer 91 =1429-1436, 2001)。當(dāng)抑制PASl時(shí)，VEGF表達(dá)顯著降低，從而證實(shí)了 EPASl活性與VEGF 表達(dá)之間的直接關(guān)聯(lián)(Xia等人，Cancer 91 1429-1436，2001)。HIF活性與VEGF表達(dá)之 間的關(guān)聯(lián)也在惡性細(xì)胞和組織中觀察到。在缺乏編碼EPASl的載體的情況下，在腎細(xì)胞癌 (RCC)細(xì)胞系中可容易地檢測(cè)到EPASl (Xia等人，Cancer 91 1429-1436，2001)。與正常組 織相比較，腎細(xì)胞癌組織樣品中EPASl和VEGF mRNA顯著增加，表明EPASl的異常激活可能參與 RCC 的血管生成(Xia 等人，Cancer 91 1429-1436，2001)。 除了 RCC外，還已報(bào)導(dǎo)EPASl在其他惡性腫瘤中的表達(dá)。EPASl在人膀胱癌，特別 地在具有侵襲性表型的膀胱癌中在mRNA和蛋白質(zhì)水平上都有表達(dá)(Xia等人，Urology 59 774-778，2002)。在頭頸部鱗細(xì)胞癌(squamous cell head-and-neck cancer (SCHNC))中 觀察到EPASl的過表達(dá)的另一個(gè)實(shí)例。高水平的EPASl與SCHNC的局部侵襲行為以及血 管生成的增強(qiáng)相關(guān)(Koukourakis 等人，Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 53 1192-1202， 2002)。這些發(fā)現(xiàn)也證實(shí)了 EPASl的過表達(dá)與對(duì)化學(xué)療法的抗性之間的關(guān)聯(lián)性。在惡性嗜 鉻細(xì)胞瘤中觀察到EPASl的過表達(dá)與癌癥之間的另一個(gè)關(guān)聯(lián)實(shí)例，該細(xì)胞瘤與良性相應(yīng)物 相比較而言展示更高水平的EPASl和誘導(dǎo)的VEGF途徑(Favier等人，Am. J. Pathol. 161 1235-1246,2002)。EPASl過表達(dá)在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中也是常見事件，并且與多個(gè)血 管生成因子的上調(diào)和癌細(xì)胞的血管生成受體過表達(dá)相關(guān)。NSCLC中EPASl的過表達(dá)指示不 良預(yù)后(Giatromanolaki等人，Br. J. Cancer 85 =881-890,2001)。在人肺腺癌細(xì)胞中觀察 到了 EPASl mRNA和蛋白質(zhì)的水平升高，并且此類細(xì)胞對(duì)低氧的暴露進(jìn)一步增加了 EPASl表 達(dá)(Sato 等人，Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 26 127-134，2002)。結(jié)合起來，這些研究證明 升高的EPASl賦予了侵襲性的腫瘤行為，并且靶向HIF途徑可能有助于幾種不同類型的癌 癥的治療。此外，低氧應(yīng)答元件在常氧條件下癌細(xì)胞系中VEGF同種型的組成型上調(diào)中 起著一定作用。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中位于細(xì)胞類型特異性增強(qiáng)子元件內(nèi)的HRE通過 增強(qiáng)的EPASl對(duì)HRE的結(jié)合來參與VEGF表達(dá)的上調(diào)(Liang等人，J. Biol. Chem. 277 20087-20094，2002)?？山Y(jié)合低氧誘導(dǎo)因子1 β但不結(jié)合HRE的截短形式EPASl不能反式 激活(transactivate)VEGF 啟動(dòng)子(Liang 等人，J. Biol. Chem. 277 =20087-20094, 2002)。 這進(jìn)一步證明了癌細(xì)胞能夠通過增強(qiáng)血管形成和血管生成所需的因子的表達(dá)來對(duì)抗低氧 條件。由于EPASl牽涉許多疾病，因此仍然長(zhǎng)期需要能夠有效地調(diào)控EPASl功能的另外 的試劑。鑒于EPASl表達(dá)的上調(diào)與許多不同類型的癌癥相關(guān)，這樣的抑制在癌癥的治療中 尤其重要。發(fā)明概述本公開內(nèi)容提供了調(diào)控EPASl表達(dá)的組合物和方法。特別地，用于調(diào)控EPASl表 達(dá)的RNAi組合物據(jù)信對(duì)于治療與EPASl相關(guān)的異常增殖狀況是有用的。異常增殖狀況的 實(shí)例有過度增生性病癥例如癌癥、腫瘤、贅生物(hyperplasias)、肺纖維化、血管生成、銀屑 病、動(dòng)脈粥樣硬化以及血管中平滑肌細(xì)胞的增殖。EPASl的抑制可能是治療此類病癥的一種 特別有用的方法。因此，本發(fā)明提供了 EPASl抑制劑和可在靶細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)EPASl的抑制的相關(guān)方法 和組合物。具體地，靶細(xì)胞包括處于不期望的增殖中的細(xì)胞例如癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞、處于與 某些疾病或狀況相關(guān)的過度生長(zhǎng)和/或增殖的細(xì)胞(例如，自身免疫疾病或移植物排斥中 的T細(xì)胞)和病原體(例如，細(xì)菌和真菌細(xì)胞)。本發(fā)明的EPASl抑制劑可通過減弱EPASl 表達(dá)或EPASl的生物學(xué)功能(例如EPASl的酶促活性)來抑制EPASl。EPASl抑制劑可以是核酸、小分子、肽，包括抗體、肽衍生物或擬肽 (peptidomimetic) 0
