用于產(chǎn)生己二酸和其他化合物的微生物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種非天然存在的微生物生物體，其具有己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺途徑。所述微生物生物體含有至少一種編碼己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺途徑中各自的酶的外源性核酸。本發(fā)明另外提供了產(chǎn)生己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺的方法。該方法可以包括在產(chǎn)生己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺的條件下和足以產(chǎn)生己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺的時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)產(chǎn)生己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺的微生物生物體，其中所述微生物生物體以足以產(chǎn)生各自產(chǎn)物的量表達(dá)至少一種編碼己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺途徑酶的外源性核酸。
【專利說明】用于產(chǎn)生己二酸和其他化合物的微生物
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2009年3月27日、 優(yōu)先權(quán)日:為2008年3月27日、申請(qǐng)?zhí)枮?200980119404.X、發(fā)明名稱為“用于產(chǎn)生己二酸和其他化合物的微生物”的發(fā)明專利申請(qǐng)的
分案申請(qǐng)。
[0002]本申請(qǐng)要求于2008年3月27日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)系列號(hào)61/040，059的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，該申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容通過引用合并于此。
[0003]發(fā)明背景
[0004]本發(fā)明總體上涉及生物合成方法，且更具體地涉及具有己二酸、6-氨基己酸和己內(nèi)酰胺生物合成能力的生物體。
[0005]己二酸，一種分子量為146.14的二羧酸，是一種具有商業(yè)意義的化合物。其主要用途是制備尼龍6，6，一種通過將己二酸與環(huán)己二胺縮合制備的線性聚酰胺，其主要用于制造不同種類的纖維。己二酸的其他用途包括其在增塑劑、不飽和聚酯和聚酯多元醇中的用途。其他用途包括用于制備聚氨酯、潤(rùn)滑劑組分，和作為調(diào)味劑和膠凝助劑用作食品成分。
[0006]過去，己二酸使用氧化作用由各種脂肪制備。目前用于己二酸合成的商業(yè)方法依靠使用過量的濃硝酸氧化KA油一一種環(huán)己酮(酮或K組分)和環(huán)己醇(醇或A組分) 的混合物，或氧化純環(huán)己醇。此方案有幾種變型，其區(qū)別在于產(chǎn)生KA或環(huán)己醇的途徑。例如，苯酚是KA油制備中的替代原料，并且已經(jīng)描述了用于從苯酚合成己二酸的方法。此方法的其他方式傾向于使用除硝酸以外的氧化劑，諸如過氧化氫、空氣或氧。
[0007]己內(nèi)酰胺是一種有機(jī)化合物，其是6-氨基己酸(e -氨基己酸、氨基己酸)的內(nèi)酰胺?；蛘咂淇梢员徽J(rèn)為是己酸的環(huán)酰胺。己內(nèi)酰胺的主要工業(yè)應(yīng)用是作為制備尼龍-6的單體。大多數(shù)己內(nèi)酰胺使用硫酸羥銨經(jīng)肟化方法然后使用Beckmann重排工藝步驟通過催化重排合成自環(huán)己酮。
[0008]因此，存在著用于有效地制備商業(yè)數(shù)量的化合物諸如己二酸和己內(nèi)酰胺的可替代方法的需求。本發(fā)明滿足了這種需求并還提供了相關(guān)的優(yōu)勢(shì)。
[0009]發(fā)明概沭
[0010]本發(fā)明提供了具有己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺途徑的非天然存在的微生物生物體。該微生物生物體含有至少一種編碼己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺途徑中各自的酶的外源性核酸。本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺的方法。該方法可以包括在產(chǎn)生己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺的條件下和足以產(chǎn)生己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺的時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)產(chǎn)生己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺的微生物生物體，其中所述微生物生物體以足以產(chǎn)生各自產(chǎn)物的量表達(dá)至少一種編碼己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺途徑酶的外源性核酸。
[0011]附圖簡(jiǎn)要說明
[0012]圖1顯示在產(chǎn)黃青霉菌(Penicillium chrysogenum)的過氧化酶體中降解己二酸的示例性途徑。
[0013]圖2顯示經(jīng)逆降解途徑形成己二酸的示例性途徑。對(duì)于己二酰-CoA至己二酸的最終轉(zhuǎn)變提供了幾種選擇。[0014]圖3顯示經(jīng)3-氧代己二酸途徑形成己二酸的示例性途徑。
[0015]圖4顯示己二酸合成和還原性TCA循環(huán)的3-氧代己二酸途徑的最后三個(gè)步驟的類似酶化學(xué)。
[0016]圖5顯示經(jīng)順，順-己二烯二酸從葡萄糖合成己二酸的示例性途徑。生物合成中間體(縮寫):D-赤蘚糖4-磷酸(E4P)、磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)、3_脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸(DAHP)、3-脫氫奎尼酸(DHQ)、3_脫氫莽草酸(DHS)、原兒荼酸(PCA)。酶(編碼基因)或反應(yīng)條件:(a) DAHP合成酶(aroFFBR)、(b) 3-脫氫奎尼酸合成酶(aroB)、(c) 3-脫氫奎尼酸脫水酶(aroD)、(d) DHS脫水酶(aroZ)、(e)原兒荼酸脫羧酶(aroY)、(f)兒荼酚 1,2-雙加氧酶(catA), (g) 10% Pt / C，H2，3400kPa，25°C。附圖取自 Niu 等，Biotechnol.Prog.18:201-211(2002))。
[0017]圖6顯示使用a -酮戊二酸作為起點(diǎn)經(jīng)a -酮己二酸合成己二酸的示例性途徑。
[0018]圖7顯示使用賴氨酸作為起點(diǎn)合成己二酸的示例性途徑。
[0019]圖8顯示使用己二酰-Cok作為起點(diǎn)的示例性己內(nèi)酰胺合成途徑。
[0020]圖9顯示使用a -酮己二酸作為起點(diǎn)的示例性己二酸合成途徑。
[0021]發(fā)明詳沭
[0022]本發(fā)明涉及具有己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺的生物合成性制備能力的細(xì)胞和生物體的設(shè)計(jì)和產(chǎn)生。本文所述的結(jié)果表明代謝途徑可以被設(shè)計(jì)和重組改造，從而在大腸桿菌(Escherichia coli)和其他細(xì)胞或生物體中實(shí)現(xiàn)己二酸、6_氨基己酸或己內(nèi)酰胺的生物合成。通過構(gòu)建具有設(shè)計(jì)的代謝基因型的菌株可以確認(rèn)己二酸、6-氨基己酸和己內(nèi)酰胺的生物合成性制備。這些代謝改造的細(xì)胞或生物體還可以進(jìn)行適應(yīng)進(jìn)化以進(jìn)一步增加己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺的生物合成，包括在接近理論最大生長(zhǎng)的條件下。
[0023]如本文所公開的，描述了許多用于產(chǎn)生己二酸、6-氨基己酸和己內(nèi)酰胺的代謝途徑。發(fā)現(xiàn)兩種途徑一逆向己二酸降解途徑和3-氧代己二酸途徑一在下列方面是有益的:(i)己二酸產(chǎn)率(以葡萄糖計(jì)，92%摩爾產(chǎn)率)，(ii)對(duì)于己二酸合成不需要氧，(iii) 相關(guān)的能量學(xué)，和(iv)產(chǎn)生作為單一發(fā)酵產(chǎn)物的己二酸的理論能力。還描述了通過a-酮己二酸或賴氨酸產(chǎn)生己二酸的代謝途徑，但其產(chǎn)率`較低，并且需要通氣以達(dá)到最大產(chǎn)量。 本文還公開了用于從己二酰-CoA產(chǎn)生6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺或兩者的途徑，所述己二酰-CoA是逆降解途徑中的前體。
[0024]如本文所公開的，描述了許多生物合成己二酸的示例性途徑。一種示例性途徑包括經(jīng)依賴于己二酸降解的可逆性的途徑的己二酸合成，如在生物體諸如產(chǎn)黃青霉菌中所描述(參見實(shí)施例1和II)。第二種示例性途徑需要形成3-氧代己二酸，然后使其還原、脫水和再次還原以形成己二酸(參見實(shí)施例1II和IV)。使用這兩種途徑的任一種的己二酸產(chǎn)率為0.92摩爾/摩爾消耗的葡萄糖。為了達(dá)到這些理論最大產(chǎn)率，不需要攝取氧，并且在厭氧條件下的能量學(xué)有利于生長(zhǎng)和產(chǎn)物分泌。從葡萄糖來源的順，順-己二烯二酸產(chǎn)生己二酸的方法以前有所描述(Frost等，美國(guó)專利號(hào)5，487，987，于1996年I月30日授權(quán)) (參見實(shí)施例V)。對(duì)本文公開的實(shí)施方案相對(duì)于此先前描述的方法的優(yōu)勢(shì)進(jìn)行了討論。通過a -酮己二酸(實(shí)施例VI)或賴氨酸(實(shí)施例VII)前體產(chǎn)生己二酸的代謝途徑的產(chǎn)率較低，并且需要通氣以達(dá)到最大產(chǎn)量。描述了從己二酰-CoA產(chǎn)生6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺或兩者的途徑，所述己二酰-CoA是逆降解途徑中的前體(參見實(shí)施例VIII和IX)。用于產(chǎn)生己二酸的其他途徑描述在實(shí)施例X和XI中。描述了構(gòu)建具有這些能力的微生物所需的示例性基因和酶以及克隆和轉(zhuǎn)化、監(jiān)測(cè)產(chǎn)物形成和使用改造的微生物用于生產(chǎn)的方法。
[0025]如本文所公開的，描述了使用葡萄糖/蔗糖作為碳底物的己二酸合成的6種不同的途徑。對(duì)于所有最大產(chǎn)率計(jì)算，在給定途徑中缺少的反應(yīng)加入至SimPheny中的大腸桿菌化學(xué)計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中，其類似于以前所述的一種網(wǎng)絡(luò)(Reed等,Genome Biol.4:R54(2003)) ?己二酸在生理?xiàng)l件下是一種帶電分子，并且其被假設(shè)需要以基于質(zhì)子的同向轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)形式的能量以被分泌出網(wǎng)絡(luò)。如果在中性或接近中性PH下進(jìn)行發(fā)酵，則此轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)在熱力學(xué)上是可行的。低PH己二酸形成將需要ATP-依賴性輸出機(jī)制，例如，與質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運(yùn)相反的ABC 系統(tǒng)。這些途徑中的反應(yīng)和實(shí)現(xiàn)這些途徑的方法描述在實(shí)施例1-XI中。
