專利名稱：提高類異戊二烯化合物的產(chǎn)生的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)生類異戊二烯(isoprenoid)化合物的領(lǐng)域，具體涉及遺傳修飾以產(chǎn)生類異戊二烯化合物的宿主細(xì)胞。
背景技術(shù)：
類異戊二烯構(gòu)成了大量各種各樣的天然產(chǎn)物，它們具有相同的生物合成來(lái)源，即單一代謝前體異戊烯二磷酸酯(isopentenyl diphosphate)(IPP)。已公開了至少20,000種類異戊二烯。通過(guò)定義，類異戊二烯由稱為異戊二烯(C5)的單元構(gòu)成。類異戊二烯中存在的碳原子數(shù)目通常是5的倍數(shù)(C5、C10、C15、C20、C25、C30和C40)，雖然也報(bào)道了不規(guī)則類異戊二烯和多萜。類異戊二烯化合物也稱為“萜”或“萜類化合物”。類異戊二烯的重要成員包括類葫蘿卜素、倍半萜、二萜和半萜。類葫蘿卜素包括，例如番茄紅素、β-胡蘿卜素等，其中許多用作抗氧化劑。倍半萜包括例如青蒿素，它是一種具有抗瘧活性的化合物。二萜包括例如紫杉醇，它是一種癌癥化學(xué)治療劑。
類異戊二烯是數(shù)量最多、結(jié)構(gòu)最多樣的天然產(chǎn)物家族。在該家族中，從植物和前體天然來(lái)源分離的萜類化合物用作市售矯味和芳香性化合物以及抗瘧藥和抗癌藥物。目前使用的大多數(shù)萜類化合物是天然產(chǎn)物或其衍生物。這種天然產(chǎn)物中的許多來(lái)源生物體(例如，樹木、海洋無(wú)脊椎動(dòng)物)既不能進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)以產(chǎn)生商業(yè)上有活力的量，也不能進(jìn)行基因操作以提高產(chǎn)量或衍生這些化合物。因此，這些天然產(chǎn)物必需從類似物半合成或采用常規(guī)化學(xué)合成方法合成。而且，許多天然產(chǎn)物具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)，使得目前合成不經(jīng)濟(jì)或不能合成。這些天然產(chǎn)物必需從其天然來(lái)源如樹木、海綿動(dòng)物、珊瑚和海洋微生物提?。换蛘邚母渥愕那绑w合成或半合成產(chǎn)生。從天然來(lái)源提取天然產(chǎn)物受到天然來(lái)源可獲得性的限制；并且，天然產(chǎn)物的合成或半合成制備產(chǎn)率低和/或成本高。這些制備問(wèn)題和天然來(lái)源限制的可獲得性限制了這些產(chǎn)物的商業(yè)和臨床發(fā)展。
類異戊二烯天然產(chǎn)物在工程化微生物中的生物合成將能夠開發(fā)上述天然來(lái)源尚未實(shí)現(xiàn)的商業(yè)和治療潛力，并產(chǎn)生花費(fèi)較少、可更廣泛獲得的精細(xì)化學(xué)品和藥品。高水平萜類化合物生物合成的主要障礙在于萜前體的制備?，F(xiàn)有試驗(yàn)已表明，當(dāng)在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，甲羥戊酸(mevalonate)途徑可產(chǎn)生異戊烯焦磷酸酯(isopentenyl pyrophosphate)(IPP)，異戊烯焦磷酸酯可異構(gòu)化并聚合形成具有商業(yè)價(jià)值的類異戊二烯和萜。使微生物代謝最佳地重新定向?yàn)槌a(chǎn)生類異戊二烯的方向需要適當(dāng)工程改造所引入的生物合成途徑，使其既能使碳有效聚集于IPP同時(shí)又不產(chǎn)生有毒的中間體。事實(shí)上，已發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生甲羥戊酸的酶的表達(dá)可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和限制微生物培養(yǎng)物的生產(chǎn)。已提示過(guò)去報(bào)道的在沒(méi)有IPP異構(gòu)酶、FPP合成酶和萜合成酶的情況下，通過(guò)表達(dá)甲羥戊酸途徑抑制生長(zhǎng)可導(dǎo)致毒性水平IPP的累積。
本領(lǐng)域需要改進(jìn)的產(chǎn)生類異戊二烯或產(chǎn)生類異戊二烯前體的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞同時(shí)提供宿主細(xì)胞的強(qiáng)壯生長(zhǎng)和類異戊二烯化合物的高水平產(chǎn)生，以及這些化合物的多異戊烯二磷酸酯(polyprenyl diphosphate)前體。本發(fā)明解決了這種需要并提供了相關(guān)優(yōu)點(diǎn)。
參考文獻(xiàn)美國(guó)專利公開2004/005678；美國(guó)專利公開2003/0148479；Martin等，(2003)Nat.Biotech.21(7)796-802；Polakowski等，(1998)Appl.Microbiol.Biotechnol.4967-71；Wilding等，(2000)J Bacteriol 182(15)4319-27；美國(guó)專利公開2004/0194162；Donald等，(1997)Appl.Env.Microbiol.633341-3344；Jackson等，(2003)Organ.Lett.51629-1632；美國(guó)專利公開2004/0072323；美國(guó)專利公開2004/0029239；美國(guó)專利公開2004/0110259；美國(guó)專利公開2004/0063182；美國(guó)專利5,460,949；美國(guó)專利公開2004/0077039；美國(guó)專利6,531,303；美國(guó)專利6,689,593；Hamano等，(2001)Biosci.Biotechnol.Biochem.651627-1635；T.Kuzuyama.(2004)Biosci.Biotechnol.Biochem.68(4)931-934；T.Kazuhiko.(2004)Biotechnology Letters.261487-1491；Brock等，(2004)Eur J.Biochem.2713227-3241；Choi等，(1999)Appl.Environ.Microbio.65 4363-4368；Parke等，(2004)Appl.Environ.Microbio.702974-2983；Subrahmanyam等，(1998)J.Bad.1804596-4602；Murli等，(2003)J.Ind.Microbiol.Biotechnol.30500-509。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了在遺傳修飾的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生類異戊二烯或類異戊二烯前體的方法。該方法通常包括調(diào)節(jié)細(xì)胞中羥甲基戊二酸單酰輔酶A(hydroxymethylglutaryl-CoA)(HMG-CoA)的水平，以使HMG-CoA水平對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性和/或不顯著抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，但卻維持在可高水平產(chǎn)生甲羥戊酸、IPP和類異戊二烯或類異戊二烯途徑的其它下游產(chǎn)物(如多異戊烯二磷酸酯和類異戊二烯化合物)的水平。本發(fā)明還提供了適用于本發(fā)明方法的遺傳修飾的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供了用于產(chǎn)生本發(fā)明遺傳修飾的宿主細(xì)胞的重組核酸構(gòu)建物，包括含有編碼一個(gè)或多個(gè)甲羥戊酸途徑酶的核苷酸序列的重組核酸構(gòu)建物，以及含有上述重組核酸構(gòu)建物的重組載體(例如，重組表達(dá)載體)。本發(fā)明還提供了鑒定編碼可緩解HMG-CoA累積誘導(dǎo)的毒性的HMG-CoA還原酶(HMGR)變體的核酸的方法。本發(fā)明還提供了用于鑒定減少HMG-CoA細(xì)胞內(nèi)累積的試劑的方法。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1是類異戊二烯代謝途徑的示意圖，從異戊烯二磷酸酯(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸酯(DMAPP)產(chǎn)生類異戊二烯生物合成途徑中間體多異戊烯二磷酸酯牻牛兒基二磷酸酯(GPP)、法呢基二磷酸酯(FPP)和牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯(GGPPP)。
圖2是甲羥戊酸(MEV)途徑產(chǎn)生IPP的示意圖。
圖3是DXP途徑產(chǎn)生IPP和二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)的示意圖。
圖4顯示了在沒(méi)有甲羥戊酸、補(bǔ)充有10mM甲羥戊酸或20mM甲羥戊酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的遺傳修飾以通過(guò)甲羥戊酸途徑產(chǎn)生IPP的大腸桿菌菌株中，紫穗槐二烯(amorphadiene)的產(chǎn)生。
圖5顯示了MevT操縱子表達(dá)增加對(duì)用MevT操縱子遺傳修飾的大腸桿菌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。
圖6顯示了MevT操縱子中包含的單個(gè)基因及其組合的表達(dá)增加對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
圖7顯示了無(wú)催化活性的HMGS對(duì)大腸桿菌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
圖8顯示了在表達(dá)毒性甲羥戊酸途徑構(gòu)建物的大腸桿菌菌株中HMG-CoA的細(xì)胞內(nèi)累積。
圖9顯示了HMG-CoA累積對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
圖10顯示了tHMGR表達(dá)增加對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
圖11顯示了tHMGR表達(dá)增加對(duì)HMG-CoA累積的影響。
圖12顯示了tHMGR表達(dá)增加對(duì)甲羥戊酸產(chǎn)生的影響。
圖13A-C顯示了pBAD24MevT質(zhì)粒的核苷酸序列(SEQ ID NO1)。
圖14A-C顯示了pBAD33MevT質(zhì)粒的核苷酸序列(SEQ ID NO2)。
圖15A-C顯示了pMevT質(zhì)粒的核苷酸序列(SEQ ID NO3)。
圖16A-D顯示了pMBIS質(zhì)粒的核苷酸序列(SEQ ID NO4)。
圖17A-B顯示了pADS質(zhì)粒的核苷酸序列(SEQ ID NO5)。
圖18A-B顯示了pAtoB質(zhì)粒的核苷酸序列(SEQ ID NO6)。
圖19A-B顯示了pHMGS質(zhì)粒的核苷酸序列(SEQ ID NO7)。
圖20 A-C顯示了pHMGR質(zhì)粒的核苷酸序列(SEQ ID NO8)。
圖21A-C顯示了pBAD18HMGR質(zhì)粒的核苷酸序列(SEQ ID NO9)。
圖22A-C顯示了pHMGSR質(zhì)粒的核苷酸序列(SEQ ID NO10)。
圖23A-C顯示了pBAD33MevT(C159A)質(zhì)粒的核苷酸序列(SEQ ID NO11)。
圖24A-C顯示了pHMGS(C159A)質(zhì)粒的核苷酸序列(SEQ ID NO12)。
定義術(shù)語(yǔ)“類異戊二烯”、“類異戊二烯化合物”、“萜”、“萜化合物”、“萜類”和“萜類化合物”在本文中可互換使用。類異戊二烯化合物由各種數(shù)量的所謂異戊二烯(C5)單元構(gòu)成。類異戊二烯中存在的碳原子數(shù)量通常是5的倍數(shù)(例如，C5、C10、C15、C20、C25、C30和C40)。也報(bào)道了不規(guī)則類異戊二烯和多萜，它們也包括在“類異戊二烯”的定義中。類異戊二烯化合物包括但不限于單萜、倍半萜、三萜、多萜和二萜。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“異戊烯二磷酸酯(prenyl diphosphate)”可與“異戊烯焦磷酸酯(prenyl pyrophosphate)”互換使用，包括具有一個(gè)異戊烯基的單異戊烯二磷酸酯(例如，IPP和DMAPP)，以及具有2個(gè)或多個(gè)異戊烯基的多異戊烯二磷酸酯。單異戊烯二磷酸酯包括異戊烯焦磷酸酯(IPP)及其異構(gòu)體二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“萜合成酶”指對(duì)IPP、DMAPP或多異戊烯焦磷酸酯進(jìn)行酶學(xué)修飾從而產(chǎn)生萜類化合物的任何酶。術(shù)語(yǔ)“萜合成酶”包括催化異戊烯二磷酸酯轉(zhuǎn)化形成類異戊二烯的酶。
術(shù)語(yǔ)“焦磷酸酯”可與“二磷酸酯”互換使用。因此，例如，術(shù)語(yǔ)“異戊烯二磷酸酯”和“異戊烯焦磷酸酯”可互換；術(shù)語(yǔ)“異戊烯基焦磷酸酯”和“異戊烯基二磷酸酯”可互換；術(shù)語(yǔ)“法呢基二磷酸酯”和“法呢基焦磷酸酯”可互換；等等。
術(shù)語(yǔ)“甲羥戊酸途徑”或“MEV途徑”在本文中指乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為IPP的生物合成途徑。甲羥戊酸途徑包括催化以下步驟的酶(a)兩分子乙酰輔酶A縮合形成乙酰乙酰輔酶A；(b)乙酰乙酰輔酶A與乙酰輔酶A縮合形成HMG-CoA；(c)HMG-CoA轉(zhuǎn)化形成甲羥戊酸；(d)甲羥戊酸磷酸化形成甲羥戊酸5-磷酸酯；(e)甲羥戊酸5-磷酸酯轉(zhuǎn)化形成甲羥戊酸5-焦磷酸酯；和(f)甲羥戊酸5-焦磷酸酯轉(zhuǎn)化形成異戊烯焦磷酸酯。甲羥戊酸途徑的示意圖如圖2所示。甲羥戊酸途徑的“上半部分”指負(fù)責(zé)使乙酰輔酶A通過(guò)MEV途徑中間體轉(zhuǎn)化形成甲羥戊酸的酶。
術(shù)語(yǔ)“1-脫氧-D-木酮糖5-二磷酸酯途徑”或“DXP途徑”在本文中指甘油醛-3-磷酸酯和丙酮酸酯通過(guò)DXP途徑中間體轉(zhuǎn)化為IPP和DMAPP的途徑，其中，DXP途徑包括催化圖3示意性所示反應(yīng)的酶。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“異戊烯基轉(zhuǎn)移酶”可與術(shù)語(yǔ)“異戊烯二磷酸酯合成酶”和“多異戊烯基合成酶”(例如，“GPP合成酶”、“FPP合成酶”、“OPP合成酶”等)互換使用，用于表示催化異戊烯二磷酸酯與烯丙型引物底物連續(xù)1’-4縮合反應(yīng)的酶，形成各種鏈長(zhǎng)度的異戊烯二磷酸酯。
術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互換使用，用于表示任意長(zhǎng)度的核苷酸聚合形式，無(wú)論是核糖核苷酸還是脫氧核苷酸。因此，該術(shù)語(yǔ)包括但不限于單鏈、雙鏈或多鏈DNA或RNA、基因組DNA、cDNA、DNA-RNA雜交體、或包含嘌呤和嘧啶堿基或其它天然、化學(xué)或生物化學(xué)修飾的非天然或衍生的核苷酸堿基的聚合體。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“操縱子”和“單個(gè)轉(zhuǎn)錄單元”可互換使用，用于表示由一個(gè)或多個(gè)控制元件(例如啟動(dòng)子)協(xié)同調(diào)節(jié)的兩個(gè)或多個(gè)相鄰的編碼區(qū)(編碼基因產(chǎn)物如RNA或蛋白質(zhì)的核苷酸序列)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“基因產(chǎn)物”指DNA編碼的RNA(或反之)或是RNA或DNA編碼的蛋白質(zhì)，其中，基因典型地包括一個(gè)或多個(gè)編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，還可包括內(nèi)含子和非編碼的核苷酸序列。
術(shù)語(yǔ)“肽”、“多肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，用于表示任意長(zhǎng)度的氨基酸聚合形式，它可包括編碼和非編碼的氨基酸、化學(xué)或生物化學(xué)修飾或衍生的氨基酸和具有修飾的肽骨架的多肽。
術(shù)語(yǔ)“天然來(lái)源”在本文中應(yīng)用于核酸、細(xì)胞或生物體，表示天然存在的核酸、細(xì)胞或生物體。例如，可從天然來(lái)源分離并且尚未在實(shí)驗(yàn)室中有目的地經(jīng)人工修飾的生物體(包括病毒)中存在的多肽或多核苷酸序列是天然來(lái)源的。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“異源核酸”指具有至少一個(gè)以下性質(zhì)的核酸(a)對(duì)于給定的宿主微生物或宿主細(xì)胞來(lái)說(shuō)，核酸是外來(lái)的(“外源性”)(即不是天然存在的)；(b)核酸包含給定宿主微生物或宿主細(xì)胞中天然存在(例如，“內(nèi)源性”)的核苷酸序列(例如，核酸包含宿主微生物或宿主細(xì)胞的內(nèi)源性核酸序列)；但是，在異源核酸的涵義中，細(xì)胞中可產(chǎn)生非天然量(例如，大于期望或大于天然存在)的所述內(nèi)源性存在的同一核苷酸序列，或者細(xì)胞中可產(chǎn)生非天然量(例如，大于期望或大于天然存在)的包含與內(nèi)源性核苷酸序列的序列不同但與內(nèi)源性序列編碼相同蛋白質(zhì)(具有相同或基本上相同的氨基酸序列)的核苷酸序列的核酸；(c)核酸包含兩個(gè)或多個(gè)其相互關(guān)系與天然相互關(guān)系不同的核苷酸序列，例如，核酸是重組的。異源核酸的一個(gè)例子是可操作地連接于轉(zhuǎn)錄控制元件(例如，啟動(dòng)子)的編碼HMGR的核苷酸序列，編碼HMGR的內(nèi)源性(天然來(lái)源)序列正常情況下沒(méi)有可操作地連接于該序列。異源核酸的另一個(gè)例子是包含編碼HMGR的核苷酸序列的高拷貝數(shù)質(zhì)粒。異源核酸的另一個(gè)例子是編碼HMGR的核酸，其中，用編碼HMGR的核酸遺傳修飾不能正常產(chǎn)生HMGR的宿主細(xì)胞；因此編碼HMGR的核酸在宿主細(xì)胞中并非天然存在，核酸對(duì)遺傳修飾的宿主細(xì)胞來(lái)說(shuō)是異源的。
如本文所用，“重組”表示特定的核酸(DNA或RNA)是克隆、限制(restriction)和/或連接步驟的各種組合的產(chǎn)物，形成具有與天然系統(tǒng)中存在的內(nèi)源性核酸不同的結(jié)構(gòu)編碼序列或非編碼序列的構(gòu)建物。通常，可從cDNA片段和短的寡核苷酸接頭、或從一系列合成的寡核苷酸裝配形成編碼結(jié)構(gòu)編碼序列的DNA序列，以提供能夠在細(xì)胞中所含的重組轉(zhuǎn)錄單元或在無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)中得以表達(dá)的合成核酸。這種序列可以是未被真核基因中通常存在的內(nèi)含子或內(nèi)部非翻譯序列間隔的開放式讀碼框形式。包含相關(guān)序列的基因組DNA也可用于形成重組基因或轉(zhuǎn)錄單元。非翻譯的DNA序列可存在于開放式讀碼框的5’或3’末端，這些序列不會(huì)影響編碼區(qū)的操縱和表達(dá)，實(shí)際上可用于通過(guò)各種機(jī)制調(diào)節(jié)所需產(chǎn)物的產(chǎn)生(參見下述“DNA調(diào)節(jié)序列”)。
因此，例如，術(shù)語(yǔ)“重組”多核苷酸或核酸指不是天然存在的，例如，通過(guò)人工介入使兩個(gè)原本分離的序列區(qū)段人工組合而制備的多核苷酸或核酸。這種人工組合常常通過(guò)化學(xué)合成途徑、或通過(guò)人工操縱分離的核酸區(qū)段(例如基因工程技術(shù))來(lái)完成。通常，用編碼相同或保守氨基酸的冗余密碼子代替密碼子，同時(shí)典型地引入或除去序列識(shí)別位點(diǎn)來(lái)完成重組?；蛘撸瑢⒕哂兴韫δ艿暮怂釁^(qū)段連接在一起以形成所需的功能組合來(lái)進(jìn)行重組。這種人工組合常常通過(guò)化學(xué)合成方式，或通過(guò)人工操縱分離的核酸區(qū)段，例如基因工程技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
“構(gòu)建物”指重組核酸，通常指重組DNA，產(chǎn)生構(gòu)建物的目的是為了特定核酸序列的表達(dá)，或用于構(gòu)建其它重組核苷酸序列。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“外源性核酸”指在天然給定細(xì)菌、生物體或細(xì)胞中不是正常或天然存在的核酸。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“內(nèi)源性核酸”指在天然給定細(xì)菌、生物體或細(xì)胞中正常存在和/或正常產(chǎn)生的核酸?！皟?nèi)源性核酸”也可指“天然核酸”或給定細(xì)菌、生物體或細(xì)胞中“天然”的核酸。例如，實(shí)施例1中編碼HMGS、甲羥戊酸激酶和磷酸甲羥戊酸激酶的核酸代表了大腸桿菌外源性核酸。這些甲羥戊酸途徑核酸從釀酒酵母(Sacchromyces cerevisiae)中克隆。在釀酒酵母中，染色體上編碼HMGS、MK和PMK的基因序列是“內(nèi)源性”核酸。
術(shù)語(yǔ)“DNA調(diào)節(jié)序列”、“控制元件”和“調(diào)節(jié)元件”可互換使用，用于表示轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列，例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、多腺苷酸化信號(hào)、終止子、蛋白降解信號(hào)等，在宿主細(xì)胞中提供和/或調(diào)節(jié)編碼序列的表達(dá)和/或經(jīng)編碼的多肽的產(chǎn)生。
術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”在本文中可與“遺傳修飾”互換使用，用于表示在細(xì)胞中引入新的核酸(例如，細(xì)胞的外源性DNA)之后所誘導(dǎo)的暫時(shí)或永久性遺傳改變。遺傳改變(“修飾”)可通過(guò)將新的DNA引入宿主細(xì)胞基因組，或通過(guò)暫時(shí)或穩(wěn)定維持新的DNA作為附加體元件來(lái)實(shí)現(xiàn)。當(dāng)細(xì)胞是真核細(xì)胞時(shí)，通常通過(guò)將DNA引入細(xì)胞基因組來(lái)實(shí)現(xiàn)永久性遺傳改變。在原核細(xì)胞中，永久性改變可引入染色體或通過(guò)染色體外元件如質(zhì)粒和表達(dá)載體引入，這些染色體外元件可包含一種或多種可選擇的標(biāo)記以利于其在重組宿主細(xì)胞中維持。
“可操作地連接”指并置，其中所述組分的關(guān)系能使它們以所需的方式起作用。例如，若啟動(dòng)子可影響編碼序列的翻譯或表達(dá)，則啟動(dòng)子可操作地連接于編碼序列。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“異源啟動(dòng)子”和“異源控制區(qū)”指通常不與天然特定核酸相連的啟動(dòng)子或其它控制區(qū)。例如，“對(duì)編碼區(qū)異源的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)”是通常不與天然編碼區(qū)相連的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)。
如本文所用，“宿主細(xì)胞”指體內(nèi)或體外真核細(xì)胞、原核細(xì)胞或來(lái)自以單細(xì)胞實(shí)體培養(yǎng)的多細(xì)胞生物(例如，細(xì)胞株)的細(xì)胞，其中，真核或原核細(xì)胞可以是、或已經(jīng)用作核酸(例如，包含編碼一個(gè)或多個(gè)生物合成途徑基因產(chǎn)物如甲羥戊酸途徑基因產(chǎn)物的核苷酸序列的表達(dá)載體)接受體，包括經(jīng)核酸遺傳修飾的原始細(xì)胞的后代。應(yīng)理解，由于天然、偶然或故意突變，單個(gè)細(xì)胞的后代在形態(tài)或在基因或整套DNA方面并不一定與原始親代完全相同?！爸亟M宿主細(xì)胞”(也稱為“遺傳修飾宿主細(xì)胞”)指，已引入異源核酸(例如表達(dá)載體)的宿主細(xì)胞。例如，本發(fā)明原核宿主細(xì)胞指，通過(guò)將異源核酸，例如對(duì)原核宿主細(xì)胞外源(不是天然存在)的外源性核酸或原核宿主細(xì)胞中不是正常存在的重組核酸引入合適的原核宿主細(xì)胞所產(chǎn)生的遺傳修飾的原核宿主細(xì)胞(例如，細(xì)菌)；本發(fā)明真核宿主細(xì)胞指，通過(guò)將異源核酸，例如對(duì)真核宿主細(xì)胞外源的外源性核酸或真核宿主細(xì)胞中不是正常存在的重組核酸引入合適的真核宿主細(xì)胞所產(chǎn)生的遺傳修飾的真核宿主細(xì)胞。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“分離的”用于描述處于與多核苷酸、多肽或細(xì)胞天然存在的環(huán)境不同的環(huán)境中的多核苷酸、多肽或細(xì)胞。分離的遺傳修飾宿主細(xì)胞可存在于遺傳修飾宿主細(xì)胞混合群中。
可制備表達(dá)盒，它包括轉(zhuǎn)錄起始或轉(zhuǎn)錄控制區(qū)(例如，啟動(dòng)子)、感興趣蛋白質(zhì)的編碼區(qū)和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。轉(zhuǎn)錄控制區(qū)包括提供感興趣蛋白質(zhì)在遺傳修飾宿主細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)的區(qū)域；提供可誘導(dǎo)表達(dá)的區(qū)域，使得當(dāng)將誘導(dǎo)劑加入到培養(yǎng)介質(zhì)中時(shí)，誘導(dǎo)感興趣蛋白質(zhì)編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄或使轉(zhuǎn)錄增加至比誘導(dǎo)前高的水平。
