專(zhuān)利名稱(chēng)：：使用干細(xì)胞的體外技術(shù)的制作方法使用干細(xì)胞的體外技術(shù)交叉參考相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求下面的優(yōu)先權(quán)(a)2004年6月1日提交的、標(biāo)題為"Invitrotechniquesforusewithstemcells"的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)60/576,266禾口(b)2004年7月15日提交的、標(biāo)題為"Indicationsforstemcelluse"的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)60/588,520。這兩個(gè)申請(qǐng)都轉(zhuǎn)讓給本專(zhuān)利申請(qǐng)的受讓人，且并入本文參考。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明通常涉及治療患有血管障礙的人類(lèi)患者的方法和裝置，更具體地涉及促進(jìn)血管發(fā)生(angiogenesis)和/或新血管形成和/或血管生成(vasculogenesis)的方法禾口裝置。發(fā)明背景由于由脂肪沉積或其他血管異常造成的動(dòng)脈狹窄弓I發(fā)了一些動(dòng)脈機(jī)能障礙。這可干擾血流和/或妨礙組織和器官得到充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣。血管障礙是普遍的病癥并且可嚴(yán)重地危及患者的生活質(zhì)量。盡管醫(yī)學(xué)治療中取得了巨大進(jìn)展以及對(duì)動(dòng)脈機(jī)能障礙的血管形成術(shù)的改進(jìn)，諸如冠狀血管的冠狀動(dòng)脈移植、球囊血管成形術(shù)和放置支架，但是很大比例的患者患有動(dòng)脈機(jī)能障礙衍生的疾病。已經(jīng)將內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelialprogenitorcell,EPC)用來(lái)治療患有血管疾病的患者。在這種嚴(yán)重情況中，當(dāng)藥物或直接血管形成術(shù)不再有效或不能使用時(shí)，需要替代的治療。EPC已經(jīng)被應(yīng)用到缺血組織中。EPC有能力分化以形成構(gòu)成血管的細(xì)胞層的內(nèi)皮。這些細(xì)胞涉及重新內(nèi)皮化、新血管化(neovascularization),血管生成以及血管發(fā)生過(guò)程。植入的EPC可成為治療過(guò)程一部分的機(jī)制包括自身再增殖(self-repopulation)、與受損組織的細(xì)胞融合以及分泌細(xì)胞因子與生長(zhǎng)因子。EPC的再增殖及它們分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞使它們能在重新內(nèi)皮化、新血管化、血管生成以及血管發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮功能。最近的證據(jù)表明EPC與受損組織的細(xì)胞的融合增強(qiáng)了組織功能再生。而且，隨著細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的分泌，EPC可影響組織固有細(xì)胞的細(xì)胞生存，并可幫助將干細(xì)胞轉(zhuǎn)移到受損組織。普通的祖細(xì)胞，造血成血管細(xì)胞(hemangioblast)，使內(nèi)皮前體和造血(血細(xì)胞)前體產(chǎn)生。該祖細(xì)胞分化成造血干細(xì)胞和成血管細(xì)胞，成血管細(xì)胞是分化成內(nèi)皮細(xì)胞前體的中胚層前體細(xì)胞。這些細(xì)胞具有增殖、遷移和分化成內(nèi)皮細(xì)胞的能力，但是還沒(méi)有獲得明確的成熟內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志。隨著定型為內(nèi)皮細(xì)胞譜系，在被稱(chēng)為血管生成的過(guò)程中成血管細(xì)胞聚集成靜脈和動(dòng)脈的原始血管叢。通過(guò)血管發(fā)生以及通過(guò)新形成血管的改造(remodeling)和動(dòng)脈生成，隨后將這原始脈管系統(tǒng)細(xì)化到功能網(wǎng)絡(luò)中。已經(jīng)顯示EPC在患有血管損傷或急性心肌梗死(AMI)的患者體內(nèi)可被動(dòng)員(即以增加的數(shù)目從骨髓(BM)遷移進(jìn)入循環(huán))(見(jiàn)下面兩篇作為并入本文參考的文章(a)Gill，M.，S.Dias，等人(2001),"VasculartraumainducesrapidbuttransientmobilizationofVEGFR2(+)AC133(+)endothelialprecursorcells",CirRes88(2):167-74;和(b)Shintani,S.，T.Murohara,等人(2001),"Mobilizationofendothelialprogenitorcellsinpatientswithacutemyocardialinfarction,"Circulation103(23):2776國(guó)9.)通常，使用EPC的目的是促使在缺血或傷疤組織內(nèi)形成天然旁路，從而減輕這些患者的臨床情形。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)已經(jīng)研究了該治療對(duì)增大血流并得到有關(guān)缺血癥狀的減輕的潛力，如通過(guò)患者在生理功能上的改進(jìn)所顯現(xiàn)。已經(jīng)描述了用于移植的自身EPC的多種來(lái)源，包括直接從骨髓(BM)吸取的干細(xì)胞，和BM衍生的外周血液干細(xì)胞。祖細(xì)胞或干細(xì)胞包括能夠增殖、遷移和分化成很多細(xì)胞類(lèi)型的骨髓細(xì)胞。骨髓造血干細(xì)胞特征為"CD34陽(yáng)性"(CD34+)，即表達(dá)CD34標(biāo)記。假設(shè)明確定義的造血祖細(xì)胞群的可塑性使它們能夠橫向分化(trans-differentiate)以響應(yīng)在靶器官中存在的環(huán)境暗示，更特異地，它們轉(zhuǎn)變成內(nèi)皮細(xì)胞。臨床需要骨髓移植是因?yàn)獒t(yī)療操作相對(duì)簡(jiǎn)單。它需要從髂嵴中吸取骨髓并立即重新注射吸取物或選擇的細(xì)胞到梗塞后傷疤中。不過(guò)，該操作是侵入性的，必須在麻醉下進(jìn)行。當(dāng)來(lái)自健康人類(lèi)志愿者的單核血細(xì)胞示出獲得體外內(nèi)皮細(xì)胞樣表型并摻入體內(nèi)毛細(xì)血管中時(shí)，獲得了表明在成人循環(huán)中存在EPC的第一個(gè)i正據(jù)(見(jiàn)Asahara,T.,T.Murohara,等人(1997),"Isolationofputativeprogenitorendothelialcellsforangiogenesis，"Science275(5302):964-7，其并入本文參考)。經(jīng)由胚胎內(nèi)皮祖細(xì)胞和造血干細(xì)胞(HSC)所共享的兩個(gè)抗原CD34和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2(VEGFR-2/KDR)的表達(dá)來(lái)鑒定這些推定的EPC。