[0026]如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“非天然存在的”當(dāng)用來說明本發(fā)明的微生物生物體或微生物時(shí)意在指微生物生物體具有至少一個(gè)在參照物種的天然存在株中正常情況下不存在的遺傳改變，所述天然存在株包括參照物種的野生株。遺傳改變包括，例如，引入可表達(dá)的編碼代謝多肽的核酸的修飾，其他核酸添加，核酸缺失和/或微生物遺傳材料的其他功能性破壞。此類修飾包括，例如，參照物種的異源多肽、同源多肽或異源多肽和同源多肽兩者的編碼區(qū)和其功能片段。其他的修飾包括，例如，非編碼調(diào)控區(qū)，其中所述修飾改變基因或操縱子的表達(dá)。示例性的代謝多肽包括己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺生物合成途徑內(nèi)的酶。
[0027]代謝修飾指從其天然存在狀態(tài)改變的生化反應(yīng)。因此，非天然存在的微生物可以具有對(duì)編碼代謝多肽的核酸或其功能片段的遺傳修飾。示例性的代謝修飾公開在本文中。
[0028]如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“分離的”當(dāng)用來說明微生物生物體時(shí)意在指生物體基本上不含有當(dāng)參照微生物生物體在自然界中被發(fā)現(xiàn)時(shí)的至少一種成分。該術(shù)語(yǔ)包括微生物生物體與當(dāng)其在自然環(huán)境中被發(fā)現(xiàn)時(shí)的一些或所有成分分開。該術(shù)語(yǔ)還包括微生物生物體與當(dāng)微生物生物體在非天然存在的環(huán)境中被發(fā)現(xiàn)時(shí)的一些或所有成分分開。因此，分離的微生物生物體與當(dāng)其在自然界中發(fā)現(xiàn)時(shí)或當(dāng)其在非天然存在的環(huán)境中生長(zhǎng)、保存或生存時(shí)的其他物質(zhì)部分或全部地分離。分離的微生物生物體的具體實(shí)例包括部分純的微生物、基本上純的微生物和在非天然存在的在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的微生物。
[0029]如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“微生物”、“微生物生物體”或“微生物體”意在指包括在古細(xì)菌域、真細(xì)菌域或真核生物域的范圍內(nèi)的作為微型細(xì)胞存在的任何生物體。因此，該術(shù)語(yǔ)意在包括具有微型尺寸的原核或真核細(xì)胞或生物體，并且包括所有物種的細(xì)菌、古細(xì)菌和真細(xì)菌以及真核微生物諸如酵母和真菌。該術(shù)語(yǔ)還包括可被培養(yǎng)以產(chǎn)生生物化學(xué)物質(zhì)的任何物種的細(xì)胞培養(yǎng)物。
[0030]如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“CoA”或“輔酶A”意在指有機(jī)輔因子或輔基(酶的非蛋白部分)，其存在是許多酶(脫輔基酶)的活性形成活性酶體系所必需的。輔酶A在某些縮合酶中起作用，在乙?；蚱渌；D(zhuǎn)移和在脂肪酸合成和氧化、丙酮酸氧化和在其他乙?；邪l(fā)揮作用。
[0031]如本文所使用，具有化學(xué)式-00C-(CH2)4-C00-(參見圖2)的“己二酸鹽 (adipate) ”(IUPAC 名稱:hexanedioate)是己二酸(IUPAC 名稱:hexanedioic acid)的離子化形式，并且要理解己二酸鹽和己二酸通篇可以互換使用以指采取其中性或離子形式的任一種形式的化合物，包括其任何鹽形式。技術(shù)人員要理解的是，具體形式將取決于pH。
[0032]如本文所使用，具有化學(xué)式-00C-(CH2)5-NH2(參見圖8)的“6_氨基己酸鹽(6-aminocaproate) ”是 6-氛基己酸(IUPAC 名稱:6_aminohexanoic acid)的離子形式，并且要理解6-氨基己酸鹽和6-氨基己酸通篇可以互換使用以指采取其中性或離子形式的任一種形式的化合物，包括其任何鹽形式。技術(shù)人員要理解的是，具體形式將取決于pH。
[0033]如本文所使用，“己內(nèi)酰胺”(IUPAC名稱:az印an-2-one (氮雜環(huán)庚烷-2-酮))是6-氨基己酸的內(nèi)酰胺(參見圖8)。
[0034]如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“基本上厭氧的”當(dāng)用來描述培養(yǎng)或生長(zhǎng)條件時(shí)意在指氧量小于液體培養(yǎng)基中溶解氧飽和度的約10%。該術(shù)語(yǔ)還意在包括液體或固體培養(yǎng)基的密閉室保持以小于約I %氧的氣氛。
[0035]如本文所使用，“外源性”意在指參照分子或參照活性被引入指宿主微生物生物體中。該分子可以通過如下方法被弓丨入,例如,通過將編碼核酸引入宿主遺傳物質(zhì)中諸如通過整合至宿主染色體中或作為非染色體遺傳物質(zhì)諸如質(zhì)粒引入。因此，該術(shù)語(yǔ)當(dāng)用來說明編碼核酸的表達(dá)時(shí)指編碼核酸以可表達(dá)形式引入至微生物生物體中。當(dāng)用來說明生物合成活性時(shí)，該術(shù)語(yǔ)指引入至宿主參照生物體中的活性。來源可以是，例如，同源或異源的編碼核酸，其在引入至宿主微生物生物體中后表達(dá)參照活性。因此，術(shù)語(yǔ)“內(nèi)源性”指參照分子或活性存在于宿主中。類似地，該術(shù)語(yǔ)當(dāng)用來說明編碼核酸的表達(dá)時(shí)指包含在微生物生物體內(nèi)的編碼核酸的表達(dá)。術(shù)語(yǔ)“異源的”指分子或活性來源于參照物種以外的來源，而“同源的”指分子或活性來源于宿主微生物生物體的。因此，本發(fā)明的編碼核酸的外源性表達(dá)可以利用異源的編碼核酸或同源的編碼核酸或兩者。
[0036]本發(fā)明的非天然存在的微生物生物體可以含有穩(wěn)定的遺傳改變，其指微生物可以培養(yǎng)5代以上而沒有丟失所述改變。通常，穩(wěn)定的遺傳改變包括持續(xù)10代以上的修飾，特別穩(wěn)定的修飾將持續(xù)約25代以上，并且更特別地，穩(wěn)定的遺傳修飾將為50代以上，包括無限期。
[0037]本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，遺傳改變，包括本文所例舉的代謝修飾，參照適當(dāng)?shù)乃拗魃矬w諸如大腸桿菌和它們相應(yīng)的代`謝反應(yīng)或適合于所需的遺傳物質(zhì)諸如所需代謝途徑的基因的來源生物體進(jìn)行描述。然而，鑒于多種多樣的生物體的全基因組測(cè)序和基因組學(xué)領(lǐng)域中的高技術(shù)水平，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠容易地將本文提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)應(yīng)用于基本上所有其他生物體。例如，本文例舉的大腸桿菌代謝改變可以通過摻入來自參照物種以外的物種的相同的或類似的編碼核酸而容易地應(yīng)用于其他物種。此類遺傳改變包括，例如，物種同源物的遺傳改變，通常和特別地，直向同源物(ortholog)、旁系同源物(paralog)或非直向同源(nonorthologous)基因置換。
[0038]直向同源物是通過垂直遺傳而相關(guān)并且在不同的生物體中負(fù)責(zé)基本上相同或同一功能的一種基因或多種基因。例如，小鼠環(huán)氧化物水解酶和人環(huán)氧化物水解酶可以被認(rèn)為是環(huán)氧化物水解的生物學(xué)功能的直向同源物。例如，當(dāng)基因共享足以表明它們是同源的量的序列相似性時(shí)，它們是通過垂直遺傳而相關(guān)的，或由共同祖先進(jìn)化而相關(guān)。如果基因共享足以表明它們已從共同祖先進(jìn)化至一級(jí)序列相似性不可鑒定的程度的量的三維結(jié)構(gòu)但不必然具有這樣的量的序列相似性，它們也可被認(rèn)為是直向同源物。直向同源的基因可以編碼具有約25% -100%氨基酸序列同一性的序列相似性的蛋白質(zhì)。如果其三維結(jié)構(gòu)也顯示相似性，則編碼共享小于25%的氨基酸相似性的蛋白質(zhì)的基因也可以被認(rèn)為由垂直遺傳而產(chǎn)生。絲氨酸蛋白酶家族的成員，包括組織纖溶酶原激活物和彈性蛋白酶，被認(rèn)為從共同祖先通過垂直遺傳而產(chǎn)生。
[0039]直向同源物包括基因或它們編碼的基因產(chǎn)物，它們通過，例如，進(jìn)化，已經(jīng)在結(jié)構(gòu)上或總體活性上發(fā)生了趨異。例如，在一個(gè)物種編碼顯示兩種功能的基因產(chǎn)物的情況下以及在此類功能已經(jīng)在第二物種中分離入不同基因的情況下，這三種基因和它們相應(yīng)的產(chǎn)物被認(rèn)為是直向同源物。對(duì)于生物化學(xué)產(chǎn)物的產(chǎn)生，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解具有待引入或待破壞的代謝活性的直向同源基因被選擇用于構(gòu)建非天然存在的微生物。顯示可分離的活性的直向同源物的實(shí)例是在兩個(gè)或多個(gè)物種之間或單個(gè)物種內(nèi)不同的活性已經(jīng)分離入不同的基因產(chǎn)物的情況。具體的實(shí)例是彈性蛋白酶蛋白水解和纖溶酶原蛋白水解(兩種類型的絲氨酸蛋白酶活性)作為纖溶酶原激活物和彈性蛋白酶分離入不同分子。第二個(gè)實(shí)例是支原體5’ -3’外切核酸酶和果蠅(Dr0Sophila)DNA聚合酶III活性的分離。來自第一物種的DNA聚合酶可以被認(rèn)為是來自第二物種的外切核酸酶或聚合酶或兩者的直向同源物，且反之亦然。
[0040]相反，旁系同源物是通過例如，復(fù)制然后通過進(jìn)化趨異而相關(guān)的同源物，并且具有相似的或共有的、但不相同的功能。旁系同源物可以源自或來自，例如，相同的物種或不同的物種。例如，微粒體環(huán)氧化物水解酶(環(huán)氧化物水解酶I)和可溶性環(huán)氧化物水解酶(環(huán)氧化物水解酶II)可以被認(rèn)為是旁系同源物，因?yàn)樗鼈兇韽墓餐嫦裙餐M(jìn)化的兩種不同的酶，它們?cè)谙嗤奈锓N中催化不同的反應(yīng)并且具有不同的功能。旁系同源物是來自相同物種的彼此具有顯著的序列相似性的蛋白質(zhì)，表明它們是同源的，或通過從共同祖先共同進(jìn)化而相關(guān)。旁系同源蛋白家族的組包括HipA同源物、螢光素酶基因、肽酶等。
[0041]非直向同源基因置換是來自一個(gè)物種的非直向同源基因可以替代不同物種中的參照基因功能。置換包括，例如，能夠在來源物種中執(zhí)行與不同物種中的參照功能相比基本上相同或相似的功能。盡管通常非直向同源置換將可被鑒定為與編碼參照功能的已知基因結(jié)構(gòu)上相關(guān)，然而結(jié)構(gòu)上不太相關(guān)但功能上相似的基因和它們相應(yīng)的基因廣物將仍然落在該術(shù)語(yǔ)的范圍內(nèi)，如其在本文中所使用的那樣。與編碼尋求替代的功能的基因相比，功能相似性需要，例如，非直向同源基因產(chǎn)物的活性位點(diǎn)或結(jié)合區(qū)中的至少一些結(jié)構(gòu)相似性。因此，非直向同源基因包括，例如`，旁系同源物或不相關(guān)基因。
[0042]因此，在鑒定和構(gòu)建本發(fā)明的具有己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺生物合成能力的非天然存在的微生物生物體時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，將本文提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)應(yīng)用于具體物種，使得代謝修飾的鑒定可以包括直系同源物的鑒定和包含或失活。就編碼催化相似或基本上相似的代謝反應(yīng)的酶的旁系同源物和/或非直向同源基因置換存在于參照微生物中這一程度而言，本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以利用這些進(jìn)化上相關(guān)的基因。