某些實(shí)施方案涉及核酸類型的EPASl抑制劑。本發(fā)明提供了分離的核酸，其中包 含可在某些條件下(例如，生理或細(xì)胞內(nèi)條件)與EPASl轉(zhuǎn)錄物雜交并且減少細(xì)胞中靶基 因的表達(dá)的至少一部分。所述靶基因轉(zhuǎn)錄物可以是任何剪接前的轉(zhuǎn)錄物(即包含內(nèi)含子)、 剪接后的轉(zhuǎn)錄物以及任何剪接變體。在某些實(shí)施方案中，靶基因轉(zhuǎn)錄物具有SEQ ID NO 1 中所示的序列。核酸類別中的實(shí)例包括例如RNAi構(gòu)建體和催化性核酸構(gòu)建體。核酸可以是 單鏈或雙鏈的。雙鏈核酸還可包含突出或非互補(bǔ)性的區(qū)域，在該區(qū)域中所述鏈中的一條或 另一條是單鏈的。單鏈核酸可包括自身互補(bǔ)的區(qū)域，這意味著化合物形成具有雙螺旋結(jié)構(gòu) 區(qū)域的所謂“發(fā)夾”或“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)。核酸可包含與由靶基因核酸序列(例如由SEQ ID NO 1(

圖1)指示的靶基因核酸序列或其任何同源物(例如直系同源物或旁系同源物)或變體 (例如等位基因)中)的不超過1000個(gè)、不超過500個(gè)、不超過250個(gè)、不超過100個(gè)或不 超過50個(gè)核苷酸組成的區(qū)域互補(bǔ)的核苷酸序列。所述互補(bǔ)的區(qū)域優(yōu)選為至少8個(gè)核苷酸， 任選地至少10、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)核苷酸?；パa(bǔ)的區(qū)域可落在靶 基因轉(zhuǎn)錄物的內(nèi)含子、編碼序列或非編碼序列內(nèi)。一般來說，核酸具有大約8至大約500個(gè) 核苷酸或堿基對(duì)的長(zhǎng)度，任選地長(zhǎng)度將為大約14至大約50個(gè)核苷酸。核酸可以是DNA、RNA 或RNA: DNA雜交體。任一條鏈可包含DNA和RNA的混合物以及不能容易地被分類為DNA或 RNA的修飾形式。同樣，雙鏈核酸可以是DNA:DNA、DNA:RNA或RNA:RNA，并且任何一條鏈也 可包含DNA和RNA的混合物以及不能容易地被分類為DNA或RNA的修飾形式。核酸可包括 多種修飾的任何類型，包括對(duì)主鏈(天然核酸中的糖-磷酸部分，包括核苷酸間連接)或堿 基部分(天然核酸的嘌呤或嘧啶部分)的一個(gè)或多個(gè)修飾。核酸優(yōu)選可具有大約15至大 約30個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，并且通常將包含一個(gè)或多個(gè)修飾來改進(jìn)特征，例如在血清、細(xì)胞或 核酸可能被遞送至的地方(例如在口服遞送核酸的情況下是胃，對(duì)于吸入的核酸是肺)中 的穩(wěn)定性。在RNAi構(gòu)建體的情況下，與靶轉(zhuǎn)錄物互補(bǔ)的鏈通常是RNA或其修飾物。另一條 鏈可以是RNA、DNA或任何其他變型。雙鏈或單鏈“發(fā)夾” RNAi構(gòu)建體的雙鏈體部分優(yōu)選長(zhǎng) 度為18至30個(gè)核苷酸，任選地大約21至27個(gè)核苷酸。催化性或酶促核酸可以是核酶或 DNA酶，并且還可包含修飾形式。當(dāng)在生理?xiàng)l件下并且以無(wú)義或有義對(duì)照幾乎不具有或不 具有作用的濃度與細(xì)胞接觸時(shí)，本文中的核酸可抑制靶EPASl基因的表達(dá)大約50%、75%、 90%或更多。用于檢測(cè)核酸效果的優(yōu)選濃度是1、5、10、20、50、100或ΙΟΟΟηΜ。還可就對(duì)細(xì) 胞表型的影響檢測(cè)本文中的核酸。在某些癌細(xì)胞系的情況下，可在施用靶向核酸后測(cè)量細(xì) 胞死亡或擴(kuò)增速率的降低。優(yōu)選地，在核酸的實(shí)驗(yàn)上有意義的濃度下細(xì)胞擴(kuò)增被抑制50% 以上。在某些方面，本發(fā)明提供了包含各種EPASl抑制劑例如靶向EPASl基因的核酸 (或靶向核酸)中任何種類的藥物組合物。藥物組合物通常包含藥學(xué)上可接受的載體。藥 物組合物可包含在生理?xiàng)l件下與靶基因轉(zhuǎn)錄物雜交并且減少靶基因在細(xì)胞中的表達(dá)的核
酸。 在某些方面，本發(fā)明提供了用于抑制EPASl基因在細(xì)胞中的表達(dá)的方法。該方法 可包括將所述細(xì)胞與有效量的核酸接觸，所述核酸在生理?xiàng)l件下與靶EPASl轉(zhuǎn)錄物雜交并 且減少靶基因在細(xì)胞中的表達(dá)。任何公開的靶向EPASl的核酸都可用于這樣的方法。所述 細(xì)胞可以是腫瘤或癌細(xì)胞、病原體細(xì)胞或正常細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，正常細(xì)胞經(jīng)歷可導(dǎo) 致患者中某些疾病或狀況的不期望的增殖。
