編碼黃曲霉毒素降解酶的基因及獲得高效黃曲霉毒素降解酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了編碼黃曲霉毒素降解酶的基因及獲得高效黃曲霉毒素降解酶的方法。編碼黃曲霉毒素降解酶的基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。獲得高效黃曲霉毒素降解酶的方法包括如下步驟：將如SEQ?ID?NO.1所示的基因克隆至載體pCold-II中，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21-PG-Tf2中得到黃曲霉毒素降解酶的表達(dá)菌；將該表達(dá)菌用四環(huán)素及IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體，破碎后利用pCold-II上的融合蛋白表達(dá)標(biāo)簽純化得到高效的黃曲霉毒素降解酶。本發(fā)明通過優(yōu)化表達(dá)載體和表達(dá)條件，獲得的黃曲霉毒素降解酶純度達(dá)到95%以上，降解黃曲霉毒素B1的效率達(dá)到161.7nmol/min/mg.pr。
【專利說明】編碼黃曲霉毒素降解酶的基因及獲得高效黃曲霉毒素降解酶的方法
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及生物技術(shù)應(yīng)用或農(nóng)業(yè)、食品、飼料等領(lǐng)域，具體涉及編碼黃曲霉毒素降解酶的基因及獲得高效黃曲霉毒素降解酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0003]黃曲霉毒素(aflatoxin，AFT)為黃曲霉和寄生曲霉等霉菌的代謝產(chǎn)物，被認(rèn)為是自然界中發(fā)現(xiàn)的毒性最大、影響最廣泛、理化性質(zhì)最穩(wěn)定的一類霉菌毒素，是農(nóng)作物常見的霉菌毒素污染物，廣泛污染飼料、糧油、動植物食品等，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的損失，給食品安全帶來極大的隱患，同時也嚴(yán)重威脅著公眾的健康，被稱為新的“萬病之源”。近年來，由于全球異常氣候逐年增加、原料全球貿(mào)易化、能源危機(jī)及原料短缺等原因使得AFT污染變得日益嚴(yán)重，AFT解毒去毒研究顯得尤為迫切重要。
[0004]AFT是一群結(jié)構(gòu)類似物，含有一個雙呋喃環(huán)(bifuran)和一個氧雜萘鄰?fù)?coumarin，又稱香豆素)?，F(xiàn)已確定的AFT有18種，其中B1、B2、Gl、G2、Ml、M2具有強(qiáng)毒性，其結(jié)構(gòu)如圖1。在這六種強(qiáng)毒性黃曲霉毒素中AFBl是發(fā)生最為頻繁、毒性最大、也是目前研究工作中最為關(guān)注的一種黃曲霉毒素。目前關(guān)于AFT解毒、去毒的傳統(tǒng)方法主要有氨化法、NaOH法、氧化處理法、混合溶劑萃取法、吸附劑脫毒及高溫法等，但這些方法由于對飼料、食品等原料的營養(yǎng)物質(zhì)破壞嚴(yán)重、后處理成本很高、使用存在不同程度的局限性等成為現(xiàn)代飼料、食品中AFT降解或去毒所面臨的非常重要的問題，而探索新的AFT降解或去毒方法是解決這一重要問題的有效途徑之一。一般而言，有效的AFT降解和去除的方法應(yīng)該滿足以下幾點(diǎn)要求:毒素應(yīng)該被破壞或者被轉(zhuǎn)化成無毒化合物；飼料或食品等原料應(yīng)該保持它原有的營養(yǎng)水平和風(fēng)味；原料的物理性狀不應(yīng)被明顯改變，去毒加工應(yīng)該經(jīng)濟(jì)可行。
[0005]研究發(fā)現(xiàn)，AFT可以通過生物酶降解作用得以去除，同時由于生物酶解毒具有對飼料、食品等原料無污染、有高度專一性、不影響原料的營養(yǎng)價值，而且能夠避免毒素的重新產(chǎn)生等優(yōu)點(diǎn)，受到人們越來越多的關(guān)注，降解黃曲霉毒素的生物酶的研究已經(jīng)有了很大的進(jìn)展° 例如，Neal and Colley (Neal G.E.and Colley P.J.Some high-performanceliquid chromatographic studies of the metabolism of aflatoxins by ratliver microsomal preparations.Biochem.J.1978， 174，839-851)、Yoshizawa(Yoshizawa H.