除了CD34，早期造血祖細(xì)胞還表達(dá)CD133(AC133),其在分化后不再表達(dá)。當(dāng)前，為實(shí)踐目的，在循環(huán)中廣泛接受的EPC的定義是CD34+ZVEGFR-2+或CD133十/VEGFR-2+細(xì)胞。從未治療患者或者從治療患者的血液中可獲得外周血液EPC，以便利用諸如粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞單核細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)的細(xì)胞因子來(lái)增大EPC的遷移。在患有血液性和動(dòng)脈衍生障礙的患者中通常避免該遷移治療。已經(jīng)報(bào)道了諸如HMGCoA還原酶抑制劑(他汀類(lèi)藥物(statins))的治療能提高循環(huán)中EPC的數(shù)量，例如見(jiàn)1、DimmelerS.，等人(2001),"畫(huà)G-CoAreductaseinhibitors(statins)increaseendothelialprogenitorcellsviathePI3-kinase/Aktpathway,"J.Clin.Invest.簡(jiǎn):391-397.2、Hyun-Jae,Hyo-SooKim,等人(2003),"EffectsofintracoronaryinfUsionofperipheralbloodstem-cellsmobilizedwithgranulocyte-colonystimulatingfactoronleftventricularsystolicfimctionandrestenosisaftercoronarystentinginmyocardialinfraction:theMAGICcellrandomizedclinicaltrial,"TheLancet363:751-756.3、BrigitAssmus,VolkerSchachinger等人，(2002),"Transplantationofprogenitorcellsandregenerationenhancementinacutemyocardialinfraction(TOPCARE-AMI),"Circulation106:3009-3017.4、AlexandraAicher，WinfreidBrenner,等人,(2003),"Assessmentofthetissuedistributionoftransplantedhumanendothelialprogenitorcellsbyradioactivelabeling,"Circulation107:2134-2139.這些文章的每一篇都并入本文參考。取出外周血液的操作對(duì)患者來(lái)說(shuō)比BM的移除更簡(jiǎn)單和更方便?？蓪PC從外周血液中分離的事實(shí)是在選擇使用這些細(xì)胞進(jìn)行治療時(shí)的一個(gè)額外重要因素。來(lái)自含有多種細(xì)胞類(lèi)型的BM的祖細(xì)胞的分離在技術(shù)上同樣是更具挑戰(zhàn)性的。在心肌梗塞的老鼠模型中，由EPC和BMC治療的結(jié)果顯示了改進(jìn)的心臟功能、更大的毛細(xì)血管密度、并行管數(shù)量顯著增加、心動(dòng)回聲圖左心室射血分?jǐn)?shù)的提高、缺血區(qū)域瘢痕化的減少以及防止心肌細(xì)胞凋亡。此外，在裸鼠缺血模型中顯示了后肢改善的血流和毛細(xì)血管密度以及肢體喪失率降低。以下作為并入本文參考的文章描述了可與在此所述技術(shù)聯(lián)合使用的技術(shù)(1)Kalka,C.,H,Masuda，等人(2000)."Vascularendothelialgrowthfactor(165)genetransferaugmentscirculatingendothelialprogenitorcellsinhumansubjects."CircRes86(12):1198-202.(2)Kawamoto，A,，H.C.Gwon，等人(2001)."Therapeuticpotentialofexvivoexpandedendothelialprogenitorcellsformyocardialischemia."Circulation103(5):634-7.(3)Kawamoto,A.，T.Tkebuchava,等人(2003)."Intramyocardialtransplantationofautologousendothelialprogenitorcellsfortherapeuticneovascularizationofmyocardialischemia,"Circulation107?！?61-8.(4)Kamihata,H.,H.Matsubara,等人(2001)."Implantationofbonemarrowmononuclearcellsintoischemicmyocardiumenhancescollateralperfusionandregionalfunctionviasidesupplyofangioblasts,angiogenicligands，andcytokines."Circulation104(9):1046-52.(5)Kocher,A.A.,M.D.Schuster,等人(2001)."Neovascularizationofischemicmyocardiumbyhumanbone-marrow-derivedangioblastspreventscardiomyocyteapoptosis,reducesremodelingandimprovescardiacfunction."NatMed7(4):430-6.以下也并入本文參考的文章和書(shū)籍章節(jié)描述了可用來(lái)與在此所述技術(shù)聯(lián)合使用的技術(shù)FlammeraJ等人(2002)."Theimpactofocularbloodflowinglaucoma."ProgressinRetinalandEyeResearch21:359-393.ZarbinMA(2004)."Currentconceptsinthepathogenesisofage-relatedmaculardegeneration."ArchOphthalmol.122(4):598-614.FrankRN(2004)."Diabeticretinopathy."NEnglJMed350:48-58.SingletonJR(2003)."Microvascularcomplicationsofimpairedglucosetolerance."Diabetes52:2867-2873.BahlmannFHet.(2004)."Erythropoietinregulatesendothelialprogenitorcells."Blood103(3):921畫(huà)6.Greenfield,Ed.(2001)."Surgery:Scientificprinciplesandpractice."Lippincot:Philadelphia,chapter107.Ko而enhovenEA等人(2000)."Etiologyandpathophysiologyofchronictransplantdysfunction."TransplantInternat.13(6):385-401.BrowneEZ等人(1986》"Complicationsofskingraftsandpedicleflaps."HandClin.2:353-9.Chen等人(1991)."Fourtypesofvenousflapsforwoundcoverage:aclinicalappraisal."J.Trauma31(9):1286-93.Beatrice等人(2004)Dermatol.Surg.30(3):399.Ferretti等人(2003)."Angiogenesisandnerveregenerationinamodelofhumanskinequivalenttransplant."LifeSci.73:1985-94.Schechner等人(2003)."Engraftmentofavascularizedhumanskinequivalent."FASEBJ.17(15):2250-60.