9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種制備9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺的方法，包括以下步驟：Ⅰ培養(yǎng)：采用補料分批培養(yǎng)方式培養(yǎng)具有產(chǎn)生戊二酰亞胺類抗生素的鏈霉菌屬的微生物，獲得發(fā)酵液；Ⅱ分離：將發(fā)酵液過濾心，然后以石油醚和丙酮的混合物為洗脫液層析濾液，得到9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺粗品；Ⅲ精制：將9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺粗品通過工業(yè)反向色譜柱，以甲醇溶液展開，得到洗脫液，洗脫液通過HPLC法檢測提純，得到9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺精品。本發(fā)明的方法采用兩步層析法，可使發(fā)酵液中的S632A2和S632A3完全分開，提高了S632A3的收率，采用補料分批培養(yǎng)方式可使發(fā)酵液中的產(chǎn)物濃度較高，并可提高培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的利用率。
【專利說明】9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺及其制備方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及通過培養(yǎng)具有產(chǎn)生戊二酰亞胺類抗生素的鏈霉菌屬的微生物提純制備9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺的方法以及由此方法得到的9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)在已知微生物產(chǎn)物可產(chǎn)生具有廣泛結(jié)構(gòu)特征和具有抗炎等藥理活性的多種物質(zhì)。戊二酰亞胺類抗生素(S632A)是由鏈霉菌產(chǎn)生的一類具有多種生物學活性的酰亞胺類化合物，現(xiàn)已報道分離到的大約20多種該類抗生素中，結(jié)構(gòu)差別主要在戊二酰亞胺六元環(huán)連接的側(cè)鏈不同，側(cè)鏈的另一端多以環(huán)狀結(jié)構(gòu)結(jié)束。9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺(S632A3)是由鏈霉菌S632 (Streptomyces hygroscopicus S632)產(chǎn)生的一種具有多種生物學活性的戊二酰亞胺類化合物。研究表明，抗生素S632A3具有抗真菌、抗病毒、抗腫瘤以及抗炎等多種藥理活性。
[0003]通常采用對鏈霉菌S632的發(fā)酵液分離提純的方法獲得S632A3，S632發(fā)酵液中的S632A是具有S632A2 (9-甲基反霉戊二酰亞胺)和S632A3兩中同分異構(gòu)體的混合體，現(xiàn)有的分離純化方法一般為一次層析法很難將S632A2和S632A3完全分開，獲得的主要組分為S632A2，致使S632A3的收率很低。因此有必要提供一種具有較高收率的制備S632A3的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種工藝周期短、收率高的制備9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺的方法以及由此方法得到的9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺。
[0005]根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種制備9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺的方法，該方法包括以下步驟:I培養(yǎng):采用補料分批培養(yǎng)方式培養(yǎng)具有產(chǎn)生戊二酰亞胺類抗生素的鏈霉菌屬的微生物，獲得發(fā)酵液；II分離:將發(fā)酵液過濾，然后以石油醚和丙酮的混合物為洗脫液層析濾液，得到9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺粗品JII精制:將9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺粗品利用工業(yè)反向色譜柱，以甲醇溶液展開，得到洗脫液，洗脫液通過HPLC法(HighPerformance Liquid Chromatography高效液相色譜法)檢測提純,得到9_甲基反式鏈霉戊二酰亞胺精品。由此，步驟III中采用工業(yè)反相色譜柱、HPLC法檢測提純，兩次層析提純可使發(fā)酵液中的S632A2和S632A3完全分開，提高了 S632A3的收率，步驟I中采用補料分批培養(yǎng)方式培養(yǎng)微生物，可使發(fā)酵液中的產(chǎn)物濃度較高，并可提高培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的利用率，且補料分批培養(yǎng)方式操作工藝簡單。
[0006]在一些實施方式中，在步驟I中，補料分批培養(yǎng)的培養(yǎng)基的pH值為6.8，培養(yǎng)溫度為30~。C，培養(yǎng)時間為4~6天，在培養(yǎng)的第3天向培養(yǎng)基中添加補料培養(yǎng)基。由此，培養(yǎng)基PH值為6.8、培養(yǎng)溫度為30°C便于微生物大量產(chǎn)生代謝物，在培養(yǎng)的第3天補料有益于維持微生物產(chǎn)生代謝物，并可提高培養(yǎng)基的利用率。
[0007]在一些實施方式中，補料培養(yǎng)基包括以重量百分比計的甘油6.0%、葡萄糖5%、蛋白胨5%，余量為水。由此，補料培養(yǎng)基可補充原培養(yǎng)基中消耗量大的營養(yǎng)物質(zhì)，并可促進微生物代謝。
