使用特異性和選擇性電場與電磁場調(diào)節(jié)干細胞基因生產(chǎn)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明描述的方法和裝置用于通過對骨細胞或含干細胞的其他組織是特異性和選擇性的電場和/或電磁場的電容耦合或電感耦合，調(diào)節(jié)干細胞中BMP2和4，TGF-β1、2和3，F(xiàn)GF-2，骨鈣素和堿性磷酸酶mRNA，其中通過向相對于干細胞布置的電極或一個或多個線圈或其他場生成裝置施加特異性和選擇性信號，生成所述特異性和選擇性的場，使得便于治療患病或受傷的骨和其他組織。
【專利說明】使用特異性和選擇性電場與電磁場調(diào)節(jié)干細胞基因生產(chǎn)
[0001] 對相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本專利申請是2011年9月23日提交的美國專利申請?zhí)?3/242, 606的部分延續(xù) 案，所述美國專利申請是2008年7月3日提交的美國專利申請?zhí)?2/167, 283 (現(xiàn)為美國專 利8, 065, 015)的延續(xù)，美國專利申請?zhí)?2/167, 283是2002年10月8日提交的美國專利申 請?zhí)?0/257, 126 (現(xiàn)為美國專利7, 465, 566)的延續(xù)，美國專利申請?zhí)?0/257, 126是2001 年2月23日提交的PCT/US01/05991的美國國家階段，其要求于2000年2月23日提交的 美國臨時申請?zhí)?0/184, 491的優(yōu)先權(quán)。這些申請的內(nèi)容通過引用以其整體并入本文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及通過施加適當?shù)碾妶龌螂姶艌龆险{(diào)干細胞中可被誘導(dǎo)以調(diào)節(jié)骨和 軟骨生長和修復(fù)的那些基因的表達的方法。所述基因包括骨形態(tài)發(fā)生基因 （特別是BMP 2 和4)、轉(zhuǎn)化生長因子β基因（TGF-β1、2和3)、成纖維細胞生長因子-2 (FGF-2)，以及控制 活的干細胞中堿性磷酸酶和骨鈣素表達的基因。通過將特異性和選擇性的電信號和電磁信 號施加到線圈、電極或其他的場產(chǎn)生裝置而生成電場和電磁場，將所述場施加到受傷或患 病的骨、軟骨和其它組織以進行治療。

【背景技術(shù)】
[0004] 雖然近來有大量關(guān)于某些組織和細胞的生長和修復(fù)的相互作用及活性的研究，卻 很少或幾乎沒有對電場和/或電磁場對干細胞的影響及這種被刺激的細胞可能對骨、軟骨 和其它組織的生長和修復(fù)的作用的研究。這樣的研究可能在開發(fā)對各種醫(yī)療問題的新的治 療上有用。
[0005] BMP家族的基因包括那些在促進骨形成和維持、從前成骨細胞的增殖、到前成骨細 胞向成熟的成骨細胞的分化、以及對成骨細胞在其整個壽命中的維持中重要的生長因子。 轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β 1、2和3)控制許多細胞功能，包括生長、增殖和分化。成纖維細胞生 長因子（FGF-2)已被證明對正常無傷的動物中的骨形成具有積極的同化作用，并在骨質(zhì)疏 松癥實驗?zāi)Ｐ椭袦p少骨質(zhì)流失。FGF-2(也稱為堿性成纖維細胞生長因子或bFGF)刺激骨形 成，減少破骨細胞的表面，并且在骨的骨髓腔中誘導(dǎo)新的骨針。
[0006] 因此，上調(diào)以上所討論的基因?qū)⒃谥委熗ǔ１环Q為骨質(zhì)疏松癥、其中骨去礦物質(zhì) 且變得異常稀薄的疾病的治療中有用。在骨質(zhì)疏松癥中，骨吸收超過骨形成，從而導(dǎo)致骨弱 化和可能的椎體骨折和塌陷。雖然骨質(zhì)疏松癥通常被認為只折磨老人，然而某些類型的骨 質(zhì)疏松癥可能會影響骨骼沒有經(jīng)受機能性應(yīng)力的各年齡段的人。在這些情況下，患者在長 時間的固定不活動期間可能會經(jīng)歷密質(zhì)骨和松質(zhì)骨的嚴重損失。已知老年患者在骨折后固 定時因廢用而出現(xiàn)骨質(zhì)流失，而這種骨質(zhì)流失可能最終導(dǎo)致在已經(jīng)骨質(zhì)疏松的骨架上發(fā)生 繼發(fā)性骨折。骨密度降低不僅可能導(dǎo)致椎骨塌陷，而且會導(dǎo)致臀部、下臂、手腕、腳踝骨折， 以及失能的痛苦。需要有可選擇的非手術(shù)療法以在這些疾病中誘導(dǎo)骨形成。