在某些方面，本發(fā)明提供了用于降低受試者中腫瘤的生長(zhǎng)速率的方法，其包括施 用足以降低腫瘤生長(zhǎng)速率的量的本文所述EPASl抑制劑。在某些方面中，本發(fā)明提供了用 于治療癌癥患者的方法，其包括給患者施用本文中的EPASl抑制劑。所述EPASl抑制劑可 以是核酸，例如RNAi核酸或催化性核酸，并且可用藥學(xué)上可接受的載體進(jìn)行配制。任選地， 腫瘤可包含一個(gè)或多個(gè)表達(dá)所述核酸所靶向的基因的癌細(xì)胞。靶EPASl基因相對(duì)于來自可 比較組織的非癌細(xì)胞而言可能是過表達(dá)的。腫瘤還可以是轉(zhuǎn)移瘤?？蓪⑦@樣的治療與至少 一種另外的抗癌化療藥物組合，所述化療藥物以與核酸加成性或協(xié)同的方式與所述核酸一 起抑制癌細(xì)胞?？梢砸越M合制劑的形式將核酸和所述另外的抗癌劑配制在一起，或可將其 獨(dú)立地配制，然后以能實(shí)現(xiàn)這種組合效應(yīng)的方式(例如，時(shí)間安排、劑量)施用。在某些方面，本發(fā)明提供了核酸在制造用于治療例如癌癥或病原體感染的藥劑中 的用途。在某些方面，本發(fā)明提供了用于從感染病原體的患者或被病原體污染的物體除去 或減少病原體的方法和組合物。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了包裝的藥物。這樣的包裝的藥物包含(i)治療有效 量的本文中公開的靶向EPASl基因的抑制劑；和(ii)用于施用所述EPASl抑制劑以治療患 有表達(dá)EPASl基因的腫瘤的患者的說明書和/或標(biāo)簽。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了包裝的消毒劑。該包裝的消毒劑可特異性地抗一 種或多種傳染原例如病原體。這樣的包裝的消毒劑包括(i)有效量的靶向傳染原中的 EPASl基因的EPASl抑制劑；和(ii)用于施用該EPASl抑制劑以除去或減少傳染原的量 的說明書和/或標(biāo)簽。附圖概述圖 1 顯示人 EPASl 的 cDNA 序列(GenBank 登錄號(hào) NM_001430) (SEQ ID NO :1)。以 下劃線和粗體標(biāo)示的3個(gè)11個(gè)堿基的區(qū)段相應(yīng)于由SEQ ID NOs 2~4表示的核心靶序列。圖 2 描述了初始 3 個(gè) siRNA 雙鏈體-siEPASIA (SEQ ID NOs :5 和 6)、siEPASlB (SEQ ID NOs :7 禾口 8)禾口 siEPASlC(SEQ ID NOs :9 禾口 10)-在 A498 (人腎癌)細(xì)胞中的抗 EPASl 活性的評(píng)估。siCONl未顯示任何EPASl下調(diào)(相對(duì)于未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)，而所有3個(gè)抗EPASl 的siRNA均表現(xiàn)出EPASl mRNA的顯著下調(diào)。圖3A顯示在初始3個(gè)位點(diǎn)附近的另外的siRNA雙鏈體在A498細(xì)胞中的抗EPASl 活性。在檢查的這些雙鏈體當(dāng)中，siEPASlA-2、siEPASIA-U siEPASIA、siEPASlA+3、 siEPASlB-4和siEPASlC-4顯示最強(qiáng)效力的抗EPASl活性。圖3B是tiling實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的舉 例說明。圖4進(jìn)一步檢查了幾個(gè)抗EPASl siRNA雙鏈體(顯示最強(qiáng)效力的抗EPASl活性的 抗EPASl siRNA雙鏈體；參見圖3A)對(duì)A498細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。在檢測(cè)的siRNA雙鏈體當(dāng) 中，siEPASlA-2和siEPASIA是A498細(xì)胞生長(zhǎng)的最重要的抑制劑，如通過實(shí)時(shí)細(xì)胞電子傳 感(real-time cell electronic sensing) (RT-CES)測(cè)量的。 圖5顯示了 siEPASlA_2(SEQ ID NOs 29和30)有效地降低培養(yǎng)的人腎細(xì)胞癌細(xì) 胞系(A-498，786-0 和 Caki-Ι)的細(xì)胞 EPASl mRNA 水平。圖6A-6C顯示在用siEPASlA-2處理后細(xì)胞增殖速率的下降。如基于VHL狀態(tài)所 預(yù)期的，siEPASlA-2在A498和786-0細(xì)胞中但未在Caki-I細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了顯著的抗增殖作用，這表明VHL缺陷的癌細(xì)胞是用于降低細(xì)胞HIF水平的治療的良好候選者。