，Uchimaru R.and Ueno Y.Metabolism of aflatoxin BI in theisolated in the rat liver.J.Bi ochem.1981,89(2), 443-452)等研究發(fā)現(xiàn)用肝微粒體、 核微粒體可以降解黃曲霉毒素；Lotliker (Lotlikar P.D.，Raj H.G.，BohmL S.，HO L L，Eun C.J., Tsuji K.and Gopalan P.Mechanism of Inhibitionof Aflatoxin BI DNA binding in the liver by phenobarbital pretreatment ofRats.Cancer Res.1989，49, 951-957.)、Hayers (Hayes J.D.，Judah D.J.，McLellan L 1.，Kerr L A.and Peacock S.D.Ethoxyquin induced resistance toAflatoxin BI in the rat is associated with the expression of a novel Alpha -class glutathione ^-transferase submit YC2， which processes high catalyticactivity for aflatoxin BI 8，9 - epoxide.Bi ochem.J.1991,279, 385-398.)、Ellis (Ellis W.0., Smith J.P., Simpson B.K.and Oldham J.H.Aflatoxins infood: occurance， biosynthesis, effects on organisms, detection and methodsof control.Cr it.Rev.Food Sc1.Nutr.1991，3, 403-439.)等分別發(fā)現(xiàn)谷胱甘妝-S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathoine-S-transferase，GST)、細(xì)胞色素 P-450 同功酶(CytochromeP-450 isozymes)、乙醒還原酶(Aldehyde reductase, AFB1-AR)對黃曲霉毒素有一定的降解作用；2003年吳肖等發(fā)現(xiàn)花生柏酶可以降解黃曲霉毒素(吳肖，劉通訊，林勉.花生柏酶水解液中黃曲霉毒素脫毒定性研究.糧油食品科技.2003，11(1)，32-33)；1995年Iiu等發(fā)現(xiàn)從真菌E20中獲得的粗提液可以降解黃曲霉毒素，并且在1998年、2001年從Armillariella tabescens中分離得到一種可以降解黃曲霉毒素的酶(ADTZ)(Liu D.L，Yao D.S.and Chen M.F.Study on detoxification of aflatoxin BIby the crude extract of fungi E20.Academic Journal of Guangdong College ofPharmacy 199b, 11(2), 92 - 94 ；Liu D.L，Yao D.S.，Liang R.，Ma L，Chen W.Q.andGu LQ.Detoxification of aflatoxin BI by enzymes isolated from Armillariellatabescens.Food and Chemical ToxicologyY^^, 36, 363 - 574 ；Liu D.L，Yao D.S.and Liang R.Production, purification and characterization of an intracellaraflatoxin-detoxifizyme from Armil (E-20).Food and Chemical Toxicology2QQI,39, 461-466) ;2003 年 Motomura 從 Pleurotus ostreatus 中也分離到一種降解黃曲霉毒素的天然酶并對其進(jìn)行了相關(guān)性質(zhì)研究(Motomura M.，Toyomasu T.，Mizuno K.andShinozawa T.Purification and characterization of an aflatoxin degradationenzyme from Pleurotus ostreatus.Microbiol.Res.2003，158, 237-242) ；2006年Alberts發(fā)現(xiàn)Rhodococcus erythropolis培養(yǎng)液可以降解黃曲霉毒素(AlbertsJ.F.，Engelbrecht Y.，Steyn P.S.