[0007] 自從1979年由美國食品和藥物管理局批準后，脈沖電磁場（PEMF)和電容耦合 (CO已被廣泛用于治療不愈性骨折（骨折不愈合）以及相關(guān)的骨愈合中的問題。對于這種 形式的療法的試驗的原始基礎(chǔ)是觀察到了對骨骼的物理應(yīng)力引起微小電流的出現(xiàn)，其與機 械應(yīng)變一起被認為構(gòu)成了將物理應(yīng)力轉(zhuǎn)化成促進骨形成的信號的機制。連同成功用于骨折 不愈合的治療的直接電場刺激，還發(fā)現(xiàn)使用PEMF和電容耦合（其中電極被放置在治療區(qū)域 的皮膚上）的非侵入性技術(shù)也是有效的。PEMF在高導(dǎo)電性的細胞外液中產(chǎn)生小的、感應(yīng)電 流（法拉第電流），而電容耦合直接導(dǎo)致在組織中的電流；PEMF和CC二者從而模擬了內(nèi)源 性電流。
[0008] 該內(nèi)源性電流，最初被認為是由于在骨中晶體的表面上發(fā)生的現(xiàn)象，已被證明是 主要由于在含有具有固定負電荷的有機成分的骨的通道中含電解質(zhì)的流體的移動，產(chǎn)生了 所謂的"流動電位"。骨中電現(xiàn)象的研究表明，當骨被機械壓縮時出現(xiàn)機電轉(zhuǎn)換機制，引起流 體和電解質(zhì)在骨細胞表面上的固定負電荷的表面上的移動，從而產(chǎn)生流動電位。這些電位 在骨中起到一定的用途，而且，與機械應(yīng)變一起，導(dǎo)致能夠刺激骨細胞合成可鈣化基體以及 由此骨生成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0009] 由本發(fā)明人和其他人于1996年報道，在Cooper培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的MC3T3-E1骨細 胞中，循環(huán)雙軸0.17 (%機械應(yīng)變導(dǎo)致了6?-@11111?嫩的顯著增長（131^111:〇11等人，13;[0(3116111· Biophys. Res. Commun. 229 :449-453,1996)。1997 年一些重要研究隨后出現(xiàn)。據(jù)報道在一 項研究中，相同的循環(huán)雙軸0. 17%機械應(yīng)變在相似的骨細胞中使得TOGF-A mRNA顯著增 加 （Brighton 等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 43 :339_346,1997)。另據(jù)報道，20mV/ cm的60kHz的電容耦合電場在Cooper培養(yǎng)皿中類似的骨細胞中產(chǎn)生TGF-P1的顯著增 加 （Brighton 等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 237 :225_229,1997)。另據(jù)報道，軟骨 細胞基質(zhì)基因和蛋白可被特異性和選擇性的電場所上調(diào)（Wang，W.，Wang，Z.，Zhang，G.， Clark, C. C. , and Brighton, C. T. , Clin. Orthp. and Related Res. ,427S：S 163-173,2004； Brighton, C. T. , Wang, ff. , and Clark, CC, Biochem. Biophys. Res. Commun. , 342 :556-561, 2006)。此外，已經(jīng)顯示骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP)的基因表達也可以被特異性和選擇性的電場 上調(diào)，所述電場在很多信號方面不同于其信號對關(guān)節(jié)軟骨是選擇性和特異性的電場（Wang， Z. , Clark, C. C. and Brighton, C. T. , J. Bone Joint Surg. ,88 :1053-1065,2006) 0