當(dāng)某核酸單鏈形式可在合適的溫度和溶液離子強(qiáng)度條件下與另一個(gè)核酸退火，則該核酸與所述另一個(gè)核酸如cDNA、基因組DNA或RNA是“可雜交的”。雜交條件和洗滌條件是眾所周知的，參見Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.的《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular CloningA LaboratoryManual)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor(1989)，具體是第11章和其中的表11.1；以及Sambrook，J.和Russell，W.的《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor(2001)。溫度和離子強(qiáng)度條件決定了雜交的“嚴(yán)謹(jǐn)性”?？烧{(diào)節(jié)嚴(yán)謹(jǐn)性條件以篩選中度類似的片段(例如來(lái)自遠(yuǎn)源生物體的同源序列)到高度類似片段(例如從近源生物體復(fù)制功能酶的基因)。雜交條件和雜交后的洗滌可用于獲得確定所需的雜交嚴(yán)謹(jǐn)條件。一組示例性雜交后洗滌是以下一系列洗滌過(guò)程室溫下，從6×SSC(其中，SSC是0.15M NaCl和15mM檸檬酸緩沖液)、0.5％SDS開始，洗滌15分鐘；然后在45℃下，用2×SSC、0.5％SDS重復(fù)洗滌30分鐘；然后在50℃下，用0.2×SSC、0.5％SDS洗滌30分鐘，重復(fù)兩次。通過(guò)使用更高的溫度可獲得其它嚴(yán)謹(jǐn)條件，其中，洗滌過(guò)程與上述相同，但是0.2×SSC、0.5％SDS中最后兩次30分鐘洗滌的溫度升高至60℃。另一組高度嚴(yán)謹(jǐn)條件采用65℃下，在0.1×SSC、0.1％SDS中進(jìn)行最后兩次洗滌。另一嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的例子是在50℃或更高的溫度下，在0.1×SSC(15mM氯化鈉/1.5mM檸檬酸鈉)中進(jìn)行雜交。另一嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的例子是在42℃下，在以下溶液中過(guò)夜孵育50％甲酰胺，5×SSC(150mM NaCl，15mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸酯鈉(pH7.6)，5×Denhardt′s溶液，10％硫酸葡聚糖和20μg/ml變性剪切鮭魚精子DNA；然后在約65℃下，在0.1×SSC中洗滌濾液。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件和雜交后洗滌條件是至少像上述代表性條件那樣嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件和雜交后洗滌條件。
雜交要求兩個(gè)核酸包含互補(bǔ)序列，雖然根據(jù)雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性，堿基間也可能存在錯(cuò)配。用于雜交核酸的適當(dāng)嚴(yán)謹(jǐn)性取決于核酸長(zhǎng)度和互補(bǔ)程度，其變化是本領(lǐng)域眾所周知的。兩個(gè)核苷酸序列間的相似或同源程度越大，具有這些序列的核酸雜交體的熔點(diǎn)(Tm)值越高。核酸雜交的相對(duì)穩(wěn)定性(對(duì)應(yīng)于較高的Tm)以下面的順序降低RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。對(duì)于長(zhǎng)度大于100個(gè)核苷酸的雜交體來(lái)說(shuō)，演繹了用于計(jì)算Tm的方程(參見Sambrook等，同上，9.50-9.51)。對(duì)于較短核酸即寡核苷酸的雜交來(lái)說(shuō)，錯(cuò)配位置顯得更加重要，寡核苷酸的長(zhǎng)度決定其特異性(參見Sambrook等，同上，11.7-11.8)。典型地，可雜交核酸的長(zhǎng)度至少約為10個(gè)核苷酸?？呻s交核酸的示例性最小長(zhǎng)度為至少約15個(gè)核苷酸；至少約20個(gè)核苷酸；以及至少約30個(gè)核苷酸。而且，技術(shù)人員將明白，根據(jù)諸如探針長(zhǎng)度等因素，可按需要調(diào)節(jié)溫度和洗滌溶液鹽濃度。
術(shù)語(yǔ)“保守氨基酸取代”指具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基蛋白質(zhì)的可互換性。例如，具有脂族側(cè)鏈的氨基酸組由甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸組成；具有脂族羥基側(cè)鏈的氨基酸組由絲氨酸和蘇氨酸組成；具有含酰胺側(cè)鏈的氨基酸組由天冬酰胺和谷氨酰胺組成；具有芳族側(cè)鏈的氨基酸組由苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸組成；具有堿性側(cè)鏈的氨基酸組由酪氨酸、精氨酸和組氨酸組成；和具有含硫側(cè)鏈的氨基酸組由半胱氨酸和蛋氨酸組成。示例性保守氨基酸取代組是纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、酪氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
“合成核酸”可從采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法化學(xué)合成的寡核苷酸結(jié)構(gòu)單元(building blocks)組裝而成。連接并退火這些結(jié)構(gòu)單元以形成基因區(qū)段，然后酶組裝這些基因片段來(lái)構(gòu)建整個(gè)基因?！盎瘜W(xué)合成”用于DNA序列時(shí)是指核苷酸元件是體外組裝的。采用公知方法可完成DNA的手動(dòng)化學(xué)合成，或采用多種市售機(jī)器中的一種來(lái)進(jìn)行自動(dòng)化學(xué)合成。根據(jù)反映宿主細(xì)胞密碼子偏倚的核苷酸序列最優(yōu)化，可修飾核酸的核苷酸序列以實(shí)現(xiàn)最優(yōu)表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解成功表達(dá)的可能性，如果密碼子選擇偏向宿主所偏好的密碼子。優(yōu)選密碼子的確定可根據(jù)來(lái)自可獲得序列信息的宿主細(xì)胞的基因研究。
多核苷酸或多肽與另一種多核苷酸或多肽具有某百分?jǐn)?shù)的“序列相同性”，是指當(dāng)比對(duì)時(shí)，該百分?jǐn)?shù)的堿基或氨基酸相同，當(dāng)比較兩個(gè)序列時(shí)，該百分?jǐn)?shù)的堿基或氨基酸在相同的相對(duì)位置中。可通過(guò)許多不同的方法來(lái)確定序列相似性。為了確定序列相同性，可采用來(lái)自互聯(lián)網(wǎng)ncbi.nlm.nih.gov/BLAST的方法和計(jì)算機(jī)程序，包括BLAST，來(lái)比對(duì)序列。例如，參見Altschul等，(1990)，J.Mol.Biol.215403-10。另一種比對(duì)算法是FASTA，一種來(lái)自Madison，Wisconsin，USA(Oxford Molecular Group，Inc.的附屬公司)的GeneticsComputing Group(GCG)數(shù)據(jù)包。其它比對(duì)技術(shù)參見《酶方法學(xué)》(Methods inEnzymology)，第266卷大分子序列分析的計(jì)算機(jī)方法(Computer Methods forMacromolecular Sequence Analysis)(1996)，Doolittle編，Academic Press，Inc.，Harcourt Brace&Co.，San Diego，California，USA的分部。尤其感興趣的是允許序列中存在缺口的比對(duì)程序。The Smith-Waterman是一種允許序列比對(duì)中存在缺口的算法。參見Meth.Mol.Biol.70173-187(1997)。而且，可采用使用Needleman&Wunsch比對(duì)法的GAP程序來(lái)比對(duì)序列。參見J.Mol.Biol.48443-453(1970)。
在進(jìn)一步描述本發(fā)明之前，要了解的是本發(fā)明并不限于所描述的具體實(shí)施方案，這些實(shí)施方案當(dāng)然是可以變化的。還需要了解的是既然本發(fā)明的范圍僅受附加的權(quán)利要求限制，文中使用的術(shù)語(yǔ)僅是為了描述具體的實(shí)施方案而不是用來(lái)限制本發(fā)明。
在提供數(shù)值范圍之處，應(yīng)了解在該范圍上下限之間的各中間數(shù)值(除非文中另有明確規(guī)定，該中間數(shù)值到下限單位的十分之一)、以及所述范圍中任何其它規(guī)定的值或中間數(shù)值也包括在內(nèi)。這些較小范圍的上下限可獨(dú)立地包括在該小范圍內(nèi)，并且也包括在本發(fā)明中，服從于所述范圍中任何具體排除的限值。在規(guī)定的范圍包括上下限之一或兩者時(shí)，排除包括上下限之一或兩者的范圍也包括在本發(fā)明內(nèi)。
除非另有定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)均與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的意思相同。雖然任何類似或等同于文中所描述的方法和材料均可用于實(shí)踐和測(cè)試本發(fā)明，現(xiàn)在將描述優(yōu)選的方法和材料。文中提及的所有出版物均納入本文作為參考來(lái)公開和描述所引用的出版物相關(guān)的方法和/或材料。
必須注意的是，除非文中另有明確規(guī)定，用在文中和所附權(quán)利要求中的單數(shù)形式“一個(gè)”、“一”與“該”均包括復(fù)數(shù)對(duì)象。因此，例如，“遺傳修飾的宿主細(xì)胞”包括多個(gè)這種宿主細(xì)胞，“該HMG-CoA還原酶”包括一種或多種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的HMG-CoA還原酶及其等價(jià)形式，等等。還應(yīng)注意，所附權(quán)利要求可能排除了任何任選因素。這樣，該聲明還可用作與權(quán)利要求元素的描述聯(lián)合使用的排他性術(shù)語(yǔ)“單獨(dú)”、“僅僅”等、或使用“負(fù)(negative)”限制的在先基礎(chǔ)。
文中提供討論的出版物僅是因?yàn)槠涔_早于本申請(qǐng)的申請(qǐng)日。不應(yīng)理解為承認(rèn)由于在先發(fā)明而使本發(fā)明不具資格先于這種出版物。此外，所提供的出版物日期可能與實(shí)際發(fā)表日期不符，這需要獨(dú)立地證實(shí)。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了在用于產(chǎn)生類異戊二烯或類異戊二烯前體的遺傳修飾宿主細(xì)胞中減少HMG-CoA抑制性累積的方法，以及在這些宿主細(xì)胞中通過(guò)消除上述毒性來(lái)增加類異戊二烯或類異戊二烯前體的產(chǎn)生的方法。該方法通常包括調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞中羥甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)的水平，以使HMG-CoA的水平對(duì)宿主細(xì)胞沒(méi)有毒性，和/或不顯著抑制宿主細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)。本發(fā)明還提供了適用于本發(fā)明方法的遺傳修飾的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供了用于產(chǎn)生本發(fā)明遺傳修飾宿主細(xì)胞的重組核酸構(gòu)建物。本發(fā)明還提供了鑒定可緩解HMG-CoA累積誘導(dǎo)的毒性的變體HMGR多肽的方法。該方法通常涉及確定試驗(yàn)HMGR變體對(duì)HMG-CoA累積誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的作用(如果有的話)。本發(fā)明還提供了用于鑒定HMGS抑制劑的方法。該方法通常涉及確定試驗(yàn)化合物對(duì)HMG-CoA累積誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的作用(如果有的話)。
本發(fā)明部分地基于以下意外觀察發(fā)現(xiàn)當(dāng)甲羥戊酸途徑中的中間體HMG-CoA在遺傳修飾以通過(guò)甲羥戊酸途徑產(chǎn)生異戊烯焦磷酸酯(IPP)或IPP前體的微生物宿主中累積時(shí)是有毒的。通過(guò)在轉(zhuǎn)化(“遺傳修飾”)有一種或多種包含編碼一個(gè)或多個(gè)甲羥戊酸途徑酶的核苷酸序列的異源核酸的宿主細(xì)胞中(例如，宿主微生物)，研究類異戊二烯化合物(和/或前體，例如甲羥戊酸、IPP和多異戊烯二磷酸酯)產(chǎn)生的增多中得到了這種發(fā)現(xiàn)。甲羥戊酸途徑酶如圖2所示。甲羥戊酸途徑包括以下酶反應(yīng)(a)兩分子乙酰輔酶A縮合形成乙酰乙酰輔酶A；(b)乙酰乙酰輔酶A與乙酰輔酶A縮合形成HMG-CoA；(c)HMG-CoA轉(zhuǎn)化形成甲羥戊酸；(d)甲羥戊酸磷酸化形成甲羥戊酸5-磷酸酯；(e)甲羥戊酸5-磷酸酯轉(zhuǎn)化形成甲羥戊酸5-焦磷酸酯；和(f)甲羥戊酸5-焦磷酸酯轉(zhuǎn)化形成異戊烯焦磷酸酯。以下發(fā)現(xiàn)是料想不到的即甲羥戊酸途徑表達(dá)水平的增加導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制。
可通過(guò)在細(xì)菌中表達(dá)甲羥戊酸途徑來(lái)產(chǎn)生類異戊二烯化合物(合適的構(gòu)建物和方法，參見美國(guó)專利公開20030148479和20040005678；和Martin等，(2003)Nature Biotech.21(7)796-802)。產(chǎn)生IPP所需的甲羥戊酸途徑酶是可變的，這取決于培養(yǎng)條件。例如，在一些實(shí)施方式中，產(chǎn)生類異戊二烯或類異戊二烯前體化合物的宿主細(xì)胞是用兩種或多種異源核酸遺傳修飾的細(xì)胞，所述異源核酸含有編碼甲羥戊酸激酶(MK)、磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)和甲羥戊酸焦磷酸酯脫羧酶(MPD)(以及任選地異戊烯焦磷酸酯異構(gòu)酶)的核苷酸序列；并且在含甲羥戊酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞。在其它實(shí)施方式中，產(chǎn)生類異戊二烯或類異戊二烯前體化合物的宿主細(xì)胞是用兩種或多種含有編碼乙酰乙酰輔酶A硫解酶、羥甲基戊二酸單酰輔酶A合成酶(HMGS)、羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGR)、MK、PMK和MPD(以及任選地IPP異構(gòu)酶)的核苷酸序列的異源核酸遺傳修飾的細(xì)胞。
為了在遺傳改變以包含外源性甲羥戊酸途徑的宿主或已含有天然(內(nèi)源性)甲羥戊酸途徑的宿主中增加類異戊二烯產(chǎn)生的水平，可增加細(xì)胞內(nèi)該途徑中各個(gè)酶的活性水平。一種常用于調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)工程改造的酶的活性水平的方法是調(diào)節(jié)編碼該酶的mRNA的轉(zhuǎn)錄速率。一種實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)的嘗試是將啟動(dòng)子(轉(zhuǎn)錄起始或轉(zhuǎn)錄控制序列)改成更強(qiáng)的啟動(dòng)子。
在表達(dá)甲羥戊酸途徑的宿主細(xì)胞中，通常希望，通過(guò)改變控制整個(gè)甲羥戊酸途徑表達(dá)的啟動(dòng)子強(qiáng)度來(lái)改變類異戊二烯產(chǎn)生的水平。例如，當(dāng)從修飾的乳糖可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子(例如pBluescript和pBBR1MCS質(zhì)粒中的啟動(dòng)子)改變?yōu)楦鼜?qiáng)的啟動(dòng)子(例如，共有的(consensus)阿拉伯糖-或乳糖-可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子)時(shí)，通常希望各個(gè)酶的表達(dá)增加，從而增加類異戊二烯產(chǎn)生的水平。因?yàn)榧琢u戊酸途徑依賴豐富的細(xì)胞前體乙酰輔酶A，預(yù)計(jì)前體產(chǎn)生不會(huì)限制IPP的產(chǎn)生。與預(yù)計(jì)的相反，觀察到，上半部分甲羥戊酸途徑表達(dá)水平增加(即乙酰乙酰輔酶A硫解酶、HMGS和HMGR表達(dá)水平的增加))導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)抑制，而所需的類異戊二烯產(chǎn)物的量沒(méi)有增加。
當(dāng)將重組DNA分子引入生物體以產(chǎn)生酶時(shí)，無(wú)論該酶用于細(xì)胞內(nèi)催化還是從細(xì)胞純化，均可觀察到毒性作用(B.R.Glick.(1995)Biotech Advances.13(12)247-261)。這些作用是由于利用了宿主細(xì)胞的資源，或者由于該酶意外的活性或毒性中間體的累積。后一種情況可由該途徑最終產(chǎn)物水平的增加而引起，或者是單個(gè)酶所特有的，該酶的活性與途徑中其它酶的活性失去平衡，導(dǎo)致中間體累積至對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性的水平。而且，難以推理預(yù)測(cè)所引入途徑的代謝物在什么水平是有毒的指標(biāo)，或這些代謝物開始顯示毒性作用的水平，因?yàn)榛瘜W(xué)類似中間體可具有顯著不同的細(xì)胞內(nèi)作用。
例如，乙酰輔酶A在細(xì)胞內(nèi)的水平可非常高，而沒(méi)有任何毒性作用。丙酰輔酶A已顯示對(duì)生長(zhǎng)在葡萄糖上的構(gòu)巢曲霉(Aspirgillus nidulans)有毒(Brock等，Eur J.Biochem.271，3227-3241(2004))。采用丙酰輔酶A合成酶工程改造以累積PHA的大腸桿菌并不顯示明顯的丙烯輔酶CoA誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制作用，并可生長(zhǎng)至高的細(xì)胞密度(Choi等，Appl.Environ.Microbio.65 4363-4368(1999))?？赡苁怯捎诹u基桂皮烯醛基輔酶A的累積，在敲除羥基桂皮烯醛基輔酶A水合酶/裂合酶的不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)菌株中觀察到對(duì)咖啡酸鹽、p-香豆素鹽和阿魏酸鹽的敏感性(Parke等，Appl.Environ.Microbio.70，2974-2983(2004))。同一參考文獻(xiàn)表明，可能由于羥基桂皮烯醛基輔酶A的累積，在過(guò)度表達(dá)hcaC的大腸桿菌中觀察到對(duì)上述三種底物的敏感性。β-酮?；d體蛋白合成酶II(KAS II)在大腸桿菌中的過(guò)度產(chǎn)生導(dǎo)致丙二酸單酰輔酶A累積至抑制生長(zhǎng)的水平。丙二酸單酰輔酶A:ACP?；D(zhuǎn)移酶(催化丙二酸單酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙二酸單酰ACP的酶)的表達(dá)，以及KAS II部分地緩解上述毒性(Subrahmanyam等，J.Bact.180 4596-4602(1998))。丙二酸單酰/甲基丙二酸單酰輔酶A連接酶在大腸桿菌中的表達(dá)結(jié)合給予丙二酸甲酯，可導(dǎo)致甲基丙二酸單酰輔酶A累積至高達(dá)90％的脂酰輔酶A庫(kù)。尚未報(bào)道在該菌株中的生長(zhǎng)抑制作用(Murli等.JInd.Microbiol.Biotechnol.30 500-509(2003))。
大多數(shù)含甲羥戊酸途徑的生物體，例如智人，利用HMGR作為類異戊二烯產(chǎn)生的調(diào)節(jié)點(diǎn)。為了限制類異戊二烯的產(chǎn)生，這些生物體降低HMGR活性，自然地促進(jìn)了其前體HMG-CoA的累積?？梢栽O(shè)想，這種HMG-CoA的累積也可在攝取降低膽固醇藥物[(例如，他汀類藥物阿托伐他汀(立普妥)、氟伐他汀(來(lái)適可)、洛伐他汀(Altocor，美降脂)、普伐他汀(普拉固)、羅蘇伐他汀(Crestor)和辛伐他汀(舒降之))]]的患者中發(fā)生，抑制了HMGR的活性。他汀類藥物的廣泛使用而沒(méi)有HMG-CoA累積引起的系統(tǒng)性毒性表明，HMG-CoA是智人的無(wú)毒性代謝物。
在甲羥戊酸途徑酶表達(dá)導(dǎo)致毒性的情況下，采用液相色譜-質(zhì)譜法的代謝物分析將生長(zhǎng)抑制表型與途徑中間體3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)的累積連接在一起。該發(fā)現(xiàn)表明，在工程改造(“遺傳修飾”)微生物宿主細(xì)胞中，中間體HMG-CoA可累積并導(dǎo)致細(xì)胞死亡或阻止細(xì)胞進(jìn)一步生長(zhǎng)，因此，通過(guò)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和/或在碳向所需類異戊二烯轉(zhuǎn)移的過(guò)程中產(chǎn)生瓶頸，從而阻礙了IPP的產(chǎn)生。
HMG-CoA的累積表明，在工程改造的甲羥戊酸途徑中，HMG-CoA的產(chǎn)生與HMG-CoA向甲羥戊酸的后續(xù)轉(zhuǎn)化之間存在不平衡。通過(guò)增加HMG-CoA還原酶(HMGR)(將HMG-CoA轉(zhuǎn)化為甲羥戊酸的酶)的總體活性，可克服上述毒性，導(dǎo)致甲羥戊酸和從甲羥戊酸合成的類異戊二烯的產(chǎn)生增加。另一種降低HMG-CoA累積的方法是通過(guò)降低HMG-CoA合酶(HMGS，將乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為HMG-CoA的酶)的總體活性來(lái)限制HMG-CoA的產(chǎn)生。另一種降低HMG-CoA累積的方法是降低影響乙酰乙酰輔酶A(HMG-CoA的直接前體)產(chǎn)生的酶(例如乙酰乙酰輔酶A硫解酶)的水平和/或活性。
根據(jù)本發(fā)明方法，可將HMG-CoA水平調(diào)節(jié)至消除毒性并允許微生物細(xì)胞適當(dāng)生長(zhǎng)的水平，從而允許類異戊二烯或類異戊二烯前體產(chǎn)生的顯著增加。應(yīng)注意，雖然調(diào)節(jié)HMG-COA水平可能不會(huì)導(dǎo)致每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生的類異戊二烯的增加，甚至可導(dǎo)致降低，但是細(xì)胞生長(zhǎng)的增加可不僅僅抵消了這種損失，導(dǎo)致培養(yǎng)物中產(chǎn)生更多的類異戊二烯。例如，如果調(diào)節(jié)HMGS的活性，使得細(xì)胞內(nèi)HMG-CoA的水平降低，每個(gè)細(xì)胞類異戊二烯的水平降低10％但細(xì)胞生長(zhǎng)加倍，事實(shí)上，培養(yǎng)物中總的生產(chǎn)力(每個(gè)細(xì)胞的活性乘以培養(yǎng)物中的細(xì)胞數(shù)量)將增加。因此，通過(guò)在細(xì)胞中降低HMG-CoA合酶的活性水平和/或通過(guò)增加HMG-CoA還原酶活性水平可增加IPP或類異戊二烯化合物的產(chǎn)生調(diào)節(jié)(增加或降低)細(xì)胞中活性HMGS和/或HMGR的活性可通過(guò)一些方式實(shí)現(xiàn)1)調(diào)節(jié)(增加或降低)編碼該酶的核酸的轉(zhuǎn)錄；2)調(diào)節(jié)(增加或降低)編碼該酶的mRNA的翻譯；3)調(diào)節(jié)(增加或降低)編碼該酶的mRNA的穩(wěn)定性；4)調(diào)節(jié)(增加或降低)該酶本身的穩(wěn)定性；和5)調(diào)節(jié)(增加或降低)該酶的酶活性。為了降低或消除HMG-CoA的毒性作用和增加類異戊二烯和/或類異戊二烯前體的產(chǎn)生，本發(fā)明還提供了細(xì)胞，用于制備該細(xì)胞的核酸和表達(dá)載體，其中，已重新設(shè)計(jì)甲羥戊酸途徑以使HMG-CoA水平無(wú)毒。
實(shí)現(xiàn)較高IPP產(chǎn)生的努力集中在推定的速率限制酶如HMGR在含有內(nèi)源性甲羥戊酸途徑的細(xì)胞中的過(guò)度表達(dá)。例如，參見Polakowski等，(1998)Appl.Microbiol.Biotechnol.4967-71(產(chǎn)生類異戊二烯角鯊烯)；Donald等，(1997)Appl.Env.Microbiol.633341-3344(產(chǎn)生類異戊二烯角鯊烯)；和Jackson等，(2003)Org.Letters 51629-1632(產(chǎn)生類異戊二烯表柏木腦)。這些報(bào)道沒(méi)有描述通過(guò)表達(dá)HMGR緩解HMG-CoA誘導(dǎo)的毒性，而是由以下發(fā)現(xiàn)驅(qū)使的在許多生物體中，HMGR是在天然利用甲羥戊酸途徑產(chǎn)生類異戊二烯的生物體中產(chǎn)生類異戊二烯的進(jìn)化調(diào)節(jié)點(diǎn)。在這些情況下，由于HMGR的過(guò)度表達(dá)，類異戊二烯的產(chǎn)生分別增加了3-10倍。
