一種超輕水干細胞培養(yǎng)基的制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及干細胞培養(yǎng)技術領域，尤其涉及一種以超輕水為溶劑的干細胞培養(yǎng)基。
【背景技術】
[0002]近年來，使用干細胞的技術被認為是治療不可治愈疾病的新途徑。干細胞是一種能夠不斷自我更新的細胞，并能增生、分裂、分化成其他各種成熟的細胞。干細胞可按不同的標準進行分類。按它們的來源可分為胚胎干細胞，骨髓干細胞和臍帶血干細胞；按它們的增生和分化的能力可分為全潛能、多潛能和單潛能的干細胞；按它們的所能夠分化成的細胞可分為神經(jīng)干細胞、心肌干細胞、血液干細胞等；按它們的成熟的程度可分為胚胎干細胞和成熟組織干細胞。
[0003]諸多研究表明干細胞不僅可以自我更新，在條件合適的情況下能分化成其他功能細胞，因此干細胞有望成為治療人類疑難疾病的有效手段。然而，干細胞在正常成體組織中含量甚微，在體外如何快速擴增與培養(yǎng)干細胞是研究干細胞的作用機制及探索其在人類疾病治療方法的重要技術。
[0004]水(H2O)由2個氫原子和I個氧原子組成，氫原子有3個同位素:質(zhì)量為I的氫
(H)，也稱氕，與氧原子結合生成輕水(H2O);質(zhì)量為2的重氫(D)，也稱氘，與氧原子結合生成重水(D2O);質(zhì)量為3的超重氫(T)，也稱氚，它含量極微，可忽略不計。普通水中，氘和氕的比率(D/Η)大約是1: 6600，即水中的體積分數(shù)為0.015% (150mg/L)。通常把氘體積分數(shù)低于0.015%的水稱為低氖水(deuterium-depleted water，DDW)，又稱超輕水。超輕水中的氘量低于天然水，是采用先進技術，把自然界水中的一部分氘去掉，降低了水中的氘含量。
[0005]國際最新研究結果和科學試驗表明:氘對生命體的生存和繁衍有害，進入生命體后很難代謝出去，高含量的氘對生命體的代謝、遺傳、酶素等都有不良影響，是一種導致生物衰老、病變、癌變及至死亡的有害物質(zhì)。而含氘量偏低的超輕水，進入生命體后具有吸收快、滲透力高、溶解力強的特點，能有效代謝生命體的物質(zhì)，吸納有益營養(yǎng)，排除有害物質(zhì)。這些情況對動物如此，對植物如此，對人類也是如此。
[0006]超輕水具有促進干細胞增殖的效果，延長干細胞細胞的傳代次數(shù)，不影響其分化的潛能，具有很高的科研和醫(yī)學應用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供一種以超輕水為溶劑的干細胞培養(yǎng)基。
[0008]本發(fā)明采用的技術方案如下:
[0009]—種超輕水干細胞培養(yǎng)基，包括基礎培養(yǎng)基、培養(yǎng)基添加劑、超輕水，所述基礎培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基。
[0010]所述培養(yǎng)基添加劑為:人血白蛋白5_25g/L，植物源性重組人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白l-10g/L，α I 酸性糖蛋白 0.l_5g/L，a 2-HS-糖蛋白 0.l_5g/L，載脂蛋白 A I 0.05_5g/L，載脂蛋白A II 0.05-5g/L，血液結合素0.01_2g/L，腺苷脫氨酶0.05_5g/L，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白0.03-2g/L，人轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白0.01-2g/L，胰島素或類胰島素功能替代品0.01-lg/Lo
[0011]更進一步地，所述培養(yǎng)基添加劑為:人血白蛋白7-20g/L，植物源性重組人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白l_7g/L，α I酸性糖蛋白0.5_3g/L，a 2_HS_糖蛋白0.5_3g/L，載脂蛋白A I
0.l_3g/L，載脂蛋白A II 0.l_3g/L，血液結合素0.02-1.5g/L，腺苷脫氨酶0.l_2g/L，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白0.05-2g/L，人轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白0.01-1.5g/L，胰島素或類胰島素功能替代品 0.01-0.8g/L0
[0012]更進一步地，所述培養(yǎng)基添加劑為:人血白蛋白15g/L，植物源性重組人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白2g/L，α I酸性糖蛋白0.7/L，a 2_HS_糖蛋白0.7g/L，載脂蛋白A I 0.3g/L，載脂蛋白A II 0.3g/L，血液結合素0.lg/L，腺苷脫氨酶0.15g/L，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白0.lg/L，人轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白0.05g/L，胰島素或類胰島素功能替代品0.04g/Lo
[0013]更進一步地，所用的超輕水含氘量為50ppm。
[0014]更進一步地，所述的干細胞培養(yǎng)基，其中，所述干細胞培養(yǎng)基pH值為7.2。
[0015]本發(fā)明提供的培養(yǎng)基中除常規(guī)培養(yǎng)細胞所需培養(yǎng)基成分，特別加入超輕水，以超輕水為溶劑，溶解培養(yǎng)基中其他成分。通過查閱相關文獻時發(fā)現(xiàn)，超輕水具有促進前成骨細胞MC3T3-E1增殖的效果，對正常前成骨細胞MC3T3-E1細胞克隆形成有促進作用，并且不影響正常細胞前成骨細胞MC3T3-E1細胞核增殖抗原PCNA蛋白的表達水平的效果。所以特別添加到干細胞培養(yǎng)基中，進行干細胞培養(yǎng)。