[0010] 在本發(fā)明人的美國專利7, 465, 566中，公開了用于創(chuàng)建調(diào)節(jié)患病或受傷組織的靶 基因的場的、特異性和選擇性電和電磁信號的確定方法。本發(fā)明通過描述調(diào)節(jié)骨髓干細胞 的靶基因表達的方法，建立在前述專利中描述的技術(shù)的基礎(chǔ)上。這些基因?qū)儆贐MP超家族， 并且包括BMP2和4，F(xiàn)GF-2和TGF-β 1、2、3,堿性磷酸酶和骨鈣素。描述了通過施加由特異 性和選擇性的電和電磁信號生成的場，治療骨疾病和損傷，包括骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)減少、骨 壞死、骨缺損、新鮮骨折、有風險骨折、延遲愈合、骨折不愈合，以及作為脊柱融合的輔助。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明涉及通過應(yīng)用向鄰近目標的骨或組織細胞的線圈、電極或其他場生成裝置 施加特異性和選擇性的信號而生成的特異性和選擇性的電場和/或電磁場，調(diào)節(jié)BMP超家 族的基因表達，所述BMP超家族包括但不限于，干細胞（作為實例）中的BMP 2和4，TGFi3 1、 2和3,及成纖維細胞生長因子-2 (FGF-2)、堿性磷酸酶和骨鈣素。通過對在其中測量到生成 的電場的效果的信號持續(xù)時間、振幅、頻率和占空比執(zhí)行連續(xù)的劑量-響應(yīng)曲線，發(fā)現(xiàn)了上 調(diào)干細胞中mRNA的最佳信號。所述最佳信號生成了振幅20-40毫伏/厘米、持續(xù)時間12 小時、頻率60千赫和占空比50-100%的電容耦合電場。特別地，本發(fā)明涉及通過施加這些 信號產(chǎn)生的場而上調(diào)干細胞中的基因表達。
[0012] 在本發(fā)明的一個不例性實施方式中，提供了用電容稱合的電場、電磁場或混合場 而特異且選擇性地上調(diào)上述干細胞的基因表達（通過mRNA測定）的方法。以具有約12小 時的場持續(xù)時間、60千赫的頻率、50% -100%的占空比以及正弦波構(gòu)型的約10-40毫伏/ 厘米的電容耦合電場對下述進行處理：骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)減少、骨壞死、新鮮骨折、有風險骨 折、延遲愈合、骨折不愈合、骨缺損、在脊柱融合中作為輔助等，所述電容耦合電場引起待上 調(diào)的BMP 2和4，F(xiàn)GF-2和TGFii 1、2和3的表達。根據(jù)本發(fā)明的方法，"特異性和選擇性"的 信號是具有預(yù)定的振幅、持續(xù)時間、占空比、頻率和波形特征的信號，其能上調(diào)BMP超家族 基因的表達（特異性）。這使得人們可以選擇不同的信號來上調(diào)BMP超家族的基因的表達， 以實現(xiàn)給定的生物學或治療的響應(yīng)（選擇性）。本發(fā)明還涉及使用本文所描述的方法以產(chǎn) 生特異性和選擇性的信號，生成電場和/或電磁場來上調(diào)BMP超家族基因的表達的裝置。
[0013] 在相關(guān)的方面，本發(fā)明涉及用于治療骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)減少、骨壞死、新鮮骨折、有 風險骨折、延遲愈合、骨折不愈合、骨缺損，作為脊柱融合中的輔助和用于處理一個或多個 上述狀況的其他療法的方法和裝置。本發(fā)明的方法中還包括通過有條理地改變已知會增 力口、或懷疑會增加所述目標基因的細胞生產(chǎn)的起始信號的持續(xù)時間，用于確定用于BMP 2 和4, TGFii _1、2和3及FGF-2的基因表達的"特異性和選擇性"信號的方法學。在找到最 佳持續(xù)時間之后，對于通過上述基因的基因表達確定的最佳持續(xù)時間，改變該信號的振幅。 占空比、頻率和波形都以相同的劑量響應(yīng)方式有條理地改變，同時保持其他信號特征恒定。 重復(fù)這個過程，直到確定了產(chǎn)生BMP 2和4, TGFii _1、2和3, FGF-2,堿性磷酸酶，骨鈣素表 達的最大增加的最佳信號。對于每個所述的基因來說，最佳信號可能在基因與基因之間有 所不同。
[0014] 本發(fā)明的這些和其它方面將在本發(fā)明的以下詳細描述中得到闡述。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的詳細描述并結(jié)合附圖，本發(fā)明將是顯然的，其中：
[0016] 圖1是當干細胞被暴露于各種電容耦合電場振幅下，BMP 2和4, TGF 1、2和3， FGF-2,堿性磷酸酶和骨鈣素的mRNA表達的散點圖示。如圖所示，各種mRNA的最大表達出 現(xiàn)在從10mV/cm到60mV/cm的信號范圍內(nèi)。
[0017] 圖2是當干細胞被暴露于振幅為20mV/cm的電容耦合電場下持續(xù)各種時間時，BMP 2和4，TGF 1、2和3，F(xiàn)GF-2,堿性磷酸酶和骨鈣素的mRNA表達的散點圖示。如圖所示，各種 mRNA的最大表達出現(xiàn)在12小時的信號持續(xù)時間時。