[0008]在一些實施方式中，在步驟I中，補料分批培養(yǎng)的培養(yǎng)基包括以重量百分比計的甘油3.0%,葡萄糖0.8%, 土豆淀粉0.2%,黃豆餅粉2.0%,蛋白胨1%，NaCl0.5%, CaCO30.2%,余量為水。由此，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分便于微生物大量繁殖，其中NaCl可維持培養(yǎng)基滲透壓，CaCO3可調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH。
[0009]在一些實施方式中,在步驟I中，在補料分批培養(yǎng)前還包括種子培養(yǎng)，種子培養(yǎng)基包括以重量百分比計的甘油4.0%，葡萄糖1%，土豆淀粉0.5%，黃豆餅粉2.0%，干酵母0.5%，NaCl0.5%，余量為水，種子培養(yǎng)基的pH值為6.8。由此，種子培養(yǎng)可使微生物由適應期進入對數(shù)期，便于在補料分批培養(yǎng)時快速繁殖。
[0010]在一些實施方式中，在步驟II中，濾液層析前還包括下述步驟:采用溶媒提取法、大孔樹脂吸附法或?qū)游龇▽V液提純。由此，濾液層析前的提純可提高層析的效率。
[0011]在一些實施方式中，在步驟III中，HPLC條件為:液相流速為4ml/min、液相溫度為18~22°C、檢測波長為560nm。由此，高效液相色譜法中利用檢測波可對S632A3進行有效的分析，液相流速為4ml/min可提聞提純的效率。
[0012]在一些實施方式中，在步驟III中，工業(yè)反向色譜柱的固相為粒度50 μ m的十八烷基硅烷鍵合硅膠，甲醇溶液為35%(體積百分比)甲醇溶液。由此，工業(yè)反相色譜柱可對9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺粗品進一步提純。
[0013]相應地，本發(fā)明還提供了一種根據(jù)上述方法得到的9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺，
其化學結(jié)構(gòu)式為: [0014]
【權(quán)利要求】
1.制備9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: I培養(yǎng):采用補料分批培養(yǎng)方式培養(yǎng)具有產(chǎn)生戊二酰亞胺類抗生素的鏈霉菌屬的微生物，獲得發(fā)酵液； II分離:將發(fā)酵液過濾，然后以石油醚和丙酮的混合物為洗脫液層析濾液，得到9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺粗品； III精制:將9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺粗品利用工業(yè)反向色譜柱，以甲醇溶液展開，得到洗脫液，洗脫液通過HPLC法檢測提純，得到9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺精品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺的方法，其特征在于，在步驟I中，補料分批培養(yǎng)的培養(yǎng)基的PH值為6.8，培養(yǎng)溫度為30°C，培養(yǎng)時間為4~6天，在培養(yǎng)的第3天向培養(yǎng)基中添加補料培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺的方法，其特征在于，所述補料培養(yǎng)基包括以重量百分比計的甘油6.0%、葡萄糖5%、蛋白胨5%，余量為水。
4.根據(jù)權(quán)利要求2述的制備9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺的方法，其特征在于，在步驟I中，補料分批培養(yǎng)的培養(yǎng)基包括以重量百分比計的甘油3.0%，葡萄糖0.8%，土豆淀粉0.2%，黃豆餅粉2.0%，蛋白胨1%，NaCl0.5%, CaCO30.2%，余量為水。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺的方法，其特征在于，在步驟I中，在補料分批培養(yǎng)前還包括種子培養(yǎng)，種子培養(yǎng)基包括以重量百分比計的甘油4.0%，葡萄糖1%，土豆淀粉0.5%，黃豆餅粉2.0%，干酵母0.5%，NaCl0.5%，余量為水，種子培養(yǎng)基的pH值為6.8。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述`的制備9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺的方法，其特征在于，在步驟II中，濾液層析前還包括下述步驟:采用溶媒提取法、大孔樹脂吸附法或?qū)游龇▽V液提純。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺的方法，其特征在于，在步驟III中，HPLC法的條件為:液相流速為4ml/min，液相溫度為18~22°C，檢測波長為560nm。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺的方法，其特征在于，在步驟III中，所述工業(yè)反向色譜柱的固相為粒度50ym的十八烷基硅烷鍵合硅膠，所述甲醇溶液為35% (體積百分比)甲醇溶液。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法得到的9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺，其化學結(jié)構(gòu)式為:



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【文檔編號】C12P17/12GK103525882SQ201310460498
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】鄧洪斌 申請人:無錫華奈生物科技有限公司