在最近幾年中己經(jīng)在人類(lèi)開(kāi)展研究檢査使用EPC和其它骨髓衍生細(xì)胞治療心肌障礙的潛在好處。近期研究證明急性心肌梗死之后植入自身祖細(xì)胞似乎能限制梗塞后損害。以下臨床試驗(yàn)集中于評(píng)估在心臟病患者體內(nèi)施用骨髓衍生或血液衍生細(xì)胞的安全性和效力的研究。Perin等人進(jìn)行了包括21個(gè)患者(14個(gè)患者在治療組，7個(gè)患者在對(duì)照組)的臨床試驗(yàn)，這些患者接受經(jīng)心內(nèi)膜注射的自身單核BMC(見(jiàn)Perin,E.C,,H.F.Dohmann,等人(2003),"Transendocardial,autologousbonemarrowcelltransplantationforsevere,chronicischemicheartfailure,"Circulation107(18):2294-302，其并入本文參考)。在4個(gè)月時(shí)，射血分?jǐn)?shù)提高，收縮末期體積減小，并且在治療患者注射段中有顯著的機(jī)械性改另一組在患有心肌梗死并進(jìn)行了冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)的六名患者中將自身EPC注射到梗死邊緣區(qū)域。手術(shù)后的三到九個(gè)月，所有患者都健在，并且在四個(gè)名者中整體左心室功能增強(qiáng)。所有六名患者都報(bào)告在運(yùn)動(dòng)能力上有顯著提高。通過(guò)定性分析，心肌灌注掃描報(bào)告六名患者中的五名已經(jīng)獲得顯著改進(jìn)。這一研究結(jié)果表明EPC植入到心臟中很可能誘導(dǎo)血管發(fā)生，從而改善梗塞心肌的灌注(見(jiàn)Stamm,C.，B.Westphal,等人(2003)，"Autologousbone-marrowstem-celltransplantationformyocardialregeneration,"Lancet361(9351):45-6，其并入本文參加)。急性心肌梗死中祖細(xì)胞移植以及再生增強(qiáng)(TOPCARE-AMI)研究涉及在再灌注急性心肌梗死患者梗塞后內(nèi)皮祖細(xì)胞或骨髓細(xì)胞直接循環(huán)到冠狀動(dòng)脈的輸送(見(jiàn)Assmus，B.,V.Schachinger，等人(2002),"TransplantationofProgenitorCellsandRegenerationEnhancementinAcuteMyocardialInfarction(TOPCARE-AMI),"Circulation106(24):009-17，其并入本文參考)。在第一批20名患者中，ll名接受EPC，9名接受BMC。4個(gè)月，祖細(xì)胞移植導(dǎo)致整體左心室射血分?jǐn)?shù)的顯著增加，心動(dòng)回聲圖顯示在梗塞區(qū)域中改善的局部室壁活動(dòng)、減少的收縮末期左心室體積以及與非隨機(jī)化、匹配的參考組相比在梗塞區(qū)域增加的心肌活力。在任何一名患者中沒(méi)有治療不利事件發(fā)生，如心律失?；蚣∷峒っ负图♀}蛋白增加。在BM衍生細(xì)胞和外周血液衍生細(xì)胞之間沒(méi)有差別。由UniversityofPittsburgh的AmitPatel領(lǐng)導(dǎo)的小組所進(jìn)行的研究涉及20名患有嚴(yán)重心力衰竭的患者，對(duì)其中IO名患者用BM衍生EPC注射到冠狀血管中。在隨后的l個(gè)月、3個(gè)月和6個(gè)月，與其他患者相比干細(xì)胞患者的射血分?jǐn)?shù)比率顯著增力[K見(jiàn)AbstractfromAmericanAssociationforThoracicSurgery,Toronto,May2004)。下面并入本文參考的文章也是感興趣的J.Folkman，Y.Shing，J.Biol.Chem.267，10931(1992)w.Brugger，S.Heimfeld，R.J.Berenson,R.Merterlsmann，L.Kanz,N.EnglJ.Med.333,283,(1995)F.Katz，R.W.Tindle,D.R.Sutherland,M.D.Greaves,Leuk.Res.9，191(1985)R.G.Andrews,J.W.Singer,I.D.Bernstein,Blood67,842(1986)Armellino,etal,Biochem.Biochem.Biophys.Res.Commun.187，1579(1992)B.Millauer,S.Wizigmann-Voos，H.Schnurch,R.Martinez,N.P.H.Moller，etal，Cell72,835(1993)J.C.Voyta,D.P.Via,C.E.Butterfieki,B.R,Zetter，J.CellBiol.99，2034(1984)P.J.Newman,M.C.Berndt，J.Gorski,G.C.White,S.Lyman,etal,Science247，1219(19卯)T.N.Sato,Y.Tozawa,U.Deutsch，K.Wolburg-Buchholz,YFujiwara,etal,Nature376,70(1995)H.Schnurch,W.Risau,Development119,957(1993)J.L.Liesveld，K.E.Frediani,A.W.Harbol，J.RDiPersio，C.N.Abboud,Leukemia8,2111(1994).S.Takeshita,L,RZheng,E.Brogi,M.Kearney,L.Q.Pu,etal,J.Clin,Invest.93,662(1994)R.Baffour，J.Berman，J.L.Garb,S.W.Rhee,J.Kaufman，etal，J.Vase.Surg.16,181(1992)J.M.Isner,A.Pieczek,R.Schainfeld,R.Blair,L.Haley,etal,Lancet348,370(1996)Y.Sato，K.Okamura，A.Morimoto，R.Hamanaka,K.Hamanaguchi,etal,Exp.CellRes.204,223(1993)下面同樣并入本文參考的文章也是感興趣的Badorff，C.，R.P.Brandes,等人(2003)."Transdifferentiationofblood-derivedhumanadultendothelialprogenitorcellsintofunctionallyactivecardiomyocytes."Circulation107(7):1024-32.Bhattacharya，V.，P.A.McSweeney,等人(2000)."EnhancedendothelializationandmicrovesselformationinpolyestergraftsseededwithCD34(+)bonemarrowcells."Blood95(2):581-5.Grant,M.B.