[0018] 圖3是在20mV/cm的電場振幅和12小時的信號持續(xù)時間下當干細胞被暴露于各 種電容耦合電場頻率時，BMP 2和4, TGF 1、2和3, FGF-2,堿性磷酸酶和骨鈣素的mRNA表 達的散點圖示。如圖所示，各種mRNA的最大表達出現(xiàn)在60kHz的頻率下。
[0019] 圖4是在60kHz的頻率、20mV/cm的電場振幅和12小時的信號持續(xù)時間下當干細 胞被暴露于各種電容耦合電場占空比時，BMP 2和4, TGF1、2和3, FGF-2,堿性磷酸酶和骨 鈣素的mRNA表達的散點圖示。如圖所示，各種mRNA的最大表達出現(xiàn)在具有正弦波構(gòu)型的 50%至100%的占空比下。
[0020] 圖5是示出了一種例如根據(jù)本發(fā)明的示例性應(yīng)用用于治療脊柱骨質(zhì)疏松癥的裝 置的圖。
[0021] 說明性實施方式的詳細描述
[0022] 本發(fā)明將在下面參考圖1-5詳細說明。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，這里所給出的那 些附圖的描述僅用于示例的目的，并不旨在以任何方式限制本發(fā)明的范圍。所有關(guān)于本發(fā) 明的范圍的問題，可以通過參考權(quán)利要求書來解決。
[0023] 本發(fā)明是基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即通過施加由特異性和選擇性的電和/或電磁信號生 成的場，可以調(diào)節(jié)某些干細胞基因的表達，所述電和/或電磁信號被施加至鄰近所述基因 的線圈、電極或其他的場生成裝置。換句話說，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，存在特異性的電和/或電磁 信號，其生成用于調(diào)節(jié)骨、軟骨和其它組織中干細胞中的基因的場，并且這些特異性的信號 能夠特異性和選擇性地調(diào)節(jié)這些細胞中的基因。特別地，根據(jù)本發(fā)明，通過應(yīng)用向場生成裝 置施加特異性和選擇性的電和/或電磁信號而生成的場，可調(diào)節(jié)掌管組織或細胞的生長、 維持、修復(fù)和變性或惡化的基因表達，從而產(chǎn)生有益的臨床效果。這些發(fā)現(xiàn)可用于開發(fā)治療 方法，所述治療方法針對某些醫(yī)療狀況，包括骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)減少、骨壞死、新鮮骨折、有 風險骨折、延遲愈合、骨折不愈合、骨缺損、脊柱融合，以及作為以上任意一種或多種狀況的 治療中的輔助。
[0024] 如本文所用，術(shù)語"信號"用于指代各種信號，包括裝置輸出的機械信號、超聲信 號、電磁信號和電信號。應(yīng)當理解的是，本文所用的術(shù)語"場"是指靶定組織內(nèi)的電場，不管 它是混合場或脈沖電磁場還是通過直流電、電容耦合或電感耦合產(chǎn)生的場。
[0025] 術(shù)語"遠程"用來意味著從一定的距離外起作用、接受作用或控制。"遠程"調(diào)節(jié)指 的是從一定的距離外控制基因的表達。"遠程地"提供指的是從一定的距離外提供。例如， 從遠程源提供特異性和選擇性信號，可以指從距離組織或細胞有一定距離的源或從身體外 部或身體以外的源提供信號。
[0026] 術(shù)語"特異性和選擇性"信號是指產(chǎn)生了具有預(yù)定的振幅、持續(xù)時間、占空比、頻率 和波形特征的電場從而上調(diào)或下調(diào)靶基因或功能互補的靶基因（特異性）的信號。這允許 人們選擇不同的"特異性和選擇性"信號以上調(diào)或下調(diào)各種基因的表達從而實現(xiàn)給定的生 物學或治療響應(yīng)（選擇性）。
[0027] 所用的術(shù)語"調(diào)節(jié)"是指控制基因的表達。調(diào)節(jié)被理解為包括上調(diào)和下調(diào)兩者。上 調(diào)指提商基因的表達，而下調(diào)指抑制或阻止基因的表達。
[0028] "功能互補"是指在給定的細胞或基因中表達是互補的或協(xié)同的兩種或更多種基 因。
[0029] "組織"是指與細胞的胞外物質(zhì)一起形成患者結(jié)構(gòu)材料中的一種的所述細胞的聚 集體。如本文所使用的，術(shù)語"組織"旨在包括身體的任何組織，包括肌肉和器官組織、腫瘤 組織以及骨或軟骨組織。此外，如本文所用的術(shù)語"組織"還可以指單個細胞。