，Holzapfel W.H.and Van Zyl W.H.Biologicaldegradation of aflatoxin BI by Rhodococcus erythropolis cultures.1nternationalJournal of Food Microbiology.2006，109，121-126)。雖然以上這些通過分離提取方式獲得的天然酶具有一定的解毒作用，但是由于提取程序繁瑣，酶產(chǎn)量低，ADTZ降解AFT的活性比較低，在高溫和極端PH條件下穩(wěn)定性差，易喪失酶活性，限制了實(shí)際應(yīng)用。為了解決獲得的天然酶活性低、穩(wěn)定性差的問題。鑒于此，Liu研究組嘗試對ADTZ酶進(jìn)行了固定化研究，ADTZ酶的酸減穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性等有了一定提1?，但酶活性沒有得到提1? (劉大嶺，姚冬生，黃炳賀，謝春芳，梁郁強(qiáng)，馬林.黃曲霉毒素解毒酶的固定化及其性質(zhì)的研究.生物工程學(xué)報(bào)2003，19(5)，603-607)。為了解決獲得的天然酶產(chǎn)量和活性低的問題，Liu研究組嘗試在原核和真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)該解毒酶，但這些酶依然存在降解效率不高、穩(wěn)定性較差、使用條件比較苛刻等問題，影響了 ADTZ的進(jìn)一步廣泛應(yīng)用(胡熔，劉大嶺，謝春芳，姚冬生.黃曲霉毒素解毒酶在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)、純化及其圓二色譜分析.中國生物工程雜志.2011，31 (4)，71-76)。
[0006] 因此如何獲得高效的黃曲霉毒素降解酶(ADTZ)，是我們應(yīng)用生物酶有效、安全解除黃曲霉毒素對環(huán)境、食品、農(nóng)業(yè)等危害的一個重要前提和首要問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種編碼黃曲霉毒素降解酶的基因。
[0008]本發(fā)明的另一目的在于提供一種獲得高效的黃曲霉毒素降解酶的生物合成方法。
[0009]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn): 一種編碼黃曲霉毒素降解酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。該基因序列是在NCBI搜索獲得ADTZ序列(GeneBank N0.AY941095.1)基礎(chǔ)上優(yōu)化得到，與原始序列相似度為78%。
[0010]一種獲得高效的黃曲霉毒素降解酶的生物合成方法，包含如下步驟:
(I)將上述編碼黃曲霉毒素降解酶的基因克隆至原核表達(dá)載體PCold-1I中得到表達(dá)黃曲霉毒素降解酶的載體pCold-11-Opt-ADTZ。
[0011](2)將pCold-11-Opt-ADTZ轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21_PG_Tf2中得到黃曲霉毒素降解酶的表達(dá)菌。
[0012](3)將黃曲霉毒素降解酶的表達(dá)菌用四環(huán)素及IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體，破碎后利用pCold-1I上的融合蛋白表達(dá)標(biāo)簽(組氨酸標(biāo)簽)純化得到高效的黃曲霉毒素降解酶(Opt-ADTZ )。
[0013]步驟(1)中所述的載體pCold-11-Opt-ADTZ優(yōu)選通過包含如下步驟的方法制備得到:編碼黃曲霉毒素降解酶的基因通過合成獲得，將其克隆至PUC19克隆載體上，獲得pUC19-0pt-ADTZ ;再以 pUC19-0pt-ADTZ 為模板，用 Opt-ADTZ 上游引物和 Opt-ADTZ 下游引物擴(kuò)增編碼黃曲霉毒素降解酶的基因；通過上下游引物上的酶切位點(diǎn)Nde I和Hind III將其構(gòu)建到pCold-1I載體上，得到載體pCold-11-Opt-ADTZ ；
其中，Opt-ADTZ 上游引物為 5’-CGCATATGCATGGCGACCACCACC-3’，Opt-ADTZ 下游引物為5’ -ATCGAACGTCGTCTGTGAAAGCTTGG-3’。
[0014]步驟(3)中所述的誘導(dǎo)的條件優(yōu)選為:誘導(dǎo)前菌液0D600為0.4~0.8，四環(huán)素濃度50ii g/mL，IPTG濃度0.5mM，誘導(dǎo)表達(dá)溫度為22°C，誘導(dǎo)時間為7小時。