以下研究探索了大腸桿菌中的甲羥戊酸途徑酶。Hamano等((2001)Biosci.Biotechnol.Biochem.651627-1635)報(bào)道了用含有來(lái)自鏈霉菌屬的甲羥戊酸途徑聚簇(cluster)的高拷貝構(gòu)建物pGEM-MEV轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DYM1的嘗試是不成功的。用含有相同甲羥戊酸途徑聚簇的低拷貝構(gòu)建物pMW-MEV轉(zhuǎn)化相同菌株的嘗試是成功的。該作者認(rèn)為，鏈霉菌屬甲羥戊酸途徑基因在大腸桿菌中的高表達(dá)可能是致死的。Wilding等，(2000)J Bacteriol 182(15)4319-27)報(bào)道，在甲羥戊酸的存在下，革蘭氏陽(yáng)性菌肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)，缺少HMG-CoA合酶和HMG-CoA還原酶的突變體能夠存活，而僅缺少HMG-CoA合酶的突變體則不能存活。
此外，本發(fā)明還提供了鑒定具有HMG-CoA解毒活性的基因產(chǎn)物的篩選方法。該方法通常包括a)通過(guò)將含有編碼候選基因產(chǎn)物的核苷酸序列的外源性核酸引入遺傳修飾的宿主細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生試驗(yàn)細(xì)胞，其中，在沒(méi)有上述外源性核酸的存在下，所述遺傳修飾的宿主細(xì)胞產(chǎn)生HMG-CoA，HMG-CoA的水平能有效抑制遺傳修飾的宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)；以及b)確定候選基因產(chǎn)物的表達(dá)對(duì)試驗(yàn)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響(如果有的話)。生長(zhǎng)抑制的降低表明，該外源性核酸編碼具有足以緩解HMG-CoA毒性的活性的基因產(chǎn)物。
此外，本發(fā)明還提供了鑒定抑制HMG-CoA累積的化合物的篩選方法。該方法通常包括a)使產(chǎn)生可有效抑制其生長(zhǎng)的HMG-CoA的試驗(yàn)細(xì)胞與試驗(yàn)化合物相接觸；以及b)確定試驗(yàn)化合物與細(xì)胞的接觸對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響(如果有的話)。生長(zhǎng)抑制的降低表明，該外源性化合物具有足以緩解HMG-CoA毒性的活性。
如上所述，大多數(shù)含甲羥戊酸途徑的生物體，例如智人，采用HMGR作為類異戊二烯產(chǎn)生的調(diào)節(jié)點(diǎn)。為了限制類異戊二烯的產(chǎn)生，這些有機(jī)體降低HMGR活性，導(dǎo)致其前體HMG-CoA的累積。這種HMG-CoA累積也可在攝取抑制HMGR活性的降低膽固醇藥物的患者中發(fā)生。
為了幫助理解本發(fā)明，提供圖1-3，這些圖示意性顯示了導(dǎo)致類異戊二烯或類異戊二烯前體產(chǎn)生的生物合成途徑。
圖1顯示了類異戊二烯途徑，包括用異戊烯基轉(zhuǎn)移酶修飾異戊烯二磷酸酯(IPP)和/或其異構(gòu)體二甲基烯丙基二磷酸酯(DMAPP)，產(chǎn)生多異戊烯二磷酸酯牻牛兒基二磷酸酯(GPP)、法呢基二磷酸酯(FPP)和牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯(GGPP)。GPP和FPP進(jìn)一步由萜合成酶修飾，分別產(chǎn)生單萜和倍半萜；GGPP進(jìn)一步由萜合成酶修飾，形成二萜和類葫蘿卜素。IPP和DMAPP由以下兩種途徑中的一種產(chǎn)生甲羥戊酸(MEV)途徑和1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸酯(DXP)途徑。
圖2示意性顯示了MEV途徑，其中，乙酰輔酶A通過(guò)一系列反應(yīng)轉(zhuǎn)化為IPP。
圖3示意性顯示了DXP途徑，其中，丙酮酸酯和D-甘油醛-3-磷酸酯通過(guò)一系列反應(yīng)轉(zhuǎn)化為IPP和DMAPP。除植物細(xì)胞之外的真核細(xì)胞僅利用MEV類異戊二烯途徑以使乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為IPP，然后異構(gòu)化為DMAPP。植物同時(shí)利用MEV和甲羥戊酸非依賴性、或DXP途徑來(lái)合成類異戊二烯。原核生物，除一些例外情況，利用DXP途徑通過(guò)分支點(diǎn)分別產(chǎn)生IPP和DMAPP。
緩解HMG-CoA毒性以及提高類異戊二烯和類異戊二烯前體產(chǎn)生的方法本發(fā)明提供了在包含、或遺傳修飾以包含含有編碼甲羥戊酸途徑中一種或多種酶的核苷酸序列的核酸的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生類異戊二烯或類異戊二烯前體的方法。該方法通常包括調(diào)節(jié)細(xì)胞中HMG-CoA的水平，以使HMG-CoA的水平對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性和/或不顯著抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，但該HMG-CoA水平可使細(xì)胞中類異戊二烯或類異戊二烯前體的產(chǎn)生增加。該方法通常包括在合適的介質(zhì)中培養(yǎng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其中，所述遺傳修飾的宿主細(xì)胞是用一種或多種對(duì)宿主細(xì)胞異源的核酸遺傳修飾的細(xì)胞，所述一種或多種核酸包含編碼一種或多種可緩解或降低HMG-CoA累積誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制或毒性的多肽的核苷酸序列。這些可緩解或降低HMG-CoA累積誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制或毒性的多肽包括但不限于HMG-CoA還原酶(HMGR)、HMG-CoA合酶(HMGS)以及影響乙酰乙酰輔酶A(HMG-CoA的前體)或甲羥戊酸水平的酶。遺傳修飾宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的類異戊二烯化合物(和/或HMG-CoA下游的類異戊二烯前體，例如甲羥戊酸、異戊烯焦磷酸酯(IPP)或多異戊烯二磷酸酯)比沒(méi)有用一種或多種編碼HMGS和/或HMGR的核酸遺傳修飾的對(duì)照(“親代”)宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的類異戊二烯化合物(和/或HMG-CoA下游的類異戊二烯前體，例如甲羥戊酸、IPP或多異戊烯二磷酸酯)的水平高。本發(fā)明還提供了適用于本發(fā)明方法的遺傳修飾的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供用于產(chǎn)生本發(fā)明遺傳修飾宿主細(xì)胞的重組核酸構(gòu)建物。
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了通過(guò)甲羥戊酸途徑在宿主細(xì)胞中降低HMG-CoA毒性和提高類異戊二烯或類異戊二烯前體產(chǎn)生的方法，其中，所述宿主細(xì)胞通過(guò)甲羥戊酸途徑產(chǎn)生類異戊二烯或類異戊二烯前體。該方法通常包括(a)遺傳修飾宿主細(xì)胞以包含一種或多種編碼一種或多種酶的異源核酸，與沒(méi)有用所述異源核酸遺傳修飾的對(duì)照親代宿主細(xì)胞相比，所述酶一旦在細(xì)胞中產(chǎn)生可降低HMG-CoA累積誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制；以及(b)在能使遺傳修飾宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的類異戊二烯或類異戊二烯前體的水平高于對(duì)照親代宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的類異戊二烯或類異戊二烯前體的水平的條件下，培養(yǎng)所述遺傳修飾的宿主細(xì)胞。
通過(guò)降低細(xì)胞中HMGS的活性水平和/或通過(guò)增加HMGR的活性水平和/或通過(guò)平衡HMGS活性和HMGR的活性水平來(lái)調(diào)節(jié)親代宿主細(xì)胞中HMG-CoA的水平，以緩解HMG-CoA累積誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。親代宿主細(xì)胞中HMG-CoA的水平也可通過(guò)促進(jìn)代謝物通過(guò)甲羥戊酸途徑的平衡流動(dòng)的遺傳修飾來(lái)調(diào)節(jié)，如下詳細(xì)所述。
本發(fā)明可應(yīng)用于通過(guò)甲羥戊酸途徑產(chǎn)生IPP和/或甲羥戊酸的宿主細(xì)胞。這些宿主細(xì)胞在本文中稱為“親代”宿主細(xì)胞，包含、或遺傳修飾以包含含有編碼一種或多種甲羥戊酸途徑中的酶的核苷酸序列的核酸(從而通過(guò)甲羥戊酸途徑產(chǎn)生IPP和/或甲羥戊酸)。親代宿主細(xì)胞具有HMG-CoA累積誘導(dǎo)的毒性，其中，在沒(méi)有其它遺傳修飾的情況下，細(xì)胞內(nèi)HMG-CoA水平可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，如下所述；因此，例如，親代宿主細(xì)胞如果沒(méi)有下述的遺傳修飾，可在細(xì)胞內(nèi)累積HMG-CoA并顯示HMG-CoA累積誘導(dǎo)的毒性。遺傳修飾親代宿主細(xì)胞以包含一種或多種對(duì)宿主細(xì)胞異源的核酸，其中，所述一種或多種核酸包含編碼HMGR和/或HMGS的核苷酸序列，可在細(xì)胞中增加HMGR活性水平和/或降低HMGS活性水平。與沒(méi)有用一種或多種包含編碼HMGR和/或HMGS的核苷酸序列的異源核酸遺傳修飾的親代宿主細(xì)胞相比，用一種或多種包含編碼HMGR和/或HMGS的核苷酸序列的異源核酸遺傳修飾的宿主細(xì)胞中，HMG-CoA累積誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制降低。用一種或多種包含編碼HMGR和/或HMGS的核苷酸序列的異源核酸遺傳修飾宿主細(xì)胞導(dǎo)致a)細(xì)胞內(nèi)HMGS活性水平降低；b)細(xì)胞內(nèi)HMGR活性水平增加；c)細(xì)胞內(nèi)HMGS活性水平降低且HMGR活性水平增加；或d)HMGS活性水平與HMGR活性水平之間達(dá)到平衡，從而緩解細(xì)胞內(nèi)HMG-CoA累積誘導(dǎo)的毒性。
因此，例如，可遺傳修飾“親代”(或“親本”)宿主細(xì)胞以包含一種或多種對(duì)宿主細(xì)胞異源的核酸，其中，所述一種或多種核酸包含編碼HMGR和/或HMGS的核苷酸序列。親代宿主細(xì)胞是通過(guò)甲羥戊酸途徑產(chǎn)生IPP和/或通過(guò)甲羥戊酸途徑產(chǎn)生甲羥戊酸的細(xì)胞。親代細(xì)胞包含、或遺傳修飾以包含含有編碼一種或多種甲羥戊酸途徑中的酶的核苷酸序列的核酸(并且通過(guò)甲羥戊酸途徑產(chǎn)生IPP和/或通過(guò)甲羥戊酸途徑產(chǎn)生甲羥戊酸)。親代細(xì)胞顯示HMG-CoA累積誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制。
遺傳修飾以包含一種或多種對(duì)宿主細(xì)胞異源的核酸的親代細(xì)胞被稱為“遺傳修飾的宿主細(xì)胞”，其中，所述一種或多種核酸包含編碼HMGR和/或HMGS的核苷酸序列。與沒(méi)有用一種或多種包含編碼HMGR和/或HMGS的核苷酸序列的異源核酸遺傳修飾的親代宿主細(xì)胞相比，在遺傳修飾的宿主細(xì)胞中HMG-CoA累積誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制降低。此外，與親代宿主細(xì)胞相比，遺傳修飾的宿主細(xì)胞中類異戊二烯或類異戊二烯前體的產(chǎn)生增加。因此，例如，與親代宿主細(xì)胞相比，遺傳修飾的宿主細(xì)胞中類異戊二烯或類異戊二烯前體的產(chǎn)生增加至少約10％、至少約20％、至少約50％、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍或至少約500倍或更多。
降低HMGS活性水平和/或增加HMGR活性水平在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明降低宿主細(xì)胞中HMG-CoA累積誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的方法包括降低細(xì)胞內(nèi)HMGS活性水平和/或增加細(xì)胞內(nèi)HMGR活性水平。降低細(xì)胞內(nèi)HMGS活性水平包括降低細(xì)胞內(nèi)HMGS多肽的總量；和降低細(xì)胞內(nèi)HMGS多肽的比活。因此，在一些實(shí)施方式中，通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)HMGS總量降低細(xì)胞內(nèi)HMGS的活性水平。在另一些實(shí)施方式中，通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)HMGS的比活來(lái)降低細(xì)胞內(nèi)HMGS的活性水平。類似地，增加細(xì)胞內(nèi)HMGR活性水平包括增加細(xì)胞內(nèi)HMGR多肽的總量；和增加細(xì)胞內(nèi)HMGR多肽的比活。因此，在一些實(shí)施方式中，通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)HMGR總量來(lái)增加細(xì)胞內(nèi)HMGR的活性水平。在另一些實(shí)施方式中，通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)HMGR的比活性來(lái)增加HMGR的活性水平。
可通過(guò)許多途徑降低細(xì)胞內(nèi)HMGS的活性水平，包括但不限于1)降低編碼HMGS的核酸的轉(zhuǎn)錄；2)降低編碼HMGS的mRNA的翻譯；3)降低編碼HMGS的mRNA的穩(wěn)定性；4)降低HMGS多肽的穩(wěn)定性；和5)降低HMGS酶的酶活性?？赏ㄟ^(guò)許多途徑增加細(xì)胞內(nèi)HMGR的活性水平，包括但不限于1)增加編碼HMGR的核酸的轉(zhuǎn)錄；2)增加編碼HMGR的mRNA的翻譯；3)增加編碼HMGR的mRNA的穩(wěn)定性；4)增加HMGR酶的穩(wěn)定性；和5)增加HMGR酶的酶活性。
因此，在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)HMG-CoA合酶和HMG-CoA還原酶的活性水平，實(shí)現(xiàn)所需的HMG-CoA的無(wú)毒水平。在一個(gè)實(shí)施方式中，親代宿主細(xì)胞為天然來(lái)源的酵母細(xì)胞，或大腸桿菌宿主細(xì)胞，用含有HMGS和HMGR編碼序列的載體遺傳修飾這些細(xì)胞。細(xì)胞中產(chǎn)生編碼的HMGS和HMGR酶，不會(huì)達(dá)到HMG-CoA的毒性水平，并實(shí)現(xiàn)通過(guò)該途徑的最佳流動(dòng)，從而提供高產(chǎn)率的所需產(chǎn)物(類異戊二烯或類異戊二烯前體化合物)。在一些實(shí)施方式中，HMGS和HMGR編碼區(qū)由不同的啟動(dòng)子控制。在另一個(gè)實(shí)施方式中，HMGS和HMGR編碼區(qū)在不同的載體上，HMGS編碼序列任選地位于較低拷貝數(shù)目的載體上。在一個(gè)實(shí)施方式中，HMGS和HMGR編碼序列在相同的操縱子上，但HMGR編碼序列位于HMGS編碼序列的上游，這種排列不同于含有HMGS和HMGR編碼序列的天然來(lái)源的操縱子。
在一些實(shí)施方式中，降低細(xì)胞內(nèi)HMGS活性水平和/或增加HMGR活性水平可降低細(xì)胞內(nèi)HMG-CoA的水平，從而降低HMG-CoA的毒性和/或生長(zhǎng)抑制作用。因此，在一些實(shí)施方式中，與顯示HMG-CoA累積誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制的對(duì)照親代細(xì)胞相比，降低細(xì)胞內(nèi)HMGS活性水平和/或增加HMGR活性水平可降低HMG-CoA的水平至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％或至少約90％。采用液相色譜-質(zhì)譜法等可容易地測(cè)得細(xì)胞中HMG-CoA的水平。
在一些實(shí)施方式中，降低細(xì)胞內(nèi)HMGS活性水平和/或增加HMGR活性水平可減少細(xì)胞內(nèi)HMG-CoA累積導(dǎo)致的生長(zhǎng)抑制作用。因此，在一些實(shí)施方式中，與顯示HMG-CoA累積誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制的對(duì)照細(xì)胞相比，降低細(xì)胞內(nèi)HMGS活性水平和/或增加HMGR活性水平可降低HMG-CoA累積介導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制作用至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％或至少約90％。采用眾所周知的方法，例如約600nm(OD600)處細(xì)菌液體培養(yǎng)物的光密度(OD)測(cè)定；集落大??；生長(zhǎng)速率；等等，來(lái)確定遺傳修飾的宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)。
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，對(duì)照親代細(xì)胞是用一種或多種包含編碼乙酰乙酰輔酶A硫解酶、HMGS和HMGR的核苷酸序列的核酸遺傳修飾的原核宿主細(xì)胞，其中，HMG-CoA在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生和累積的水平可對(duì)細(xì)胞造成生長(zhǎng)抑制或毒性。作為非限制性的例子，對(duì)照親代細(xì)胞是用表達(dá)構(gòu)建物遺傳修飾的大腸桿菌宿主細(xì)胞，所述表達(dá)構(gòu)建物包含編碼乙酰乙酰輔酶A硫解酶、HMGS和HMGR的核苷酸序列，所述核苷酸序列在質(zhì)粒或染色體上以所述順序位于一個(gè)多順?lè)醋硬倏v子中；而遺傳修飾的宿主細(xì)胞是用表達(dá)構(gòu)建物遺傳修飾的大腸桿菌，所述表達(dá)構(gòu)建物包含編碼乙酰乙酰輔酶A硫解酶、HMGR和HMGS的核苷酸序列，所述核苷酸序列在質(zhì)?；蛉旧w上以調(diào)整的所述順序位于一個(gè)多順?lè)醋硬倏v子中。作為其它非限制性的例子，對(duì)照親代細(xì)胞是用表達(dá)構(gòu)建物遺傳修飾的大腸桿菌宿主細(xì)胞，所述表達(dá)構(gòu)建物包含編碼乙酰乙酰輔酶A硫解酶、HMGS和HMGR的核苷酸序列，所述核苷酸序列在中等拷貝質(zhì)粒上以所述順序位于一個(gè)多順?lè)醋硬倏v子中；而遺傳修飾的宿主細(xì)胞是用表達(dá)構(gòu)建物遺傳修飾的大腸桿菌，所述表達(dá)構(gòu)建物包含以所述順序位于低拷貝質(zhì)粒上的編碼乙酰乙酰輔酶A硫解酶和HMGS的核苷酸序列，和在單獨(dú)的高拷貝質(zhì)粒上的HMGR核苷酸序列。作為其它非限制性的例子，對(duì)照親代細(xì)胞是用表達(dá)構(gòu)建物遺傳修飾的大腸桿菌宿主細(xì)胞，所述表達(dá)構(gòu)建物包含編碼乙酰乙酰輔酶A硫解酶、HMGS和HMGR的核苷酸序列，所述核苷酸序列在中等拷貝質(zhì)粒上以所述順序位于一個(gè)多順?lè)醋硬倏v子中；而遺傳修飾的宿主細(xì)胞是用表達(dá)構(gòu)建物遺傳修飾的大腸桿菌，所述表達(dá)構(gòu)建物包含以所述順序位于中等拷貝質(zhì)粒上的編碼乙酰乙酰輔酶A硫解酶和HMGS的核苷酸序列(其中，改變核糖體結(jié)合位點(diǎn)以減少翻譯)，和在單獨(dú)的中等拷貝質(zhì)粒上的核苷酸序列HMGR(在該序列中，啟動(dòng)子已變?yōu)檩^強(qiáng)的啟動(dòng)子)。作為其它非限制性的例子，對(duì)照親代細(xì)胞是用表達(dá)構(gòu)建物遺傳修飾的大腸桿菌宿主細(xì)胞，所述表達(dá)構(gòu)建物包含編碼乙酰乙酰輔酶A硫解酶、HMGS和HMGR的核苷酸序列，所述核苷酸序列在中等拷貝質(zhì)粒上以所述順序位于一個(gè)多順?lè)醋硬倏v子中；而遺傳修飾的宿主細(xì)胞是用表達(dá)構(gòu)建物遺傳修飾的大腸桿菌，所述表達(dá)構(gòu)建物包含編碼乙酰乙酰輔酶A硫解酶、具有工程改造蛋白酶位點(diǎn)的HMGS、以及融合有高度溶解性蛋白(如谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶)的HMGR的核苷酸序列，所述核苷酸以所述順序位于中等拷貝質(zhì)粒上。
如上所述，遺傳改造引起蛋白質(zhì)氨基酸序列的改變將導(dǎo)致HMGS和HMGR相對(duì)催化活性的改變(以Vmax或Vmax/Km衡量)。因此，在一些實(shí)施方式中，與親代宿主細(xì)胞相比，以每細(xì)胞HMGR/HMGS計(jì)，降低HMGS活性水平和/或增加HMGR活性水平導(dǎo)致遺傳修飾的宿主細(xì)胞中HMGR催化活性與HMGS催化活性的比例增加至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約90％、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍或至少約500倍或更多。采用眾所周知的方法，例如約600nm(OD600)處細(xì)菌液體培養(yǎng)物的光密度(OD)測(cè)定；集落大??；生長(zhǎng)速率；等等，可容易地測(cè)定遺傳修飾宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)照親代細(xì)胞是真核細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞如釀酒酵母。在一些實(shí)施方式中，對(duì)照親代真核細(xì)胞在內(nèi)源性丙酮酸脫羧酶基因中包含一個(gè)或多個(gè)突變，使得丙酮酸脫羧酶基因功能損傷，從而使得HMG-CoA在細(xì)胞內(nèi)累積至抑制細(xì)胞生長(zhǎng)或?qū)?xì)胞有毒的水平。在實(shí)施本發(fā)明的過(guò)程中，可通過(guò)修飾編碼HMGR或其控制元件的核酸進(jìn)一步修飾對(duì)照親代細(xì)胞，以增加轉(zhuǎn)錄、翻譯、或比活水平，產(chǎn)生遺傳修飾的宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)引入質(zhì)粒上的、受誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制的HMGR來(lái)進(jìn)一步修飾對(duì)照親代細(xì)胞。
通過(guò)降低HMG-CoA合酶的活性水平減少HMG-CoA累積的修飾通過(guò)參考本說(shuō)明書，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，HMG-CoA水平至少部分地依賴于細(xì)胞內(nèi)HMGS的活性水平。在一些實(shí)施方式中，上述HMG-CoA累積誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的降低和/或細(xì)胞內(nèi)HMG-CoA水平的降低可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)HMGS活性水平來(lái)實(shí)現(xiàn)。因此，在一些實(shí)施方式中，減輕HMG-CoA累積誘導(dǎo)的毒性和/或HMG-CoA的無(wú)毒性水平可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)HMG-CoA合酶的活性水平來(lái)實(shí)現(xiàn)。在這些實(shí)施方式中，遺傳修飾親代宿主細(xì)胞以包含對(duì)宿主細(xì)胞異源的核酸，所述親代宿主細(xì)胞包含、或遺傳修飾以包含含有編碼一種或多種甲羥戊酸途徑中的酶的核苷酸序列的核酸(并通過(guò)甲羥戊酸途徑產(chǎn)生IPP和/或甲羥戊酸)，其中，所述核酸包含編碼HMGS的核苷酸序列，與未用包含編碼HMGS的核苷酸序列的異源核酸遺傳修飾的親代宿主細(xì)胞相比，在用包含編碼HMGS的核苷酸序列的異源核酸遺傳修飾的宿主細(xì)胞中，HMG-CoA累積誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制降低。
在一個(gè)實(shí)施方式中，使用編碼HMGS的異源核酸代替所有或一部分內(nèi)源性HMGS基因。在另一個(gè)實(shí)施方式中，親代宿主細(xì)胞是遺傳修飾以含有外源性HMGS基因的細(xì)胞；親代宿主細(xì)胞的外源性HMGS基因被提供較低HMGS活性水平的(例如，HMGS的量和/或HMGS的活性比親代宿主細(xì)胞中的要低)修飾的HMGS基因所取代。在另一個(gè)實(shí)施方式中，降低HMGS活性水平的異源核酸編碼HMGS抑制劑或減少HMGS轉(zhuǎn)錄物翻譯的反義RNA。在這兩種情況下，雖然與親代菌株相比，修飾的宿主細(xì)胞的特異性類異戊二烯或類異戊二烯前體產(chǎn)生速率可能降低，但對(duì)HMG-CoA有關(guān)生長(zhǎng)抑制作用的緩解將導(dǎo)致更大的細(xì)胞密度，引起類異戊二烯或類異戊二烯前體的產(chǎn)生總體上增加。
在一些實(shí)施方式中，將異源核酸引入親代宿主細(xì)胞，異源核酸與編碼HMGS的內(nèi)源性核酸重組，從而遺傳修飾親代宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，與控制內(nèi)源性HMGS轉(zhuǎn)錄的內(nèi)源性啟動(dòng)子相比，異源核酸包含較低啟動(dòng)子強(qiáng)度的啟動(dòng)子，重組事件導(dǎo)致內(nèi)源性啟動(dòng)子被異源啟動(dòng)子所取代。在其它實(shí)施方式中，與內(nèi)源性HMGS相比，異源核酸包含編碼顯示較低酶活性的HMGS的核苷酸序列，重組事件導(dǎo)致內(nèi)源性HMGS編碼序列被異源HMGS編碼序列所取代。