[0016]本發(fā)明提供的一種干細胞培養(yǎng)基，與常規(guī)培養(yǎng)基相比，該培養(yǎng)基能大大加速干細胞的生長速度并延長干細胞細胞的傳代次數(shù)，又不影響其分化的潛能。
【附圖說明】
[0017]圖1為本發(fā)明的培養(yǎng)基對人體骨髓間干細胞增殖的加速作用的實驗結果。
[0018]圖2為本發(fā)明的培養(yǎng)基對人體臍帶干細胞增殖的加速作用的實驗結果。
【具體實施方式】
[0019]本發(fā)明提供的一種干細胞培養(yǎng)基，對其具體操作方法進行進一步闡述。
[0020]實施例1，第一種超輕水配置培養(yǎng)基
[0021]基礎培養(yǎng)基的配制:將DMEM/F12培養(yǎng)基干粉溶解于800ml滅菌的超輕水中，加入3g NaHCO3,用pH計調(diào)節(jié)pH至7.2，定容至100ml0
[0022]本發(fā)明所述培養(yǎng)基添加劑為:人血白蛋白15g/L，植物源性重組人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白2g/L，α?酸性糖蛋白0.7/L，a2-HS_糖蛋白0.7g/L，載脂蛋白A I 0.3g/L，載脂蛋白AII 0.3g/L，血液結合素0.lg/L，腺苷脫氨酶0.15g/L，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白0.lg/L，人轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白0.05g/L，胰島素或類胰島素功能替代品0.04g/Lo
[0023]用基礎培養(yǎng)基溶解上述培養(yǎng)基添加劑，再用pH計調(diào)節(jié)pH至7.2，用0.22 μ m的濾膜過濾除菌，在4°C下避光保存。
[0024]實施例2，第二種超輕水配置培養(yǎng)基
[0025]基礎培養(yǎng)基的配制:將DMEM/F12培養(yǎng)基干粉溶解于800ml滅菌的超輕水中，加入3g NaHCO3,用pH計調(diào)節(jié)pH至7.2，定容至100ml0
[0026]本發(fā)明所述培養(yǎng)基添加劑為:人血白蛋白5g/L，植物源性重組人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白lg/L, α I酸性糖蛋白0.1/L, a 2_HS_糖蛋白0.lg/L，載脂蛋白A I 0.05g/L，載脂蛋白AII 0.05g/L，血液結合素0.01g/L，腺苷脫氨酶0.05g/L，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白0.03g/L，人轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白0.01g/L，胰島素或類胰島素功能替代品0.01g/Lo
[0027]用基礎培養(yǎng)基溶解上述培養(yǎng)基添加劑，再用pH計調(diào)節(jié)pH至7.2，用0.22 μ m的濾膜過濾除菌，在4°C下避光保存。
[0028]實施例3，第三種超輕水配置培養(yǎng)基
[0029]基礎培養(yǎng)基的配制:將DMEM/F12培養(yǎng)基干粉溶解于800ml滅菌的超輕水中，加入3g NaHCO3,用pH計調(diào)節(jié)pH至7.2，定容至100ml0
[0030]本發(fā)明所述培養(yǎng)基添加劑為:人血白蛋白25g/L，植物源性重組人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白10g/L，α I酸性糖蛋白5/L，a 2_HS_糖蛋白5g/L，載脂蛋白A I 5g/L，載脂蛋白A II 5g/L，血液結合素2g/L，腺苷脫氨酶5g/L，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白2g/L，人轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白2g/L，胰島素或類胰島素功能替代品lg/L。
[0031]用基礎培養(yǎng)基溶解上述培養(yǎng)基添加劑，再用pH計調(diào)節(jié)pH至7.2，用0.22 μ m的濾膜過濾除菌，在4°C下避光保存。
[0032]實施例4，人體骨髓間干細胞培養(yǎng)
[0033]測試培養(yǎng)基:常規(guī)培養(yǎng)基組分:DMEM/F12基本培養(yǎng)基，10%胎牛血清(FBS);本發(fā)明的培養(yǎng)基。
[0034]受試的干細胞為人體骨髓間干細胞。
[0035]將細胞按照10-20%的密度接種，接種后加入培養(yǎng)基培養(yǎng)(37°C，5% C02)。通過MTT法每隔12小時測一次細胞密度。
[0036]圖1為本實施例的實驗結果，從圖中可以看出，經(jīng)本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)的干細胞比經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞表現(xiàn)出增殖速率快，得到的細胞數(shù)量多，代次間穩(wěn)定。
[0037]實施例5，人體臍帶干細胞培養(yǎng)
[0038]測試培養(yǎng)基:常規(guī)培養(yǎng)基組分:DMEM/F12基本培養(yǎng)基，10%胎牛血清(FBS);本發(fā)明的培養(yǎng)基。