[0043]直系同源物、旁系同源物和非直向同源基因置換可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法來確定。例如，對(duì)于兩種多肽，核酸或氨基酸序列的檢查將揭示比較的序列之間的序列同一性和相似性?；谶@些相似性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定是否相似性足夠高從而表明這些蛋白質(zhì)通過從共同祖先進(jìn)化而相關(guān)。本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的算法，諸如Align、BLAST、Clustal W和其他算法比較和確定原始序列相似性或同一性，并且還確定序列中空位的存在或顯著性，其可以被賦予權(quán)重或分值。此類算法在本領(lǐng)域中也是已知的，并且類似地可應(yīng)用于確定核苷酸序列相似性或同一性?；谟糜谟?jì)算統(tǒng)計(jì)學(xué)相似性的公知方法、或在隨機(jī)多肽中找到相似匹配的機(jī)會(huì)以及確定的匹配的顯著性來計(jì)算足以確定關(guān)聯(lián)性的相似性參數(shù)。如果需要，兩條或多條序列的計(jì)算機(jī)比較也可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過肉眼觀察來優(yōu)化。相關(guān)的基因產(chǎn)物或蛋白質(zhì)可被預(yù)期具有高相似性，例如，25% -100%序列同一性。如果掃描具有足夠大小的數(shù)據(jù)庫(kù)，不相關(guān)的蛋白質(zhì)可以具有與如預(yù)期將偶然發(fā)生的那樣基本上相同的同一性(約5% )。5% -24%之間的序列可以代表或不代表足以得出比較的序列是相關(guān)的結(jié)論的同源性。對(duì)于給定的數(shù)據(jù)庫(kù)大小，可以進(jìn)行用于確定此類匹配的顯著性的其他統(tǒng)計(jì)學(xué)分析以確定這些序列的相關(guān)性。
[0044]例如，使用BLAST算法確定兩條或多條序列的關(guān)聯(lián)性的示例性參數(shù)可如下所示。簡(jiǎn)言之，使用BLASTP2.0.8版(1999年I月5日)和下列參數(shù)執(zhí)行氨基酸序列比對(duì):矩陣:0BL0SUM62 ;空位開放:11 ;空位延伸:1 ；x_dropoff:50 ;期望值:10.0 ;字長(zhǎng):3 ;過濾器:開。可以使用BLASTN2.0.6版(1998年9月16日)和下列參數(shù)執(zhí)行核酸序列比對(duì):匹配:
I;錯(cuò)配:-2 ;空位開放:5 ;空位延伸:2 ；x_dropoff:50 ;期望值:10.0 ;字長(zhǎng):11 ;過濾器:關(guān)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道可以對(duì)上述參數(shù)作出何種修改來例如，增加或降低比較的嚴(yán)格性，和確定兩條或多條序列的關(guān)聯(lián)性。
[0045]本發(fā)明提供了能夠產(chǎn)生己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺的非天然存在的微生物生物體。例如，己二酸途徑可以是逆向己二酸降解途徑(參見實(shí)施例1和II)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有己二酸途徑的非天然存在的微生物生物體，其包含以足以產(chǎn)生己二酸的量表達(dá)的至少一種編碼己二酸途徑酶的外源性核酸，所述己二酸途徑包括琥珀酰-Cok:乙酰-Cok酰基轉(zhuǎn)移酶、3-羥酰-Cok脫氫酶、3-羥基己二酰-Cok脫水酶、5-羧基-2-戊烯酰-Cok還原酶和己二酰-Cok合成酶或磷酸己二酰轉(zhuǎn)移酶/己二酸激酶或己二酰-Cok:乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或己二酰-Cok水解酶。另外，己二酸途徑可以經(jīng)由3-氧代己二酸途徑(參見實(shí)施例1II和IV)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有己二酸途徑的非天然存在的微生物生物體，其包含以足以產(chǎn)生己二酸的量表達(dá)的至少一種編碼己二酸途徑酶的外源性核酸，所述己二酸途徑包括琥珀酰-Cok:乙酰-CoA?；D(zhuǎn)移酶、3-氧代己二酰-Cok轉(zhuǎn)移酶、3-氧代己二酸還原酶、3-羥基己二酸脫水酶和2-烯酸還原酶。
[0046]還在另一個(gè)實(shí)施方案`中，本發(fā)明提供了具有6-氨基己酸途徑的非天然存在的微生物生物體，其包含以足以產(chǎn)生6-氨基己酸的量表達(dá)的至少一種編碼6-氨基己酸途徑酶的外源性核酸，所述6-氨基己酸途徑包括CoA-依賴性醛脫氫酶和轉(zhuǎn)氨酶(參見實(shí)施例VIII和IX)。備選地，6-氨基己酸脫氫酶可以用來轉(zhuǎn)變己二酸半醛以形成6-氨基己酸(參見圖8)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有己內(nèi)酰胺途徑的非天然存在的微生物生物體，其包含以足以產(chǎn)生己內(nèi)酰胺的量表達(dá)的至少一種編碼己內(nèi)酰胺途徑酶的外源性核酸，所述己內(nèi)酰胺途徑包括CoA-依賴性醛脫氫酶、轉(zhuǎn)氨酶或6-氨基己酸脫氫酶和酰胺水解酶(參見實(shí)施例VIII和IX)。
[0047]如本文所公開，本發(fā)明的產(chǎn)生6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺的微生物生物體可以從己二酰-CoA前體產(chǎn)生6-氨基己酸和/或己內(nèi)酰胺(參見圖8和實(shí)施例VIII和IX)。因此，要理解，產(chǎn)生6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺的微生物生物體可以進(jìn)一步包括產(chǎn)生己二酰-CoA的途徑。例如，己二酰-Cok途徑可以包括圖2的酶，其通過己二酰-Cok的產(chǎn)生利用琥珀酰-Cok和乙酰-CoA作為前體，即，缺少用于將己二酰-CoA轉(zhuǎn)變?yōu)榧憾岬淖罱K步驟的酶。因此，一個(gè)示例性的己二酰-Cok途徑可以包括琥珀酰-Cok:乙酰-Cok?；D(zhuǎn)移酶、3-羥酰-Cok脫氫酶、3-羥基己二酰-CoA脫水酶和5-羧基-2-戊烯酰-CoA還原酶。[0048]另外，如圖1中所示，己二酸降解途徑包括通過己二酸CoA連接酶將己二酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧憾?Cok的步驟。因此，己二酰-Cok途徑可以是進(jìn)一步包括將己二酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧憾?CoA的酶活性的己二酸途徑，包括，例如，如圖1的第一步驟中的己二酸-CoA連接酶活性和以逆向進(jìn)行的圖2的最終步驟中的任一種酶，例如，己二酰-CoA合成酶(也稱為己二酸Co-A連接酶)、磷酸己二酰轉(zhuǎn)移酶/己二酸激酶、己二酰-CoA:乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶或己二酰-CoA水解酶的任一種。具有己二酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧憾?CoA活性的酶可以是內(nèi)源性活性或可以作為編碼該酶的外源性核酸而提供，如本文所公開的。因此，要理解，利用己二酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧憾?CoA的酶活性，任何己二酸途徑可以用來產(chǎn)生己二酰-CoA途徑。這樣的途徑可以包含在產(chǎn)生6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺的微生物生物體中，從而為6-氨基己酸和/或己內(nèi)酰胺的產(chǎn)生提供己二酰-CoA前體。
[0049]其他示例性的己二酸途徑利用α -酮己二酸作為前體(參見圖6和實(shí)施例VI)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有己二酸途徑的非天然存在的微生物生物體，其包含以足以產(chǎn)生己二酸的量表達(dá)的至少一種編碼己二酸途徑酶的外源性核酸，所述己二酸途徑包括高檸檬酸合成酶、高烏頭酸酶、同分異構(gòu)檸檬酸脫氫酶、2-酮己二酸還原酶、α -羥基己二酸脫水酶和氧化還原酶。進(jìn)一步示例性的己二酸途徑利用賴氨酸降解途徑(參見圖7和實(shí)施例VII)。本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供了具有己二酸途徑的非天然存在的微生物生物體，其包含以足以產(chǎn)生己二酸的量表達(dá)的至少一種編碼己二酸途徑酶的外源性核酸，所述己二酸途徑包括碳氮裂合酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)氨酶和氧化還原酶。
[0050]還有另一個(gè)示例性的己二酸途徑利用α -酮己二酸作為前體(參見圖9和實(shí)施例X和XI)。因此，本發(fā)明另外提供了具有己二酸途徑的非天然存在的微生物生物體，其包含以足以產(chǎn)生己二酸的量表達(dá)的至少一種編碼己二酸途徑酶的外源性核酸，所述己二酸途徑包括α -酮己二酰-CoA合成酶、磷酸酮己二酰轉(zhuǎn)移酶(phosphotransketoadipylase) /α -酮己二酸激酶或α -酮己二酰-Cok:乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶；2_羥基己二酰-Cok脫氫酶；
2-羥基己二酰-Cok脫水酶；5_羧基-2-戊烯酰-Cok還原酶；和己二酰-Cok合成酶、磷酸己二酰轉(zhuǎn)移酶(phosphotransadipyla`se) /己二酸激酶、己二酰-CoA:乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或己二酰-CoA水解酶。還在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有己二酸途徑的非天然存在的微生物生物體，其包含以足以產(chǎn)生己二酸的量表達(dá)的至少一種編碼己二酸途徑酶的外源性核酸，所述己二酸途徑包括2-羥基己二酸脫氫酶；2_羥基己二酰-Cok合成酶、磷酸羥基己二酰轉(zhuǎn)移酶/ 2-羥基己二酸激酶或2-羥基己二酰-CoA:乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶；2-羥基己二酰-CoA脫水酶；5_羧基-2-戊烯酰-CoA還原酶；和己二酰-CoA合成酶、磷酸己二酰轉(zhuǎn)移酶/己二酸激酶、己二酰-CoA:乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或己二酰-CoA水解酶。
[0051]在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺途徑的非天然存在的微生物生物體，其中所述非天然存在的微生物生物體包含至少一種編碼將底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的多肽的外源性核酸，如本文所公開的那樣。因此，本發(fā)明提供了含有至少一種編碼多肽的外源性核酸的非天然存在的微生物生物體，其中所述多肽是轉(zhuǎn)變己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺途徑的底物和產(chǎn)物的酶或蛋白質(zhì)，諸如圖2、3、8和9中所示的那些。