[0015]步驟(3)中所述的純化的方法優(yōu)選包括如下步驟:清洗并再生的HisTrap FFN1-柱裝到蛋白純化儀(AKTA purifier 10)上，用柱平衡緩沖液進(jìn)行柱平衡，流速為
2.5mL/min;平衡完畢后，將收集的誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體用柱平衡緩沖液重懸，超聲破碎，離心取上清以0.5mL/min的流速進(jìn)行上樣結(jié)合；上樣完畢后，用80% (v/v)柱平衡緩沖液和20% (v/v)洗脫緩沖液配比成50mM咪唑?qū)⒅系姆翘禺愋噪s質(zhì)洗去，直至UV280基線不再變化時，用洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，流速2.5mL/min，用自動收樣器收集目的蛋白；再用洗脫緩沖液洗脫，收集目的蛋白；將收集的目的蛋白放在蛋白濃縮管(Mill1-Q)中，離心(2700rpm,4°C, IOmin);加入脫鹽緩沖液洗滌蛋白(每次加入ImL左右的脫鹽溶液)三次，然后收集目的蛋白得到純化的黃曲霉毒素降解酶Opt-ADTZ。其中，
柱平衡緩沖液組分為:50mM Tris-base,300mM NaCl, pH=8.0 ；
洗脫緩沖液組分為:50mM Tris-HCl, 300mM氯化鈉，250mM咪唑，pH=8.0 ；
脫鹽緩沖液組分為:50mM Tris-HCl, 50mM氯化鈉，pH=8.0。[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果:通過優(yōu)化基因序列、表達(dá)載體和表達(dá)條件，獲得的黃曲霉毒素降解酶Opt-ADTZ純度達(dá)到95%以上，降解黃曲霉毒素BI的效率是161.7nmol/min/mg.pr，酶比活力為161.7U/mg, IL LB培養(yǎng)基可獲得黃曲霉毒素降解酶的總活力是388.0U，而目前文獻(xiàn)報(bào)道的IL LB培養(yǎng)基獲得黃曲霉毒素降解酶ADTZ的總活力是在3~50U范圍(IU酶單位定義為:lnmol AFBl在合適條件下Imin內(nèi)轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是具有強(qiáng)毒性的6種黃曲霉毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖。
[0018]圖2是PCR篩選pCold-11-Opt-ADTZ陽性單克隆瓊脂糖凝膠電泳圖⑷為DL2000，2為水樣陰性對照，4和6為陽性單克隆，13為pUC19-0pt-ADTZ陽性對照。
[0019]圖3是優(yōu)化條件下表達(dá)并純化黃曲霉毒素降解酶Opt-ADTZ的SDS-PAGE圖；I =Marker, 2:未誘導(dǎo)菌液，3:誘導(dǎo)菌液，4:破碎細(xì)胞后離心得到的上清，5:流穿液(蛋白混合液經(jīng)過結(jié)合柱沒有結(jié)合部分)，6:洗脫未結(jié)合蛋白，7:純化后的黃曲霉毒素降解酶Opt-ADTZ0
圖4是黃曲霉毒素AFBl標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，I (A.U)為熒光強(qiáng)度相對單位(arbitraryunit, au)。
[0020]圖5是黃曲霉毒素降解酶作用3分鐘掃描獲得的熒光檢測光譜圖；其中，Opt-ADTZ:0.095mg/mL,反應(yīng)體系中AFBl初始濃度為0.5l^g/mL ；I (CPS.)是熒光強(qiáng)度，即CPS是Counts Per Second, X射線強(qiáng)度I的計(jì)數(shù)率，即每秒進(jìn)入探測器的有效X射線光子數(shù)目。
【具體實(shí)施方式】
[0021]以下實(shí)施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0022]實(shí)施例1優(yōu)化的黃曲霉毒素降解酶基因
在NCBI上搜索黃曲霉毒素降解酶基因(GeneBank N0.AY941095.1 )，對其進(jìn)行密碼子優(yōu)化得到優(yōu)化的黃曲霉毒素降解酶基因(辦其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，優(yōu)化的基因與原始基因的序列相似度為78%。將Opt-ADTZ進(jìn)行合成后克隆到PUC19 載體上得到 pUC19-0pt-ADTZ。
[0023]實(shí)施例2黃曲霉毒素降解酶表達(dá)載體pCold-11-Opt-ADTZ的構(gòu)建 (I)質(zhì)粒的提取