[0030] "患者"是指動物，優(yōu)選為哺乳動物，更優(yōu)選人。
[0031] 本發(fā)明提供了靶向某些組織、細胞或疾病的治療方法和裝置。特別地，在受傷或患 病組織或細胞中，與修復(fù)過程相關(guān)的基因表達可以通過施加由特異性和選擇性針對靶組織 或細胞中待調(diào)節(jié)基因的電信號所生成的場而進行調(diào)節(jié)?？梢酝ㄟ^施加對于每種基因或每 組互補基因來說特異性和選擇性的信號而上調(diào)或下調(diào)基因的表達，從而產(chǎn)生有益的臨床效 果。例如，特定的特異性和選擇性信號產(chǎn)生的電場可以上調(diào)某種期望的基因的表達，而同一 種或另一種特定的特異性和選擇性信號可以產(chǎn)生電場下調(diào)某種不希望的基因的表達。某種 基因可以被一種特定的特異性和選擇性信號所產(chǎn)生的場上調(diào)，并被另一種特異性和選擇性 信號所產(chǎn)生的場下調(diào)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，某些患病或受傷的組織可以通過調(diào)節(jié)那些 掌管所述組織的生長、維持、修復(fù)和變性或退化的基因而被靶向進行治療。
[0032] 本發(fā)明的方法和裝置基于的是，鑒定那些生成了對于與某些靶定的患病或受傷組 織相關(guān)的基因表達來說特異性和選擇性的場的信號。例如，通過改變施加到場生成裝置的 信號的頻率、振幅、波形或占空比從而生成對于每種選擇的基因或者基因家族的施加場，使 得以各種形式施加的電場（例如電容耦合、電感耦合或混合場）能夠特異性和選擇性地調(diào) 節(jié)患者身體中靶定組織或細胞中的基因表達。暴露于電場的持續(xù)時間也可以影響電場特異 性和選擇性地調(diào)節(jié)在患者體內(nèi)的靶定組織或細胞中的基因表達的能力。特異性和選擇性信 號可以系統(tǒng)性地產(chǎn)生施加到每個基因的電場，直到發(fā)現(xiàn)提供了關(guān)于基因表達所需的效果的 頻率、振幅、波形、占空比和持續(xù)時間的適當組合。
[0033] 應(yīng)當理解的是，可以有針對性的對各種患病或受傷組織或疾病狀態(tài)進行治療，因 為用于某些基因表達的電場的特異性和選擇性可以被幾個因素影響。特別地，由具有合適 的頻率、振幅、波形和/或占空比的電信號生成的電場對某些基因的表達可以是特異性和 選擇性的，從而提供針對性的治療。時間的因素（例如，暴露于電場的持續(xù)時間）也能影響 電場對特定基因的表達的特異性和選擇性。通過施加特定的持續(xù)時間的電場，基因表達的 調(diào)節(jié)可能更為有效（或成為可能）。因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解的是，本發(fā)明提供了改 變產(chǎn)生電場的電信號的頻率、振幅、波形、占空比和/或施加的持續(xù)時間，直到發(fā)現(xiàn)所述電 場對某些基因的表達是選擇性和特異性的，從而提供針對多種患病或受傷組織或疾病的治 療。
[0034] 因此，本發(fā)明可以提供有針對性的治療，因為有可能通過施加由具有適當?shù)念l率、 振幅、波形和/或占空比的特異性和選擇性信號產(chǎn)生的電場適當?shù)某掷m(xù)時間，從而調(diào)節(jié)與 特定的患病或受傷組織相關(guān)的某些基因的表達。產(chǎn)生電場的信號的特異性和選擇性因此 可能被影響，以便調(diào)節(jié)某些基因的表達，從而針對某些患病或受傷組織或疾病狀態(tài)進行治 療。特別地，本發(fā)明提供了對于骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)減少、骨壞死、新鮮骨折、有風險骨折、骨折 不愈合、骨缺損、脊柱融合，以及作為以上任意一種或多種病癥的治療中的輔助的針對性治 療。