，W.S.May,等人(2002)."Adulthematopoieticstemcellsprovidefunctionalhemangioblastacitivityduringretinalneovascularization."NatMed8(6):607-12.Hirata,K.,T.S.Li,等人(2003)."Autologousbonemarrowcellimplantationastherapeuticangiogenesisforischemichindlimbindiabeticratmodel."AmJPhysiolHeartCircPhysiol284(1):H66-70.Ikenaga，S.，K.Hamano,等人(2001)."Autologousbonemarrowimplantationinducedangiogenesisandimproveddeterioratedexercisecapacityinaratischemichindlimbmodel."JSurgRes96(2):277-83.Kalka,C.，H.Masuda，等人(2000)."Transplantationofexvivoexpandedendothelialprogenitorcellsfortherapeuticneovascularization."ProcNatlAcadSciUSA97(7):3422-7,Kaushal，S.，GE.Amiel,等人(2001)."Functionalsmall-diameterneovesselscreatedusingendothelialprogenitorcellsexpandedexvivo."NatMed7(9):1035-40.Kornowski,R.,M.B.Leon,等人(2000)."Electromagneticguidanceforcatheter-basedtransendocardialinjection:aplatformforintramyocardialangiogenesistherapy.Resultsinnormalandischemicporcinemodels."JAmCollCardiol35(4):1031-9.Li,R.K.，Z.Q.Jia，等人(1996)."Cardiomyocytetransplantationimprovesheartfunction."AnnThoracSurg62(3):654-60;discussion660-1.Rajnoch，C.，J.C.Chachques,等人(2001),"Cellulartherapyreversesmyocardialdysfunction."JThoracCardiovascSurg121(5):871-8.Schatteman,G.C.,H.D.Hanlon,等人(2000)."Blood-derivedangioblastsaccelerateblood-flowrestorationindiabeticmice."JClinInvest106(4):571-8.Shintani,S.，T.Murohara,等人(2001)."Augmentationofpostnatalneovascularizationwithautologousbonemarrowtransplantation."Circulation103(6):897畫(huà)903.Strauer,B.E.，M.Brehm,等人(2002)."Repairofinfractedmyocardiumbyautologousintracoronarymononuclearbonemarrowcelltransplantationinhumans."Circulation106(15):1913-8.Taylor,D.A.，B,Z.Atkins,等人(1998)."Regeneratingfunctionalmyocardium:improvedperformanceafterskeletalmyoblasttransplantation."NatMed4(8):929-33.Thompson,C.A.，B.A.Nasseri，等人(2003)."Percutaneoustransvenouscellularcardiomyoplasty.Anovelnonsurgicalapproachformyocardialcelltreansplatation."JAmCollCardiol41(11):1964-71.Tomita，S.,R.K.Li，等人(1999)."Autologoustransplantationofbonemarrowcellsimprovesdamagedheartfunction."Circulation100(19Suppl):11247-56.Tomita,S.，D.A.Mickle,等人(2002)."Improvedheartflmctionwithmyogenesisandangiogenesisafterautologousporcinebonemarrowstromalcelltransplantation."JThoracCardiovascSurg123(6):1132-40.Wang等人(2004)."Rosiglitazonefacilitatesangiogenicprogenitorcelldifferentiationtowardendotheliallineage:anewparadigminglitazonepleiotropy,"Circulation109(11):1392-400.Rupp等人(2004)."Statintherapyinpatientswithcoronaryarterydiseaseimprovestheimpairedendothelialprogenitorcelldifferentiationintocardiomyogeniccells."BasicResCardiol.99(l》61-8.Quirici等人(2001)."DifferentiationandexpansionofendothelialcellsfromhumanbonemarrowCD133(+)cells."BrJHaematol.115(1):186-94.DiStefano等人(2002)"Differentgrowthconditionsforperipheralbloodendothelialprogenitors."CardiovascRadiatMed.3(3-4》172-5.Akita等人(2003)."Hypoxicpreconditioningaugmentsefficacyofhumanendothelialprogenitorcellsfortherapeuticneovascularization,"LabInvest.83(l):65-73.Wang等人(2004)."Mechanical,cellular,andmolecularfactors'interacttomodulatecirculatingendothelialcellprogenitors."AmJPhysiolHeartCircPhysiol.286(5):H1985-93.Bahlmann等人(2003)."Endothelialprogenitorcellproliferationanddifferentiationisregulatedbyerythropoietin."KidneyInt.64(5):1648-52.Heeschen等人(2003》"Erythropoietinisapotentphysiologicstimulusforendothelialprogenitorcellmobilization."Blood.102(4》1340-6.Verma等人(2004)."C-reactiveproteinattenuatesendothelialprogenitorcellsurvival,differentiation,andflmction:FurtherevidenceofamechanisticlinkbetweenC-reactiveproteinandcardiovasculardisease."Circulation.109(17):2058隱67.