發(fā)明_既述 本發(fā)明的一個(gè)方面涉及包含長(zhǎng)度為大約15至大約30個(gè)核苷酸的含有選自SEQ ID NOs 2-4之序列的第一鏈和長(zhǎng)度為大約15至大約30個(gè)核苷酸的第二鏈的核酸，其中第一 鏈和第二鏈的至少12個(gè)核苷酸彼此互補(bǔ)并且在生理?xiàng)l件下形成雙鏈核酸，以及其中所述 雙鏈核酸可通過RNA干擾機(jī)制減少內(nèi)皮PAS結(jié)構(gòu)域蛋白I(EPASl)在細(xì)胞中的表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，所述核酸是任選地在長(zhǎng)度上為大約15至大約30個(gè)核苷酸的 雙鏈RNA。在其他實(shí)施方案中，核酸是發(fā)夾RNA，其中所述發(fā)夾RNA包含在長(zhǎng)度上具有大約4 至大約10個(gè)核苷酸的環(huán)區(qū)域。在本文中公開的實(shí)施方案的任一個(gè)中，所述核酸可包含DNA 多核苷酸作為其第一鏈，以及RNA多核苷酸作為其第二鏈。在一些實(shí)施方案中，上述核酸的 第一和/或第二鏈可包含3'突出區(qū)域、5'突出區(qū)域或3'和5'突出區(qū)域，其中所述突出 區(qū)域任選地在長(zhǎng)度上包含大約1至大約10個(gè)核苷酸。在公開的實(shí)施方案的任一個(gè)中，所述核酸的第一鏈可包含選自下述的序列SEQ ID NOs :5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、 53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79 和 81。類似地，第二鏈可包含選自下述的 序列=SEQ ID NO :6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、 48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80 和 82。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及包含在生理?xiàng)l件下與相應(yīng)于SEQ ID NO :1中核苷酸 655-718,2878-2929或4978-5039的EPASl轉(zhuǎn)錄物區(qū)域雜交并且減少EPASl在細(xì)胞中的表 達(dá)的序列的分離核酸。在另外的實(shí)施方案中，所述核酸包含與相應(yīng)于SEQ ID N0:1中核苷 酸665-708、2888-2919或4988-5029的EPASl轉(zhuǎn)錄物區(qū)域雜交的序列。在特定的實(shí)施方 案中，所述核酸包含與相應(yīng)于SEQ ID NO :1中核苷酸670-703、2893-2914或4992-5024的 EPASl轉(zhuǎn)錄物區(qū)域雜交的序列。在某些實(shí)施方案中，所述核酸可以是單鏈的或雙鏈的。在公開的實(shí)施方案的任一個(gè)中，所述核酸可包含與EPASl的所述區(qū)域之一互補(bǔ)的 至少10個(gè)連續(xù)核苷酸。該核酸在長(zhǎng)度上可以是大約14至大約50個(gè)核苷酸。本文中描述 的任一個(gè)核酸可以是RNA分子、DNA分子或可包含DNA鏈和RNA鏈。在一些實(shí)施方案中，任一公開的核酸可以是包含選自SEQ ID NOs :2_4的序列的 RNAi構(gòu)建體。在某些實(shí)施方案中，核酸是包含選自SEQ ID NOs :5_82的序列的RNAi構(gòu)建 體。在其他實(shí)施方案中，核酸可以是酶促核酸，例如核酶或DNA酶。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，任一公開的核酸可以是RNAi構(gòu)建體，例如，dsRNA或 發(fā)夾RNA。RNAi構(gòu)建體的雙鏈體部分在長(zhǎng)度上可以是大約15至大約30個(gè)核苷酸。在公開的實(shí)施方案的任一個(gè)中，核酸任選地包含一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的主鏈或堿基 部分，其中所述經(jīng)修飾的主鏈或堿基部分可包含一個(gè)或多個(gè)下列部分烷基膦酸酯、硫代磷 酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯(alkylphosphonothioates)、氨基磷酸酯、磷酸酯、氨 甲酸酯、乙酰胺酯(acetamidate)、羧甲酯(carboxylmethyl esters)、碳酸酯和磷酸三酯。 被修飾的主鏈或堿基部分任選地包含至少一個(gè)2' -0-烷基化核糖核苷酸。在某些實(shí)施方案中，上述核酸和/或任何上述可應(yīng)用組合的核酸，當(dāng)在生理?xiàng)l件 下，例如以大約10或大約20nM的濃度與細(xì)胞接觸時(shí)，可抑制細(xì)胞中的EPASl表達(dá)50%或更高。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及包含任何公開的實(shí)施方案的核酸和藥學(xué)上可接受的載 體的藥物組合物。在某些實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的載體包括陽(yáng)離子聚合物。所述藥學(xué)上可接受 的載體還可包括環(huán)糊精聚合物，例如im-⑶P。在某些實(shí)施方案中，所述藥物組合物可包含顆 粒，所述顆粒包含環(huán)糊精聚合物和任何所述公開的核酸和/或是被PEG化的。