[0035] 本發(fā)明的裝置能夠施加特異性和選擇性的信號到場生成裝置，從而產(chǎn)生特異性和 選擇性的場，其被直接施加于患者的患病或受傷組織和/或皮膚上。本發(fā)明的裝置也可提 供特異性和選擇性場的遠程應(yīng)用（例如，在離患病或受傷組織一定距離處施加場，不過所 述場仍然在靶細胞內(nèi)產(chǎn)生所需的效果），但是需要理解電容耦合裝置必須接觸受試者的皮 膚。在電容耦合的情況下，本發(fā)明的裝置可包括將電極貼附至患者身體靠近受傷或患病組 織的器件。例如，自粘接導(dǎo)電電極可以附著到在患者的骨折骨骼兩側(cè)的皮膚上。如圖5所 示，本發(fā)明的裝置可包括自粘接電極，其可將所述裝置貼附至患者的身體上。例如，本發(fā)明 的裝置可包括電極，其貼附到在反面具有VELCRO?貼的電源單元，使得所述電源單元可 以貼附到適合繞在患者上的石膏周圍的VELCRO?帶（未示出）上。在電感耦合的情況 下，本發(fā)明的裝置可包括取代電極的、貼附至電源單元上的線圈或其他場生成裝置。自粘接 帶狀電極也可以被貼附到患者的背部，使一對電極的每一個電極都平行于脊柱，該對電極 中的一個電極縱向放置在脊柱的一側(cè)，該對電極的另一電極縱向放置在脊柱的對面。在這 種情況下，VELCRO?貼可以是患者所穿著的衣服的一部分。
[0036] 本發(fā)明的裝置可以采用各種方式應(yīng)用。所述裝置可以是便攜式的，也可以暫時或 永久地貼附至患者的身體。本發(fā)明的裝置優(yōu)選是非侵入性的。例如，可以通過應(yīng)用適于與患 者皮膚接觸的電極而施加由預(yù)定的特異性和選擇性的電信號所產(chǎn)生的電場，從而使本發(fā)明 的裝置應(yīng)用到患者的皮膚上。這樣的信號也可通過其中流有時變電流的線圈而進行施加， 從而產(chǎn)生特異性和選擇性的電磁場，其能穿透組織并在靶組織中產(chǎn)生特異性和選擇性的電 場。例如，線圈可如美國專利號7158835描述的被結(jié)合到患者的衣物并置于患者的脊柱和 /或臀部附近。本發(fā)明的裝置也可以是能夠植入到患者中的，包括植入在患者的皮膚下。
[0037] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員將進一步了解，本發(fā)明的場生成裝置可以以各種形式提供，包 括：具有用于施加到一對或多對電極的程序化、多種、可切換、特異性和選擇性的信號的電 容偶聯(lián)電源單元，與具有可切換、多種、特異性和選擇性信號的電源單元附連的電磁線圈或 螺線管，以及具有用于產(chǎn)生特異性和選擇性信號電源供應(yīng)的超聲刺激器。一般來說，場生成 裝置的傾向性基于的是患者的接受性和患者依從性。在本領(lǐng)域中當前可用的最小和最便攜 單元是電容耦合單元；然而，具有極為敏感的皮膚的患者可能更喜歡使用電感耦合單元。另 一方面，超聲單元需要最多的患者合作，但可能是某些患者需要使用的。 實施例
[0038] 本發(fā)明是通過下面的例子詳細說明，這是為了說明的目的，并無意限制本發(fā)明的 范圍。
[0039] 材料和方法
[0040] 人類干細胞（5X IO5細胞/cm 2)被放置于專門改良的Cooper培養(yǎng)皿上。在實驗 條件快要開始前更換培養(yǎng)基，使細胞生長十天。在第10天，這些研究中的實驗細胞培養(yǎng)物 用輸出為44. 81V峰-到-峰、電容耦合的60kHz正弦波信號處理。這在培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基 中生成了 20mV/cm、電流密度300 μ A/em2的計算場強。對照細胞培養(yǎng)皿除了電極未連接到 函數(shù)發(fā)生器外，其他與被刺激的培養(yǎng)皿均相同。
[0041] 在實驗結(jié)束時，根據(jù)制造商的指示使用TRIzol分離總RNA，并使用Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄（RT)。從公布的cDNA序列中選擇或使用Primer Express軟件程 序設(shè)計在實時RT-PCR技術(shù)中使用的寡核苷酸引物。使用ABI Prism? 7000序列檢測系統(tǒng) 對RT-PCR產(chǎn)物進行定量實時分析。
[0042] 如下所述，系統(tǒng)地發(fā)現(xiàn)了用于目標基因，包括BMP2和4、TGF-P 1、2和3、FGF-2、堿 性磷酸酶和骨鈣素的所需上調(diào)的最佳信號。采用已知會導(dǎo)致產(chǎn)生能增加（或者甚至只是懷 疑會增加）給定蛋白的細胞生產(chǎn)的電場的電信號作為起始信號，用于確定在靶組織中生成 所述電場用于該蛋白的基因表達（mRNA)的特異性信號。首先通過在保持所有其他信號特 征恒定（持續(xù)時間，占空比和頻率）的同時改變信號的振幅，來執(zhí)行劑量-響應(yīng)曲線（圖1)。 這確定了用于該蛋白的基因表達的起始信號的最佳振幅。然后執(zhí)行第二劑量-響應(yīng)曲線， 這次改變電場在靶組織中的持續(xù)時間（以mV/cm)，同時保持最佳的振幅和其他信號特征恒 定（圖2)。執(zhí)行第三劑量-響應(yīng)，這次在保持之前發(fā)現(xiàn)的最佳振幅和最佳持續(xù)時間恒定的 同時，改變信號的頻率（圖3)。執(zhí)行第四劑量-響應(yīng)，在保持之前發(fā)現(xiàn)的最佳振幅、持續(xù)時 間以及頻率恒定的同時，從100% (恒定的）到10%或更低改變占空比（圖4)。通過這種 方法，確定了用于在BMP 2和4, TGF-β 1、2和3，F(xiàn)GF-2,堿性磷酸酶和骨鈣素的基因表達中 產(chǎn)生最大增加的最佳信號。