授予Isner等人的美國(guó)專(zhuān)利5,980,887、6，569,428和6,676,937作為參考并入本文，這些專(zhuān)利通常描述了包括用在調(diào)節(jié)血管發(fā)生的方法中的EC祖細(xì)胞的藥物產(chǎn)物，即用于在所選患者和在一些優(yōu)選實(shí)施方案中將血管發(fā)生調(diào)節(jié)物靶向特異位置從而增強(qiáng)或抑止血管形成。例如，EC祖細(xì)胞可用于增強(qiáng)血管發(fā)生或用于輸送血管發(fā)生調(diào)節(jié)物，例如將抗血管發(fā)生物質(zhì)或促血管發(fā)生物質(zhì)分別輸送到病理性血管發(fā)生或功利性血管發(fā)生的位置。另外，在另一實(shí)施方案中，EC祖細(xì)胞可用于誘導(dǎo)受損血管的重新內(nèi)皮化，從而通過(guò)間接抑制平滑肌細(xì)胞增殖來(lái)減少再狹窄。授予Kanz等人的、并入本文參考的美國(guó)專(zhuān)利5，541，103描述了對(duì)患有某種類(lèi)型癌癥的患者進(jìn)行高劑量化療治療。為了便于恢復(fù)，描述了外周血液祖細(xì)胞的離體(exvivo)擴(kuò)增過(guò)程，其中富集CD34+細(xì)胞并將其培養(yǎng)在包含IL-1、IL-3、IL-6、EPO和SCF的培養(yǎng)基中?？蓪⒃撾x體擴(kuò)增的外周血液祖細(xì)胞施用給化療后的癌癥患者。并入本文參考的Itescu的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)2003/0199464描述了治療涉及心肌細(xì)胞缺失的個(gè)體心臟障礙的方法。該方法包括給該個(gè)體施用一定量的能有效促使個(gè)體心臟內(nèi)心肌細(xì)胞增殖的物質(zhì)從而治療該障礙。在一個(gè)實(shí)施方案中，該物質(zhì)是人內(nèi)皮祖細(xì)胞。該申請(qǐng)還描述了確定個(gè)體心肌細(xì)胞對(duì)凋亡敏感性的方法。并入本文參考的Itescu的PCT專(zhuān)利公開(kāi)WO01/94420描述了剌激個(gè)體心肌梗塞損傷組織中血管生成的方法，該方法包含(a)從個(gè)體的一個(gè)位置上移出干細(xì)胞；(b)從這些干細(xì)胞中恢復(fù)內(nèi)皮祖細(xì)胞；(c)將來(lái)自步驟(b)中的內(nèi)皮祖細(xì)胞導(dǎo)入到個(gè)體的不同位置，使得前體遷移到該組織中并刺激該組織的再血管化。可以直接或通過(guò)遷移取出所述干細(xì)胞。在導(dǎo)入個(gè)體之前可擴(kuò)增該內(nèi)皮祖細(xì)胞。描述了在梗死部周?chē)M織中誘導(dǎo)血管發(fā)生的方法。還描述了用于選擇性增強(qiáng)將人骨髓衍生內(nèi)皮細(xì)胞前體運(yùn)輸?shù)接扇毖獡p傷損害的組織的位置的方法，該方法包含(a)將內(nèi)皮祖細(xì)胞施用給個(gè)體；(b)給個(gè)體施用趨化因子使得能夠?qū)?nèi)皮細(xì)胞前體吸引到缺血組織上。還描述了一種用于剌激個(gè)體心肌梗死損傷組織的血管發(fā)生或血管生成的方法，該方法包含將同種異型干細(xì)胞注射到個(gè)體體內(nèi)。還描述了一種用于改進(jìn)已經(jīng)患有心肌梗死的患者的心肌功能的方法，該方法包含任何一種所述方法。還描述了一種用于改進(jìn)已經(jīng)患有心肌梗死的患者的心肌功能的方法，該方法包含將G-CSF或抗-CXCR4抗體注射到個(gè)體體內(nèi)以動(dòng)員內(nèi)皮祖細(xì)胞。授予Gillis的美國(guó)專(zhuān)利5,199,942描述了接受細(xì)胞減數(shù)治療的患者進(jìn)行自身造血細(xì)胞移植的方法，該方法包括(1)在細(xì)胞減數(shù)治療之前從患者的骨髓或外周血液中獲得造血祖細(xì)胞；(2)用選自由白介素-3(IL-3)、青灰因子(SF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-l(IL-l)、GM-CSF/IL-3融合蛋白及其組合所組成的組中的離體生長(zhǎng)因子來(lái)離體擴(kuò)增造血祖細(xì)胞，從而提供包含祖細(xì)胞擴(kuò)增細(xì)胞群的細(xì)胞制品；以及(3)與細(xì)胞減數(shù)治療同步或在其之后將該細(xì)胞制品施用給患者。該方法任選地包括用募集生長(zhǎng)因子將造血祖細(xì)胞募集至外周血液中的初步治療以及用植入生長(zhǎng)因子來(lái)促使細(xì)胞制劑中的造血祖細(xì)胞植入和增殖的后續(xù)治療。本專(zhuān)利還描述了包含細(xì)胞培養(yǎng)基、離體生長(zhǎng)因子和自體血清的造血祖細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基組成。并入本文參考的、授予Shoshan的美國(guó)專(zhuān)利4,656,130描述了膠原包被的細(xì)胞生長(zhǎng)平板，該平板包括用膠原原纖維的存儲(chǔ)穩(wěn)定包被包被的基層。制備該膠原包被的細(xì)胞生長(zhǎng)平板的方法包含將懸浮在蒸餾水中的生物活性膠原原纖維分布到組織培養(yǎng)皿中。其后，將含有該膠原原纖維懸浮液的平皿放置在設(shè)有無(wú)菌氣流和紫外線燈的層流通風(fēng)櫥中。該原纖維沉淀并粘附在平皿底部，水蒸發(fā)到無(wú)菌氣流中并在層流通風(fēng)櫥的排氣處被去除，并且紫外線燈確保所得膠原原纖維薄層是無(wú)菌的并準(zhǔn)備用于活細(xì)胞接種。還可將該方法描述成獲得方便的預(yù)包被細(xì)胞生長(zhǎng)平板，該平板當(dāng)保持在室溫中時(shí)可維持適度的貯藏期限而在細(xì)胞生長(zhǎng)支持屬性上沒(méi)有任何明顯的降低。并入本文參考的、授予Swiderek等人的美國(guó)專(zhuān)利5,932,473描述了用于鹽溶液中含有細(xì)胞粘附促進(jìn)劑的組合物包被的細(xì)胞培養(yǎng)基層。諸如塑料、玻璃或多孔纖維的基層用于0.005-0.5M檸檬酸鹽溶液或硫酸鹽溶液中含有大約5-1000ug/ml的聚-D-賴(lài)氨酸的組合物包被，以在供每平方厘米的基層上提供大約50-500ul的組合物。漂洗該包被的基層以去除外來(lái)雜質(zhì)，并將其干燥以獲得具有增加貯藏期限和/或穩(wěn)定性的被包被的基層。該包被的基層可通過(guò)用諸如酒精的滅菌介質(zhì)進(jìn)行漂洗來(lái)進(jìn)行滅菌。并入本文參考的、授予Septak的美國(guó)專(zhuān)利6,040,182描述了用于在組織培養(yǎng)治療的塑料表面如聚苯乙烯分析平板上促進(jìn)高蛋白結(jié)合能力的方法和材料。并入本文參考的、授予Ozkan的美國(guó)專(zhuān)利4,450,231描述了用以確定免疫復(fù)合物的血清樣本或類(lèi)似物的免疫測(cè)定法。描述了一種方法，該方法包括在塑料基底上產(chǎn)生能粘附在塑料基底上并具有吸收樣本免疫復(fù)合物能力的非蛋白質(zhì)、非離子聚合物的一個(gè)層面，將樣本放置在該層面上并處理該層面以產(chǎn)生免疫復(fù)合物的量的指示。該聚合物可以是聚乙二醇、葡聚糖、聚氯乙烯、聚多元醇或聚乙二醇的加合物。