適用于本發(fā)明方法的遺傳修飾的宿主細(xì)胞被一種或多種異源核酸、包括含有編碼HMGS的核苷酸序列的核酸遺傳修飾，從而降低細(xì)胞內(nèi)HMGS的活性水平。與未用一種或多種含有編碼HMGS的核苷酸序列的核酸遺傳修飾的親代宿主細(xì)胞相比，細(xì)胞內(nèi)HMGS的活性水平降低至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％或至少約90％。親代宿主細(xì)胞顯示HMG-CoA累積誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制。
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，對(duì)照親代細(xì)胞是用一種或多種含有編碼乙酰乙酰輔酶A硫解酶、HMGS和HMGR的核苷酸序列的核酸遺傳修飾的原核宿主細(xì)胞，其中，HMG-CoA在細(xì)胞內(nèi)可產(chǎn)生和累積至抑制生長(zhǎng)或?qū)?xì)胞有毒的水平。作為非限制性的例子，對(duì)照親代細(xì)胞是用包含SEQ ID NO1所示核苷酸序列的表達(dá)構(gòu)建物遺傳修飾的大腸桿菌宿主細(xì)胞；而遺傳修飾的宿主細(xì)胞是用包含SEQ ID NO1所示核苷酸序列的修飾版本的表達(dá)構(gòu)建物遺傳修飾的大腸桿菌，其中，HMGS上游的核糖體結(jié)合位點(diǎn)已改變以減少翻譯。作為非限制性的例子，對(duì)照親代細(xì)胞是用包含SEQ ID NO1所示核苷酸序列的表達(dá)構(gòu)建物遺傳修飾的大腸桿菌宿主細(xì)胞；而遺傳修飾的宿主細(xì)胞是用包含SEQ ID NO1所示核苷酸序列的修飾版本的表達(dá)構(gòu)建物遺傳修飾的大腸桿菌，其中，HMGS的編碼區(qū)中已引入RNase位點(diǎn)。作為非限制性的例子，對(duì)照親代細(xì)胞是用包含SEQID NO1所示核苷酸序列的表達(dá)構(gòu)建物遺傳修飾的大腸桿菌宿主細(xì)胞；而遺傳修飾的宿主細(xì)胞是用包含SEQ ID NO2所示核苷酸序列的表達(dá)構(gòu)建物遺傳修飾的大腸桿菌。例如，參見圖5和實(shí)施例2。作為非限制性的例子，對(duì)照親代細(xì)胞是用包含SEQ ID NO1所示核苷酸序列的表達(dá)構(gòu)建物遺傳修飾的大腸桿菌宿主細(xì)胞；而遺傳修飾的宿主細(xì)胞是用包含SEQ ID NO1和SEQ ID NO8所示核苷酸序列的表達(dá)構(gòu)建物遺傳修飾的大腸桿菌。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)照親代細(xì)胞是是真核細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞如釀酒酵母。在一些實(shí)施方式中，對(duì)照親代真核細(xì)胞在內(nèi)源性丙酮酸脫羧酶基因中包含一個(gè)或多個(gè)突變，使得丙酮酸脫羧酶基因功能損傷，從而使得HMG-CoA在細(xì)胞內(nèi)累積至抑制細(xì)胞生長(zhǎng)或?qū)?xì)胞有毒的水平。
可通過(guò)許多方法降低遺傳修飾的宿主細(xì)胞中HMGS的活性水平，包括但不限于1)降低與HMGS編碼區(qū)可操作地連接的啟動(dòng)子的啟動(dòng)子強(qiáng)度；2)降低包含編碼HMGS的核苷酸序列的質(zhì)粒的拷貝數(shù)；3)降低HMGS mRNA的穩(wěn)定性(其中，“HMGS mRNA”指包含編碼HMGS的核苷酸序列的mRNA)；4)修飾HMGS mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列，從而降低HMGS mRNA的翻譯水平；5)改變HMGS mRNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)與HMGS編碼序列起始密碼子之間的距離和/或序列，從而降低HMGS mRNA的翻譯水平；6)改變HMGS編碼序列起始密碼子5’端的整個(gè)順?lè)醋娱g區(qū)域，從而降低HMGS mRNA的翻譯水平；7)改變HMGS的密碼子選擇，從而降低HMGS mRNA的翻譯水平；8)降低HMGS的酶穩(wěn)定性；9)降低HMGS的比活性(單位活性/單位蛋白質(zhì))；以及10)當(dāng)HMGS編碼在操縱子上時(shí)，改變多順?lè)醋觤RNA上編碼區(qū)的順序?？蛇M(jìn)行兩種或多種上述修飾，以降低遺傳修飾宿主細(xì)胞中HMGS的活性水平。
在一些實(shí)施方式中，通過(guò)使用低拷貝數(shù)質(zhì)粒，HMGS活性水平相對(duì)于對(duì)照親代細(xì)胞中的HMGS活性降低，其中，所述質(zhì)粒包含編碼HMGS的核苷酸序列。降低含有編碼HMGS的核苷酸序列的載體的質(zhì)粒拷貝數(shù)可通過(guò)選擇已知為低拷貝數(shù)質(zhì)粒的質(zhì)粒骨架來(lái)實(shí)現(xiàn)。低拷貝數(shù)質(zhì)粒通常具有少于約20質(zhì)?？截?細(xì)胞，例如從約5質(zhì)?？截?細(xì)胞到約20質(zhì)?？截?細(xì)胞。合適的低拷貝數(shù)質(zhì)粒包括但不限于pACYC184、pBR332、pBAD33、pBBR1MCS和pSC101。例如，細(xì)胞內(nèi)存在的pSC101通常為5拷貝/細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)將兩個(gè)基因設(shè)置在兩種不同的表達(dá)載體上來(lái)調(diào)節(jié)HMGS和HMGR的水平，使得HMGS編碼序列位于低拷貝載體上，而HMGR編碼區(qū)位于高拷貝載體上。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，基因位于相同的載體上、但在不同啟動(dòng)子的控制下，HMGS編碼序列在兩個(gè)啟動(dòng)子中較弱啟動(dòng)子的控制下。
通過(guò)增加HMG-CoA還原酶活性水平減少細(xì)胞內(nèi)HMG-CoA累積的修飾通過(guò)參考本說(shuō)明書，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，HMG-CoA水平至少部分地依賴于細(xì)胞內(nèi)HMGR的活性水平。上述HMG-CoA累積誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的降低和/或細(xì)胞內(nèi)HMG-CoA水平的降低可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)HMGR活性水平來(lái)實(shí)現(xiàn)。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，HMG-CoA的無(wú)毒性水平和/或緩解HMG-CoA累積誘導(dǎo)的毒性可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)HMG-CoA還原酶的活性水平來(lái)實(shí)現(xiàn)。在這些實(shí)施方式中，遺傳修飾親代宿主細(xì)胞以包含對(duì)宿主細(xì)胞異源的核酸，所述親代宿主細(xì)胞包含、或遺傳修飾以包含含有編碼一種或多種甲羥戊酸途徑中的酶的核苷酸序列的核酸，并通過(guò)甲羥戊酸途徑產(chǎn)生IPP和/或甲羥戊酸，其中，所述核酸包含編碼HMGR的核苷酸序列，與未用包含編碼HMGR的核苷酸序列的異源核酸遺傳修飾的對(duì)照親代宿主細(xì)胞相比，在用包含編碼HMGR的核苷酸序列的異源核酸遺傳修飾的宿主細(xì)胞中，HMG-CoA累積誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制降低。
適用于本發(fā)明方法的遺傳修飾的宿主細(xì)胞被一種或多種異源核酸、包括含有編碼HMGR的核苷酸序列的核酸遺傳修飾，從而升高細(xì)胞內(nèi)HMGR的活性水平。與沒(méi)有用一種或多種含有編碼HMGR的核苷酸序列的核酸遺傳修飾的對(duì)照宿主細(xì)胞相比，細(xì)胞內(nèi)HMGR的活性水平升高至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％或至少約90％。
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，對(duì)照親代細(xì)胞是用一種或多種含有編碼乙酰乙酰輔酶A硫解酶、HMGS和HMGR的核苷酸序列的核酸遺傳修飾的原核宿主細(xì)胞，其中，HMG-CoA在細(xì)胞內(nèi)可產(chǎn)生和累積至抑制生長(zhǎng)或?qū)?xì)胞有毒的水平。在一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)照親代細(xì)胞是天然情況下不含有甲羥戊酸途徑的原核宿主細(xì)胞，遺傳修飾所述細(xì)胞以產(chǎn)生甲羥戊酸；而遺傳修飾的宿主細(xì)胞可進(jìn)一步工程改造以改變HMGR活性，使得細(xì)胞內(nèi)HMG-CoA的水平對(duì)細(xì)胞沒(méi)有抑制作用或無(wú)毒。在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，對(duì)照親代細(xì)胞是遺傳修飾以產(chǎn)生甲羥戊酸的大腸桿菌宿主細(xì)胞；而遺傳修飾的宿主細(xì)胞是用除下述參考文獻(xiàn)中所列構(gòu)建物以外的構(gòu)建物增強(qiáng)的對(duì)照親代細(xì)胞遺傳修飾版本的大腸桿菌Kato-Emori等，Mol Genet Genomics(2001)265135-42，Learned RM等，PNAS.(1989)862779-83，T.Dairi等，Mol Gen Genet(2000)262957-964，Allen等，Appl Environ.Microbio.(1997).633341-3344，Hedl等，J Bacteriol，(2002)，1842116-2122，Jackson等，Org.Lett.(2003)51629-1632，Randolph Y.Hampton等，(1994)Cell，125299-312，Markus Veen等，F(xiàn)EMS Yeast Res(2003)487-95，Beach MJ等，J Bacteriol(1989)1712994-3001，Bischoff KM等，Protein Sci(1997)6156-161，F(xiàn)riesen JA等，Biochemistry.(1997)362173-7，F(xiàn)rimpong等，JBiol Chem.(1994)26911478-83，Panda等，Appl Microbiol Biotechnol(2004)66143-152。
作為非限制性的例子，對(duì)照親代細(xì)胞是用包含SEQ ID NO1所示核苷酸序列的表達(dá)構(gòu)建物遺傳修飾的大腸桿菌宿主細(xì)胞；而遺傳修飾的宿主細(xì)胞是用包含SEQ ID NO1和SEQ ID NO8所示核苷酸序列的表達(dá)構(gòu)建物遺傳修飾的大腸桿菌。例如，參見圖6和7以及實(shí)施例3和4。作為非限制性的例子，對(duì)照親代細(xì)胞是用包含SEQ ID NO2所示核苷酸序列的表達(dá)構(gòu)建物遺傳修飾的大腸桿菌宿主細(xì)胞；而遺傳修飾的宿主細(xì)胞是用包含SEQ ID NO2和SEQ ID NO9所示核苷酸序列的表達(dá)構(gòu)建物遺傳修飾的大腸桿菌。例如，參見圖10和實(shí)施例6。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)照親代細(xì)胞是真核細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞如釀酒酵母。在一些實(shí)施方式中，對(duì)照親代真核細(xì)胞在內(nèi)源性丙酮酸脫羧酶基因中包含一個(gè)或多個(gè)突變，使得丙酮酸脫羧酶基因功能損傷，從而使得HMG-CoA在細(xì)胞內(nèi)累積至抑制細(xì)胞生長(zhǎng)或?qū)?xì)胞有毒的水平。
可以多種方式增加遺傳修飾的宿主細(xì)胞中的HMGR活性水平，這些方式包括但不限于1)增加與HMGR編碼區(qū)可操作地連接的啟動(dòng)子的啟動(dòng)子強(qiáng)度；2)增加包括編碼HMGR的核苷酸序列的質(zhì)粒的拷貝數(shù)；3)增加HMGR mRNA的穩(wěn)定性(其中，“HMGR mRNA”是包含編碼HMGR的核苷酸序列的mRNA)；4)修飾HMGR mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列，以提高HMGR mRNA的翻譯水平；5)修飾HMGR mRNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)與HMGR編碼序列起始密碼子之間的序列，以提高HMGR mRNA的翻譯水平；6)修飾HMGR編碼區(qū)起始密碼子5’端的整個(gè)順?lè)醋娱g區(qū)域，以提高HMGR mRNA的翻譯水平；7)修飾HMGR的密碼子應(yīng)用以提高HMGR mRNA的翻譯水平；8)表達(dá)HMGR中使用的稀有密碼子tRNA以提高HMGR mRNA的翻譯水平；9)增加HMGR的酶穩(wěn)定性；或10)增加HMGR的比活性(單位活性/單位蛋白質(zhì))。可進(jìn)行兩種或多種上述修飾以提高HMGR的活性水平。
在SEQ ID NO2所示核苷酸序列中，HMGR編碼區(qū)在pBAD啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下。在一些實(shí)施方式中，與HMGR編碼區(qū)可操作地連接的啟動(dòng)子是比pBAD啟動(dòng)子強(qiáng)效的啟動(dòng)子，例如，mRNA的轉(zhuǎn)錄水平比采用pBAD啟動(dòng)子的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平高至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約90％、至少約2倍、至少約5倍、至少約10倍或更多。合適的啟動(dòng)子包括但不限于共有(consensus)lac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子、λ啟動(dòng)子和T7啟動(dòng)子。
增加質(zhì)?？截悢?shù)可通過(guò)選擇已知為中等或高拷貝數(shù)質(zhì)粒的質(zhì)粒骨架來(lái)實(shí)現(xiàn)。低拷貝數(shù)質(zhì)粒通常提供少于約20個(gè)質(zhì)?？截?細(xì)胞。中等拷貝數(shù)質(zhì)粒通常提供約20-50個(gè)質(zhì)?？截?細(xì)胞，或約20-80個(gè)質(zhì)?？截?細(xì)胞。高拷貝數(shù)質(zhì)粒通常提供約80-200個(gè)質(zhì)?？截?細(xì)胞或更多。在許多實(shí)施方式中，包含編碼HMGR的核苷酸序列的核酸是包含含有編碼HMGR的核苷酸序列的核酸的高拷貝數(shù)質(zhì)粒載體。合適的高拷貝數(shù)質(zhì)粒包括但不限于pUC載體(例如，pUC8、pUC18、pUC19等)、pBluescript載體、pGEM載體和pTZ載體。
通過(guò)參考本說(shuō)明書，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞中HMGS和HMGR的相對(duì)活性水平可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)HMG-CoA的水平。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，同時(shí)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)HMG-CoA合酶和HMG-CoA還原酶的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)所需的HMG-CoA無(wú)毒水平。在一個(gè)實(shí)施方式中，親代宿主細(xì)胞是用含有HMGS和HMGR編碼序列的載體遺傳修飾的天然來(lái)源的酵母或大腸桿菌宿主細(xì)胞。細(xì)胞中產(chǎn)生編碼的HMGS和HMGR酶，不會(huì)達(dá)到HMG-CoA的毒性水平并實(shí)現(xiàn)通過(guò)該途徑的最佳流動(dòng)，提供高產(chǎn)率的所需產(chǎn)物(類異戊二烯或類異戊二烯前體化合物)。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)不同的啟動(dòng)子控制HMGS和HMGR編碼區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，HMGS和HMGR編碼序列在不同的載體上，HMGS編碼序列任選地位于較低拷貝數(shù)的載體上。在一個(gè)實(shí)施方式中，HMGS和HMGR編碼區(qū)在相同的操縱子上，但HMGR編碼區(qū)位于HMGS編碼序列的上游，這種排列不同于天然來(lái)源的含有HMGS和HMGR編碼序列的操縱子。
通過(guò)平衡甲羥戊酸途徑中的流動(dòng)降低HMG-CoA累積的修飾在一些實(shí)施方式中，通過(guò)平衡所述途徑中的代謝物流動(dòng)來(lái)降低HMG-CoA累積誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制或毒性?？梢远喾N方式平衡代謝物流動(dòng)，這些方式包括但不限于1)HMGS上游酶(即AtoB、AtoC、AtoA、AtoD)的突變，限制該酶所能獲得的底物(乙酰乙酰輔酶A)；2)HMGS上游酶(例如，A-C、A-A、A-D、以及涉及脂肪酸生物合成的酶)表達(dá)的改變，限制該酶所能獲得底物(乙酰乙酰輔酶A)；3)HMGR下游酶(即MK、PMK、MVD)表達(dá)的改變，耗竭甲羥戊酸的供應(yīng)，因而促進(jìn)HMG-CoA轉(zhuǎn)化為甲羥戊酸；4)改變HMGR下游酶(即MK、PMK、MVD)催化特征的突變，耗竭甲羥戊酸的供應(yīng)，因而促進(jìn)HMG-CoA轉(zhuǎn)化為甲羥戊酸；5)HMGR與上游酶(即乙酰乙酰輔酶A硫解酶、HMGS)的蛋白質(zhì)融合，以配合HMG-CoA產(chǎn)生酶表達(dá)為HMGR；6)HMGS與下游酶(即MK)的蛋白質(zhì)融合，以配合HMG-CoA產(chǎn)生酶表達(dá)為負(fù)責(zé)使代謝物移動(dòng)遠(yuǎn)離HMG-CoA的酶。
增加類異戊二烯或類異戊二烯前體的產(chǎn)生上述方法緩解了細(xì)胞中HMG-CoA累積誘導(dǎo)的毒性和/或生長(zhǎng)抑制；并可增加細(xì)胞內(nèi)類異戊二烯化合物和/或類異戊二烯前體化合物的產(chǎn)生。因此，本發(fā)明提供了增加細(xì)胞中類異戊二烯化合物或類異戊二烯前體化合物的方法，該方法通常包括調(diào)節(jié)細(xì)胞中HMG-CoA的水平以使HMG-CoA的水平保持低于毒性或生長(zhǎng)抑制水平，然而該水平足夠高以增加類異戊二烯化合物或類異戊二烯前體化合物的產(chǎn)生。
本發(fā)明提供了增加細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的類異戊二烯化合物、或類異戊二烯化合物前體(例如，甲羥戊酸、IPP、多異戊烯二磷酸酯等)的方法。該方法通常包括在顯示HMG-CoA累積誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的細(xì)胞中提高HMGR的活性水平和/或降低HMGS的活性水平。在一些實(shí)施方式中，顯示HMG-CoA累積誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的細(xì)胞是不能通過(guò)甲羥戊酸途徑正常合成IPP或甲羥戊酸、并且用一種或多種包含編碼甲羥戊酸途徑酶的核苷酸序列的核酸的遺傳修飾的親代宿主細(xì)胞，所述酶產(chǎn)生的水平可導(dǎo)致細(xì)胞中毒性或生長(zhǎng)抑制水平HMG-CoA的累積。在一些實(shí)施方式，顯示HMG-CoA累積誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的細(xì)胞是不能通過(guò)甲羥戊酸途徑正常合成IPP或甲羥戊酸、但遺傳修飾以使細(xì)胞內(nèi)HMG-CoA累積在生長(zhǎng)抑制或毒性水平的親代宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，化合物是類異戊二烯前體化合物IPP。在一個(gè)實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
在一些實(shí)施方式中，在細(xì)胞中降低HMGS活性水平和/或提高HMGR活性水平可增加遺傳修飾的宿主細(xì)胞、或遺傳修飾宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物產(chǎn)生的甲羥戊酸。因此，在一些實(shí)施方式中，與親代宿主細(xì)胞相比，在細(xì)胞中降低HMGS活性水平和/或增加HMGR活性水平可增加遺傳修飾的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的甲羥戊酸至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約90％、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、或至少約500倍或更多。使用眾所周知的方法，例如氣相色譜-質(zhì)譜、液相色譜-質(zhì)譜、離子色譜-質(zhì)譜、薄層色譜、脈沖安培檢測(cè)、uv-vis光譜測(cè)定等，可容易地測(cè)定甲羥戊酸的產(chǎn)生。
在一些實(shí)施方式中，降低細(xì)胞中HMGS活性水平和/或提高HMGR活性水平可增加遺傳修飾的宿主細(xì)胞、或遺傳修飾的宿主細(xì)胞培養(yǎng)物所產(chǎn)生的IPP。因此，在一些實(shí)施方式中，與親代宿主細(xì)胞相比，降低細(xì)胞中HMGS活性水平和/或提高HMGR活性水平可增加遺傳修飾的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的IPP至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約90％、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、或至少約500倍或更多。使用眾所周知的方法，例如液相色譜-質(zhì)譜、薄層色譜、離子色譜-質(zhì)譜、脈沖安培檢測(cè)、uv-vis光譜測(cè)定等，可容易地測(cè)定IPP的產(chǎn)生。
在一些實(shí)施方式中，降低細(xì)胞中HMGS活性水平和/或提高HMGR活性水平可增加遺傳修飾的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的類異戊二烯。因此，在一些實(shí)施方式中，與親代宿主細(xì)胞相比，降低細(xì)胞中HMGS活性水平和/或提高HMGR活性水平可增加遺傳修飾的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的甲羥戊酸至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約90％、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、或至少約500倍或更多。使用眾所周知的方法，例如氣相色譜-質(zhì)譜、液相色譜-質(zhì)譜、離子色譜-質(zhì)譜、脈沖安培檢測(cè)、uv-vis光譜測(cè)定等，可容易地測(cè)定類異戊二烯的產(chǎn)生。
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明方法可提高每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生的類異戊二烯或類異戊二烯前體，例如，以每個(gè)細(xì)胞計(jì)，采用本發(fā)明方法產(chǎn)生的類異戊二烯或類異戊二烯前體化合物的量比對(duì)照親代細(xì)胞產(chǎn)生的類異戊二烯或類異戊二烯前體化合物的量高至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約90％、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、或至少約500倍或更多。通過(guò)測(cè)量細(xì)胞干重或測(cè)量細(xì)胞培養(yǎng)物的光密度測(cè)定細(xì)胞的量。
在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明方法可提高每單位體積細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的類異戊二烯或類異戊二烯前體，例如，以每單位體積細(xì)胞培養(yǎng)物計(jì)算，采用本發(fā)明方法產(chǎn)生的類異戊二烯或類異戊二烯前體化合物的量比對(duì)照親代細(xì)胞產(chǎn)生的類異戊二烯或類異戊二烯前體化合物的量高至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約90％、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、或至少約500倍或更多。
在一些實(shí)施方式中，提高類異戊二烯化合物或類異戊二烯前體化合物產(chǎn)生的本發(fā)明方法包括調(diào)節(jié)培養(yǎng)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基組成，以增加甲羥戊酸途徑中間體(例如，乙酰輔酶A)的水平。在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基包含醋酸酯，它可增加乙酰輔酶A的水平，從而增加細(xì)胞中HMG-CoA的水平。