[0043] 圖1顯示培養(yǎng)10天后人類干細胞響應(yīng)的散點圖，示出了刺激振幅對8個目標基 因 （BMP 2和4, TGF- β 1、2及3, FGF-2,堿性磷酸酶，和骨鈣素）的mRNA表達的作用。在 20mV/cm時，所述基因中的7個的mRNA表達趨同，這不存在于其他振幅水平下。還進一步注 意到，所選擇的基因可以給出特異性的響應(yīng)。例如，對于TGF-β 3的最佳振幅發(fā)生在IOmV/ cm，BMP-4則發(fā)生在60mV/cm，等等。干細胞在60ΚΗζ頻率、50%的占空比下被刺激12小時。
[0044] 圖2顯示培養(yǎng)10天后人類干細胞響應(yīng)的散點圖，示出了刺激持續(xù)時間對8個目標 基因 （BMP 2和4，TGF-M、2及3，F(xiàn)GF-2,堿性磷酸酶，和骨鈣素）的mRNA表達的作用。用 60KHz頻率、50%占空比和20mV/cm振幅的信號刺激干細胞2-24小時。注意到在12小時刺 激后，存在所述8個基因的表達的趨同，這不存在于其他測試的持續(xù)時間。此外，如圖1所 示，所選擇的基因在除12小時刺激外的特定的小時處有最佳響應(yīng)。
[0045] 圖3顯示培養(yǎng)10天后人類干細胞響應(yīng)的散點圖，示出了刺激的頻率對8個目標基 因 （BMP 2和4, TGF- β 1、2及3, FGF-2,堿性磷酸酶，和骨鈣素）的mRNA表達的作用。在 50%占空比和20mV/cm的振幅下用各種信號頻率刺激干細胞。注意到在刺激12小時后在 60kHz的頻率下得到8個基因的最佳表達。
[0046] 圖4顯示培養(yǎng)10天后人類干細胞響應(yīng)的散點圖，示出了刺激的占空比對8個目標 基因 （BMP 2和4，TGF-M、2及3，F(xiàn)GF-2,堿性磷酸酶，和骨鈣素）的mRNA表達的作用。占 空比是12. 5% (1分鐘開/7分鐘關(guān)）、25% (1分鐘開/3分鐘關(guān)）、50% (1分鐘開/1分鐘 關(guān)）、75% (1分鐘開/20秒關(guān)），以及100% (信號一直開）。注意到50%、75%和100%得 到幾乎相同的結(jié)果。選擇50%的占空比是因為它需要較少的能量，并且因此使電池壽命更 長。
[0047] 圖5顯示用電容耦合裝置對病人進行骨質(zhì)疏松癥治療。在布口袋中的電源組 (130)被穿戴，所述布口袋用布帶固定在腰部，或可以滑入病人衣物的任何口袋。元件 110a、b和120a、b顯示了表面導(dǎo)電布電極，其用導(dǎo)電凝膠粘在患者背部，位于Ll到L5 7jC平 處的腰椎任一側(cè)。電源單元提供了根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)化的信號，例如，60KHz頻率、50%占空 比和每天持續(xù)12小時的20mV/cm的正弦波信號。這是用于刺激指定腰椎內(nèi)干細胞以上調(diào) 8個目標基因 （BMP 2和4，TGF-M、2及3，F(xiàn)GF-2,堿性磷酸酶，和骨鈣素）的mRNA表達的 最佳信號。
[0048] 本發(fā)明清楚地顯示，在實施例中所述的最佳電場（10mV/cm-60mV/cm，優(yōu)選20mV/ cm，12小時持續(xù)時間，60kHz頻率，以及50-100 %占空比）可以顯著上調(diào)BMP 2和4， TGF-β 1、2及3, FGF-2,堿性磷酸酶和骨鈣素基因的表達，并因此增加在骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì) 減少、骨壞死、骨骨折、有風險骨折、骨折不愈合、骨缺損、脊柱融合中的骨形成，以及作為以 上任意一種或多種治療中的輔助。另外，圖1-4清楚地顯示，在四個劑量-響應(yīng)研究的每一 個中，各種基因的響應(yīng)之間存在差異。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，如本文使用電容耦合所描述 的適當?shù)碾妶?，也與電感耦合及生成等效或幾乎等效的電場特征的所有電磁系統(tǒng)是相同有 效的。本領(lǐng)域技術(shù)人員還將會理解，更獨特的信號特征可以通過更多的實驗來和更多的數(shù) 據(jù)點發(fā)現(xiàn)（例如，100±3%的占空比，持續(xù)30±3分鐘），但每一個信號特征的這樣相對較小 的變化被認為是在本文給出的教導(dǎo)下處于本領(lǐng)域技術(shù)人員的水平之內(nèi)的。