用在該檢定中的產(chǎn)品是由塑料、聚苯乙烯和聚氯乙烯制成的具有孔的平板或試管，并且在該平板孔或在該試管腔內(nèi)具有所述非蛋白質(zhì)、非離子聚合物層的一個(gè)層面。并入本文參考的、Kutryk等人的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)2003/0229393描述了用于產(chǎn)生如支架、支架移植物、合成血管移植物或心臟瓣膜等醫(yī)療設(shè)備的組合物和方法，這些醫(yī)療設(shè)備用整合了抗體、抗體片段或小分子的生物相容性基質(zhì)包被，所述抗體、抗體片段或小分子識(shí)別、結(jié)合和/或與祖細(xì)胞表面抗原相互作用以便在設(shè)備的表面上固定細(xì)胞。該設(shè)備上的所述包被還可能含有化合物和生長(zhǎng)因子，用于促進(jìn)祖內(nèi)皮細(xì)胞在該設(shè)備的表面上加速粘附、生長(zhǎng)及結(jié)合的細(xì)胞分化為成熟和功能性?xún)?nèi)皮細(xì)胞以防止內(nèi)膜超常增生。描述了用于制備所述醫(yī)療設(shè)備、組合物的方法以及治療患有血管疾病如再狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化或其他類(lèi)型脈管梗阻的哺乳動(dòng)物的方法。發(fā)明簡(jiǎn)述本專(zhuān)利申請(qǐng)?jiān)斒隽藦慕M織中分離、分化和擴(kuò)增干細(xì)胞的方法。例如，干細(xì)胞可包括內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)?？蛇x或另外的，該組織可包括人體外周血液。典型地，將該干細(xì)胞移植到供體體內(nèi)或另一個(gè)體體內(nèi)(例如以便于增強(qiáng)血管生成和/或血管發(fā)生和/或新血管化)。本專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)峁┝擞糜讷@得含有適當(dāng)數(shù)量功能性EPC的產(chǎn)品的方案。所述方法包括(a)從組織中提取細(xì)胞亞群；(b)在富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)l-30天(或3—30或4、5、6、7或8天)擴(kuò)增并分化EPC;和域(c)識(shí)別培養(yǎng)物的細(xì)胞組分；(d)將適當(dāng)數(shù)量的EPC移植到患者體內(nèi)。應(yīng)當(dāng)理解的是盡管在此所述一些實(shí)施方案特異性涉及衍生自血液的EPC，但是本發(fā)明的范圍包括使用衍生自多種身體組織的干細(xì)胞的技術(shù)。對(duì)于一些應(yīng)用，該方法包含從供體和/或患者中收集血液樣品、從所述樣品中分離外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞、從單核細(xì)胞級(jí)分中分離出富集CD31的細(xì)胞群和祖細(xì)胞以及在引起存在于細(xì)胞混合液中的造血祖細(xì)胞分化成EPC并進(jìn)行增殖的條件下使這些細(xì)胞生長(zhǎng)。可典型地利用這一離體擴(kuò)增步驟，因?yàn)樵谘h(huán)中EPC的數(shù)量低于0.1X。這一增加階段之后，可將這些細(xì)胞通過(guò)注射植入目標(biāo)器官如患者的冠狀動(dòng)脈或心肌的血管中。因此，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案提供了使用提取血液的方法，包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；和通過(guò)培養(yǎng)第二批細(xì)胞3到30天來(lái)增加密度在1.055到1.068g/ml之間的細(xì)胞的數(shù)量。在一個(gè)實(shí)施方案中，將血細(xì)胞施加到第一梯度，包括將血細(xì)胞施加至lJ包J舌如Ficoll-PaquePlus(TM)(AmershamBiosciences,'Uppsala,Sweden)或Lymph叩rep(TM)(Axis-ShieldpoCAS,Oslo,Norway)或從其它來(lái)源得到的蔗糖和環(huán)氧氯丙烷的共聚物的梯度。在一個(gè)實(shí)施方案中，由技術(shù)人員現(xiàn)場(chǎng)制備該密度梯度。在一個(gè)實(shí)施方案中，將第一批細(xì)胞施加到第二梯度，包括將第一批細(xì)胞施加到包括如OptiPrep(TM)或Nycodenz(TM)(Axis-ShieldpoCAS,Oslo,Norway)的碘克沙醇水溶液的梯度。在一個(gè)實(shí)施方案中，將第一批細(xì)胞施加到第二梯度，包括將第一批細(xì)胞施加到包括如Percoll(TM)(AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden)的聚乙烯吡咯烷酮包被的硅膠的梯度上。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案進(jìn)一步提供了使用提取的干細(xì)胞的方法，包括將包括干細(xì)胞的組織施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；將第二批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.068g/ml之間的第三批細(xì)胞的第三梯度；和通過(guò)培養(yǎng)第三批細(xì)胞3到30天來(lái)增加密度在1.055到1.068g/ml之間的細(xì)胞的數(shù)量。在一個(gè)實(shí)施方案中，第三梯度適于選擇密度在1.059到1.068g/nil之間的細(xì)胞，并且其中將第二批細(xì)胞施加到第三梯度包括選擇密度在1.059到1.068g/ml之間的細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，還提供了使用提取的血液的方法，包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；和在包括(例如包被有)血漿和/或抗體的表面上溫育第二批細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，另外提供了使用提取的血液的方法，包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；禾口在包括促生長(zhǎng)分子(growth-enhancingmolecule)而非膠原或纖連蛋白的表面上溫育第二批細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，溫育第二批細(xì)胞包括在除了促生長(zhǎng)分子外還包括膠原和纖連蛋白至少其中一種的表面上溫育第二批細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，還另外提供了使用提取的血液的方法，包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；和在包括最高為5%血清(例如沒(méi)有血清、少于1%的血清或在1%到5%之間的血清)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第二批細(xì)胞1到5天。