可采用本發(fā)明方法產(chǎn)生的類異戊二烯包括但不限于單萜，包括但不限于檸檬烯、citranellol、香葉醇、薄荷腦、紫蘇醇(perillyl alcohol)、芳樟醇、側(cè)柏酮；倍半萜，包括但不限于蜚蠊酮B、銀杏內(nèi)酯B(gingkolide B)、紫穗槐二烯、青蒿素、青蒿酸(artemisinic acid)、瓦倫烯、努特卡酮、表-柏木腦、表-馬兜鈴烯(epi-aristolochene)、法呢醇、棉酚、sanonin、蜚蠊酮和福斯高林；二萜，包括但不限于casbene、eleutherobin、紫杉醇、蔓生素(prostratin)和偽蕨素；三萜，包括但不限于arbruside E、鴉膽丁(bruceantin)、睪酮、孕酮、可的松、洋地黃毒苷。類異戊二烯還包括但不限于類葫蘿卜素，如番茄紅素、α-和β-胡蘿卜素、α-和β-玉米黃質(zhì)、胭脂樹橙、玉米黃素、蝦青素和黃體素。類異戊二烯還包括但不限于三萜、甾體化合物、以及由被其它化學(xué)基團(tuán)修飾的類異戊二烯組成的化合物如混合的萜-生物堿和輔酶Q-10。
遺傳修飾的宿主細(xì)胞本發(fā)明提供了遺傳修飾的宿主細(xì)胞；以及包含遺傳修飾的宿主細(xì)胞的組合物。遺傳修飾的宿主細(xì)胞可用于產(chǎn)生類異戊二烯化合物或類異戊二烯前體化合物，如上所述。
如上所述，本發(fā)明產(chǎn)生類異戊二烯或類異戊二烯前體的方法通常包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞。遺傳修飾的宿主細(xì)胞指用一種或多種包含編碼一種或多種酶的核苷酸序列的異源核酸遺傳修飾的宿主細(xì)胞，當(dāng)在細(xì)胞中產(chǎn)生時(shí)，所述酶可緩解細(xì)胞中HMG-CoA累積誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制(毒性)。親代細(xì)胞(例如，沒(méi)有遺傳修飾一種或多種包含編碼一種或多種酶的核苷酸序列的異源核酸，當(dāng)在細(xì)胞中產(chǎn)生時(shí)，這些酶可緩解細(xì)胞中HMG-CoA累積誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制和/或毒性)指產(chǎn)生、或遺傳修飾以通過(guò)甲羥戊酸途徑產(chǎn)生IPP的細(xì)胞。
因此，例如，“親代”(或“親本”)宿主細(xì)胞指遺傳修飾以包含一種或多種對(duì)宿主細(xì)胞異源的核酸，其中，所述一種或多種核酸包含編碼HMGR和/或HMGS的核苷酸序列。親代宿主細(xì)胞通過(guò)甲羥戊酸途徑產(chǎn)生IPP和/或通過(guò)甲羥戊酸途徑產(chǎn)生甲羥戊酸。親代細(xì)胞包含、或遺傳修飾以包含含有編碼一種或多種甲羥戊酸途徑中的酶的核苷酸序列的核酸(并通過(guò)甲羥戊酸途徑產(chǎn)生IPP和/或通過(guò)甲羥戊酸途徑產(chǎn)生甲羥戊酸)。遺傳修飾親代細(xì)胞以包含一種或多種對(duì)宿主細(xì)胞異源的核酸，其中，所述一種或多種核酸包含編碼HMGR和/或HMGS的核苷酸序列，這種細(xì)胞稱為“遺傳修飾的宿主細(xì)胞”。與未用一種或多種包含編碼HMGR和/或HMGS的核苷酸序列的異源核酸遺傳修飾的親代宿主細(xì)胞相比，遺傳修飾的親代宿主細(xì)胞中HMG-CoA累積誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制降低。而且，遺傳修飾的宿主細(xì)胞顯示甲羥戊酸或類異戊二烯產(chǎn)物水平的提高，這種提高是每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生的甲羥戊酸的增加和/或細(xì)胞活力的增加的組合導(dǎo)致的。應(yīng)理解，可反復(fù)應(yīng)用本發(fā)明以逐步增加類異戊二烯化合物的產(chǎn)生，從而在一種情況下，特定的細(xì)胞株可以是遺傳修飾的宿主細(xì)胞，而然后在下一種情況中，它可以是用作進(jìn)一步改進(jìn)的起始點(diǎn)的親代宿主細(xì)胞?；蛘?，本發(fā)明描述了HMG-CoA累積的毒性，允許從頭構(gòu)建避免與高水平類異戊二烯產(chǎn)生相關(guān)的HMG-CoA毒性的遺傳系統(tǒng)及相關(guān)宿主細(xì)胞。因此，如果遺傳修飾的宿主細(xì)胞可進(jìn)一步遺傳修飾以產(chǎn)生由于HMG-CoA累積導(dǎo)致細(xì)胞活力降低的細(xì)胞，所述進(jìn)一步遺傳修飾的細(xì)胞相對(duì)于最初遺傳修飾的宿主細(xì)胞實(shí)際上是親代宿主細(xì)胞。
在一些實(shí)施方式中，親代細(xì)胞是不能通過(guò)甲羥戊酸途徑正常產(chǎn)生IPP或甲羥戊酸的細(xì)胞；例如，親代細(xì)胞指用一種或多種包含編碼一種或多種甲羥戊酸途徑中的酶的核苷酸序列的異源核酸遺傳修飾的細(xì)胞。例如，親代細(xì)胞是不能通過(guò)甲羥戊酸途徑正常產(chǎn)生IPP或甲羥戊酸的原核細(xì)胞，該細(xì)胞遺傳修飾有一種或多種包含編碼乙酰乙酰輔酶A硫解酶、HMGS和HMGR的核苷酸序列的核酸，其中，乙酰乙酰輔酶A硫解酶和HMGS的活性水平可使細(xì)胞內(nèi)HMG-CoA累積至抑制生長(zhǎng)或產(chǎn)生毒性的水平。一個(gè)例子是用包含SEQ ID NO1所示核苷酸序列的構(gòu)建物遺傳修飾的大腸桿菌細(xì)胞。親代宿主細(xì)胞的第二個(gè)例子是用包含SEQ ID NO2所示核苷酸序列的構(gòu)建物遺傳修飾的大腸桿菌細(xì)胞。
在其它實(shí)施方式中，親代細(xì)胞是可通過(guò)甲羥戊酸途徑正常合成IPP和/或甲羥戊酸的細(xì)胞，例如，親代細(xì)胞是包含編碼一種或多種甲羥戊酸途徑中的酶的內(nèi)源性核酸的細(xì)胞。在這些實(shí)施方式中，遺傳修飾親代細(xì)胞，使得HMG-CoA在細(xì)胞內(nèi)累積至對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性或生長(zhǎng)抑制的水平。例如，在可通過(guò)甲羥戊酸途徑正常產(chǎn)生IPP和/或甲羥戊酸的宿主細(xì)胞的丙酮酸脫羧酶基因中引入一個(gè)或多個(gè)突變，使得丙酮酸脫羧酶基因功能損傷，從而使得HMG-CoA在細(xì)胞內(nèi)累積至對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性的水平。在這種情況下，親代細(xì)胞是可通過(guò)甲羥戊酸途徑正常產(chǎn)生IPP和/或甲羥戊酸的宿主細(xì)胞，遺傳修飾這種細(xì)胞以在內(nèi)源性丙酮酸脫羧酶中引入一個(gè)或多個(gè)突變，使得丙酮酸脫羧酶基因功能損傷。
為產(chǎn)生本發(fā)明遺傳修飾的宿主細(xì)胞，采用已確立的技術(shù)，包括但不限于電穿孔、硫酸鈣沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染等，將一種或多種包含編碼可緩解HMG-CoA累積誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制的酶的核苷酸序列的核酸穩(wěn)定地或暫時(shí)引入親代宿主細(xì)胞。為實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，核酸通常還包含可選擇性標(biāo)記，例如，任何已知的可選擇性標(biāo)記如新霉素抗性、氨芐西林抗性、四環(huán)素抗性、氯霉素抗性、卡那霉素抗性等。
甲羥戊酸途徑酶如上所述，親代細(xì)胞是產(chǎn)生、或遺傳修飾以通過(guò)甲羥戊酸途徑產(chǎn)生IPP和/或通過(guò)甲羥戊酸途徑產(chǎn)生甲羥戊酸的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞顯示HMG-CoA累積誘導(dǎo)的毒性或生長(zhǎng)抑制。甲羥戊酸途徑包括(a)兩分子乙酰輔酶A縮合形成乙酰乙酰輔酶A；(b)乙酰乙酰輔酶A與乙酰輔酶A縮合形成HMG-CoA；(c)HMG-CoA轉(zhuǎn)化形成甲羥戊酸；(d)甲羥戊酸磷酸化形成甲羥戊酸5-磷酸酯；(e)甲羥戊酸5-磷酸酯轉(zhuǎn)化形成甲羥戊酸5-焦磷酸酯；和(f)甲羥戊酸5-焦磷酸酯轉(zhuǎn)化形成異戊烯焦磷酸酯。產(chǎn)生IPP所需的甲羥戊酸途徑酶可不同，取決于培養(yǎng)條件。
在一些實(shí)施方式中，親代宿主細(xì)胞是用一種或多種包含編碼乙酰乙酰輔酶A硫解酶、HMGS和HMGR的核苷酸序列的異源核酸遺傳修飾的細(xì)胞，而且親代宿主細(xì)胞是產(chǎn)生甲羥戊酸的細(xì)胞。親代宿主細(xì)胞的非限制性例子是用包含SEQ ID NO1所示核苷酸序列或編碼與SEQ ID NO1編碼的酶功能類似的酶的的核苷酸序列的構(gòu)建物遺傳修飾的大腸桿菌細(xì)胞。親代宿主細(xì)胞的另一個(gè)非限制性例子是用包含SEQ ID NO2所示核苷酸序列或編碼與SEQ ID NO2編碼的酶功能類似的酶的核苷酸序列的構(gòu)建物遺傳修飾的大腸桿菌細(xì)胞。親代宿主細(xì)胞的另一個(gè)非限制性例子是用包含SEQ ID NO7所示核苷酸序列或編碼與SEQID NO7編碼的酶功能類似的酶的核苷酸序列的構(gòu)建物遺傳修飾的酵母細(xì)胞。親代宿主細(xì)胞的另一個(gè)非限制性例子是用一種或多種包含SEQ ID NO1和SEQID NO6所示核苷酸序列或編碼與SEQ ID NO1和SEQ ID NO6編碼的酶功能類似的酶的核苷酸序列的構(gòu)建物遺傳修飾的大腸桿菌細(xì)胞。親代宿主細(xì)胞的另一個(gè)非限制性例子是用一種或多種包含SEQ ID NO1和SEQ ID NO7所示核苷酸序列或編碼與SEQ ID NO1和SEQ ID NO7編碼的酶功能類似的酶的核苷酸序列的構(gòu)建物遺傳修飾的大腸桿菌細(xì)胞。親代宿主細(xì)胞的另一個(gè)非限制性例子是用一種或多種包含SEQ ID NO1和SEQ ID NO11所示核苷酸序列或編碼與SEQ ID NO1和SEQ ID NO11編碼的酶功能類似的酶的核苷酸序列的構(gòu)建物遺傳修飾的大腸桿菌細(xì)胞。親代宿主細(xì)胞的另一個(gè)非限制性例子是用包含SEQID NO6和SEQ ID NO7編碼的甲羥戊酸途徑基因的核苷酸序列、或編碼與SEQ ID NO6和SEQ ID NO7編碼的甲羥戊酸途徑酶功能類似的酶的核苷酸序列的構(gòu)建物遺傳修飾的酵母細(xì)胞。親代宿主細(xì)胞的另一個(gè)非限制性例子是用包含SEQ ID NO11編碼的甲羥戊酸途徑酶的核苷酸序列或編碼與SEQ ID NO11編碼的那些酶功能類似的酶的核苷酸序列的構(gòu)建物遺傳修飾的酵母細(xì)胞。
在其它實(shí)施方式中，親代宿主細(xì)胞是用一種或多種包含編碼乙酰乙酰輔酶A硫解酶、HMGS、HMGR、甲羥戊酸激酶(MK)、磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)和甲羥戊酸焦磷酸酯脫羧酶(MPD)(以及任選地IPP異構(gòu)酶)的核苷酸序列的異源核酸遺傳修飾的細(xì)胞。親代宿主細(xì)胞的一個(gè)例子是用包含SEQ ID NO2和SEQID NO4所示核苷酸序列的構(gòu)建物遺傳修飾的大腸桿菌細(xì)胞。親代宿主細(xì)胞的另一個(gè)例子是用包含SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示核苷酸序列的構(gòu)建物遺傳修飾的大腸桿菌細(xì)胞。
在一些實(shí)施方式中，親代宿主細(xì)胞是用一種或多種包含編碼甲羥戊酸激酶(MK)、磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)和甲羥戊酸焦磷酸酯脫羧酶(MPD)(以及任選地異戊烯焦磷酸酯異構(gòu)酶)的核苷酸序列的異源核酸遺傳修飾的細(xì)胞；并在包含甲羥戊酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)親代宿主細(xì)胞。
在其它實(shí)施方式中，親代宿主細(xì)胞是用一種或多種包含編碼乙酰乙酰輔酶A硫解酶、羥甲基戊二酸單酰輔酶A合成酶(HMGS)、羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGR)、MK、PMK和MPD(以及任選地IPP異構(gòu)酶)的核苷酸序列的異源核酸遺傳修飾的細(xì)胞。
在其它實(shí)施方式中，親代宿主細(xì)胞是用一種或多種包含編碼MK、PMK、MPD、IPP異構(gòu)酶和異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列的異源核酸遺傳修飾的細(xì)胞。在其它實(shí)施方式中，親代宿主細(xì)胞是用一種或多種包含編碼乙酰乙酰輔酶A硫解酶、HMGS、HMGR、MK、PMK、MPD、IPP異構(gòu)酶和異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列的異源核酸遺傳修飾的細(xì)胞。親代宿主細(xì)胞的一個(gè)例子是用包含SEQID NO2、SEQ ID NO4和SEQ ID NO5所示核苷酸序列的構(gòu)建物遺傳修飾的大腸桿菌細(xì)胞。另一個(gè)例子是用包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO4和SEQ ID NO5所示核苷酸序列的構(gòu)建物遺傳修飾的大腸桿菌細(xì)胞。
在其它實(shí)施方式中，親代宿主細(xì)胞是具有天然(內(nèi)源性)甲羥戊酸途徑并經(jīng)過(guò)遺傳修飾而使HMG-CoA的水平相對(duì)于未經(jīng)修飾的宿主細(xì)胞提高的細(xì)胞，導(dǎo)致HMG-CoA累積引起生長(zhǎng)抑制。在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，親代細(xì)胞株是經(jīng)遺傳修飾以提高乙酰輔酶A產(chǎn)生的釀酒酵母，其中通過(guò)引入一種或多種遺傳修飾以使磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶、乳酸脫氫酶和丙酮酸脫羧酶功能損傷(例如，通過(guò)敲除)。
在許多實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞(包括親代宿主細(xì)胞和遺傳修飾的宿主細(xì)胞)是單細(xì)胞生物，或在培養(yǎng)基中以單細(xì)胞生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。合適的真核宿主細(xì)胞包括但不限于酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、真菌細(xì)胞和藻類細(xì)胞。合適的真核宿主細(xì)胞包括但不限于巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、芬蘭畢赤酵母(Pichia finlandica)、海藻畢赤酵母(Pichiatrehalophila)、Pichia koclamae、膜醭畢赤酵母(Pichia membranaefaciens)、仙人掌畢赤酵母(Pichia opuntiae)、耐熱畢赤酵母(Pichia thermotolerans)、Pichiasalictaria、Pichia guercuum、Pichia pijperi、Pichia stiptis、甲醇型畢赤酵母(Pichiamethanolica)、畢赤酵母(Pichia sp.)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、酵母屬(Saccharomyces sp.)、多形漢森酵母(Hansenula polymorpha)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces sp.)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、白色念珠菌(Candida albicans)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉素(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、Chrysosporiumlucknowense、鐮孢霉屬(Fusarium sp.)、Fusarium gramineum、鐮孢霉(Fusariumvenenatum)、粗糙鏈孢霉(Neurospora crassa)、萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)等。在一些實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞是除植物細(xì)胞以外的真核細(xì)胞。
在其它實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞。合適的原核細(xì)胞包括但不限于以下多種實(shí)驗(yàn)室株中的任一種大腸桿菌(Escherichia coli)、乳酸菌屬(Lactobacillus sp.)、沙門氏菌屬(Salmonella sp.)、志賀氏菌屬(Shigella sp.)等。例如，參見Carrier等，(1992)J.Immunol.1481176-1181；美國(guó)專利6,447,784；和Sizemore等，(1995)Science 270299-302。本發(fā)明中可使用的沙門氏菌株的例子包括但不限于傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)和鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)。合適的志賀氏菌株包括但不限于弗氏志賀氏菌(Shigella flexneri)、宋內(nèi)志賀氏菌(Shigella sonnei)和Shigella disenteriae。典型地，所述實(shí)驗(yàn)室株是非致病性的。其它合適的細(xì)菌的非限制性例子包括但不限于枯草桿菌(Bacillussubtilis)、普氏假單胞菌(Pseudomonas pudita)、綠膿假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、Pseudomonas mevalonii、球形紅色細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)、莢膜紅色細(xì)菌(Rhodobacter capsulatus)、深紅紅螺菌(Rhodospirillum rubrum)、紅球菌屬(Rhodococcus sp.)等。在一些實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
如上所述，在一些實(shí)施方式中，親代宿主細(xì)胞是用一種或多種包含編碼甲羥戊酸途徑酶的核苷酸序列的異源核酸遺傳修飾的細(xì)胞。為了遺傳修飾親代宿主細(xì)胞使其通過(guò)甲羥戊酸途徑產(chǎn)生IPP和/或通過(guò)甲羥戊酸途徑產(chǎn)生甲羥戊酸，采用已確立的技術(shù)，包括但不限于電穿孔、硫酸鈣沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染等，將一種或多種包含編碼一種或多種甲羥戊酸途徑酶的核苷酸序列的核酸穩(wěn)定地或暫時(shí)引入宿主細(xì)胞。為實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，核酸通常還包含可選擇性標(biāo)記，例如，任何已知的可選擇性標(biāo)記如新霉素抗性、氨芐西林抗性、四環(huán)素抗性、氯霉素抗性、卡那霉素抗性等。
在許多實(shí)施方式中，用于遺傳修飾宿主細(xì)胞使其可通過(guò)甲羥戊酸途徑產(chǎn)生IPP和/或甲羥戊酸的宿主細(xì)胞是包含含有編碼甲羥戊酸途徑酶的核苷酸序列的核酸的表達(dá)載體。類似地，在許多實(shí)施方式中，用于遺傳修飾親代宿主細(xì)胞從而降低HMG-CoA累積誘導(dǎo)的毒性和/或細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的核酸是包含含有編碼一種或多種可緩解HMG-CoA累積誘導(dǎo)的毒性和/或細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的酶的核苷酸序列的核酸的表達(dá)載體。合適的表達(dá)載體包括但不限于桿狀病毒載體、噬菌體載體、質(zhì)粒、噬菌粒、粘粒、fosmid、細(xì)菌人工染色體、病毒載體(例如，基于牛痘病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、SV40、單純皰疹病毒等的病毒載體)、基于P1的人工染色體、酵母質(zhì)粒、酵母人工染色體以及對(duì)特定感興趣宿主(例如大腸桿菌和酵母)特異的任何其它載體。因此，例如，用于表達(dá)甲羥戊酸途徑基因產(chǎn)物的多種表達(dá)載體的任一種中包含編碼甲羥戊酸途徑基因產(chǎn)物的核酸。這些載體包含染色體、非染色體以及合成的DNA序列。
許多合適的表達(dá)載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，許多可商業(yè)獲得。提供以下載體是示例性的；對(duì)于細(xì)菌宿主細(xì)胞pQE載體(Qiagen)、pBluescript質(zhì)粒、pNH載體、λ-ZAP載體(Stratagene)；pTrc99a、pKK223-3、pDR540和pRIT2T(Pharmacia)；對(duì)于真核宿主細(xì)胞pXT1、pSG5(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVLSV40(Pharmacia)。但是，也可使用任何其它質(zhì)?；蚱渌d體，只要它們與宿主細(xì)胞相容。
為了產(chǎn)生包含一種或多種含有編碼甲羥戊酸途徑酶的核苷酸序列的異源核酸的親代宿主細(xì)胞，將編碼甲羥戊酸途徑酶的核苷酸序列插入表達(dá)載體中。表達(dá)載體中編碼甲羥戊酸途徑酶的核苷酸序列可操作地連接于合適的表達(dá)控制序列(例如，啟動(dòng)子)，以指導(dǎo)編碼的基因產(chǎn)物的合成。類似地，為了從親代宿主細(xì)胞產(chǎn)生遺傳修飾的宿主細(xì)胞，使用包含編碼例如HMGS和/或HMGR的核苷酸序列的表達(dá)載體。HMGS和/或HMGR編碼序列可操作地連接于合適的表達(dá)控制序列，以指導(dǎo)編碼的基因產(chǎn)物的合成。根據(jù)所采用的宿主/載體系統(tǒng)，表達(dá)載體中可使用許多合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制元件，包括組成型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)元件、轉(zhuǎn)錄終止子等(例如，參見Bitter等，(1987)Methodsin Enzymology，153516-544)。
用于原核宿主細(xì)胞的合適的啟動(dòng)子包括但不限于細(xì)菌噬菌體T7 RNA聚合物啟動(dòng)子；trp啟動(dòng)子；lac操縱子啟動(dòng)子；雜合啟動(dòng)子，例如lac/tac雜合啟動(dòng)子、tac/trc雜合啟動(dòng)子、trp/lac啟動(dòng)子、T7/lac啟動(dòng)子；trc啟動(dòng)子；tac啟動(dòng)子等；araBAD啟動(dòng)子；體內(nèi)調(diào)節(jié)啟動(dòng)子，例如ssaG啟動(dòng)子或相關(guān)啟動(dòng)子(例如，參見美國(guó)專利公開20040131637)、pagC啟動(dòng)子(Pulkkinen和Miller，JBacterioL，1991173(1)86-93；Alpuche-Aranda等，PNAS，1992；89(21)10079-83)、nirB啟動(dòng)子(Harborne等，(1992)Mol.Micro.62805-2813)等(例如，參見Dunstan等，(1999)Infect.Immun.675133-5141；McKelvie等，(2004)Vaccine223243-3255；和Chatfield等，(1992)Biotechnol.10888-892)；sigma70啟動(dòng)子，例如共有sigma70啟動(dòng)子(例如，參見GenBank登錄號(hào)AX798980、AX798961和AX798183)；穩(wěn)定期啟動(dòng)子，例如dps啟動(dòng)子、spv啟動(dòng)子等；來(lái)源于致病島SPI-2的啟動(dòng)子(例如，例如WO96/17951)；actA啟動(dòng)子(例如，參見Shetron-Rama等，(2002)Infect.Immun.701087-1096)；rpsM啟動(dòng)子(例如，參見Valdivia和Falkow(1996).Mol.Microbiol.22367-378)；tet啟動(dòng)子(例如，參見Hillen，W.和Wissmann，A.(1989)In Saenger，W.和Heinemann，U.(編)，Topics in Molecularand Structural Biology，Protein-Nucleic Acid Interaction.Macmillan，London，UK，第10卷，第143-162頁(yè))；SP6啟動(dòng)子(例如，參見Melton等，(1984)Nucl.AcidsRes.127035-7056)；等等。
合適的真核啟動(dòng)子的非限制性例子包括CMV立即早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟動(dòng)子、來(lái)自逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR和鼠金屬球蛋白-I的啟動(dòng)子。選擇合適的載體和啟動(dòng)子在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。表達(dá)載體還可包含用于翻譯起始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。表達(dá)載體還可包含用于擴(kuò)增表達(dá)的適當(dāng)序列。