在其他實(shí)施方案中，藥物組合物的顆粒還可包含金剛烷。在一些實(shí)施方案中，藥 物組合物包含靶向特定組織或細(xì)胞類型的配體，其中所述配體任選地包括轉(zhuǎn)鐵蛋白。在 某些實(shí)施方案中，藥物組合物包含納米顆粒，其中所述納米顆粒在直徑上為大約10至大約 lOOnm，例如直徑為大約50至大約70nm，例如直徑為大約50nm。在另外的實(shí)施方案中，所述藥學(xué)上可接受的載體包括含有咪唑_修飾的環(huán)糊精 的陽(yáng)離子聚合物和含有金剛烷-PEG-配體的靶向部分，其中所述聚合物和靶向部分形成 封裝所述核酸的納米顆粒。納米顆粒的直徑為大約50至大約120nm，例如大約50至大約 lOOnm，例如大約50至大約70nm，或甚至大約50nm。例如，藥物組合物的靶向配體可包括 半乳糖和/或轉(zhuǎn)鐵蛋白。在另外的方面，本發(fā)明涉及任何所述公開的核酸在制造用于治療與不希望的細(xì)胞 增殖相關(guān)的疾病或狀況的藥劑中的用途。所述細(xì)胞可以是癌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞或病原性細(xì)胞 (pathogenic cell)。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞可以是其不期望的增殖導(dǎo)致所述疾病或 狀況的正常細(xì)胞。本發(fā)明的其他方面涉及用于治療癌癥患者的方法，其包括給患者施用治療有效量 的任何上述核酸。在某些實(shí)施方案中，所述方法還可包括施用至少一種另外的抗癌化療藥 物，例如氟尿嘧啶(5FU)，所述抗癌化療藥物例如以加成或協(xié)同的方式與該核酸一起抑制癌 細(xì)胞的增殖。在一些實(shí)施方案中，癌細(xì)胞與來自可比較組織的非癌細(xì)胞相比較而言表達(dá)更 高水平的EPASl。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治療癌癥患者的方法，其包括給患者施用治療 有效量的雙鏈核酸(所述雙鏈核酸通過RNAi機(jī)制降低EPASl的表達(dá))和一種或多種誘導(dǎo) EPASl表達(dá)的抗癌劑。在上文或其他地方描述的任何方法中，可用藥學(xué)上可接受的載體配制所述核酸。 在某些實(shí)施方案中，可用靶向癌細(xì)胞例如腎透明細(xì)胞癌的配體配制所述核酸，例如其中所 述配體任選地包括轉(zhuǎn)鐵蛋白和/或半乳糖)?？蓪⒑怂崤渲茷榫酆衔锛{米顆粒的組分，其中 所述納米顆粒在直徑上可為大約10至大約120nm，例如大約50至大約120nm，例如大約50 至大約IOOnm或甚至大約50nm。在本文中公開的任一方法中，可全身性施用治療有效量的所述核酸。本文中描述的方法還可包括在施用所述核酸之前測(cè)定患者中von Hippel-Landau(VHL)蛋白的水平。例如，可通過測(cè)量與健康受試者相比較而言患者中VHL 的RNA或蛋白質(zhì)水平的降低來測(cè)定所述活性。在其他實(shí)施方案中，可通過遺傳篩查鑒定VHL 基因中的一個(gè)或多個(gè)突變來測(cè)定所述活性，其中所述一個(gè)或多個(gè)突變包括引起截短的突變 或可引起等位基因丟失的突變。此外，所述一個(gè)或多個(gè)突變可包含無(wú)義突變、移碼突變、啟 動(dòng)子突變、增強(qiáng)子突變、剪接位點(diǎn)突變、無(wú)效突變或多聚腺苷酸尾突變。發(fā)明詳述
概述
EPASl的激活導(dǎo)致HI F靶基因，特別是編碼VEGF、TGF- α、Met、基質(zhì)細(xì)胞衍生因 子(SDF)-I和趨化因子受體CXCR4等的基因的上調(diào)(Soccio等人，Jour. Biol. Chem. 280 19410-19418,2005 ；Kim和 Kaelin，J. Clin. Onocology 22 :4991-5004,2004)。因此，其是一 種期望的癌癥治療靶。特別地，EPASl的上調(diào)與腎細(xì)胞癌密切相關(guān)，并且部分地歸因于其與 von Hippel-Lindau腫瘤抑制基因(VHL)的關(guān)聯(lián)。VHL的失活與各種VHL相關(guān)異常，特別地 腎透明細(xì)胞癌(RCC)的發(fā)生有關(guān)聯(lián)。VHL基因產(chǎn)物pVHL是識(shí)別HIF的α亞基和將其靶向 多遍在蛋白化作用(polyubiquitination)和蛋白酶體降解的復(fù)合體的部分。因此，VHL-缺 陷型癌細(xì)胞具有增加水平的HIF，從而使得它們是用于降低細(xì)胞HIF水平的治療的良好候 選者。
EPASl的抑制可通過抑制細(xì)胞中EPASl的生物學(xué)活性例如其酶促活性來實(shí)現(xiàn)。備 選地，EPASl的抑制可通過抑制細(xì)胞中EPASl基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。小分子和核酸可供用于 下調(diào)EPASl活性和/或表達(dá)。一些實(shí)例包括反義分子(例如，美國(guó)專利7，217，57 和短發(fā) 夾 RNA(如 Kondo 等人 1(3) :439-444,2003 和 Zimmer 等人 2 :89-95,2004 中描述的)。然 而，仍然期望擁有新型和改進(jìn)的EPASl抑制劑作為下調(diào)EPASl的新型工具。