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，仍另外提供了使用提取的血液的方法，包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；和在包括大于或等于10%血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第二批細(xì)胞1到5天。在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)第二批細(xì)胞包括在少于20%血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第二批細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，還提供了使用提取的血液的方法，包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到L074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；在低血清階段，在包括少于10%的血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第二批細(xì)胞；禾口在高血清階段，在包括大于10%的血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第二批細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，在低血清階段培養(yǎng)第二批細(xì)胞包括培養(yǎng)第二批細(xì)胞1到5天。在一個(gè)實(shí)施方案中，在高血清階段培養(yǎng)第二批細(xì)胞包括培養(yǎng)第二批細(xì)胞1到30天。在一個(gè)實(shí)施方案中，在高血清階段培養(yǎng)第二批細(xì)胞之前，在低血清階段培養(yǎng)第二批細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，在高血清階段培養(yǎng)第二批細(xì)胞之后進(jìn)行在低血.清階段培養(yǎng)第二批細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，進(jìn)一步提供了使用提取的血液的方法，包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；在一至少2小時(shí)的低含氧量和/或高碳酸(H/H)階段，在H/H條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞；和在一至少1天的非H/H階段，在非H/H條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞。在本專(zhuān)利申請(qǐng)文中和權(quán)利要求中，術(shù)語(yǔ)高碳酸(hypercapnia)指C02的濃度大于5%。在一個(gè)實(shí)施方案中，H/H和非H/H階段是在一少于30天的培養(yǎng)期內(nèi)，且在H/H條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞包括在培養(yǎng)期的最初兩天于H/H條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，H/H和非H/H階段是在一少于30天的培養(yǎng)期內(nèi)，且在H/H條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞包括在培養(yǎng)期的最后兩天于H/H條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，H/H和非H/H階段是在一少于30天的培養(yǎng)期內(nèi)，且在H/H條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞包括在培養(yǎng)期的最初兩天和最后兩天之間的至少兩小時(shí)于H/H條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，在非H/H條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞之前，在H/H條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，在非H/H條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞之后進(jìn)行在H/H條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，進(jìn)一步提供了使用提取的血液的方法，包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；和在包括至少以下物質(zhì)中之一的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第二批細(xì)胞促紅細(xì)胞生成素、VEGF、IGF、FGF、來(lái)自雌激素家族的分子(例如，17-P-雌二醇、雌酮、雌三醇、雌二醇衍生物、戊酸雌二醇、環(huán)戊丙酸雌二醇、美雌醇、炔雌醚)、來(lái)自孕激素(progestin)家族的分子(例如，孕酮(progesterone)、hydroxyprogesteronecaroate、酉昔酸甲夢(mèng)圣孕酮)、"[也汀類(lèi)藥物(例如，辛伐他汀(Simvastatin)、阿伐他汀(Atorvastatin))以及抗糖尿病藥物(例如，羅格列酮(Rosiglitazone))。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗糖尿病藥物包括羅格列酮，且培養(yǎng)第二批細(xì)胞包括在含有羅格列酮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第二批細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，他汀類(lèi)藥物包括辛伐他汀或阿伐他汀，并且培養(yǎng)第二批細(xì)胞包括在包括辛伐他汀或阿伐他汀的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第二批細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，來(lái)自雌激素和孕激素家族的激素分子包括17-e-雌二醇和孕酮，并且培養(yǎng)第二批細(xì)胞包括在包括17-P-雌二醇和/或孕酮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第二批細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，來(lái)自雌激素和孕激素家族的激素分子包括17-e-雌二醇和孕酮，并且培養(yǎng)第二批細(xì)胞包括在包括17-e-雌二醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第二批細(xì)胞，并在一定時(shí)期后向其中加入孕酮。在一個(gè)實(shí)施方案中，來(lái)自雌激素和孕激素家族的激素分子包括17-P-雌二醇和孕酮，并且培養(yǎng)第二批細(xì)胞包括在包括孕酮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第二批細(xì)胞，并在一定時(shí)期后向其中加入17-e-雌二醇。