[0039]受試的干細胞為人體臍帶干細胞。將細胞按照10-20%的密度接種，接種后加入培養(yǎng)基培養(yǎng)(37°C，5% C02)。通過MTT法每隔12小時測一次細胞密度。
[0040]圖2為本實施例的實驗結果，從圖中可以看出，經(jīng)本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)的干細胞比經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞表現(xiàn)出增殖速率快，得到的細胞數(shù)量多，代次間穩(wěn)定。由此，采用本發(fā)明的培養(yǎng)基對干細胞的擴增與常規(guī)的培養(yǎng)基相比達到100%細胞密度的時間大大縮短。
【主權項】
1.一種以超輕水為溶劑的干細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基組分包括基礎培養(yǎng)基、培養(yǎng)基添加劑、超輕水；培養(yǎng)基添加劑為:人血白蛋白5-25g/L，植物源性重組人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白l-10g/L，α I酸性糖蛋白0.l_5g/L，a 2_HS_糖蛋白0.l_5g/L，載脂蛋白A I0.05-5g/L，載脂蛋白A II 0.05-5g/L，血液結合素0.01_2g/L，腺苷脫氨酶0.05_5g/L，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白0.03-2g/L，人轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白0.01-2g/L，胰島素或類胰島素功能替代品 0.0l-lg/Lo2.根據(jù)權利要求1所述的干細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基添加劑為:人血白蛋白7_20g/L，植物源性重組人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白l_7g/L，α I酸性糖蛋白0.5_3g/L，a 2_HS_糖蛋白 0.5-3g/L，載脂蛋白 A I 0.l_3g/L，載脂蛋白 A II 0.l_3g/L，血液結合素 0.02-1.5g/L，腺苷脫氨酶0.l_2g/L，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白0.05-2g/L，人轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白0.01-1.5g/L，膜島素或類膜島素功能替代品0.01-0.8g/L03.根據(jù)權利要求2所述的干細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基添加劑為:人血白蛋白15g/L，植物源性重組人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白2g/L，α I酸性糖蛋白0.7/L，a 2_HS_糖蛋白0.7g/L，載脂蛋白A I 0.3g/L，載脂蛋白A II 0.3g/L，血液結合素0.lg/L，腺苷脫氨酶0.15g/L，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白0.lg/L，人轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白0.05g/L，胰島素或類胰島素功能替代品0.04g/Lo4.根據(jù)權利要求1或2或3所述的干細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述基礎培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基。5.根據(jù)權利要求1或2或3所述的干細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述的超輕水含氘量為50ppmo6.根據(jù)權利要求4所述的干細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述的超輕水含氘量為50ppm。7.根據(jù)權利要求1或2或3或6所述的干細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述干細胞培養(yǎng)基pH值為7.2。8.根據(jù)權利要求4所述的干細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述干細胞培養(yǎng)基pH值為7.2。9.根據(jù)權利要求5所述的干細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述干細胞培養(yǎng)基pH值為7.2。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種以超輕水為溶劑配制的干細胞培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基特點在于是以超輕水為溶劑。本發(fā)明提供的培養(yǎng)基能夠快速擴增干細胞，同時又不影響干細胞的潛能，使干細胞擴增速度是常規(guī)培養(yǎng)基的3倍以上。并適用于多種干細胞的培養(yǎng)。具有很高的研究應用價值。
【IPC分類】C12N5/071, C12N5/0775
【公開號】CN105154396
【申請?zhí)枴緾N201510673253
【發(fā)明人】柯香文
【申請人】大連世紀新源技術開發(fā)有限公司
【公開日】2015年12月16日
【申請日】2015年10月16日