核酸EPASl抑制劑
在某些方面，本發(fā)明提供了 EPASl基因的核酸抑制劑和用于例如通過減少或下調(diào) EPASl基因的表達(dá)來抑制或降低EPASl基因或蛋白的活性的方法?！耙种啤被颉敖档汀币庵?該基因的表達(dá)或編碼一種或多種蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)亞基的核酸或等價(jià)核酸的水平被降低至 低于在本發(fā)明的核酸試劑不存在時(shí)觀察到的水平。
如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“核酸”或“核酸試劑”是指含有核苷酸并且具有期望的對(duì) EPASl基因的效果的任何基于核酸的化合物。核酸可以是單鏈、雙鏈或多鏈的，并且可包含 經(jīng)修飾或未修飾的核苷酸或非核苷酸或各種混合物和其組合。本發(fā)明的核酸試劑的實(shí)例包 括但不限于dsRNA、siRNA和酶促核酸。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了被靶向一個(gè)或多個(gè)物種(包括真核生物或原核 生物)的EPASl基因或mRNA的核酸抑制劑。在某些實(shí)施方案中，可將所述核酸抑制劑設(shè)計(jì) 成能夠特異性抑制來自某些物種的EPASl基因或mRNA序列的表達(dá)但不抑制來自其他物種 的EPASl基因或mRNA的表達(dá)。例如，可用于治療病原體感染的核酸抑制劑可設(shè)計(jì)成能夠特 異性抑制病原體中EPASl基因或mRNA的表達(dá)但不抑制宿主的EPASl基因或mRNA的表達(dá)。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了被靶向到EPASl基因內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)特定區(qū)域 的EPASl基因核酸抑制劑。人EPASl基因內(nèi)的示例性區(qū)域包括下文表1(也參見圖1)中顯 示的核心靶區(qū)域。核心靶序列通常是指在被抑制劑核酸例如dsRNA、siRNA或酶促核酸序列 特異性結(jié)合后有效地抑制EPASl表達(dá)的靶EPASl基因或相應(yīng)mRNA的部分。一般地，核酸抑 制劑可在嚴(yán)格條件下與包含核心靶序列的EPASl蛋白區(qū)域，或包含側(cè)翼連接EPASl基因或 mRNA序列內(nèi)核心靶序列的一個(gè)或兩個(gè)末端的5、10或20個(gè)核苷酸的EPASE基因或mRNA部 分(例如核心靶位點(diǎn)+/-5、+/-10或+/-20個(gè)核苷酸(在任一端或兩端上))雜交。表1中 顯示的核心靶序列是從人EPASl序列獲得的；然而，來自其他物種包括真核生物例如其他 哺乳動(dòng)物的EPASl序列中的等同區(qū)域也包括在本文中。
表1. EPASl的核心靶序列(HIF2 α )的實(shí)例
權(quán)利要求
1. 一種核酸，其包含(i)包含選自SEQ ID NOs 2~4的序列的在長(zhǎng)度上為大約15至大約30個(gè)核苷酸的第 一鏈，和( )在長(zhǎng)度上為大約5至大約30個(gè)核苷酸的第二鏈，其中第一鏈與第二鏈的至少12個(gè)核苷酸彼此互補(bǔ)并且在生理?xiàng)l件下形成雙鏈核酸， 以及其中所述雙鏈核酸可通過RNA干擾機(jī)制降低內(nèi)皮PAS結(jié)構(gòu)域蛋白I(EPASl)在細(xì)胞中 的表達(dá)。
2.權(quán)利要求1的核酸，其中所述核酸是雙鏈RNA。
3.權(quán)利要求2的核酸，其中所述雙鏈部分任選地在長(zhǎng)度上為大約15至大約30個(gè)核苷酸。
4.權(quán)利要求1的核酸，其中所述核酸是發(fā)夾RNA。
5.權(quán)利要求4的核酸，其中所述發(fā)夾RNA包含具有在長(zhǎng)度上為大約4至大約10個(gè)核苷 酸的環(huán)區(qū)域。
6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸，其中所述第一鏈?zhǔn)荄NA多核苷酸，并且所述第二鏈 是RNA多核苷酸。
7.權(quán)利要求6的核酸，其中所述第一和/或第二鏈還包含3'突出區(qū)域、5'突出區(qū)域 或3'和5'突出區(qū)域。
8.權(quán)利要求7的核酸，其中所述突出區(qū)域在長(zhǎng)度上為大約1至大約10個(gè)核苷酸。
9.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸，其中所述第一鏈包含選自SEQID NOs :5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79和 81 的序列。
10.權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的核酸，其中所述第二鏈包含選自SEQIDNO :6、8、10、12、 14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80和 82 的序列。