此外，在許多實(shí)施方式中，表達(dá)載體包含一個(gè)或多個(gè)可選擇的標(biāo)記基因以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型特性，例如真核細(xì)胞培養(yǎng)物的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，或者例如原核宿主細(xì)胞如大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐西林抗性。
通常，重組表達(dá)載體包括復(fù)制起點(diǎn)和允許宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的可選擇性標(biāo)記，例如大腸桿菌的氨芐西林抗性基因、釀酒酵母TRP1基因等；來(lái)源于高表達(dá)基因的啟動(dòng)子以指導(dǎo)編碼序列的轉(zhuǎn)錄。這些啟動(dòng)子可來(lái)源于編碼糖酵解酶如3-磷酸甘油酸酯激酶(PGK)、α-因子、酸性磷酸酶或熱休克蛋白等的操縱子。
在許多實(shí)施方式中，親代宿主細(xì)胞包含可操作地連接于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的編碼甲羥戊酸途徑酶的核苷酸序列。類似地，在許多實(shí)施方式中，遺傳修飾的宿主細(xì)胞包括可操作地連接于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的編碼HMGR和/或HMGS的核苷酸序列。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是本領(lǐng)域眾所周知的。合適的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括但不限于噬菌體λ的pL；Plac；Ptrp；Ptac(Ptrp-lac雜合啟動(dòng)子)；異丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如lacZ啟動(dòng)子；四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如pBAD(例如，參見Guzman等，(1995)J.Bacteriol.1774121-4130)；木糖-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如Pxyl(例如，參見Kim等，(1996)Gene18171-76)；GAL1啟動(dòng)子；色氨酸啟動(dòng)子；lac啟動(dòng)子；醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、乙醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；棉子糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；熱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如熱誘導(dǎo)型λPL啟動(dòng)子、熱敏感阻抑物控制的啟動(dòng)子(例如，CI857-阻抑性λ-基表達(dá)載體；例如，參見Hoffmann等，(1999)FEMS Microbiol Lett.177(2)327-34)；等等。
在許多實(shí)施方式中，用包含編碼甲羥戊酸途徑基因產(chǎn)物的核苷酸序列的核酸修飾宿主細(xì)胞產(chǎn)生親代宿主細(xì)胞，其中，所述編碼甲羥戊酸途徑基因產(chǎn)物的核苷酸序列可操作地連接于組成型啟動(dòng)子。類似地，在一些實(shí)施方式中，HMGS和/或HMGR編碼序列可操作地連接組成型啟動(dòng)子。原核細(xì)胞中使用的合適的的組成型啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于sigma70啟動(dòng)子，例如共有sigma70啟動(dòng)子。
在酵母中，可使用許多含組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的載體。參見《最新分子生物學(xué)方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，第2卷，1988，Ausubel等編，Greene Publish.Assoc.&Wiley Interscience，第13章；Grant等，1987，《酵母的表達(dá)與分泌載體》(Expression and Secretion Vectors for Yeast)，Methods inEnzymology，Wu&Grossman編，31987，Acad.Press，N.Y.，第153卷，第516-544卷；Glover，1986，《DNA克隆》(DNA Cloning)，第II卷，IRL Press，Wash.，D.C，第3章；和Bitter，1987，《酵母的異源基因表達(dá)》(Heterologous Gene Expressionin Yeast)，Methods in Enzymology，Berger&Kimmel編，Acad.Press，N.Y.，第152卷，第673-684頁(yè)；和《酵母的分子生物學(xué)》(The Molecular Biology of the YeastSaccharomyces)，1982，Strathern等編，Cold Spring Harbor Press，第I和II卷?？墒褂媒M成型酵母啟動(dòng)子如ADH或LEU2或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子如GAL(《酵母克隆》(Cloning in Yeast)，第3章，R.Rothstein InDNA Cloning第11卷，A PracticalApproach，DM Glover編，1986，IRL Press，Wash.，D.C.)。或者，可使用促進(jìn)外源DNA序列整合進(jìn)入酵母染色體的載體。
當(dāng)親代宿主細(xì)胞經(jīng)遺傳修飾產(chǎn)生兩種或多種甲羥戊酸途徑酶時(shí)，在一些實(shí)施方式中，編碼兩種或多種酶的核苷酸序列可各自包含在獨(dú)立的表達(dá)載體上。當(dāng)宿主細(xì)胞經(jīng)遺傳修飾表達(dá)一種或多種甲羥戊酸途徑酶時(shí)，在一些實(shí)施方式中，編碼一種或多種甲羥戊酸途徑酶的核苷酸序列在單個(gè)表達(dá)載體上。當(dāng)編碼一種或多種甲羥戊酸途徑酶的核苷酸序列包含在單個(gè)表達(dá)載體上時(shí)，在一些實(shí)施方式中，核苷酸序列將可操作地連接于共同控制元件(例如，啟動(dòng)子)，例如，共同控制元件控制單個(gè)表達(dá)載體上所有編碼甲羥戊酸途徑酶的核苷酸序列的表達(dá)。
當(dāng)編碼甲羥戊酸途徑酶的核苷酸序列包含在單個(gè)表達(dá)載體上時(shí)，在一些實(shí)施方式中，所述核苷酸序列將可操作地連接于不同的控制元件(例如，啟動(dòng)子)，例如不同的控制元件分別控制在單個(gè)表達(dá)載體上的各個(gè)編碼甲羥戊酸途徑酶的核苷酸序列的表達(dá)。
當(dāng)用一種或多種包含編碼可緩解HMG-CoA累積誘導(dǎo)的毒性的酶的核苷酸序列的核酸遺傳修飾親代宿主細(xì)胞時(shí)，在一些實(shí)施方式中，所述酶將編碼在兩個(gè)不同(獨(dú)立)的表達(dá)構(gòu)建物中。例如，在一些實(shí)施方式中，在相同啟動(dòng)子的控制下，HMGR由高拷貝質(zhì)粒表達(dá)，而HMGS由低拷貝質(zhì)粒表達(dá)。在其它實(shí)施方式中，HMGR和HMGS由類似拷貝數(shù)的質(zhì)粒表達(dá)，表達(dá)HMGR的啟動(dòng)子強(qiáng)于HMGS。當(dāng)用一種或多種包含編碼可緩解HMG-CoA累積誘導(dǎo)的毒性的酶的核苷酸序列的核酸遺傳修飾親代宿主細(xì)胞時(shí)，在一些實(shí)施方式中，所述酶編碼在單個(gè)表達(dá)構(gòu)建物上。例如，在一些實(shí)施方式中，HMGR和HMGS將在單個(gè)啟動(dòng)子的控制下由單個(gè)質(zhì)粒表達(dá)，但HMGR的工程化轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定性高于HMGS。
當(dāng)編碼可緩解HMG-CoA累積誘導(dǎo)的毒性的酶的核苷酸序列包含在單個(gè)表達(dá)構(gòu)建物中時(shí)，在一些實(shí)施方式中，所述核苷酸序列可操作地連接于不同的控制元件(例如，啟動(dòng)子)，例如，不同的控制元件分別控制在單個(gè)表達(dá)構(gòu)建物上的各個(gè)可緩解HMG-CoA累積誘導(dǎo)的毒性的酶的表達(dá)。例如，在一些實(shí)施方式中，HMGR和HMGS由單個(gè)質(zhì)粒表達(dá)，表達(dá)HMGR的啟動(dòng)子強(qiáng)于HMGS。
編碼甲羥戊酸途徑酶的核苷酸序列編碼MEV途徑基因產(chǎn)物的核苷酸序列是本領(lǐng)域已知的，可采用任何已知的編碼MEV途徑基因產(chǎn)物的核苷酸序列來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明遺傳修飾的宿主細(xì)胞。例如，編碼乙酰乙酰輔酶A硫解酶、HMGS、HMGR、MK、PMK、MPD和IDI的核苷酸序列是本領(lǐng)域已知的。下面是已知的編碼MEV途徑基因產(chǎn)物的核苷酸序列的非限制性例子，各個(gè)MEV途徑酶之后的括號(hào)里是GenBank登錄號(hào)和生物體乙酰乙酰輔酶A硫解酶(NC_000913 REGION232413 L..2325315；大腸桿菌)、(D49362；脫氮副球菌(Paracoccus denitrificans))和(L20428；釀酒酵母)；HMGS(NC 001145.互補(bǔ)19061..20536；釀酒酵母)、(X96617；釀酒酵母)、(X83882；擬南芥(Arabidopsis thaliana))、(AB037907；Kitasatospora griseola)和(BT007302；智人(Homo sapiens))；HMGR(NM_206548；黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster))、(NM_204485；紅原雞(Gallus gallus))、(AB015627；鏈霉菌屬KO-3988)、(AF542543；野生煙草(Nicotiana attenuate))、(AB037907；Kitasatosporagriseola)、(AX128213，提供編碼截短HMGR的序列；釀酒酵母)和(NC_001145互補(bǔ)(115734..118898；釀酒酵母))；MK(L77688；擬南芥)和(X55875；釀酒酵母)；PMK(AF429385；橡膠樹(Hevea brasiliensis))、(NM_006556；智人)、(NC_001145.互補(bǔ)712315..713670；釀酒酵母)；MPD(X97557；釀酒酵母)、(AF290095；屎腸球菌(Enterococcus faecium))和(U49260；智人)；以及IDI(NC_000913，3031087..3031635；大腸桿菌)和(AF082326；雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis))。
在一些實(shí)施方式中，HMGR編碼區(qū)如SEQ ID NO13所示，編碼缺少野生型HMGR跨膜區(qū)的截短形式的HMGR(“tHMGR”)。HMGR的跨膜區(qū)包含酶的調(diào)節(jié)部分，并且沒(méi)有催化活性。
可以本領(lǐng)域已知的各種方式改變?nèi)魏我阎狹EV途徑酶的編碼序列，以在所編碼的酶的氨基酸序列中產(chǎn)生定向改變。變體MEV途徑酶的氨基酸通?；绢愃朴谌魏我阎狹EV途徑酶的氨基酸序列，即至少一個(gè)氨基酸不同、至少2個(gè)、至少5個(gè)、至少10個(gè)或至少20個(gè)氨基酸不同，但通常不多于約50個(gè)氨基酸。序列改變可以是取代、插入或刪除。例如，如下所述，可改變核苷酸序列，產(chǎn)生特定宿主細(xì)胞的密碼子偏倚。此外，可引入一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列差異，在經(jīng)編碼的蛋白質(zhì)中形成保守氨基酸改變。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)表達(dá)改變的HMGS或HMGR蛋白質(zhì)或兩者可實(shí)現(xiàn)HMGS和HMGR的所需相對(duì)水平以及HMG-CoA的非毒性水平。
異戊烯基轉(zhuǎn)移酶在一些實(shí)施方式中，遺傳修飾本發(fā)明遺傳修飾的宿主細(xì)胞以包含一種或多種含有編碼一種或多種甲羥戊酸途徑酶的核苷酸序列的核酸，如上所述；以及含有編碼異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列的核酸。
異戊烯基轉(zhuǎn)移酶是一大類催化IPP連續(xù)縮合形成各種鏈長(zhǎng)度異戊烯二磷酸酯的酶。合適的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶包括催化IPP與烯丙型引物底物縮合形成類異戊二烯化合物的酶，所述類異戊二烯化合物具有約2-6000個(gè)異戊二烯單元或更多，例如2個(gè)異戊二烯單元(牻牛兒基焦磷酸酯合酶)、3個(gè)異戊二烯單元(法呢基焦磷酸酯合酶)、4個(gè)異戊二烯單元(牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸酯合酶)、5個(gè)異戊二烯單元、6個(gè)異戊二烯單元(十六烷基焦磷酸酯合酶)、7個(gè)異戊二烯單元、8個(gè)異戊二烯單元(八氫番茄紅素合酶、八異戊烯焦磷酸酯合酶)、9個(gè)異戊二烯單元(九異戊烯焦磷酸酯合酶)、10個(gè)異戊二烯單元(十異戊烯焦磷酸酯合酶)、約10-15個(gè)異戊二烯單元、約15-20個(gè)異戊二烯單元、約20-25個(gè)異戊二烯單元、約25-30個(gè)異戊二烯單元、約30-40個(gè)異戊二烯單元、約40-50個(gè)異戊二烯單元、約50-100個(gè)異戊二烯單元、約100-250個(gè)異戊二烯單元、約250-500個(gè)異戊二烯單元、約500-1000個(gè)異戊二烯單元、約1000-2000個(gè)異戊二烯單元、約2000-3000個(gè)異戊二烯單元、約3000-4000個(gè)異戊二烯單元、約4000-5000個(gè)異戊二烯單元、或約5000-6000個(gè)異戊二烯單元或更多。
合適的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶包括但不限于E-異戊二烯二磷酸酯合酶，包括但不限于牻牛兒基二磷酸酯(GPP)合酶、法呢基二磷酸酯(FPP)合酶、牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯(GGPP)合酶、六異戊烯基二磷酸酯(HexPP)合酶、七異戊烯基二磷酸酯(HepPP)合酶、八異戊烯基(OPP)二磷酸酯合酶、茄呢酰二磷酸酯(SPP)合酶、十異戊烯基二磷酸酯(DPP)合酶、糖膠合酶和杜仲膠合酶；以及Z-異戊二烯基二磷酸酯合酶，包括但不限于九異戊烯基二磷酸酯(NPP)合酶、十一異戊烯基二磷酸酯(UPP)合酶、去氫多萜基二磷酸酯合酶、二十異戊烯基二磷酸酯合酶、天然橡膠合酶和其它Z-異戊二烯基二磷酸酯合酶。
來(lái)自多個(gè)物種的許多異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列是已知的，可用于或修飾后用于產(chǎn)生本發(fā)明遺傳修飾的宿主細(xì)胞。編碼異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列是本領(lǐng)域已知的。參見，例如，人法呢基焦磷酸酯合酶mRNA(GenBank登錄號(hào)J05262；智人)；法呢基二磷酸酯合酶(FPP)基因(GenBank登錄號(hào)J05091；釀酒酵母)；異戊烯基二磷酸酯二甲基烯丙基二磷酸酯異構(gòu)酶基因(J05090；釀酒酵母)；Wang和Ohnuma(2000)Biochim.Biophys.Acta 152933-48；美國(guó)專利6,645,747；擬南芥法呢基焦磷酸酯合酶2(FPS2)/FPP合酶2/法呢基二磷酸酯合酶2(At4g17190)mRNA(GenBank登錄號(hào)NM_202836)；銀杏(Ginkgo biloba)牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶(ggpps)mRNA(GenBank登錄號(hào)AY371321)；擬南芥牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸酯合酶(GGPS1)/GGPP合酶/法呢基轉(zhuǎn)移酶(farnesyltanstransferase)(At4g36810)mRNA(GenBank登錄號(hào)NM_119845)；法呢基、牻牛兒基牻牛兒基、牻牛兒基法呢基、六異戊烯基、七異戊烯基二磷酸酯合酶的Synechococcus elongatus基因(SelF-HepPS)(GenBank登錄號(hào)AB016095)；等等。
密碼子選擇在一些實(shí)施方式中，修飾編碼甲羥戊酸途徑酶的核苷酸序列，使這些核苷酸序列反映特定宿主細(xì)胞的密碼子偏好。例如，在一些實(shí)施方式中，可修飾核苷酸序列產(chǎn)生酵母密碼子偏好。例如，參見Bennetzen和Hall(1982)J.Biol.Chem.257(6)3026-3031。作為另一個(gè)非限制性的例子，在其它實(shí)施方式中，修飾核苷酸序列產(chǎn)生大腸桿菌密碼子偏好。例如，參見Gouy和Gautier(1982)NucleicAcids Res.10(22)7055-7074；Eyre-Walker(1996)Mol.Biol.Evol.13(6)864-872。也可參見Nakamura等，(2000)Nucleic Acids Res.28(1)292。
如上所述，在一些實(shí)施方式中，修飾HMGS編碼序列的密碼子選擇以降低HMGS mRNA的翻譯水平。通過(guò)修飾序列以包含稀有或宿主細(xì)胞不常見的密碼子，可實(shí)現(xiàn)通過(guò)修飾密碼子選擇而降低HMGS mRNA的翻譯水平。可獲得許多生物體的密碼子表，這些密碼子表總結(jié)了特定生物體利用特定密碼子編碼氨基酸的時(shí)間百分?jǐn)?shù)。某些密碼子比其它“稀有”密碼子更常用。序列中使用“稀有”密碼子通常能降低其翻譯速率。因此，例如，通過(guò)引入一個(gè)或多個(gè)稀有密碼子修飾編碼序列可影響翻譯速率，但不會(huì)影響已翻譯酶的氨基酸序列。例如，編碼精氨酸的有6個(gè)密碼子CGT、CGC、CGA、CGG、AGA和AGG。在大腸桿菌中，密碼子CGT和CGC(各自在大腸桿菌中編碼大約40％的精氨酸)比密碼子AGG(在大腸桿菌中編碼大約2％的精氨酸)要常用得多。將基因序列中的CGT密碼子變?yōu)锳GG密碼子不會(huì)改變酶的序列，但可能會(huì)降低基因翻譯速率。
其它遺傳修飾在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明遺傳修飾的宿主細(xì)胞指經(jīng)過(guò)以下修飾的宿主細(xì)胞遺傳修飾以包含一種或多種含有編碼可緩解HMG-CoA累積誘導(dǎo)的毒性的酶的核苷酸序列的核酸；以及進(jìn)一步遺傳修飾以提高萜生物合成途徑中間體產(chǎn)生，和/或進(jìn)一步遺傳修飾以提高類異戊二烯或類異戊二烯前體產(chǎn)生，和/或進(jìn)一步遺傳修飾以使內(nèi)源性萜生物合成途徑基因功能損傷。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“功能損傷”指遺傳修飾核酸，導(dǎo)致該核酸編碼的基因產(chǎn)物的產(chǎn)量低于正常水平，和/或沒(méi)有功能。與親代菌株相比，這些遺傳修飾可減少菌株單位IPP或甲羥戊酸產(chǎn)率(每個(gè)細(xì)胞的產(chǎn)量)，但HMG-CoA誘導(dǎo)的毒性的緩解將使細(xì)胞密度增加，從而培養(yǎng)物總產(chǎn)率(單位產(chǎn)率乘以培養(yǎng)物的細(xì)胞密度)將增加。
提高內(nèi)源性萜生物合成途徑中間體產(chǎn)量的遺傳修飾包括但不限于導(dǎo)致宿主細(xì)胞中磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶水平和/或活性降低的遺傳修飾。通過(guò)增加乙酰輔酶A的細(xì)胞內(nèi)濃度而增加類異戊二烯生物合成途徑中間體的細(xì)胞內(nèi)濃度。大腸桿菌將大量的醋酸酯形式的細(xì)胞內(nèi)乙酰輔酶A分泌入培養(yǎng)基中。編碼磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(pta，負(fù)責(zé)乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化形成醋酸酯的第一個(gè)酶)的基因的缺失將減少醋酸酯分泌。降低原核宿主細(xì)胞中磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶的水平和/或活性的遺傳修飾是特別有用的，其中，親代宿主細(xì)胞是用包含編碼一種或多種MEV途徑基因產(chǎn)物的核苷酸序列的核酸遺傳修飾的宿主細(xì)胞。
因?yàn)橐阴］o酶A同時(shí)是HMG-CoA合成過(guò)程中乙酰乙酰輔酶A硫解酶和HMGS的反應(yīng)物，在一些宿主細(xì)胞中，細(xì)胞內(nèi)乙酰輔酶A量的增加將導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)HMG-CoA量的增加，HMG-CoA量的增加又將導(dǎo)致毒性作用。因此，降低磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶總活性的遺傳修飾由于HMG-CoA的累積，將導(dǎo)致生長(zhǎng)速率或最終細(xì)胞密度降低，產(chǎn)生可用本發(fā)明方法修飾的親代菌株?；蛘?，增加磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶總活性的遺傳修飾可用于克服HMG-CoA累積導(dǎo)致的毒性作用。
在一些實(shí)施方式中，導(dǎo)致原核宿主細(xì)胞中磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶水平降低的遺傳修飾是使原核宿主細(xì)胞編碼磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶的內(nèi)源性pta基因功能損傷的遺傳突變?？梢远喾N方式使pta基因功能損傷，包括插入可動(dòng)遺傳因子(例如，轉(zhuǎn)座子等)；刪除所有或部分基因，導(dǎo)致不形成基因產(chǎn)物、或產(chǎn)物被截短且在將乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為醋酸酯的過(guò)程中沒(méi)有功能；基因突變，導(dǎo)致不形成基因產(chǎn)物、產(chǎn)物被截短且在將乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為醋酸酯的過(guò)程中沒(méi)有功能；刪除或突變一個(gè)或多個(gè)控制pta基因表達(dá)的控制元件，導(dǎo)致不產(chǎn)生基因產(chǎn)物；等等。
在一些實(shí)施方式中，刪除了遺傳修飾宿主細(xì)胞的內(nèi)源性pta基因?？墒褂萌魏蝿h除基因的方法。pta基因刪除方法的一個(gè)非限制性例子是使用λRed重組系統(tǒng)。Datsenko和Wanner(2000)Proc Natl Acad Sci USA 97(12)第6640-5頁(yè)。在一些實(shí)施方式中，pta基因在用包含編碼MK、PMK、MPD和IDI的核苷酸序列的核酸遺傳修飾的宿主細(xì)胞(例如，大腸桿菌)中缺失。在一些實(shí)施方式中，pta基因在用包含編碼MK、PMK、MPD和IPP的核苷酸序列的核酸遺傳修飾的宿主細(xì)胞(例如，大腸桿菌)中缺失。在一些實(shí)施方式中，pta基因在用包含編碼MK、PMK、MPD、IPP和異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列的核酸遺傳修飾的宿主細(xì)胞(例如，大腸桿菌)中缺失。
增加乙酰輔酶A細(xì)胞內(nèi)水平的其它修飾包括但不限于降低細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶總活性的修飾，降低細(xì)胞內(nèi)乙酸激酶總活性的修飾，降低細(xì)胞內(nèi)醇脫氫酶總活性的修飾，阻斷三羧酸循環(huán)的修飾，例如那些降低2-酮戊二酸脫氫酶總活性的修飾，或阻斷氧化磷酸化作用的修飾，例如那些降低(F1F0)H+-ATP合酶總活性的修飾，或它們的組合。
降低乙酰輔酶A細(xì)胞內(nèi)水平的其它修飾包括但不限于增加細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶總活性的修飾，增加細(xì)胞內(nèi)乙酸激酶總活性的修飾，和增加細(xì)胞內(nèi)醇脫氫酶總活性的修飾，或它們的組合。
在一些實(shí)施方式中，親代宿主細(xì)胞是如上所述遺傳修飾以增加HMG-CoA水平的宿主細(xì)胞；進(jìn)一步遺傳修飾導(dǎo)致內(nèi)源性DXP生物合成途徑基因功能損傷。這種遺傳修飾的宿主細(xì)胞可用于篩選使HMG-CoA轉(zhuǎn)化為甲羥戊酸的酶，如下詳細(xì)所述，因?yàn)榧?xì)胞依賴甲羥戊酸途徑產(chǎn)生所需的類異戊二烯可加劇HMG-CoA的毒性。
在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明遺傳修飾的宿主細(xì)胞指經(jīng)過(guò)以下修飾的宿主細(xì)胞遺傳修飾以包含一種或多種含有編碼DXP生物合成途徑基因產(chǎn)物的核苷酸序列的核酸；以及進(jìn)一步遺傳修飾導(dǎo)致內(nèi)源性MEV生物合成途徑基因功能損傷。若出于技術(shù)原因，能夠在天然利用甲羥戊酸途徑產(chǎn)生類異戊二烯的生物體中非常輕易地篩選出與HMG-CoA毒性有關(guān)的酶時(shí)，這種宿主細(xì)胞是有用的。