[0052]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有己二酸途徑的非天然存在的微生物生物體，其中所述微生物生物體含有至少一種編碼將底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的多肽的外源性核酸，所述的底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物選自琥珀酰-Cok和乙酰-Cok轉(zhuǎn)變?yōu)?-氧代己二酰-Cok ； 3-氧代己二酰-Cok轉(zhuǎn)變?yōu)?-羥基己二酰-Cok ；3-羥基己二酰-Cok轉(zhuǎn)變?yōu)?-羧基-2-戊烯酰-Cok ；
5-羧基-2-戊烯酰-Cok轉(zhuǎn)變?yōu)榧憾?Cok ；己二酰-Cok轉(zhuǎn)變?yōu)榧憾?參見圖2)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有己二酸途徑的非天然存在的微生物生物體，其中所述微生物生物體含有至少一種編碼將底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的多肽的外源性核酸，所述的底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物選自琥珀酰-Cok和乙酰-Cok轉(zhuǎn)變?yōu)?-氧代己二酰-Cok ；3-氧代己二酰-Cok轉(zhuǎn)變?yōu)?-氧代己二酸；3_氧代己二酸轉(zhuǎn)變?yōu)?-羥基己二酸；3_羥基己二酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧?2-烯二酸鹽(hexa-2-enedioate);己_2_烯二酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)榧憾?參見圖3)。
[0053]在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有6-氨基己酸途徑的非天然存在的微生物生物體，其中所述微生物生物體含有至少一種編碼將底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的多肽的外源性核酸，所述的底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物選自己二酰-CoA轉(zhuǎn)變?yōu)榧憾岚肴?；和己二酸半醛轉(zhuǎn)變?yōu)?-氨基己酸(參見圖8)。還在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有己內(nèi)酰胺途徑的非天然存在的微生物生物體，其中所述微生物生物體含有至少一種編碼將底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的多肽的外源性核酸，所述的底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物選自己二酰-CoA轉(zhuǎn)變?yōu)榧憾岚肴患憾岚肴┺D(zhuǎn)變?yōu)?-氨基己酸；和6-氨基己酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧簝?nèi)酰胺。
[0054]還在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有己二酸途徑的非天然存在的微生物生物體，其中所述微生物生物體含有至少一種編碼將底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的多肽的外源性核酸，所述的底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物選自α-酮己二酸轉(zhuǎn)變?yōu)棣?-酮己二酰-CoA; α-酮己二酰-CoA轉(zhuǎn)變?yōu)?-羥基己二酰-CoA ;2_羥基己二酰-CoA轉(zhuǎn)變?yōu)?-羧基-2-戊烯酰-CoA ;5-羧基-2-戊烯酰-Cok轉(zhuǎn)變?yōu)榧憾?Cok ;和己二酰-Cok轉(zhuǎn)變?yōu)榧憾?參見圖9)。另外，本發(fā)明提供了具有己二酸途徑的非天然存在的微生物生物體，其中所述微生物生物體含有至少一種編碼將底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的多肽的外源性核酸，所述的底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物選自α -酮己二酸轉(zhuǎn)變?yōu)?-羥基己二 酸；2_羥基己二酸轉(zhuǎn)變?yōu)?-羥基己二酰-CoA ；2-羥基己二酰-Cok轉(zhuǎn)變?yōu)?-羧基-2-戊烯酰-Cok ；5-羧基-2-戊烯酰-Cok轉(zhuǎn)變?yōu)榧憾?Cok ;和己二酰-CoA轉(zhuǎn)變?yōu)榧憾?圖9)。
[0055]在本文中一般地提及代謝反應(yīng)、其反應(yīng)物或產(chǎn)物、或具體提及編碼與提及的代謝反應(yīng)、反應(yīng)物或產(chǎn)物相關(guān)的或催化提及的代謝反應(yīng)、反應(yīng)物或產(chǎn)物的酶的一種或多種核酸或基因來本發(fā)明進(jìn)行描述。除非在本文中另外明確地指明，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，對(duì)反應(yīng)的提及還構(gòu)成對(duì)該反應(yīng)的反應(yīng)物和產(chǎn)物的提及。類似地，除非在本文中另外明確地指明，對(duì)反應(yīng)物或產(chǎn)物的提及也提及該反應(yīng)，并且對(duì)這些代謝組分的任一種的提及也提及編碼催化該提及的反應(yīng)、反應(yīng)物或產(chǎn)物的酶的一種基因或多種基因。同樣，就代謝生物化學(xué)、酶學(xué)和基因組學(xué)的公知領(lǐng)域而言，本文對(duì)基因或編碼核酸的提及也構(gòu)成對(duì)相應(yīng)編碼的酶和其催化的反應(yīng)以及該反應(yīng)的反應(yīng)物和產(chǎn)物的提及。
[0056]本發(fā)明的非天然存在的微生物生物體可以通過引入可表達(dá)的編碼一種或多種參與一個(gè)或多個(gè)己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺生物合成途徑的酶的核酸來產(chǎn)生。取決于選擇用于生物合成的宿主微生物生物體，可以表達(dá)用于一些或所有特定的己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺生物合成途徑的核酸。例如，如果選擇的宿主缺乏一種或多種用于所需生物合成途徑的酶，則將可表達(dá)的用于一種或多種缺乏的酶的核酸引入至宿主中用于隨后的外源表達(dá)。備選地，如果選擇的宿主顯示一些途徑基因的內(nèi)源性表達(dá)，但缺乏其他的基因表達(dá)，則需要編碼一種或多種缺乏的酶的編碼核酸以實(shí)現(xiàn)己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺生物合成。因此，本發(fā)明的非天然存在的微生物生物體可以通過引入外源酶活性以獲得所需的生物合成途徑來產(chǎn)生，或所需的生物合成途徑可以通過引入一種或多種外源酶活性來獲得，所述一種或多種外源酶活性與一種或多種內(nèi)源酶一起產(chǎn)生所需產(chǎn)物諸如己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺。
[0057]取決于所選擇的宿主微生物生物體的己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺生物合成途徑組分，本發(fā)明的非天然存在的微生物生物體包括至少一種外源性表達(dá)的編碼己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺途徑的核酸并且至多達(dá)一個(gè)或多個(gè)己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺生物合成途徑的所有編碼核酸。例如，己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺生物合成可以在缺乏途徑酶的宿主中通過外源表達(dá)相應(yīng)的編碼核酸來建立。在缺乏己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺途徑的所有酶的宿主中，可以包括外源表達(dá)途徑中的所有酶，盡管要理解的是，即使宿主含有至少一種途徑酶，也可以表達(dá)途徑的所有酶。
[0058]例如，在用于產(chǎn)生己二酸的途徑中所有酶的外源表達(dá)可以包含在宿主生物體中，諸如琥珀酰-Cok:乙酰-Cok?；D(zhuǎn)移酶、3-羥酰-Cok脫氫酶、3-羥基己二酰-Cok脫水酶、
5-羧基-2-戊烯酰-CoA還原酶和己二酰-CoA合成酶或磷酸己二酰轉(zhuǎn)移酶/己二酸激酶或己二酰-CoA:乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或己二酰-CoA水解酶。特別地，宿主生物體可以含有己二酸途徑酶:琥珀酰-Cok:乙酰-Cok?；D(zhuǎn)移酶、3-羥酰-Cok脫氫酶、3-羥基己二酰-Cok脫水酶、5-羧基-2-戊烯酰-Cok還原酶和己二酰-Cok合成酶。備選地，宿主生物體可以含有己二酸途徑酶:琥珀酰-Cok:乙酰-Cok酰基轉(zhuǎn)移酶、3-羥酰-Cok脫氫酶、3-羥基己二酰-Cok脫水酶、5-羧基-2-戊烯酰-Cok還原酶和磷酸己二酰轉(zhuǎn)移酶/己二酸激酶。另外，宿主生物體可以含有己二酸途徑酶:琥珀酰-CoA:乙酰-CoA?；D(zhuǎn)移酶、3-羥酰-CoA脫氫酶、3-羥基己二酰-CoA脫水酶、5-羧基-2-戍烯酰-CoA還原酶和己二酰-CoA:乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶。此外，宿主生物體可以含有己二酸途徑酶:琥珀酰-CoA:乙酰-CoA?；D(zhuǎn)移酶、3-羥酰-CoA脫氫酶、3-羥基己二酰-CoA脫水酶、5-羧基-2-戊烯酰-CoA還原酶和己二酰-CoA水解酶。
[0059]在產(chǎn)生6-氨基己酸的微生物生物體情況下，在用于產(chǎn)生6-氨基己酸的途徑中所有酶的外源表達(dá)可以包含在宿主生物體中，諸如CoA-依賴性醛脫氫酶和轉(zhuǎn)氨酶或CoA-依賴性醛脫氫酶和6-氨基己酸脫氫酶。對(duì)于產(chǎn)生己內(nèi)酰胺的微生物生物體，在用于產(chǎn)生己內(nèi)酰胺的途徑中所有酶的外源表達(dá)可以包含在宿主生物體中，諸如CoA-依賴性醛脫氫酶、轉(zhuǎn)氨酶或6-氨基己酸脫氫酶和酰胺水解酶。
[0060]鑒于本文提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，以可表達(dá)形式引入的編碼核酸的數(shù)目將至少與所選擇的宿主微生物生物體的己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺途徑缺陷相配。因此，本發(fā)明的非天然存在的微生物生物體可以具有一種、兩種、三種、四種或五種，至多所有編碼構(gòu)成己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺生物合成途徑的上述酶的核酸。在一些實(shí)施方案中，非天然存在的微生物生物體還可以包括促進(jìn)或優(yōu)化己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺生物合成或賦予宿主微生物生物體以其他有用功能的其他遺傳修飾。一種這樣的其他功能性可以包括，例如，增加一種或多種己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺途徑前體的合成，所述前體諸如在己二酸合成時(shí)的琥珀酰-CoA和/或乙酰-CoA，或在6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺合成時(shí)的己二酰-CoA，包括本文中公開的己二酸途徑酶。