11.一種分離的核酸，其中包含在生理?xiàng)l件下與EPASl轉(zhuǎn)錄物中對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:1內(nèi) 核苷酸655-718、2878-2929或4978-5039的區(qū)域發(fā)生雜交并且降低EPASl在細(xì)胞中的表達(dá) 的序列。
12.權(quán)利要求11的分離的核酸，其中所述核酸包含與EPASl轉(zhuǎn)錄物中對(duì)應(yīng)于SEQID NO 1內(nèi)核苷酸66-708、2888-2919或4988-5029的區(qū)域發(fā)生雜交的序列。
13.權(quán)利要求11的核酸，其中所述核酸包含與EPASl轉(zhuǎn)錄物中對(duì)應(yīng)于SEQID NO=I內(nèi) 核苷酸670-703，2893-2914或4992-5024的區(qū)域發(fā)生雜交的序列。
14.權(quán)利要求11至13中任一項(xiàng)的核酸，其中所述核酸是單鏈的。
15.權(quán)利要求11至13中任一項(xiàng)的核酸，其中所述核酸是雙鏈的。
16.權(quán)利要求11至15中任一項(xiàng)的核酸，其中所述核酸包含與EPASl的所述區(qū)域中的一 個(gè)互補(bǔ)的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸。
17.權(quán)利要求11至16中任一項(xiàng)的核酸，其中所述核酸在長(zhǎng)度上為大約14至大約50個(gè) 核苷酸。
18.權(quán)利要求11至17中任一項(xiàng)的核酸，其中所述核酸是RNA分子。
19.權(quán)利要求11至17中任一項(xiàng)的核酸，其中所述核酸是DNA分子。
20.權(quán)利要求11至17中任一項(xiàng)的核酸，其中所述核酸包含DNA鏈和RNA鏈。
21.權(quán)利要求11至20中任一項(xiàng)的核酸，其中所述核酸是包含選自SEQID NOs 2~4的 序列的RNAi構(gòu)建體。
22.權(quán)利要求11至20中任一項(xiàng)的核酸，其中所述核酸是包含選自SEQID NOs :5_82的 序列的RNAi構(gòu)建體。
23.權(quán)利要求11至22中任一項(xiàng)的核酸，其中所述核酸是酶促核酸。
24.權(quán)利要求23的核酸，其中所述酶促核酸是核酶。
25.權(quán)利要求23的核酸，其中所述酶促核酸是DNA酶。
26.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸，其中所述核酸是RNAi構(gòu)建體。
27.權(quán)利要求26的核酸，其中所述RNAi構(gòu)建體是dsRNA。
28.權(quán)利要求27的核酸，其中所述RNAi構(gòu)建體是發(fā)夾RNA。
29.權(quán)利要求27的核酸，其中所述RNAi構(gòu)建體的雙鏈體部分在長(zhǎng)度上為大約15至大 約30個(gè)核苷酸。
30.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸，其中所述核酸任選地包含一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的主 鏈或堿基部分。
31.權(quán)利要求30的核酸，其中所述經(jīng)修飾的主鏈或堿基部分包含下列中的一個(gè)或多 個(gè)烷基膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、磷酸酯、氨甲酸 酯、乙酰胺酯、羧甲酯、碳酸酯和磷酸三酯。
32.權(quán)利要求30任一項(xiàng)的核酸，其中所述經(jīng)修飾的主鏈或堿基部分包含至少一個(gè) 2' -0-烷基化核糖核苷酸。
33.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸，其中，當(dāng)在生理?xiàng)l件下以IOnM的濃度與細(xì)胞接觸 時(shí)，所述核酸抑制該細(xì)胞中的EPASl表達(dá)50%或更多。
34.包含前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
35.權(quán)利要求34的藥物組合物，其中所述藥學(xué)上可接受的載體包括陽(yáng)離子聚合物。
36.權(quán)利要求34的藥物組合物，其中所述藥學(xué)上可接受的載體包括環(huán)糊精聚合物。
37.權(quán)利要求36的藥物組合物，其中所述環(huán)糊精結(jié)構(gòu)是im-⑶P。
38.權(quán)利要求34的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含顆粒，所述顆粒包含環(huán)糊精 聚合物和權(quán)利要求1至33中任一項(xiàng)的核酸并且是PEG化的。
39.權(quán)利要求38的藥物組合物，其中所述顆粒還包含金剛烷。
40.權(quán)利要求34的藥物組合物，其還包含靶向特定組織或細(xì)胞類型的配體。
41.權(quán)利要求40的藥物組合物，其中所述配體包括轉(zhuǎn)鐵蛋白。
42.權(quán)利要求34的藥物組合物，其包含納米顆粒，其中所述納米顆粒的直徑為大約10 至大約IOOnm.
43.權(quán)利要求42的藥物組合物，其中所述納米顆粒的直徑為大約50至大約70nm.