取2個裝有20mL LB(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、氨芐青霉素30mg/L)培養(yǎng)基的錐形瓶，將含有pUC19-0pt-ADTZ、pCold-1I質(zhì)粒的單菌落分別加入培養(yǎng)基中，在37°C、220rpm下過夜培養(yǎng)，按照SDS裂解法提取質(zhì)粒。質(zhì)粒提取完成后將其做好標(biāo)記放A 4°C冰箱等待下一步使用。
[0024](2) PCR 擴(kuò)增 Opt-ADTZ、Opt-ADTZ和 pCoId-1I 的雙酶切
PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系:質(zhì)粒(pUC19-0pt-ADTZ) I ii L、10Xbuffer 5 u L, dNTPs 4u L,Opt-ADTZ 上游引物 I u L、0pt-ADTZ 下游引物 I u L、Taq DNA聚合酶 I u L、加 ddH20 至 50 u L。[0025]Opt-ADTZ 上游引物為 5’ -CGCATATGCATGGCGACCACCACC-3’，
Opt-ADTZ 下游引物為 5’ -ATCGAACGTCGTCTGTGAAAGCTTGG-3?,
下劃線分別是酶切位點(diǎn)Nde I和Hind III。
[0026]PCR 擴(kuò)增條件:94°C預(yù)變性 5min ;94°C 30s,55°C 30s,72°C 2min，25 個循環(huán)；最后延伸72°C 5min。
[0027]將PCR產(chǎn)物Opt-ADTZ通過瓊脂糖凝膠電泳檢測正確后，進(jìn)行膠回收并用Nde I和Hind III進(jìn)行雙酶切。pCold-1I載體(該載體的融合蛋白表達(dá)標(biāo)簽為六個組氨酸His)也用Nde I和Hind III進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物進(jìn)行膠回收用于連接。
[0028](3)連接及轉(zhuǎn)化
在EP管中分別加入酶切后的載體pCold-1I 2uLU0XT4 DNA連接酶緩沖液I y L、T4DNA連接酶I ii L、H2O 5 yL、酶切后的目的基因Opt-ADTZ I U L混勻，載體和目的基因的量可變化，將EP管放入16°C的恒溫水浴箱中，水浴16h。這一步可將載體與目的基因連在一起。
[0029]將制得的感受態(tài)DH5 a從冰箱中拿出放于冰上凍融，加入10 L連接產(chǎn)物，將EP管重置于冰中30min，然后放入到42°C的水浴中，放置90s，再放入冰中，靜置5min。每管加入600 u L LB培養(yǎng)基，在搖床中37°C、180rpm培養(yǎng)60~90min ;然后4000rpm離心，取600 u L上清，將沉淀輕輕混勻，涂在含氨芐青霉素30mg/L的LB平板上，在37 °C恒溫箱中培養(yǎng)13~16h。
[0030](4)單克隆檢測
將上步平板上長出的單菌落，活化于含氨芐青霉素30mg/L20mL LB培養(yǎng)基的燒瓶中37°C、220rpm培養(yǎng)16h。取菌液3 y L進(jìn)行PCR驗(yàn)證(圖2)，分別取質(zhì)粒(pUC19-0pt_ADTZ)3 y L和水3 y L進(jìn)行PCR做陽性和陰性對照，將PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，若菌液擴(kuò)增出的條帶與質(zhì)粒pUC19-0pt-ADTZ擴(kuò)增出的條帶分子量相同，則初步證明連接成功。
[0031]將正確條帶所對應(yīng)的菌液重新活化，保菌送去測序，測序序列結(jié)果顯示載入的
片段長度為2104bp，與Opt-ADTZ比對，比對一致表明載體pCold-11-Opt-ADTZ構(gòu)
建成功。
[0032]實(shí)施例3黃曲霉毒素降解酶的表達(dá)純化 (I)誘導(dǎo)條件的優(yōu)化
對誘導(dǎo)前菌液濃度、誘導(dǎo)劑四環(huán)素及IPTG濃度、誘導(dǎo)表達(dá)溫度、誘導(dǎo)時間進(jìn)行了優(yōu)化提取大腸桿菌DH5 a中的pCold-11-Opt-ADTZ質(zhì)粒，將提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21_PG_Tf2感受態(tài)中。將含有目的基因的表達(dá)菌活化于含氨芐青霉素30mg/L的20mL LB培養(yǎng)基的燒瓶中37°C、220rpm培養(yǎng)16h，取活化后的菌液按2.5%的接種量接種于500mL LB培養(yǎng)基中，選擇不同的誘導(dǎo)條件進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)后收集菌體，通過SDS-PAGE檢測目的蛋白表達(dá)情況，以確定最優(yōu)的誘導(dǎo)條件。最后確定最優(yōu)的誘導(dǎo)條件為:誘導(dǎo)前菌液0D600為0.4~0.8，四環(huán)素濃度50ii g/mL，IPTG濃度0.5mM，誘導(dǎo)表達(dá)溫度為22°C，誘導(dǎo)時間為7小時。