[0049] 本領(lǐng)域技術(shù)人員也將認識到，對本發(fā)明的許多其他改進可能在本發(fā)明的范圍之 內(nèi)。例如，本文所描述的最佳場可以通過成對或成條狀、結(jié)合在托架、包或石膏中的兩個或 更多個合適的表面電極施加到任何骨骼，并通過電容耦合的方式遞送。此外，這里所描述的 最佳電場可以通過結(jié)合在托架、包或石膏中的線圈或螺線管被施加到任何骨骼，并通過電 感耦合的方式遞送。因此，本發(fā)明的范圍并非限定于上述的優(yōu)選實施例，而是僅由權(quán)利要求 書限定。
【權(quán)利要求】
1. 一種裝置，其用于治療骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)減少、骨壞死、新鮮骨折、有風險骨折、骨折 不愈合、骨缺損、脊柱融合，以及作為骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)減少、骨壞死、新鮮骨折、有風險骨 折、骨折不愈合、骨缺損、脊柱融合治療的輔助，通過靶組織中的人類干細胞提高骨形成，和 /或用于在患者中涉及通過mRNA和蛋白所測量的BMP2和4, TGF-0 1、2和3, FGF-2,骨鈣素 和堿性磷酸酶的其他病癥， 所述裝置包括： 生成具有約60kHz的頻率的至少一種特異性和選擇性信號的信號源，所述信號源控 制和改變所述至少一種特異性和選擇性信號的施加持續(xù)時間，每24小時時段提供約12小 時的持續(xù)時間，并且所述信號源在50%到100%之間改變所述特異性和選擇性信號的占空 比；和 一個或多個場生成裝置，其連接到所述信號源以便接收所述至少一種特異性和選擇性 信號并且被可操作地相對于靶組織布置，所述一個或多個場生成裝置在接收到所述至少一 種特異性和選擇性的信號后，導(dǎo)致在所述靶組織中生成振幅約10到60mV/cm的特異性和選 擇性的電場和/或電磁場，當所述場被施加到含BMP2和4, TGF- 0 1、2和3, FGF-2,骨鈣素和 堿性磷酸酶的靶組織時，所述場特異性和選擇性地上調(diào)BMP2和4, TGF-0 1、2和3, FGF-2， 骨鈣素和堿性磷酸酶的基因表達，和/或上調(diào)通過mRNA測量的靶組織中的蛋白。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的裝置，其進一步包括驅(qū)動所述信號源的便攜式電源單元。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的裝置，其進一步包括將所述一個或多個場生成裝置貼附至患者身 體靠近靶定骨組織的器件。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1的裝置，其進一步包括將所述信號源貼附至患者身體的器件。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1的裝置，其中通過將所述至少一種特異性和選擇性信號施加到所述 一個或多個場生成裝置上而生成的場，通過電容耦合或電感耦合被施加到所述靶組織上。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1的裝置，其中所述特異性和選擇性的信號具有正弦波構(gòu)型。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1的裝置，其中所述靶組織中的特異性和選擇性的場具有約為20mV/ cm的振幅。
【文檔編號】C12N13/00GK104350150SQ201280067937
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2012年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月23日
【發(fā)明者】卡爾·T·布萊頓 申請人:賓夕法尼亞大學理事會