44.權(quán)利要求43的藥物組合物，其中所述納米顆粒的直徑任選地為大約50nm。
45.權(quán)利要求34的藥物組合物，其中所述藥學(xué)上可接受的載體包含含有咪唑修飾的環(huán)糊精的陽(yáng)離子聚合物，和包含金剛烷-PEG-配體的靶向部分，其中所述聚合物和靶向部分形成封裝核酸的納米顆粒。
46.權(quán)利要求45的藥物組合物，其中所述納米顆粒具有大約50至大約120nm的直徑。
47.權(quán)利要求46的藥物組合物，其中所述納米顆粒具有大約50至大約IOOnm的直徑。
48.權(quán)利要求47的藥物組合物，其中所述納米顆粒具有大約50至大約70nm的直徑。
49.權(quán)利要求45的藥物組合物，其中所述納米顆粒具有大約50nm的直徑。
50.權(quán)利要求45的藥物組合物，其中所述靶向配體包含半乳糖。
51.權(quán)利要求45的藥物組合物，其中所述靶向配體包含轉(zhuǎn)鐵蛋白。
52.權(quán)利要求1至33中任一項(xiàng)的核酸用于制造藥劑的用途，所述藥劑用于治療與不期 望的細(xì)胞增殖相關(guān)的疾病或狀況。
53.權(quán)利要求52的用途，其中所述細(xì)胞是癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞。
54.權(quán)利要求52的用途，其中所述細(xì)胞是病原體細(xì)胞。
55.權(quán)利要求52的用途，其中所述細(xì)胞是正常細(xì)胞，其不期望的增殖導(dǎo)致所述疾病或 狀況。
56.用于治療癌癥患者的方法，其包括給該患者施用治療有效量的權(quán)利要求1至33中 任一項(xiàng)的核酸。
57.權(quán)利要求56的方法，其還包括施用至少一種另外的抗癌化療藥物，所述化療藥物 以加成或協(xié)同方式與所述核酸一起抑制癌細(xì)胞的增殖。
58.權(quán)利要求57的方法，其中所述化療藥物任選地是氟尿嘧啶(5FU)。
59.權(quán)利要求56的方法，其中所述癌細(xì)胞與來自可比較組織的非癌細(xì)胞相比較而言表 達(dá)更高水平的EPASl。
60.治療癌癥患者的方法，其包括給所述患者施用治療有效量的雙鏈核酸和一種或多 種誘導(dǎo)EPASl表達(dá)的抗癌藥，所述雙鏈核酸通過RNAi機(jī)制降低EPASl的表達(dá)。
61.權(quán)利要求56至60中任一項(xiàng)的方法，其中使用藥學(xué)上可接受的載體配制所述核酸。
62.權(quán)利要求56至60中任一項(xiàng)的方法，其中使用靶向癌細(xì)胞的配體配制所述核酸。
63.權(quán)利要求62的方法，其中所述癌細(xì)胞是腎透明細(xì)胞癌，并且所述配體包括轉(zhuǎn)鐵蛋白。
64.權(quán)利要求62的方法，其中所述配體是半乳糖。
65.權(quán)利要求56至60中任一項(xiàng)的方法，其中將所述核酸配制為聚合物納米顆粒的成分。
66.權(quán)利要求65的方法，其中所述納米顆粒的直徑為大約10至大約120nm。
67.權(quán)利要求66的方法，其中所述納米顆粒的直徑為大約50至大約120nm。
68.權(quán)利要求67的方法，其中所述納米顆粒的直徑為大約50至大約lOOnm。
69.權(quán)利要求65的方法，其中所述納米顆粒的直徑為大約50nm。
70.權(quán)利要求56至69中任一項(xiàng)的方法，其中全身性施用治療有效量的所述核酸。
71.權(quán)利要求56至70中任一項(xiàng)的方法，其還包括在施用該核酸之前測(cè)定患者中von Hippel-Landau(VHL)蛋白活性的水平。
72.權(quán)利要求71的方法，其中通過測(cè)量與健康受試者相比較而言患者中VHL的RNA或 蛋白質(zhì)水平的下降來測(cè)定所述活性。
73.權(quán)利要求71的方法，其中利用遺傳篩查鑒定VHL基因中的一個(gè)或多個(gè)突變來測(cè)定 所述活性。
74.權(quán)利要求73的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)突變包括引起截短的突變或引起等位基 因丟失的突變。
75.權(quán)利要求73的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)突變包括無(wú)義突變、移碼突變、啟動(dòng)子突 變、增強(qiáng)子突變、剪接位點(diǎn)突變、無(wú)效突變和多聚腺苷酸尾突變。
全文摘要
本發(fā)明涉及內(nèi)皮PAS結(jié)構(gòu)域蛋白1(EPAS1)的抑制劑以及與EPAS1抑制劑相關(guān)的方法和組合物。在某些實(shí)施方案中，EPAS1抑制劑包括核酸，例如siRNA。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102037123SQ200980118798
公開日2011年4月27日 申請(qǐng)日期2009年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月4日
發(fā)明者J·D·海德爾, J·Y-C·劉, M·E·戴維斯 申請(qǐng)人:卡蘭多制藥股份有限公司