[0061]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的非天然存在的微生物生物體產(chǎn)生自含有酶促合成己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺的能力的宿主。在此具體的實(shí)施方案中，其可以用來增加己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺途徑產(chǎn)物的合成或積累，從而例如，驅(qū)使己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺途徑反應(yīng)朝向產(chǎn)生己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺。增加的合成或積累可以通過，例如，編碼一種或多種上述己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺途徑酶的核酸的過度表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。一種或多種己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺途徑酶的過度表達(dá)可以，例如，通過一種或多種內(nèi)源基因的外源表達(dá)，或通過一種或多種異源基因的外源表達(dá)來發(fā)生。因此，天然存在的生物體可以容易地生成為本發(fā)明的非天然存在的微生物生物體，例如，通過過度表達(dá)一種、兩種、三種、四種、五種，即，所有編碼己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺生物合成途徑酶的核酸來產(chǎn)生己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺。另外，非天然存在的生物體可以通過誘變導(dǎo)致己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺生物合成途徑中的酶活性增加的內(nèi)源基因來生成。
[0062]在特別有用的實(shí)施方案中，采用編碼核酸的外源表達(dá)。外源表達(dá)賦予對(duì)宿主和應(yīng)用定制調(diào)節(jié)表達(dá)和/或調(diào)控元件以達(dá)到由用戶控制的所需表達(dá)水平的能力。然而，在其他實(shí)施方案中，也可以利用內(nèi)源表達(dá)，諸如通過去除負(fù)調(diào)控效應(yīng)器或當(dāng)與誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或其他調(diào)控元件連接時(shí)誘導(dǎo)基因的啟動(dòng)子。因此，具有天然存在的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的內(nèi)源基因可以通過提供適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)劑而上調(diào)，或內(nèi)源基因的調(diào)控區(qū)可以被改造以結(jié)合誘導(dǎo)型調(diào)控元件，從而允許在所需的時(shí)間調(diào)控內(nèi)源基因的增加表達(dá)。類似地，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以被包含作為內(nèi)源基因的調(diào)控元件引入至非天然存在的微生物生物體中。
[0063]要理解，在本發(fā)明的方法中，一種或多種外源性核酸的任一種可以被引入至微生物生物體中以產(chǎn)生本發(fā)明的非天然存在的微生物生物體。核酸可以被引入以便將，例如，己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺生物合成途徑賦予微生物生物體。備選地，編碼核酸可以被引入以產(chǎn)生具有催化一些所需反應(yīng)的生物合成能力的中間微生物生物體，以賦予己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺生物合成能力。例如，具有己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺生物合成途徑的非天然存在的微生物生物體可以包含至少兩種編碼所需酶的外源性核酸。在產(chǎn)生己二酸的情況下，至少 兩種外源性核酸可以編碼酶諸如琥珀酰-Cok:乙酰-Cok酰基轉(zhuǎn)移酶和3-羥酰-CoA脫氫酶，或琥珀酰-Cok:乙酰-Cok?；D(zhuǎn)移酶和3-羥基己二酰-Cok脫水酶，或3-羥基己二酰-CoA和5-羧基-2-戊烯酰-CoA還原酶，或3-羥酰-CoA和己二酰-CoA合成酶的組合，等等。在產(chǎn)生己內(nèi)酰胺的情況下，至少兩種外源性核酸可以編碼酶諸如CoA-依賴性醛脫氫酶和轉(zhuǎn)氨酶，或CoA-依賴性醛脫氫酶和酰胺水解酶，或轉(zhuǎn)氨酶和酰胺水解酶的組合。因此，要理解生物合成途徑的兩種或多種酶的任何組合可以包含在本發(fā)明的非天然存在的微生物生物體中。
[0064]類似地，要理解，生物合成途徑的三種以上的酶的任何組合可以包含在本發(fā)明的非天然存在的微生物生物體中，例如，在產(chǎn)生己二酸的情況下，如果需要，酶琥珀酰-CoA:乙酰-Cok?；D(zhuǎn)移酶、3-羥酰-Cok脫氫酶和3-羥基己二酰-Cok脫水酶；或琥珀酰-Cok:乙酰-Cok酰基轉(zhuǎn)移酶、3-羥酰-Cok脫氫酶和5-羧基-2-戊烯酰-Cok還原酶；或琥珀酰-CoA:乙酰-CoA?；D(zhuǎn)移酶、3-羥酰-CoA脫氫酶和己二酰-CoA合成酶；或3-羥酰-CoA脫氫酶、3-羥基己二酰-CoA脫水酶和己二酰-CoA:乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶的組合，等等，只要所需生物合成途徑的酶的組合導(dǎo)致產(chǎn)生相應(yīng)的所需產(chǎn)物。類似地，如果需要，如本文所公開的生物合成途徑的四種以上的酶的任意組合可以包含在本發(fā)明的非天然存在的微生物生物體中，只要所需生物合成途徑的酶的組合導(dǎo)致產(chǎn)生相應(yīng)的所需產(chǎn)物。[0065]除了如本文所描述的生物合己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺以外，本發(fā)明的非天然存在的微生物生物體和方法也可以以彼此以及與本領(lǐng)域中公知的其他微生物微生物體和方法的各種組合來使用，從而通過其他途徑實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物合成。例如，除了使用己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺生產(chǎn)體以外，產(chǎn)生己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺的一個(gè)替代方法是通過加入能夠?qū)⒓憾帷?-氨基己酸或己內(nèi)酰胺途徑中間體轉(zhuǎn)變?yōu)榧憾帷?-氨基己酸或己內(nèi)酰胺的另一微生物生物體。一種這樣的步驟包括，例如，產(chǎn)生己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺途徑中間體的微生物生物體的發(fā)酵。然后，己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺途徑中間體可以用作第二微生物生物體的底物，所述第二微生物生物體將己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺途徑中間體轉(zhuǎn)變?yōu)榧憾帷?-氨基己酸或己內(nèi)酰胺。己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺途徑中間體可以直接加入至第二生物體的另一培養(yǎng)物中或己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺途徑中間體生產(chǎn)體的初始培養(yǎng)物可以例如，通過細(xì)胞分離而去除這些微生物生物體，然后將第二生物體加入至發(fā)酵液中，從而可以用來產(chǎn)生最終產(chǎn)物而無需中間體純化步驟。
[0066]在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的非天然存在的微生物生物體和方法可以以大量的亞途徑組裝，從而實(shí)現(xiàn)，例如，己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺的生物合成。在這些實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的所需產(chǎn)物的生物合成途徑可以分離至不同的微生物生物體中，并且所述不同的微生物生物體可以共培養(yǎng)以產(chǎn)生最終產(chǎn)物。在這樣的生物合成路線中，一種微生物生物體的產(chǎn)物是第二種微生物生物體的底物，直至合成最終產(chǎn)物。例如，己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺的生物合成可以通過構(gòu)建含有用于將一種途徑中間體轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪煌緩街虚g體或產(chǎn)物的生物合成途徑的微生物生物體來實(shí)現(xiàn)。備選地，己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺還可以使用在同一容器中的兩種微生物通過共培養(yǎng)或共發(fā)酵從微生物生物體中生物合成地產(chǎn)生，其中第一種微生物生物體產(chǎn)生己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺中間體，且第二種微生物生物體將該中間體轉(zhuǎn)變?yōu)榧憾帷?-氨基己酸或己內(nèi)酰胺。
[0067]鑒于本文提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，對(duì)于本發(fā)明的非天然存在的微生物生物體和方法與其他微生物生物體，與具有亞途徑的其他非天然存在的微生物生物體的共培養(yǎng)，以及與本領(lǐng)域中公知的產(chǎn)生己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺的其他化學(xué)和/或生物化學(xué)方法的組合，存在有大量的組合和排列。