[0033](2)誘導(dǎo)菌株的準(zhǔn)備
將含有目的基因的表達(dá)菌活化于含氨芐青霉素30mg/L的20mL LB培養(yǎng)基的燒瓶中37°C、220rpm培養(yǎng)16h，取活化后的菌液按2.5%的接種量接種于500mL LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到0D600 0.4~0.8的時候，加入四環(huán)素濃度50ii g/mL，半小時后加入IPTG至終濃度0.5mM,22°C、220rpm誘導(dǎo)7小時,用高速冷凍離心機(jī)(J-26XP, Beckman) 12000rpm、4°C離心收集誘
導(dǎo)后的囷。
[0034](3) HisTrap FF N1-柱的再生
首先用二次蒸餾水洗5個柱體積，后用0.5M的NaOH溶液洗滌3個柱體積，注滿NaOH浸泡30min，再用0.5M的NaOH溶液洗滌I~2個柱體積，再用二次蒸餾水洗滌10個柱體積，直至柱子里不再有NaOH溶液，然后用柱平衡緩沖液(50mM Tris-base, 300mM NaCl, pH
8.0)洗滌5個柱體積，平衡純化柱。[0035](4)蛋白純化 純化蛋白所用緩沖液:
柱平衡緩沖液組分為:50mM Tris-base, 300mM NaCl, pH = 8.0 ；
洗脫緩沖液組分為:50 mM Tris-HCl, 300 mM氯化鈉，250mM咪唑，pH = 8.0 ；
脫鹽緩沖液組分為:50 mM Tris-HCl, 50 mM氯化鈉，pH = 8.0。
[0036]將誘導(dǎo)后的細(xì)菌沉淀放在冰上凍融，用30mL柱平衡緩沖液懸浮細(xì)菌，超聲破碎(運(yùn)行3秒，停3秒，180個循環(huán))至溶液變?yōu)榘胪该鳡顟B(tài)為止，然后用高速冷凍離心機(jī)(J-26XP, Beckman) 12000rpm 4°C離心 40min,取上清用 0.45 u m 的濾膜過濾。
[0037]將清洗并再生的HisTrap FF N1-柱裝到蛋白純化儀(AKTA purifier 10)上,用柱平衡緩沖液進(jìn)行柱平衡，流速為2.5mL/min。平衡完畢后，將收集的誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體用柱平衡緩沖液重懸，超聲破碎，離心取上清以0.5mL/min的流速進(jìn)行上樣結(jié)合。上樣完畢后，用80% (v/v)柱平衡緩沖液和20% (v/v)洗脫緩沖液配比成50mM咪唑?qū)⒅系姆翘禺愋噪s質(zhì)洗去，直至UV280基線不再變化時，用洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，流速2.5mL/min,用自動收樣器收集目的蛋白。將收集的目的蛋白放在蛋白濃縮管(Mi 11 1-Q)中，離心(2700rpm,4°C, IOmin);加入脫鹽緩沖液洗滌蛋白(每次加入ImL左右的脫鹽溶液)三次，然后收集目的蛋白得到純化的黃曲霉毒素降解酶Opt-ADTZ。
[0038]獲得純化的Opt-ADTZ蛋白的SDS-PAGE結(jié)果如圖3所示，目的蛋白Opt-ADTZ純度在95%以上，通過與蛋白Marker的對照可以看出，蛋白的單體分子量為77KDa左右，與根據(jù)優(yōu)化的黃曲霉毒素降解酶核酸系列推導(dǎo)的氨基酸序列計(jì)算得到的基本符合。IL LB培養(yǎng)基可獲得黃曲霉毒素降解酶2.4mg。
[0039]實(shí)施例3黃曲霉毒素降解酶的活性檢測 (I)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
將黃曲霉毒素AFBl加入反應(yīng)緩沖液中，配制一系列的濃度(0、0.2,0.4,0.6,0.8、I ii g/mL),然后在多功能微孔板檢測系統(tǒng)SpectraMax M5上測定突光值,其中激發(fā)波長是365nm，發(fā)射波長是435nm，黃曲霉毒素AFBl標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。
[0040]反應(yīng)緩沖液組分是:0.2 M Na2HPO4-0.1 M檸檬酸，pH為6.0。
[0041](2)酶活性的測試
首先將黃曲霉毒素AFBl按一定濃度加入反應(yīng)緩沖液中，測定突光值,然后加入一定體積的酶液，反應(yīng)一定時間后測定熒光值，根據(jù)反應(yīng)前后熒光值的減少及所用的時間來計(jì)算確定酶的催化效率。結(jié)果如圖5所示，掃描獲得的熒光檢測光譜圖，其中，Opt-ADTZ:
0.095mg/mL ;反應(yīng)體系中初始AFBl濃度為0.5Mg/mL。
[0042]上述結(jié)果表明:本發(fā)明制備得到的黃曲霉毒素降解酶降解黃曲霉毒素BI的效率是161.7 nmol/min/mg.pr，酶比活力為161.7U/mg，IL LB培養(yǎng)基可獲得黃曲霉毒素降解酶
2.4mg，總活力是 388.0 U。
[0043]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式 ，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種編碼黃曲霉毒素降解酶的基因，其特征在于:核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一種獲得高效的黃曲霉毒素降解酶的生物合成方法，其特征在于包含如下步驟: (1)將權(quán)利要求1所述的基因克隆至原核表達(dá)載體PCold-1I中得到表達(dá)黃曲霉毒素降解酶的載體 PCold-11-Opt-ADTZ ； (2)將pCold-11-Opt-ADTZ轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21-PG-Tf2中得到黃曲霉毒素降解酶的表達(dá)菌； (3)將黃曲霉毒素降解酶的表達(dá)菌用四環(huán)素及IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體，破碎后利用pCold-1I上的融合蛋白表達(dá)標(biāo)簽純化得到高效的黃曲霉毒素降解酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的獲得高效的黃曲霉毒素降解酶的生物合成方法，其特征在于:步驟(1)中所述的載體pCold-11-Opt-ADTZ通過包含如下步驟的方法制備得到:權(quán)利要求I所述的基因通過合成獲得，將其克隆至PUC19克隆載體上，獲得pUC19-0pt-ADTZ ;再以pUC19-0pt-ADTZ為模板，用Opt-ADTZ上游引物和Opt-ADTZ下游引物擴(kuò)增編碼黃曲霉毒素降解酶的基因；通過上下游引物上的酶切位點(diǎn)Nde I和Hind III將其構(gòu)建到pCold-1I載體上，得到載體 pCold-11-Opt-ADTZ ;其中，Opt-ADTZ 上游引物為 5’ -CGCATATGCATGGCGACCAC CACC-3’，Opt-ADTZ 下游引物為 5’ -ATCGAACGTCGTCTGTGAAAGCTTGG-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的獲得高效的黃曲霉毒素降解酶的生物合成方法，其特征在于:步驟(3)中所述的誘導(dǎo)的條件為:誘導(dǎo)前菌液0D600為0.4~0.8，四環(huán)素濃度50 y g/mL, IPTG濃度0.5mM，誘導(dǎo)表達(dá)溫度為22°C，誘導(dǎo)時間為7小時。
5.根據(jù)權(quán)`利要求2所述的獲得高效的黃曲霉毒素降解酶的生物合成方法，其特征在于:步驟(3)中所述的純化的方法包括如下步驟:清洗并再生的HisTrap FF N1-柱裝到蛋白純化儀上，用柱平衡緩沖液進(jìn)行柱平衡，流速為2.5mL/min ;平衡完畢后，將收集的誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體用柱平衡緩沖液重懸，超聲破碎，離心取上清以0.5mL/min的流速進(jìn)行上樣結(jié)合；上樣完畢后，用80%柱平衡緩沖液和20%洗脫緩沖液配比成50mM咪唑?qū)⒅系姆翘禺愋噪s質(zhì)洗去，直至UV280基線不再變化時，用洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，流速2.5mL/min,用自動收樣器收集目的蛋白；再用洗脫緩沖液洗脫，收集目的蛋白；將收集的目的蛋白放在蛋白濃縮管中，離心；加入脫鹽緩沖液洗滌蛋白三次，然后收集目的蛋白得到純化的黃曲霉毒素降解酶；其中，柱平衡緩沖液組分為:50mM Tris-base,300mM NaCl, pH = 8.0 ;洗脫緩沖液組分為:50mM Tris-HCl, 300mM氯化鈉，250mM咪唑，pH=8.0 ;脫鹽緩沖液組分為:50mM Tris-HCl, 50mM 氯化鈉，pH=8.0。
【文檔編號】C12R1/69GK103555745SQ201310580819
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月19日
【發(fā)明者】馮玲玲, 萬堅(jiān), 李俊, 金晶, 任彥亮, 黃培培, 馮江濤 申請人:華中師范大學(xué)