在一些實(shí)施方式中，當(dāng)本發(fā)明遺傳修飾的宿主細(xì)胞是用包含編碼一種或多種MEV途徑基因產(chǎn)物的核苷酸序列的核酸遺傳修飾的原核宿主細(xì)胞時(shí)，可進(jìn)一步遺傳修飾宿主細(xì)胞，以使一種或多種內(nèi)源性DXP途徑基因功能損傷?？砂l(fā)生功能損傷的DXP途徑基因包括一種或多種編碼任何以下DXP基因產(chǎn)物的基因1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸酯合酶、1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸酯還原酮異構(gòu)酶(reductoisomerase)、4-二磷酸胞苷基(diphosphocytidyl)-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇合酶、4-二磷酸胞苷基-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇激酶、2C-甲基-D-赤蘚糖醇2，4-環(huán)二磷酸酯合酶和1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸酯合酶。
可以多種方式使內(nèi)源性DXP途徑基因功能損傷，包括插入可動(dòng)遺傳因子(例如，轉(zhuǎn)座子等)；刪除所有或部分基因，導(dǎo)致不形成基因產(chǎn)物、或產(chǎn)物被截短且沒(méi)有酶活性；基因突變，導(dǎo)致不形成基因產(chǎn)物、產(chǎn)物被截短且沒(méi)有酶功能；刪除或突變一個(gè)或多個(gè)控制基因表達(dá)的控制元件，導(dǎo)致不產(chǎn)生基因產(chǎn)物；等等。
包含本發(fā)明遺傳修飾宿主細(xì)胞的組合物本發(fā)明還提供包含本發(fā)明遺傳修飾宿主細(xì)胞的組合物。本發(fā)明組合物包含本發(fā)明遺傳修飾的宿主細(xì)胞；并且在一些實(shí)施方式中還包含一種或多種其它成分，這些成分的選擇部分地基于遺傳修飾宿主細(xì)胞的特定用途。合適的成分包括但不限于鹽；緩沖劑；穩(wěn)定劑；蛋白酶抑制劑；細(xì)胞膜和/或細(xì)胞壁保存化合物，例如甘油、二甲亞砜等；適合細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)；等等。
核酸本發(fā)明提供包含編碼HMGS和/或HMGR的核苷酸序列的核酸，其中，當(dāng)所述核酸被引入包含或遺傳修飾以包含(核酸)的親代宿主細(xì)胞時(shí)，可緩解HMG-CoA累積誘導(dǎo)的毒性或生長(zhǎng)抑制。因此，當(dāng)本發(fā)明核酸被引入顯示HMG-CoA累積誘導(dǎo)的毒性的宿主細(xì)胞中時(shí)，可緩解HMG-CoA累積誘導(dǎo)的毒性或生長(zhǎng)抑制。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明核酸包含可操作地連接于強(qiáng)啟動(dòng)子的編碼HMGR的核苷酸序列。
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明核酸是包含編碼HMGR的核苷酸序列的表達(dá)構(gòu)建物。在一些實(shí)施方式中，表達(dá)構(gòu)建物是用于在原核細(xì)胞中合成經(jīng)編碼的HMGR的構(gòu)建物。在一些實(shí)施方式中，表達(dá)構(gòu)建物是用于在真核細(xì)胞中合成經(jīng)編碼的HMGR的構(gòu)建物。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明核酸包含編碼HMGR的核苷酸序列，其中，所述核酸是中等拷貝數(shù)的質(zhì)粒。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明核酸包含編碼HMGR的核苷酸序列，其中，所述核酸是高拷貝數(shù)的質(zhì)粒。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明核酸包含可操作地連接于強(qiáng)啟動(dòng)子的編碼HMGR的核苷酸序列，其中，所述核酸是高拷貝數(shù)的質(zhì)粒。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明核酸包含可操作地連接于強(qiáng)啟動(dòng)子的編碼HMGR的核苷酸序列，其中，所述核酸是中等拷貝數(shù)的質(zhì)粒。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明核酸包含在中等拷貝數(shù)質(zhì)粒上可操作地連接于弱啟動(dòng)子的編碼HMGR的核苷酸序列。
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明核酸包含編碼融合蛋白的核苷酸序列，所述融合蛋白包含可操作地連接于HMGR的乙酰乙酰輔酶A硫解酶。在一些實(shí)施方式中，通過(guò)將乙酰乙酰輔酶A硫解酶與HMGR的編碼序列相連產(chǎn)生編碼乙酰乙酰輔酶A/HMGR融合蛋白的核酸。在一些實(shí)施方式中，融合蛋白是天然存在的。在另一些實(shí)施方式中，融合蛋白是天然存在的，除了Hedl等，((2002)J.Bacteriol.1842116-2122)所述融合蛋白以外。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明核酸包含編碼含有乙酰乙酰輔酶A硫解酶和HMGS的融合蛋白的核苷酸序列。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明核酸包含編碼含有乙酰乙酰輔酶A硫解酶、HMGS和HMGR的融合蛋白的核苷酸序列。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明核酸包含編碼含有HMGS和HMGR的融合蛋白的核苷酸序列。
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明核酸是包含編碼HMGR的核苷酸序列的表達(dá)構(gòu)建物，其中，所述表達(dá)構(gòu)建物是除了以下參考文獻(xiàn)所述表達(dá)構(gòu)建物以外的構(gòu)建物Kato-Emori等，Mol Genet Genomics(2001)265135-42，Learned RM等，PNAS.(1989)862779-83，T.Dairi等，MoI Gen Genet(2000)262957-964，Allen等，Appl Environ.Microbio.(1997).633341-3344，Hedl等，JBacteriol，(2002)，1842116-2122，Jackson等，Org.Lett.(2003)51629-1632，Randolph Y.Hampton等，(1994)Cell，125299-312，Markus Veen等，F(xiàn)EMS YeastRes(2003)487-95，Beach MJ等，J Bacteriol(1989)1712994-3001，Bischoff KM等，Protein Sci(1997)6156-161，F(xiàn)riesen JA等，Biochemistry.(1997)362173-7，F(xiàn)rimpong等，J Biol Chem.(1994)26911478-83，Panda等，Appl MicrobiolBiotechnol(2004)66143-152。
篩選方法本發(fā)明提供了鑒定具有HMG-CoA解毒活性的基因產(chǎn)物的篩選方法；以及鑒定抑制HMG-CoA累積的試劑的方法。在一些實(shí)施方式中，鑒定的基因產(chǎn)物是編碼HMGR，如變體HMGR的基因產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方式中，鑒定的基因產(chǎn)物是編碼變體HMGR的基因產(chǎn)物，其中，變體HMGR可增加細(xì)胞中總的HMGR活性。在另一個(gè)實(shí)施方式中，鑒定的基因產(chǎn)物產(chǎn)生降低HMGS活性的產(chǎn)物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，鑒定的基因產(chǎn)物產(chǎn)生了利用甲羥戊酸作為底物的產(chǎn)物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，鑒定的基因產(chǎn)生了編碼MK的產(chǎn)物。在另一個(gè)實(shí)施例中，鑒定的基因產(chǎn)物可從細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)甲羥戊酸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，鑒定的基因產(chǎn)物是HMG-CoA裂解酶或編碼HMG-CoA裂解酶。在另一個(gè)實(shí)施方式中，鑒定的基因產(chǎn)物編碼琥珀酰-羥甲基戊二酸酯輔酶A-轉(zhuǎn)移酶，或是琥珀酰-羥甲基戊二酸酯輔酶A-轉(zhuǎn)移酶。
為了鑒定可降低HMG-CoA累積誘導(dǎo)的毒性的基因產(chǎn)物，方法通常包括a)將包含編碼候選基因產(chǎn)物的核苷酸序列的外源性核酸引入宿主細(xì)胞，以產(chǎn)生試驗(yàn)細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞產(chǎn)生HMG-CoA的水平可有效抑制宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)；和b)確定候選基因產(chǎn)物的表達(dá)對(duì)試驗(yàn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用(如果有的話)。為了鑒定降低細(xì)胞內(nèi)HMG-CoA累積、和/或降低細(xì)胞內(nèi)HMGS活性水平的試劑，方法通常包括a)試驗(yàn)細(xì)胞與受試試劑相接觸，其中，試驗(yàn)細(xì)胞通過(guò)甲羥戊酸途徑合成甲羥戊酸，并且試驗(yàn)細(xì)胞顯示HMG-CoA累積誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制，和b)確定受試試劑對(duì)HMG-CoA累積誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制的作用(如果有的話)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“確定”指定量和定性測(cè)定，這樣，在本文中術(shù)語(yǔ)“確定”可與“分析”、“測(cè)量”等互換使用。
本發(fā)明篩選方法是基于細(xì)胞的體外試驗(yàn)?？墒褂枚喾N細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，試驗(yàn)所用細(xì)胞是真核細(xì)胞，如上所述。在另一些實(shí)施方式中，試驗(yàn)所用細(xì)胞是原核細(xì)胞，如上所述。
鑒定具有HMG-CoA解毒活性的基因產(chǎn)物的方法本發(fā)明提供了鑒定具有HMG-CoA解毒活性的基因產(chǎn)物的體外篩選方法。所鑒定的基因產(chǎn)物可用于緩解HMG-CoA累積誘導(dǎo)的毒性，因而可用于產(chǎn)生類異戊二烯化合物或類異戊二烯前體的方法中。該方法通常包括a)將包含編碼候選基因產(chǎn)物的核苷酸序列的外源性核酸引入宿主細(xì)胞，以產(chǎn)生試驗(yàn)細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞產(chǎn)生HMG-CoA的水平可有效抑制宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)；和b)確定與宿主細(xì)胞相比，候選基因產(chǎn)物的表達(dá)對(duì)試驗(yàn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用(如果有的話)。由候選基因產(chǎn)物降低HMG-CoA累積誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制的能力確定候選基因產(chǎn)物減少HMG-CoA累積和緩解HMG-CoA累積誘導(dǎo)的毒性的作用。與宿主細(xì)胞相比，試驗(yàn)細(xì)胞中生長(zhǎng)抑制的降低表明，該外源性核酸編碼具有緩解HMG-CoA累積誘導(dǎo)的毒性的充分活性的基因產(chǎn)物。宿主細(xì)胞是產(chǎn)生一種或多種甲羥戊酸途徑中的酶的細(xì)胞，以產(chǎn)生HMG-CoA。在一些實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞是不能通過(guò)甲羥戊酸途徑正常產(chǎn)生甲羥戊酸，并且用一種或多種包含編碼一種或多種甲羥戊酸途徑酶的核苷酸序列的核酸遺傳修飾的細(xì)胞，以使HMG-CoA在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生和累積至生長(zhǎng)抑制水平。在其它實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞是天然產(chǎn)生生長(zhǎng)抑制水平的HMG-CoA、或除了通過(guò)引入一種或多種外源性MEV途徑基因以外的遺傳修飾以達(dá)到這種作用的細(xì)胞。
宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的HMG-CoA的量可抑制宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)，例如，HMG-CoA的細(xì)胞內(nèi)濃度可抑制宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)。典型地，HMG-CoA在宿主細(xì)胞中累積，與不產(chǎn)生HMG-CoA的對(duì)照宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)速率相比，或與在不利于合成生長(zhǎng)抑制量的HMG-CoA的條件下培養(yǎng)的宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)速率相比，累積的量可抑制宿主細(xì)胞生長(zhǎng)至少約10％、至少約20％、至少約30％、至少約40％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％、或至少約90％或更多。在一些實(shí)施方式中，HMG-CoA在宿主細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)累積的量對(duì)宿主細(xì)胞是致死性的，例如誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的死亡。
在一些實(shí)施方式中，顯示HMG-CoA累積誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的宿主細(xì)胞是不能通過(guò)甲羥戊酸途徑正常合成甲羥戊酸或IPP、并且已用一種或多種包含編碼甲羥戊酸途徑酶的核苷酸序列的核酸遺傳修飾的細(xì)胞。例如，在一些實(shí)施方式中，顯示HMG-CoA累積誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的宿主細(xì)胞是用一種或多種包含編碼乙酰乙酰輔酶A硫解酶、HMGS和HMGR的核苷酸序列的核酸遺傳修飾的原核細(xì)胞，其中，細(xì)胞中產(chǎn)生的乙酰乙酰輔酶A硫解酶、HMGS和HMGR的量將導(dǎo)致HMG-CoA累積誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制。
在另一些實(shí)施方式中，顯示HMG-CoA累積誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的宿主細(xì)胞是通過(guò)甲羥戊酸途徑正常合成甲羥戊酸或IPP、并且經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞，使得HMG-CoA細(xì)胞內(nèi)水平增加，導(dǎo)致HMG-CoA累積誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制。
在能使HMG-CoA在細(xì)胞內(nèi)累積至抑制生長(zhǎng)和/或誘導(dǎo)死亡的量的條件下，體外培養(yǎng)試驗(yàn)細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，在誘導(dǎo)編碼HMGS或HMGR的核苷酸序列表達(dá)的誘導(dǎo)物存在下培養(yǎng)試驗(yàn)細(xì)胞，所述核苷酸序列在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下。采用任何檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的標(biāo)準(zhǔn)方法可確定試驗(yàn)細(xì)胞中存在的HMG-CoA的量是否抑制試驗(yàn)細(xì)胞的生長(zhǎng)。例如，當(dāng)細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，通常由光密度的增加測(cè)定生長(zhǎng)；可通過(guò)將產(chǎn)生生長(zhǎng)抑制量HMG-CoA的宿主細(xì)胞液體培養(yǎng)物的光密度(例如，在600nm處)與產(chǎn)生生長(zhǎng)抑制量中間體的相同宿主細(xì)胞液體培養(yǎng)物的光密度進(jìn)行比較，檢測(cè)生長(zhǎng)抑制。也可通過(guò)視覺(jué)觀察接種在含有合適的生長(zhǎng)培養(yǎng)基的瓊脂上的細(xì)胞集落的大小來(lái)檢測(cè)生長(zhǎng)抑制。
本發(fā)明篩選方法包括將外源性核酸引入宿主細(xì)胞，產(chǎn)生試驗(yàn)細(xì)胞，其中，宿主細(xì)胞是當(dāng)產(chǎn)生的HMG-CoA達(dá)到生長(zhǎng)抑制量時(shí)顯示生長(zhǎng)抑制作用的細(xì)胞。當(dāng)將包含編碼HMGR的核苷酸序列的外源性核酸引入宿主細(xì)胞時(shí)，可緩解試驗(yàn)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制。因此，生長(zhǎng)抑制作用的降低表明，外源性核酸編碼HMGR，編碼的HMGR達(dá)到可緩解HMG-CoA累積誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制的水平和/或活性。生長(zhǎng)抑制的降低包括生長(zhǎng)抑制降低至少約20％、至少約30％、至少約40％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約90％或更多。在一些實(shí)施方式中，外源性核酸編碼的HMGR降低生長(zhǎng)抑制作用，使得細(xì)胞生長(zhǎng)速率恢復(fù)至在不產(chǎn)生生長(zhǎng)抑制量HMG-CoA的條件下生長(zhǎng)時(shí)宿主細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)速率。
在一些實(shí)施方式中，例如，當(dāng)外源性核酸是多種外源性核酸(例如，cDNA文庫(kù)、基因文庫(kù)、核酸群，各自編碼具有不同氨基酸序列的HMGR，等等)時(shí)，將外源性核酸引入多種宿主細(xì)胞，形成多種試驗(yàn)細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，在能使HMG-CoA在細(xì)胞內(nèi)累積至生長(zhǎng)抑制和/或誘導(dǎo)死亡的量的條件下，試驗(yàn)細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；包含含有編碼HMGR的核苷酸序列的外源性核酸的試驗(yàn)細(xì)胞將比不包含含有編碼HMGR的核苷酸序列的外源性核酸的試驗(yàn)細(xì)胞生長(zhǎng)得快，或者包含含有編碼HMGR的核苷酸序列的外源性核酸的試驗(yàn)細(xì)胞存活，而不包含含有編碼HMGR的核苷酸序列的外源性核酸的試驗(yàn)細(xì)胞將死亡。
在一些實(shí)施方式中，方法還包括從試驗(yàn)細(xì)胞分離外源性核酸，其中，外源性核酸是在本發(fā)明篩選方法中能緩解生長(zhǎng)抑制的核酸。從試驗(yàn)細(xì)胞分離外源性核酸的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。合適的方法包括但不限于本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的堿裂解方法中的任一種。
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明篩選方法還包括進(jìn)一步表征候選基因產(chǎn)物。在這些實(shí)施方式中，從試驗(yàn)細(xì)胞分離包含編碼HMGR的核苷酸序列的外源性核酸；在細(xì)胞中和/或在體外無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄/分離系統(tǒng)中表達(dá)基因產(chǎn)物。在一些實(shí)施方式中，對(duì)外源性核酸進(jìn)行核苷酸序列分析，由核苷酸序列推斷基因產(chǎn)物的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，將基因產(chǎn)物的氨基酸序列與氨基酸序列公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的其它氨基酸序列進(jìn)行比較，以確定與已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列是否存在任何顯著程度的氨基酸序列相同性。此外，在細(xì)胞中和/或在體外無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中表達(dá)基因產(chǎn)物；分析基因產(chǎn)物對(duì)代謝途徑中間體或其它代謝物的作用。
適合引入宿主細(xì)胞以產(chǎn)生試驗(yàn)細(xì)胞的外源性核酸包括但不限于從細(xì)胞分離的天然來(lái)源的核酸；從細(xì)胞分離之前或之后經(jīng)修飾(例如，突變)的天然來(lái)源的核酸；合成核酸，例如，在實(shí)驗(yàn)室里采用標(biāo)準(zhǔn)核酸化學(xué)合成方法合成的核酸，或通過(guò)重組方法合成的核酸；在細(xì)胞中或在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中經(jīng)體外擴(kuò)增的合成或天然來(lái)源的核酸；等等。
適合引入宿主細(xì)胞的外源性核酸包括但不限于基因組DNA；RNA；從細(xì)胞分離的mRNA的互補(bǔ)DNA(cDNA)拷貝；重組DNA；以及諸如采用DNA合成的標(biāo)準(zhǔn)無(wú)細(xì)胞體外方法體外合成的DNA。在一些實(shí)施方式中，外源性核酸是從細(xì)胞(原核細(xì)胞或真核細(xì)胞)制備的cDNA文庫(kù)。在一些實(shí)施方式中，外源性核酸是從細(xì)胞(原核細(xì)胞或真核細(xì)胞)制備的基因組DNA文庫(kù)。
在一些實(shí)施方式中，核酸在引入宿主細(xì)胞之前發(fā)生突變。使核酸突變的方法是本領(lǐng)域公知的，包括已確立的化學(xué)突變方法、輻射誘導(dǎo)的誘變以及合成期間使核酸突變的方法。DNA突變的化學(xué)方法包括使DNA接觸化學(xué)誘變?cè)缂谆撬嵋阴?EMS)、甲磺酸甲酯(MMS)、N-亞硝基脲(ENU)、N-甲基-N-硝基-N’-亞硝基胍、4-硝基喹啉N-氧化物、硫酸二乙酯、苯芘、環(huán)磷酰胺、博來(lái)霉素、三乙醇胺、丙烯酰胺單體、氮芥、長(zhǎng)春新堿、雙環(huán)氧烷烴(例如，雙環(huán)氧丁烷)、ICR-170、甲醛、鹽酸丙卡巴肼、環(huán)氧乙烷、二甲基亞硝胺、7，12二甲基苯蒽、苯丁酸氮芥、六甲基磷酸酰胺、重硫酸鹽等。輻射突變誘導(dǎo)劑包括紫外線輻射、γ-照射、X-射線和快速中子轟擊。使用例如三甲補(bǔ)骨脂素與紫外光也可將突變引入核酸。隨機(jī)或定向插入可動(dòng)DNA因子如轉(zhuǎn)座因子是產(chǎn)生突變的另一種合適的方法。也可在例如采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)如易錯(cuò)PCR的無(wú)細(xì)胞體外系統(tǒng)的擴(kuò)增過(guò)程中將突變引入核酸?？刹捎肈NA改組技術(shù)(例如，外顯子改組、功能區(qū)切換等)體外將突變引入核酸。突變被引入核酸也可以是細(xì)胞中DNA修復(fù)酶缺陷的結(jié)果，例如，預(yù)計(jì)細(xì)胞中存在編碼突變體DNA修復(fù)酶的突變體基因可在細(xì)胞基因組中產(chǎn)生高頻率突變(即約1個(gè)突變/100個(gè)基因-1個(gè)突變/10,000基因)。編碼DNA修復(fù)酶的基因包括但不限于Mut H、Mut S、Mut L和Mut U、和其它物種中的同系物(例如，MSH 1-6、PMS 1-2、MLH 1、GTBP、ERCC-I等)。使核酸突變的方法是本領(lǐng)域公知的，并且任何已知的方法都是適用的。例如，參見Stemple(2004)Nature 51-6；Chiang等，(1993)PCR MethodsAppl 2(3)210-217；Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci USA 9110747-51；以及美國(guó)專利6,033,861和6,773,900。
在許多實(shí)施方式中，將外源性核酸插入表達(dá)載體。適用于原核和真核宿主細(xì)胞的表達(dá)載體是本領(lǐng)域已知的，并且可使用任何合適的表達(dá)載體。合適的表達(dá)載體如上所述。