`[0068]己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺途徑酶的編碼核酸的來源可以包括，例如，其中編碼基因產(chǎn)物能夠催化所參照的反應(yīng)的任何物種。此類物種包括原核生物體和真核生物體，包括，但不限于，細(xì)菌，包括古細(xì)菌和真細(xì)菌，和真核生物，包括酵母、植物、昆蟲、動(dòng)物和哺乳動(dòng)物，包括人。此類來源的示例性物種包括，例如，大腸桿菌、Pseudomonas knackmussi1、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、變形斑沙雷菌(Serratia proteamaculans)、鏈霉菌屬 2065 (Streptomyces sp.2065)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、富養(yǎng)產(chǎn)喊菌(Ralstonia eutropha)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、小眼蟲(Euglenagracilis)、齒垢密螺旋體(Treponema denticola)、克氏梭狀芽抱桿菌(Clostridiumkluyveri)、智人(Homo sapiens)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、不動(dòng)桿菌屬ADPl (Acinetobacter sp.ADP1)、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)、巴氏真桿菌(Eubacterium barkeri)、不角軍糖消化鏈球菌(Peptostreptococcus asaccharolyticus)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)、熱乙酸梭菌(Clostridium thermoaceticum) (Moorella thermoaceticum(熱乙酸穆爾氏菌))、乙酸鈣不動(dòng)桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)、小家鼠(Mus musculus)、野豬(Sus scrofa)、黃桿菌屬(Flavobacterium sp)、金黃節(jié)桿菌(Arthrobacteraurescens)、產(chǎn)黃青霉菌(Penicillium chrysogenum)、黑曲霉菌(Aspergillus niger)、構(gòu)巢曲霉菌(Aspergillus nidulans),枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)、曼海姆產(chǎn)玻拍酸菌(Mannheimia succiniciproducens)、楊氏梭菌(Clostridium I jungdahlii)、Clostridiumcarboxydivorans、嗜熱脂肪土芽抱桿菌(Geobacillus stearothermophilus)、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)、反硝化無色桿菌(Achromobacter denitrificans)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、發(fā)酵氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans)、梭菌屬 M62/1 (Clostridium sp.M62/1)、具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum),以及本文公開的或作為相應(yīng)基因的來源生物體可獲得的其他示例性物種(參見實(shí)施例)。然而，在現(xiàn)在可以獲得的550個(gè)以上的物種的全基因組序列(這些中超過一半可在公共數(shù)據(jù)庫(kù)諸如NCBI上獲得)，包括395個(gè)微生物基因組和大量的酵母、真菌、植物、和哺乳動(dòng)物基因組的情況下，對(duì)于相關(guān)或關(guān)系較遠(yuǎn)的物種中的一種或多種基因，鑒定編碼必要的己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺生物合成活性的基因，包括例如已知基因的同源、直向同源物、旁系同源物和非直向同源基因置換，和生物體之間遺傳改變的互換，是本領(lǐng)域中常規(guī)的和公知的。因此，能夠?qū)崿F(xiàn)本文關(guān)于特定生物體諸如大腸桿菌所描述的己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺的生物合成的代謝改變可以容易地應(yīng)用于其他微生物，同樣地包括原核和真核生物。鑒于本文提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將知曉在一個(gè)生物體中舉例說明的代謝改變可以同樣地應(yīng)用于其他生物體。
[0069]在一些情況下，諸如當(dāng)可替代的己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺生物合成途徑存在于不相關(guān)物種中時(shí)，己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺生物合成可以通過，例如，來自不相關(guān)物種的催化類似的但不相同的代謝反應(yīng)以代替參照反應(yīng)的一種或多種旁系同源物的外源表達(dá)而賦予宿主物種。因?yàn)樵诓煌纳矬w之間存在有代謝網(wǎng)絡(luò)問的某些差異，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解不同生物體之間的實(shí)際基因利用可以發(fā)生變化。然而，鑒于本文提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員還將理解本發(fā)明的教導(dǎo)和方法可以使用本文例舉的那些的同類代謝改變應(yīng)用于所有微生物`生物體以構(gòu)建將合成己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺的目標(biāo)物種的微生物生物體。
[0070]宿主微生物生物體可以選自，并且非天然存在的微生物生物體可以產(chǎn)生自，例如，細(xì)菌、酵母、真菌或可應(yīng)用于發(fā)酵方法的多種其他微生物中的任一種。示例性的細(xì)菌包括選自大腸桿菌、奧克西托克雷白桿菌(Klebsiella oxytoca)、產(chǎn)琥拍酸厭氧螺旋菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)、產(chǎn)玻拍酸放線桿菌(Actinobacillussuccmogenes)、曼海姆產(chǎn)琥拍酸菌、埃特里根瘤菌(Rhizobium etli)、枯草芽孢桿菌、谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)、氧化葡萄酸桿菌(Gluconobacter oxydans)、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌、乳酸乳球菌、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、天藍(lán)色鏈霉菌、丙酮丁醇梭菌、熒光假單胞菌、和惡臭假單胞菌的物種。示例性的酵母或真菌包括選自釀酒酵母、裂殖酵母、克魯維酵母、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)、土曲霉菌、黑曲霉菌和畢赤酵母的物種。例如，大腸桿菌是特別有用的宿主生物體，因?yàn)樗且环N適合于遺傳工程改造的受到充分表征的微生物生物體。其他特別有用的宿主生物體包括酵母諸如釀酒酵母。
[0071]用于構(gòu)建和測(cè)試非天然存在的產(chǎn)生己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺的宿主的表達(dá)水平的方法可以通過，例如，本領(lǐng)域中公知的重組和檢測(cè)方法來進(jìn)行。這些方法可參見，例如，Sambrook 等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual (分子克隆:實(shí)驗(yàn)室指南)，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001);和 Ausubel 等，CurrentProtocols in Molecular Biology (現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù))，John Wiley and Sons,Baltimore, MD (1999)。[0072]參與產(chǎn)生己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺的途徑中的外源核酸序列可以使用本領(lǐng)域中公知的技術(shù)而穩(wěn)定地或瞬時(shí)地引入至宿主細(xì)胞中，所述技術(shù)包括，但不限于，接合、電穿孔、化學(xué)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染、和超聲轉(zhuǎn)化。對(duì)于在大腸桿菌或其他原核細(xì)胞中的外源表達(dá)，真核生物核酸的基因或cDNA中的一些核酸序列可以編碼靶向信號(hào)諸如N-端線粒體或其他靶向信號(hào)，如果需要它們可以在轉(zhuǎn)化至原核生物宿主細(xì)胞中之前被去除。例如，線粒體前導(dǎo)序列的去除導(dǎo)致大腸桿菌中的增加表達(dá)(Hoffmeister等，.1.Biol.Chem.280:4329-4338(2005))。對(duì)于在酵母或其他真核細(xì)胞中的外源表達(dá)，基因可以在胞液中表達(dá)，無需加入前導(dǎo)序列，或可以通過加入適合于宿主細(xì)胞的適當(dāng)?shù)陌邢蛐蛄兄T如線粒體靶向或分泌信號(hào)而靶向至線粒體或其他細(xì)胞器，或靶向分泌。因此，要理解，對(duì)核酸序列的去除或包含靶向序列的適合修飾可以結(jié)合至外源核酸序列中以賦予其所需的特性。此外，基因可以使用本領(lǐng)域中公知的技術(shù)進(jìn)行密碼子優(yōu)化以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的最佳表達(dá)。
[0073]可以構(gòu)建一種或多種表達(dá)載體以包含與宿主生物體中有功能的表達(dá)控制序列可操作地連接的如本文所例舉的一個(gè)或多個(gè)編碼己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺生物合成途徑的核酸?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的微生物宿主生物體的表達(dá)載體包括，例如,質(zhì)粒、噬菌體載體、病毒載體、附加體和人工染色體，包括可操作用于穩(wěn)定的整合入宿主染色體中的載體和選擇序列或標(biāo)記。另外，表達(dá)載體包括一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因和適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)控制序列。例如，還可以包括提供對(duì)抗生素或毒素的抗性、補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)缺陷性缺乏、或供應(yīng)培養(yǎng)基中不包含的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)素的選擇性標(biāo)記基因。表達(dá)控制序列可以包括本領(lǐng)域中公知的組成型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止子等。當(dāng)兩種或多種外源編碼核酸要共表達(dá)時(shí)，兩種核酸可以插入至，例如單一表達(dá)載體中或獨(dú)立的表達(dá)載體中。對(duì)于單一載體表達(dá)，編碼核酸可以可操作性地連接至一條共有表達(dá)控制序列或連接至不同的表達(dá)控制序列，諸如一個(gè)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和一個(gè)組成型啟動(dòng)子。參與代謝或合成途徑的外源核酸序列的轉(zhuǎn)化可以使用本領(lǐng)域中公知的方法來確認(rèn)。此類方法包括，例如，核酸分析諸如mRNA的Northern印跡或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，或用于基因產(chǎn)物表達(dá)的免疫印跡，或用于測(cè)試引入的核酸序列或其相應(yīng)的基因產(chǎn)物的表達(dá)的其他合適的分析方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員要理解，外源核酸以足以產(chǎn)生所需產(chǎn)物的量表達(dá)，并且進(jìn)一步要理解，表達(dá)水平可以使用本領(lǐng)域中公知的和如本文中所公開的方法進(jìn)行優(yōu)化以獲得充分的表達(dá)。
[0074]本發(fā)明另外提供了用于產(chǎn)生所需產(chǎn)物諸如己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于產(chǎn)生己二酸的方法，包括在產(chǎn)生己二酸的條件下和足以產(chǎn)生己二酸的時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)具有己二酸途徑的非天然存在的微生物生物體，所述途徑包含以足以產(chǎn)生己二酸的量表達(dá)的至少一種編碼己二酸途徑酶的外源性核酸，所述己二酸途徑包括琥珀酰-CoA:乙酰-CoA酰基轉(zhuǎn)移酶、3-羥酰-CoA脫氫酶、3-羥基己二酰-CoA脫水酶、5-羧基-2-戊烯酰-CoA還原酶和己二酰-CoA合成酶或磷酸己二酰轉(zhuǎn)移酶/己二酸激酶或己二酰-CoA:乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或己二酰-CoA水解酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于產(chǎn)生己二酸的方法，包括在產(chǎn)生己二酸的條件下和足以產(chǎn)生己二酸的時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)具有己二酸途徑的非天然存在的微生物生物體，所述途徑包含以足以產(chǎn)生己二酸的量表達(dá)的至少一種編碼己二酸途徑酶的外源性核酸，所述己二酸途徑包括琥珀酰-CoA:乙酰-Cok?；D(zhuǎn)移酶、3-氧代己二酰-Cok轉(zhuǎn)移酶、3-氧代己二酸還原酶、3-羥基己二酸脫水酶和2-烯酸還原酶。
[0075]還在另一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明提供了一種用于產(chǎn)生6-氨基己酸的方法,包括在產(chǎn)生6-氨基己酸的條件下和足以產(chǎn)生6-氨基己酸的時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)具有6-氨基己酸途徑的非天然存在的微生物生物體，所述途徑包含以足以產(chǎn)生6-氨基己酸的量表達(dá)的至少一種編碼6-氨基己酸途徑酶的外源性核酸，所述6-氨基己酸途徑包括CoA-依賴性醛脫氫酶和轉(zhuǎn)氨酶或6-氨基己酸脫氫酶。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于產(chǎn)生己內(nèi)酰胺的方法，包括在產(chǎn)生己內(nèi)酰胺的條件下和足以產(chǎn)生己內(nèi)酰胺的時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)具有己內(nèi)酰胺途徑的非天然存在的微生物生物體，所述途徑包含以足以產(chǎn)生己內(nèi)酰胺的量表達(dá)的至少一種編碼己內(nèi)酰胺途徑酶的外源性核酸，所述己內(nèi)酰胺途徑包括CoA-依賴性醛脫氫酶、轉(zhuǎn)氨酶或6-氨基己酸脫氫酶和酰胺水解酶。
[0076]本發(fā)明另外提供了一種用于產(chǎn)生己二酸的方法，包括在產(chǎn)生己二酸的條件下和足以產(chǎn)生己二酸的時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)具有己二酸途徑的非天然存在的微生物生物體，所述途徑包含以足以產(chǎn)生己二酸的量表達(dá)的至少一種編碼己二酸途徑酶的外源性核酸，所述己二酸途徑包括α-酮己二酰-CoA合成酶、磷酸酮己二酰轉(zhuǎn)移酶/α-酮己二酸激酶或α-酮己二酰-Cok:乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶；2_羥基己二酰-Cok脫氫酶；2_羥基己二酰-Cok脫水酶；5_羧基-2-戊烯酰-CoA還原酶；和己二酰-CoA合成酶、磷酸己二酰轉(zhuǎn)移酶/己二酸激酶、己二酰-CoA:乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或己二酰-CoA水解酶。
[0077]還在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于產(chǎn)生己二酸的方法，包括在產(chǎn)生己二酸的條件下和足以產(chǎn)生己二酸的時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)具有己二酸途徑的非天然存在的微生物生物體，所述途徑包含以足以產(chǎn)生己二酸的量表達(dá)的至少一種編碼己二酸途徑酶的外源性核酸，所述己二酸途徑包括2-羥基己二酸脫氫酶；2_羥基己二酰-Cok合成酶、磷酸羥基己二酰轉(zhuǎn)移酶/2-羥基己二酸激酶或2-羥基己二酰-Cok:乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶；2_羥基己二酰-CoA脫水酶；5_羧基-2-戊烯酰-CoA還原酶；和己二酰-CoA合成酶、磷酸己二酰轉(zhuǎn)移酶/己二酸激酶、己二酰-CoA:乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或己二酰-CoA水解酶。
[0078]可以使用公知的方法進(jìn)行適當(dāng)?shù)募兓?或檢測(cè)己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺的產(chǎn)生的測(cè)定。對(duì)于待檢測(cè)的每種工程菌株可以生長(zhǎng)適當(dāng)?shù)膹?fù)制物諸如一式三份培養(yǎng)物。例如，可以監(jiān)測(cè)被改造的生產(chǎn)宿主中的產(chǎn)物和副產(chǎn)物形成。終產(chǎn)物和中間體，和其他有機(jī)化合物可以通過諸如HPLC (高效液相色譜)、GC-MS (氣相色譜-質(zhì)譜)和LC-MS (液相色譜-質(zhì)譜)的方法使用本領(lǐng)域中公知的常規(guī)操作來分析。產(chǎn)物在發(fā)酵液中的釋放還可以使用培養(yǎng)上清液來檢測(cè)。 副產(chǎn)物和殘余的葡萄糖可以使用，例如，用于葡萄糖和醇的折射率檢測(cè)器，和用于有機(jī)酸的 UV 檢測(cè)器通過 HPLC (Lin 等，Biotechnol.Bioeng.90:775-779 (2005))，或本領(lǐng)域中公知的其他適當(dāng)?shù)臏y(cè)定法和檢測(cè)方法來定量。來自外源DNA序列的各酶的活性還可以使用本領(lǐng)域中公知的方法來測(cè)定。
[0079]己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺可以使用本領(lǐng)域中公知的多種方法與培養(yǎng)物中的其他組分分離。所述分離方法包括，例如，萃取方法以及包括連續(xù)液-液萃取、滲透蒸發(fā)、膜過濾、膜分離、反滲透、電滲析、蒸餾、結(jié)晶、離心、萃取過濾、離子交換色譜、尺寸排阻色譜、吸附色譜和超濾的方法。所有上述的方法在本領(lǐng)域中均是公知的。
[0080]本文所述的任何非天然存在的微生物生物體可以被培養(yǎng)以產(chǎn)生和/或分泌本發(fā)明的生物合成產(chǎn)物。例如，己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺生產(chǎn)體可以被培養(yǎng)用于生物合成產(chǎn)生己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺。
[0081]對(duì)于己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺的產(chǎn)生，重組株培養(yǎng)在含有碳源和其他必需營(yíng)養(yǎng)素的培養(yǎng)基中。非常需要在發(fā)酵罐中保持厭氧條件以減少總工藝的成本。所述條件可以例如，通過首先用氮?dú)鈬娚渑囵B(yǎng)基，然后用隔膜和壓線帽(crimp-cap)密封燒瓶來獲得。對(duì)于在厭氧條件下未觀察到生長(zhǎng)的菌株，可以通過將隔膜穿以小孔用于限量通氣來施加微氧條件。示例性的厭氧條件先前已有描述并且在本領(lǐng)域中是公知的。示例性的需氧和厭氧條件描述在，例如，于2007年8月10日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)11/891,602中。發(fā)酵可以如本文公開的那樣，以分批、分批補(bǔ)料或連續(xù)的方式進(jìn)行。
[0082]如果需要，培養(yǎng)基的pH可以根據(jù)需要通過加入堿，諸如NaOH或其他堿，或酸保持在所需的PH，尤其是中性pH，諸如約7的pH，從而將培養(yǎng)基保持在所需的pH。生長(zhǎng)速率可以通過使用分光光度計(jì)^OOnm)測(cè)量光密度來測(cè)定，葡萄糖攝取速率可以通過監(jiān)測(cè)碳源隨時(shí)間的消耗來確定。
[0083]生長(zhǎng)培養(yǎng)基可以是，例如，任何碳水化合物來源。其可以向非天然存在的微生物供應(yīng)碳源。所述來源包括，例如，糖類諸如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖和淀粉。碳水化合物的其他來源包括，例如，可再生的原料和生物質(zhì)?？梢杂米鞅景l(fā)明的方法中的原料的示例類型的生物質(zhì)包括纖維質(zhì)生物質(zhì)、半纖維質(zhì)生物質(zhì)和木質(zhì)素原料或原料的部分。此類生物質(zhì)原料含有，例如，用作碳源的碳水化合物底物諸如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖和淀粉。鑒`于本文提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，除了上面例舉的那些以外的可再生的原料和生物質(zhì)也可以用于培養(yǎng)本發(fā)明的微生物生物體以產(chǎn)生己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺。
[0084]除了諸如上面所例舉的那些可再生的原料以外，本發(fā)明的己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺微生物生物體還可以被修飾用于靠合成氣作為其碳源而生長(zhǎng)。在此具體實(shí)施方案中，一種或多種蛋白質(zhì)或酶在產(chǎn)生己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺的生物體中表達(dá)以提供用于利用合成氣或其他氣態(tài)碳源的代謝途徑。
[0085]合成氣體，也稱為合成氣或發(fā)生爐煤氣，是煤和含碳物質(zhì)諸如生物質(zhì)材料包括農(nóng)作物和殘?jiān)臍饣闹饕a(chǎn)物。合成氣是主要含有H2和CO的混合物，并且可以獲自任何有機(jī)原料的氣化，所述有機(jī)原料包括但不限于煤、煤油、天然氣、生物質(zhì)和有機(jī)廢料。氣化通常在高燃料/氧比率下進(jìn)行。盡管主要含H2和CO，但合成氣還可以包括較小量的CO2和其他氣體。因此，合成氣體提供氣態(tài)碳諸如CO和另外地CO2的廉價(jià)來源。
[0086]Wood-Ljungdahl途徑催化CO和H2轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴?CoA和其他的產(chǎn)物諸如乙酸。能夠利用CO和合成氣的生物體還通常具有通過Wood-Ljungdahl途徑所包含的相同的一組基本的酶和轉(zhuǎn)變作用來利用CO2和C02/H2混合物的能力。在揭示CO也可以由同一微生物利用和相同的途徑被包括在內(nèi)之前很長(zhǎng)一段時(shí)間以來，認(rèn)為微生物將CO2轉(zhuǎn)變?yōu)橐宜崾荋2-依賴性的。許多產(chǎn)乙酸菌已經(jīng)顯示在CO2的存在下生長(zhǎng)，并且產(chǎn)生諸如乙酸的化合物，只要存在氫以供應(yīng)必需的還原當(dāng)量(參見,例如,Drake,Acetogenesis,3-60頁(yè),Chapman和Hall,New York, (1994))。這可以通過下列的等式來概括:
[0087]2C02+4H2+nADP+nPi — CH3C00H+2H20+nATP
[0088]因此，具有Wood-Ljungdahl途徑的非天然存在的微生物可以同樣地利用CO2和H2混合物以產(chǎn)生乙酰-CoA和其他所需的產(chǎn)物。