如上所述，在一些實(shí)施方式中，在其天然環(huán)境中從細(xì)胞或生物體中分離外源性核酸。在一些實(shí)施方式中，從細(xì)胞或生物體分離核酸之前使細(xì)胞或生物體的核酸發(fā)生突變。在其它實(shí)施方式中，體外無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中合成外源性核酸。
適合引入宿主細(xì)胞的外源性核酸包括從與宿主細(xì)胞不同物種的細(xì)胞或生物體分離的核酸。外源性核酸合適的來(lái)源包括但不限于六界中的任何細(xì)胞或生物體，例如細(xì)菌(例如，真細(xì)菌)；古細(xì)菌；原生生物；真菌；植物界；和動(dòng)物界。外源性核酸合適的來(lái)源包括原生生物界類似植物的成員，包括但不限于藻類(例如，綠藻、紅藻、共生藻、藍(lán)細(xì)菌)；原生生物界類似真菌的成員，例如粘菌、水霉等；原生生物界類似動(dòng)物的成員，例如，鞭毛類(例如，裸藻)、類變形蟲(例如，阿米巴)、孢子蟲(例如，頂復(fù)合器門、粘原蟲門、微孢子蟲)和纖毛蟲(例如，草履蟲)。外源性核酸合適的來(lái)源包括真菌界的成員，包括但不限于以下各門的成員擔(dān)子菌門(珊瑚菌；例如蘑菇、鵝膏菌、牛肝菌、Cantherellus等的成員)；子囊菌門(子囊菌，包括例如酵母)；菌藻植物門(地衣)；接合菌門(結(jié)合真菌)；和不完全菌門。外源性核酸合適的來(lái)源包括植物界的成員，包括但不限于任何以下各門的成員苔鮮植物門(例如，苔蘚)、角苔門(例如，金魚藻)、Hepaticophyta(例如，地錢)、石松植物門(例如，石松)、楔葉植物門(例如，木賊)、裸蕨植物門(例如，whisk ferns)、瓶爾小草門、蕨類植物門(例如，厥類)、蘇鐵植物門、Gingkophyta、松柏植物門、買麻藤植物門和被子植物門(例如，顯花植物)。外源性核酸合適的來(lái)源包括動(dòng)物界的成員，包括但不限于任何以下各門的成員海綿動(dòng)物門(海綿動(dòng)物)；扁盤動(dòng)物門；直泳蟲門(海洋無(wú)脊椎動(dòng)物寄生蟲)；菱形蟲門；腔腸動(dòng)物門(珊瑚、?？?、水母、海鰓、海腎、海黃蜂)；櫛水母動(dòng)物門(櫛水母)；扁形動(dòng)物門(扁蟲)；紐形動(dòng)物門(紐形動(dòng)物)；有腭動(dòng)物門(Ngathostomulida)(有腭動(dòng)物)；腹毛動(dòng)物門；輪蟲動(dòng)物門；鰓曳動(dòng)物門；動(dòng)吻動(dòng)物門；鎧甲動(dòng)物門；棘頭動(dòng)物門；內(nèi)肛動(dòng)物門；Nemotoda；線形動(dòng)物門；環(huán)口動(dòng)物門；軟體動(dòng)物門(軟體動(dòng)物)；星蟲動(dòng)物門(星蟲動(dòng)物)；環(huán)節(jié)動(dòng)物門(環(huán)節(jié)動(dòng)物)；緩步動(dòng)物門(緩步動(dòng)物)；有爪動(dòng)物門(有爪動(dòng)物)；節(jié)肢動(dòng)物門(包括以下亞門螯肢動(dòng)物亞門、多足動(dòng)物亞門、六足亞門和甲殼亞門，其中，螯肢動(dòng)物亞門包括例如蜘蛛、肢口綱和海蜘蛛類，多足動(dòng)物亞門包括例如唇足亞綱(蜈蚣)、倍足亞綱(千足蟲)、Paropoda和綜合綱，六足亞門包括昆蟲，甲殼亞門包括蝦、磷蝦、藤壺等；帚蟲動(dòng)物門；外肛動(dòng)物門(苔蘚動(dòng)物)；腕足動(dòng)物門；棘皮動(dòng)物門(例如，海星、海洋雛菊、毛頭星、海膽、海參、海蛇尾、brittle baskets等)；毛顎動(dòng)物門(毛顎動(dòng)物)；半索動(dòng)物門(橡實(shí)蟲)；和脊索動(dòng)物門。脊索動(dòng)物門合適的成員包括任何以下亞門中的成員尾索動(dòng)物亞門(海鞘；包括海鞘綱、Thaliacea和Larvacea)；頭索動(dòng)物亞門(文昌魚)；盲鰻亞門(盲鰻)；脊椎動(dòng)物亞門，其中，脊椎動(dòng)物亞門包括例如以下各綱中的成員八目鰻綱(Petromyzontida)(八目鰻)、軟骨魚綱(軟骨魚)、輻鰭魚綱(輻鰭魚)、Actinista(coelocanths)、肺魚綱(肺魚)、爬行綱(爬行類動(dòng)物，例如蛇、鈍吻鱷、鱷魚、蜥蜴等)、鳥綱(鳥類)；和哺乳綱(哺乳動(dòng)物)。合適的植物包括任何單子葉植物和雙子葉植物。
因此，例如，合適的細(xì)胞包括來(lái)自以下生物體的細(xì)胞，包括但不限于原生動(dòng)物、植物、真菌、藻類細(xì)胞、酵母、爬行動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、哺乳動(dòng)物、海洋微生物、海洋無(wú)脊椎動(dòng)物、節(jié)肢動(dòng)物、等腳動(dòng)物、昆蟲、蜘蛛類動(dòng)物、原始細(xì)菌和真細(xì)菌。
在一些實(shí)施方式中，從取自生物體的組織、從分離自生物體的特定細(xì)胞或細(xì)胞群等分離外源性核酸。例如，當(dāng)生物體是植物時(shí)，在一些實(shí)施方式中，從木質(zhì)部、韌皮部、形成層、葉、根等分離外源性核酸。當(dāng)生物體是動(dòng)物時(shí)，在一些實(shí)施方式中，從特定組織(例如，肺、肝、心臟、腎、腦、脾、皮膚、胚胎組織等)，或特定細(xì)胞型(例如，神經(jīng)元細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、星形細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、胰島細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等)分離外源性核酸。
在一些實(shí)施方式中，外源性核酸是合成核酸。在一些實(shí)施方式中，合成核酸包含編碼變體HMGR，例如與天然來(lái)源的HMGR或其它親代HMGR在氨基酸序列上有一個(gè)或多個(gè)氨基酸不同的HMGR的核苷酸序列。在一些實(shí)施方式中，與天然來(lái)源親代HMGR的氨基酸序列相比，變體HMGR在氨基酸序列上有一個(gè)氨基酸、兩個(gè)氨基酸、三個(gè)氨基酸、四個(gè)氨基酸、五個(gè)氨基酸、六個(gè)氨基酸、七個(gè)氨基酸、八個(gè)氨基酸、九個(gè)氨基酸、或氨基酸、或更多個(gè)氨基酸不同。在一些實(shí)施方式中，與天然來(lái)源親代HMGR的氨基酸序列相比，變體HMGR在氨基酸序列上有約10個(gè)氨基酸到約15個(gè)氨基酸、約15個(gè)氨基酸到約20個(gè)氨基酸、約20個(gè)氨基酸到約25個(gè)氨基酸、約25個(gè)氨基酸到約30個(gè)氨基酸、約30個(gè)氨基酸到約35個(gè)氨基酸、約35個(gè)氨基酸到約40個(gè)氨基酸、約40個(gè)氨基酸到約50個(gè)氨基酸、約50個(gè)氨基酸到約60個(gè)氨基酸或更多個(gè)氨基酸不同。
在一些實(shí)施方式中，變體HMGR由在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下與編碼已知HMGR的核酸雜交的核酸所編碼。在另一些實(shí)施方式中，變體HMGR由在溫和雜交條件下與編碼已知HMGR的核酸雜交的核酸所編碼。在另一些實(shí)施方式中，變體HMGR由在低嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下與編碼已知HMGR的核酸雜交的核酸所編碼。
在一些實(shí)施方式中，采用任何已確立的方法，使包含編碼天然來(lái)源HMGR的核苷酸序列的核酸發(fā)生突變，產(chǎn)生包含編碼變體HMGR的核苷酸序列的核酸。合適的誘變方法包括但不限于化學(xué)突變方法、輻射誘導(dǎo)的誘變以及合成期間使核酸突變的方法，如上所述。因此，例如，使包含編碼天然來(lái)源HMGR的核苷酸序列的核酸接觸化學(xué)誘變劑，如上所述，或經(jīng)歷輻射突變、或經(jīng)歷易錯(cuò)PCR，并將誘變處理的核酸引入如上所述遺傳修飾的宿主細(xì)胞。使用細(xì)菌“增變”株的隨機(jī)誘變方法也是本領(lǐng)域公知的，可用于產(chǎn)生變體HMGR。例如，參見Greener等，“使用大腸桿菌增變株的有效隨機(jī)誘變技術(shù)”(“An EfficientRandom Mutagenesis Technique Using an E.coli Mutator Strain”)，Methods inMolecular Biology，57375-385(1995)。利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的飽和誘變技術(shù)也是本領(lǐng)域公知的，也可以使用。例如，參見美國(guó)專利6,171,820。由緩解HMG-CoA累積引起的生長(zhǎng)抑制的能力來(lái)鑒定包含編碼變體HMGR的核苷酸序列的核酸。
編碼HMGR的核苷酸序列是本領(lǐng)域已知的，可改變?nèi)魏我阎腍MGR編碼核苷酸序列，以產(chǎn)生本發(fā)明方法中使用的合成核酸。
在一些實(shí)施方式中，尤其感興趣的是鑒定酶活性增加、從而降低HMG-CoA累積誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的變體HMGR。與親代HMGR相比，酶活性增加的變體HMGR的酶活性增加至少約10％、至少約20％、至少約30％、至少約40％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約90％、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約5倍、至少約10倍、或至少約25倍、或更多。
鑒定減少HMG-CoA累積的試劑的方法本發(fā)明還提供了鑒定抑制或減少HMG-CoA累積的試劑的體外篩選方法；鑒定降低細(xì)胞中HMGS活性水平的試劑的方法；鑒定抑制HMG-CoA產(chǎn)生的試劑的方法；以及鑒定使HMG-CoA轉(zhuǎn)化為或加速轉(zhuǎn)化為其它化合物的試劑的方法。這些方法通常包括a)使試驗(yàn)細(xì)胞與受試試劑相接觸，其中，試驗(yàn)細(xì)胞通過(guò)甲羥戊酸途徑合成甲羥戊酸，試驗(yàn)細(xì)胞顯示HMG-CoA累積誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制；和b)確定受試試劑對(duì)HMG-CoA累積誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制的作用(如果有的話)。生長(zhǎng)抑制的降低表明，該試劑降低生長(zhǎng)抑制水平的HMG-CoA在細(xì)胞內(nèi)的累積。
抑制或減少細(xì)胞中HMG-CoA累積并促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的試劑可用于增加類異戊二烯化合物的產(chǎn)生，如本文所述。抑制或減少細(xì)胞中HMG-CoA累積的試劑，并降低細(xì)胞中HMGS活性水平的試劑也可用于降低膽固醇生物合成，因而可用于治療多種與高血膽固醇水平有關(guān)的病癥。
術(shù)語(yǔ)“候選試劑”、“受試試劑”、“試劑”、“物質(zhì)”和“化合物”在本文中可互換使用。候選試劑包括多種化學(xué)類型，典型地為合成、半合成或天然來(lái)源的無(wú)機(jī)或有機(jī)分子。候選試劑包括合成或天然化合物大庫(kù)中的試劑。例如，合成化合物庫(kù)可從Maybridge Chemical Co.(Trevillet，Cornwall，UK)、ComGenex(South San Francisco，CA)和MicroSource(New Milford，CT)商業(yè)獲得。稀有候選庫(kù)可從Aldrich(Milwaukee，Wis.)獲得，也可使用?；蛘?，細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物提取物形式的天然化合物庫(kù)可從Pan Labs(Bothell，WA)獲得或可容易地制備。
候選試劑可以是分子量大于50且小于約2,500道爾頓的小的有機(jī)或無(wú)機(jī)化合物。候選試劑可包括與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相互作用所需的官能團(tuán)，特別是氫鍵，至少包括胺、羰基、羥基或羧基，并可包含至少兩個(gè)官能化學(xué)基團(tuán)。候選試劑可包含被一個(gè)或多個(gè)上述官能團(tuán)取代的環(huán)狀碳或雜環(huán)結(jié)構(gòu)和/或芳族或多芳族結(jié)構(gòu)。候選試劑也可以是生物分子，包括肽、糖、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶、它們的衍生物、結(jié)構(gòu)類似物或組合。
本發(fā)明試驗(yàn)包括對(duì)照，合適的對(duì)照包括沒(méi)有受試試劑時(shí)顯示HMG-CoA累積誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制的細(xì)胞。通常，平行給予不同試劑濃度的多種試驗(yàn)混合物，以獲得對(duì)不同濃度的差異性響應(yīng)。典型地，這些濃度中的一個(gè)用作陰性對(duì)照，即零濃度或低于檢測(cè)限水平。
試劑與細(xì)胞接觸的合適的持續(xù)時(shí)間可通過(guò)經(jīng)驗(yàn)確定，通常持續(xù)的時(shí)間足以使試劑進(jìn)入細(xì)胞并使試劑對(duì)HMG-CoA累積誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制具有可檢測(cè)的作用。通常，合適的時(shí)間為10分鐘到24小時(shí)，或約1小時(shí)到約8小時(shí)。
可以許多不同的方式設(shè)計(jì)篩選方法，其中，可采用多種試驗(yàn)構(gòu)型和方案，如本領(lǐng)域所知。例如，可將試驗(yàn)細(xì)胞(顯示HMG-CoA累積誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制的細(xì)胞)接種在多孔板(例如，96孔板、384孔板等)的孔中，在板的各孔中分別加入各種受試試劑。篩選方法可以是自動(dòng)化的。
采用眾所周知的試驗(yàn)，例如臺(tái)盼藍(lán)染色排斥試驗(yàn)、MTT(溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基-2H-四唑鹽)試驗(yàn)等，評(píng)價(jià)候選試劑對(duì)試驗(yàn)中所用細(xì)胞的任何細(xì)胞毒活性。將不顯示細(xì)胞毒活性的試劑視作候選試劑。
感興趣的受試試劑是指與沒(méi)有受試試劑的對(duì)照相比，降低HMG-CoA累積誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制至少約10％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約55％、至少約60％、至少約65％、至少約70％、至少約80％、至少約90％、或更多的試劑。采用標(biāo)準(zhǔn)方法可容易地測(cè)定受試試劑對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制是否具有作用，如上所述。
在一些實(shí)施方式中，受試試劑指降低細(xì)胞中HMGS活性水平的試劑。感興趣的受試試劑指與沒(méi)有受試試劑的對(duì)照相比，可降低HMGS活性水平至少約10％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約55％、至少約60％、至少約65％、至少約70％、至少約80％、至少約90％、或更多的試劑。
采用多種試驗(yàn)方法可容易地測(cè)定受試試劑是否能降低細(xì)胞中HMGS的活性水平。作為一個(gè)非限制性的例子，在來(lái)自受試試劑降低HMG-CoA累積誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的細(xì)胞樣品的細(xì)胞裂解物中測(cè)定HMGS酶活性。HMGS的測(cè)定可通過(guò)以下方法進(jìn)行將過(guò)量乙酰輔酶A和乙酰乙酰輔酶A加入到含有細(xì)胞提取物或純化酶的緩沖溶液(例如，100mM Tris-HCl)中。5分鐘后，終止反應(yīng)(例如，通過(guò)冷凍樣品)，LC-MS測(cè)定產(chǎn)生的HMG-CoA。
作為另一個(gè)例子，測(cè)定細(xì)胞中的HMGS mRNA水平?？刹捎迷S多方法來(lái)測(cè)定核酸的存在和/或細(xì)胞中特定mRNA的水平。可直接測(cè)定mRNA或逆轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行測(cè)定?？赏ㄟ^(guò)常規(guī)技術(shù)，例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增核酸，提供足夠量用于分析。聚合酶鏈反應(yīng)的使用參見Saiki等，(1985)，Science 239487所述；技術(shù)綜述參見Sambrook等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，CSH Press 1989，第14.2-14.33頁(yè)；并且各種PCR方案如許多教科書中所述，包括，例如《PCR方案》(PCR Protocols)J.Bartlett和D.Stirling編，(2003)Humana Press。
擴(kuò)增反應(yīng)中可包含可檢測(cè)的標(biāo)記。合適的標(biāo)記包括熒光染料，例如，異硫氰酸熒光素(FITC)、羅丹明、得克薩斯紅、藻紅蛋白、別藻藍(lán)蛋白、6-羧基熒光素(6-FAM)、2’，7’-二甲氧基-4’，5’-二氯-6-羧基熒光素(JOE)、6-羧基-X-羅丹明(ROX)、6-羧基-2’，4’，7’，4，7-六氯熒光素(HEX)、5-羧基熒光素(5-FAM)或N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA)、放射性標(biāo)記如32P、35S、3H；等等。標(biāo)記可以是兩階段系統(tǒng)，其中擴(kuò)增的DNA與具有高親和結(jié)合配體如親和素、特定抗體等的生物素、半抗原等偶聯(lián)，結(jié)合配體與可檢測(cè)的標(biāo)記偶聯(lián)。標(biāo)記可偶聯(lián)于一個(gè)或兩個(gè)引物?；蛘?，標(biāo)記擴(kuò)增中所使用的核苷酸，以將標(biāo)記加入到擴(kuò)增產(chǎn)物中。
許多測(cè)定樣品中核酸豐度的不同方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，其中，特別感興趣的方法包括Pietu等，Genome Res.(1996年6月)6492-503；Zhao等，Gene(1995年4月24日)156207-213；Soares，Curr.Opin.Biotechnol.(1997年10月)8542-546；Raval，J.Pharmacol Toxicol Methods(1994年11月)32125-127；Chalifour等，Anal.Biochem(1994年2月1日)216299-304；Stolz&Tuan，Mol.Biotechnol.(1996年12月)6225-230；Hong等，Bioscience Reports(1982)2907；和McGraw，Anal.Biochem.(1984)143298中所述的方法。還感興趣的是WO 97/27317中所述的方法，該專利的內(nèi)容被納入本文作為參考。
可獲得許多測(cè)定特定樣品中蛋白質(zhì)表達(dá)水平的方法。例如，檢測(cè)可利用細(xì)胞染色或具有對(duì)蛋白質(zhì)特異的標(biāo)記抗體的組織切片，根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行。透化處理細(xì)胞以染色胞質(zhì)分子。將感興趣抗體加入到細(xì)胞樣品中，孵育一定時(shí)間以結(jié)合表位，通常至少約10分鐘。抗體可標(biāo)記有放射性同位素、酶、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑或其它標(biāo)記以直接檢測(cè)?；蛘撸墒褂玫诙A段抗體或反應(yīng)物來(lái)擴(kuò)大信號(hào)。這些反應(yīng)物是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，第一抗體可偶聯(lián)生物素，加入辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的親和素作為第二階段反應(yīng)物。最終檢測(cè)采用在過(guò)氧化物酶存在下發(fā)生顏色變化的底物?；蛘?，第二抗體偶聯(lián)熒光化合物，例如熒光素、羅丹明、得克薩斯紅等?？赏ㄟ^(guò)多種方法，包括離解細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)、顯微鏡、發(fā)射成像、閃爍計(jì)數(shù)等來(lái)測(cè)定抗體結(jié)合的存在或不存在。
實(shí)施例給出下面的實(shí)施例是為了提供給本領(lǐng)域普通技術(shù)人員如何制備和使用本發(fā)明的全面描述和說(shuō)明，而不是為了限制本發(fā)明者所認(rèn)為的本發(fā)明的范圍，也不表示下面的實(shí)驗(yàn)是所有或僅僅進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。已盡量確保所用數(shù)字(例如，量、溫度等)的準(zhǔn)確性，但應(yīng)考慮到一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。除非另有說(shuō)明，份數(shù)是重量份數(shù)，分子量是重量平均分子量，溫度是攝氏度、壓力為大氣壓或接近大氣壓?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)縮寫，例如，bp堿基對(duì)；kb千堿基；pl皮升；s或sec秒；min分鐘；h或hr小時(shí)；aa氨基酸；kb，千堿基；bp堿基對(duì)；nt核苷酸；i.m.肌內(nèi)；i.p.腹膜內(nèi)；s.c皮下；等等。
實(shí)施例1體內(nèi)產(chǎn)生甲羥戊酸限制紫穗槐二烯的產(chǎn)生下面的實(shí)施例中使用以下菌株、載體、生長(zhǎng)條件和分析方法。
菌株、質(zhì)粒構(gòu)建和生長(zhǎng)培養(yǎng)基菌株使用都來(lái)自Invitrogen的大腸桿菌菌株TOP10和DH10B進(jìn)行克隆和質(zhì)粒構(gòu)建。使用大腸桿菌DH10B進(jìn)行類異戊二烯產(chǎn)生、生長(zhǎng)和代謝物分析。
生長(zhǎng)培養(yǎng)基為克隆和增殖帶有本文所述各重組載體的大腸桿菌菌株，使用Miller改良的Luria肉湯培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich)，培養(yǎng)基中含有適量抗生素以進(jìn)行質(zhì)粒選擇。對(duì)于生產(chǎn)、生長(zhǎng)和代謝物試驗(yàn)，使工程改造(“遺傳修飾”或“重組”)的大腸桿菌菌株在Miller改良的Luria肉湯培養(yǎng)基(LB)、1％(重量/體積)甘油和適量抗生素中生長(zhǎng)。通過(guò)將1體積2 M DL-甲羥戊酸內(nèi)酯(Sigma-Aldrich)與1.02體積2 M KOH混合，37℃下孵育30分鐘，制備用作培養(yǎng)基補(bǔ)充物的DL-甲羥戊酸(Campos等，(2001)Biochem.J.35359-67)。為維持質(zhì)粒，合適的話，將所需的抗生素加入到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。使用來(lái)自Roche的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和來(lái)自Sigma-Aldrich的L-阿拉伯糖來(lái)引入啟動(dòng)子系統(tǒng)。
質(zhì)粒/操縱子構(gòu)建根據(jù)美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0030148479和20040005678，以及Martin等，(2003)Nat.Biotech.21(7)796-802所述組裝異源甲羥戊酸途徑多基因操縱子。MevT操縱子編碼來(lái)自大腸桿菌的基因atoB，來(lái)自釀酒酵母的HMGS和來(lái)自釀酒酵母的截短形式的HMGR1稱為“tHMGR..”。MevT操縱子編碼負(fù)責(zé)乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為甲羥戊酸的酶(圖2)。采用Invitrogen TOPO TA克隆系統(tǒng)(Carlsbad，CA)，將組裝的操縱子克隆入pCR4 TOPO載體，進(jìn)行序列測(cè)定。根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明，進(jìn)行與pCR4 TOPO載體的連接和大腸桿菌TOP10的轉(zhuǎn)化。
由于生物化學(xué)途徑的表達(dá)常常在特定表達(dá)水平下最佳，因而將MevT操縱子克隆入多種表達(dá)載體來(lái)確定質(zhì)?？截悢?shù)和啟動(dòng)子強(qiáng)度對(duì)克隆的途徑表達(dá)的作用。通過(guò)用SalI限制酶消化空白載體和pCR4 TOPO中的MevT操縱子并用T4 DNA連接酶連接，將MevT操縱子克隆入pBAD24(中等拷貝數(shù)、阿拉伯糖誘導(dǎo)型質(zhì)粒)(Guzman等，(1995)J Bacteriology 1774121-4130)，M.Ehrmann等，(1997)Proc.Natl.Acad ScL USA 9413111-13115)的SalI位點(diǎn)。所得質(zhì)粒稱為pBAD24MevT(SEQ ID NO1)(美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)
發(fā)明者J·D·基斯林, J·D·紐曼, D·J·皮特拉 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)