[0089]Wood-Ljungdahl途徑在本領(lǐng)域中是公知的，并且由12個(gè)反應(yīng)組成，這些反應(yīng)可以分成兩個(gè)支路:(I)甲基支路和(2)羰基支路。甲基支路將合成氣轉(zhuǎn)變?yōu)榧谆臍淙~酸酯(甲基-THF)，而羰基支路將甲基-THF轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴?CoA。甲基支路中的反應(yīng)由以下酶按次序催化:鐵氧還蛋白氧化還原酶、甲酸脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化脫水酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還原酶。羧基支路中的反應(yīng)由下列酶按次序催化:鈷胺素類咕啉(cobalamide corrinoid)/鐵-硫蛋白、甲基轉(zhuǎn)移酶、一氧化碳脫氫酶、乙酰-CoA合成酶、乙酰-CoA合成酶二硫化物還原酶和氫化酶。根據(jù)本文提供的用于引入足夠數(shù)量的編碼核酸以產(chǎn)生己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺途徑的教導(dǎo)和指導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，對(duì)于至少引入宿主生物體中缺少的編碼Wood-Ljungdahl酶的核酸,也可以進(jìn)行相同的改造設(shè)計(jì)。因此，將一種或多種編碼核酸引入至本發(fā)明的微生物生物體中使得被修飾的生物體含有完整的Wood-Ljungdahl途徑,將賦予合成氣利用能力。
[0090]鑒于本文提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解可以產(chǎn)生這樣的非天然存在的微生物生物體，當(dāng)其靠 碳源諸如碳水化合物生長(zhǎng)時(shí)其分泌本發(fā)明的生物合成化合物。此類化合物包括，例如，己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺和己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺途徑中的任一種中間代謝物。所有必需的工作是改造一種或多種必需的酶活性以實(shí)現(xiàn)所需化合物或中間體的生物合成，包括，例如，包含己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺生物合成途徑的一些或全部。因此，本發(fā)明提供了一種非天然存在的微生物生物體，當(dāng)其靠碳水化合物生長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)生和/或分泌己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺，并且當(dāng)其靠碳水化合物生長(zhǎng)時(shí)其產(chǎn)生和/或分泌己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺途徑中顯示的任一種中間代謝物。例如，本發(fā)明的產(chǎn)生己二酸的微生物生物體可以根據(jù)需要從中問體啟動(dòng)合成，所述中間體例如3-氧代己二酰-CoA、3-羥基己二酰-CoA、5-羧基-2-戊烯酰-CoA或己二酰-CoA (參見圖2)。另外，產(chǎn)生己二酸的微生物生物體可以從中問體，例如，3-氧代己二酰-CoA、3-氧代己二酸、3-羥基己二酸或己-2-烯二酸鹽啟動(dòng)合成(參見圖3)。本發(fā)明的產(chǎn)生6-氨基己酸的微生物生物體可以從中問體啟動(dòng)合成，所述中間體例如，己二酸半醛(參見圖8)。本發(fā)明的產(chǎn)生己內(nèi)酰胺的微生物生物體可以根據(jù)需要從中問體啟動(dòng)合成，所述中間體例如己二酸半醛或
6-氨基己酸(參見圖8)。
[0091]本發(fā)明的非天然存在的微生物生物體使用如本文所例舉的本領(lǐng)域中公知的方法來構(gòu)建，從而外源性地以足以產(chǎn)生己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺的量表達(dá)至少一種編碼己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺途徑酶的核酸。要理解，本發(fā)明的微生物生物體在足以產(chǎn)生己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺的條件下培養(yǎng)。根據(jù)本文提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)，本發(fā)明的非天然存在的微生物生物體可以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)生約0.l_200mM之間或以上的細(xì)胞內(nèi)濃度的己二酸、
6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺的生物合成。通常，己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺的細(xì)胞內(nèi)濃度在約3-150mM之間，尤其是約5-125mM之間，和更優(yōu)選約8_100mM之間，包括約10mM、20mM、50mM、80mM或更大。這些示例性范圍中的每一個(gè)之間和以上的細(xì)胞內(nèi)濃度也可以由本發(fā)明的非天然存在的微生物生物體來實(shí)現(xiàn)。
[0092]在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)條件包括厭氧的或基本上厭氧的生長(zhǎng)或維持條件。示例性的厭氧條件先前已有描述并且在本領(lǐng)域中是公知的。示例性的用于發(fā)酵工藝的厭氧條件描述在本文中，且描述在例如，于2007年8月10日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)11/891,602中。這些條件中的任一種條件以及本領(lǐng)域中公知的其他厭氧條件可以用于所述非天然存在的微生物生物體。在這些厭氧條件下，己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺生產(chǎn)株可以以
5-10mM或更高的細(xì)胞內(nèi)濃度以及本文中例舉的其他濃度合成己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺。要理解，即使上面的描述提到了細(xì)胞內(nèi)濃度，產(chǎn)生己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺的微生物生物體可以在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺和/或?qū)a(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中。
[0093]培養(yǎng)條件可以包括，例如，液體培養(yǎng)方法以及發(fā)酵和其他大規(guī)模培養(yǎng)方法。如本文所述，在厭氧或基本上厭氧的培養(yǎng)條件下可以獲得特別有用的產(chǎn)量的本發(fā)明的生物合成產(chǎn)物。
[0094]如本文所述，用于實(shí)現(xiàn)己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺的生物合成的一種示例性生長(zhǎng)條件包括厭氧培養(yǎng)或發(fā)酵條件。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的非天然存在的微生物生物體可以在厭氧或基本上厭氧的條件下維持、培養(yǎng)或發(fā)酵。簡(jiǎn)言之，厭氧條件指缺少氧的環(huán)境。基本上厭氧的條件包括，例如，培養(yǎng)基中的溶解氧濃度保持在O和10%之間的飽和度的培養(yǎng)、分批發(fā)酵或發(fā)酵?；旧蠀捬醯臈l件還包括使細(xì)胞在保持以小于1%氧的氣氛的密封室內(nèi)在液體培養(yǎng)基中或固體瓊脂上生長(zhǎng)或休眠。氧的百分比可以通過，例如，用N2 / CO2混合物或其他合適的一種或多種非 氧氣體噴射培養(yǎng)物來保持。
[0095]本文所述的培養(yǎng)條件可以按比例放大和連續(xù)生長(zhǎng)用于制造己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺。示例性的生長(zhǎng)方法包括，例如，分批補(bǔ)料發(fā)酵和分批分離；分批補(bǔ)料發(fā)酵和連續(xù)分離，或連續(xù)發(fā)酵和連續(xù)分離。所有這些方法在本領(lǐng)域中是公知的。發(fā)酵方法對(duì)于生物合成商用量的己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺是特別有用的。通常，并且當(dāng)采用非連續(xù)的培養(yǎng)方法，連續(xù)和/或接近連續(xù)的產(chǎn)生己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺將包括在充足的營(yíng)養(yǎng)素和培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的非天然存在的產(chǎn)生己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺的生物體，從而將生長(zhǎng)保持和/或幾乎保持在指數(shù)生長(zhǎng)期。在此類條件下的連續(xù)培養(yǎng)可以包括，例如，I天、2、3、4、5、6或7天或更多天。另外，連續(xù)培養(yǎng)可以包括I周、2、3、4或5或更多周，并且可達(dá)幾個(gè)月。備選地，如果對(duì)于具體應(yīng)用是合適的，本發(fā)明的生物體可以培養(yǎng)幾小時(shí)。要理解，連續(xù)和/或接近連續(xù)的培養(yǎng)條件也可以包括這些示例性期間之間的所有時(shí)間間隔。要進(jìn)一步理解，培養(yǎng)本發(fā)明的微生物生物體的時(shí)間持續(xù)足夠的時(shí)間段以產(chǎn)生足量的產(chǎn)物用于所期望的目的。
[0096]發(fā)酵方法在本領(lǐng)域中是公知的。簡(jiǎn)言之，用于生物合成產(chǎn)生己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺的發(fā)酵可以被利用，例如，分批補(bǔ)料發(fā)酵和分批分離；分批補(bǔ)料發(fā)酵和連續(xù)分離，或連續(xù)發(fā)酵和連續(xù)分離。分批和連續(xù)發(fā)酵方法的實(shí)例在本領(lǐng)域中是公知的。
[0097]除了上面使用本發(fā)明的己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺生產(chǎn)株用于連續(xù)生產(chǎn)大量己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺的發(fā)酵方法以外，己二酸、6-氨基己酸或己內(nèi)酰胺生產(chǎn)株還可以，例如，同時(shí)地進(jìn)行化學(xué)合成方法，從而將產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌衔铮虍a(chǎn)物可以從發(fā)酵培養(yǎng)物中分離并且連續(xù)地進(jìn)行化學(xué)轉(zhuǎn)變作用，從而將產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌衔铮绻枰脑?。如本文所述，利?-氧代己二酸、己-2-烯二酸鹽的己二酸途徑中的中間體，可以通過在鉬催化劑上的化學(xué)氫化作用轉(zhuǎn)變?yōu)榧憾?參見實(shí)施例1II)。
[0098]為了生成較好的生產(chǎn)株，可以利用代謝建模來優(yōu)化生長(zhǎng)條件。還可以使用建模來設(shè)計(jì)基因敲除，從而額外地優(yōu)化該途徑的利用(參見，例如，美國(guó)專利
【發(fā)明者】A·P·博加德, 普里蒂·法克雅, 羅賓·E·奧斯特豪特 申請(qǐng)人:基因組股份公司