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，進(jìn)一步提供了使用所提取的干細(xì)胞的方法，包括將包括干細(xì)胞的組織施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；和通過(guò)培養(yǎng)第二批細(xì)胞3到30天，增加密度在1.059到1.068g/ml之間的細(xì)胞的數(shù)量。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括從骨髓中提取干細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括動(dòng)員來(lái)自骨髓的干細(xì)胞以促進(jìn)干細(xì)胞的提取。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括從血液、臍帶血、胚胎、胎兒或胎盤(pán)中提取干細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)第二批細(xì)胞包括在培養(yǎng)的第一階段于第一容器中培養(yǎng)第二批細(xì)胞；在培養(yǎng)的第一階段末期從第一容器中取出至少一些第二批細(xì)胞；和在培養(yǎng)的第二階段于第二容器中培養(yǎng)從第一容器中所取出的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，取出至少一些第二批細(xì)胞包括選擇取出粘附在第一容器表面上的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，取出至少一些第二批細(xì)胞包括選擇取出沒(méi)有粘附在第一容器表面上的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一容器包括在其表面上的促生長(zhǎng)分子，并且在第一容器中培養(yǎng)細(xì)胞包括在包括促生長(zhǎng)分子的第一容器中培養(yǎng)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二容器包括在其表面上的促生長(zhǎng)分子，并且在第二容器中培養(yǎng)細(xì)胞包括在包括促生長(zhǎng)分子的第二容器中培養(yǎng)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，促生長(zhǎng)分子選自下列血漿(其可以是自體的、同種異型的或異種的)、膠原、纖連蛋白、生長(zhǎng)因子以及干細(xì)胞表面受體的抗體。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，因此提供了使用提取的血液的方法，包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；通過(guò)培養(yǎng)第二批細(xì)胞3到30天來(lái)增加密度在1.055到1.074g/ml之間的細(xì)胞的數(shù)量；禾口在所培養(yǎng)的細(xì)胞中鑒定內(nèi)皮祖細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，將血液施加到第一梯度包括將血液施加到包括蔗糖和環(huán)氧氯丙垸共聚物的溶液中。在一個(gè)實(shí)施方案中，將第一批細(xì)胞施加到第二梯度包括將第一批細(xì)胞施加到碘克沙醇(iodixanol)的水溶液中。在一個(gè)實(shí)施方案中，將第一批細(xì)胞施加到第二梯度包括將第一批細(xì)胞施加到包括用聚乙烯吡咯烷酮包被的硅膠體的梯度密度溶液中。在一個(gè)實(shí)施方案中，將血細(xì)胞施加到第一梯度包括將血細(xì)胞施加到Ficoll樣梯度(Ficoll-likegradient)中。在一個(gè)實(shí)施方案中，將第一批細(xì)胞施加到第二梯度包括將第一批細(xì)胞施加到OptiPrep樣梯度中。在一個(gè)實(shí)施方案中，將第一批細(xì)胞施加到第二梯度包括將第一批細(xì)胞施加到Percoll樣梯度中。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，還提供了使用所提取的干細(xì)胞的方法，包括將包括干細(xì)胞的組織施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；將第二批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.068g/ml之間的第三批細(xì)胞的第三梯度；通過(guò)培養(yǎng)第三批細(xì)胞3到30天來(lái)增加密度在1.055到1.068g/ml之間密度的細(xì)胞的數(shù)量；及鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的內(nèi)皮祖細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，第三梯度適于選擇具有在1.059到1.068g/ml之間密度的細(xì)胞，并且其中將第二批細(xì)胞施加到第三梯度包括選擇具有1.059到1.068g/ml之間密度的細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，還提供了使用提取的血液的方法，包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度.，將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；在包括血漿的表面上培養(yǎng)第二批細(xì)胞；和鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)包括當(dāng)表面用自體血漿包被時(shí)，在該表面上培養(yǎng)第二批細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)包括當(dāng)表面用選自由同種異型血漿和異種血漿中的至少一種血漿包被時(shí)，在該表面上培養(yǎng)第二批細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，還提供了使用組織的方法，包括在包括血漿的表面上培養(yǎng)組織。在一個(gè)實(shí)施方案中，該組織包括血液。在一個(gè)實(shí)施方案中，血漿包括自體血漿。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，還提供了使用提取的血液的方法，包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；在包括抗體的表面上培養(yǎng)第二批細(xì)胞；和鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，祖細(xì)胞包括內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，并且其中鑒別祖細(xì)胞包括鑒別EPC。在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)包括當(dāng)表面用自體血漿包被時(shí)，在該表面上培養(yǎng)第二批細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)包括當(dāng)表面用選自由同種異型血漿和異種血漿中的至少一種血漿包被時(shí)，在該表面上培養(yǎng)第二批細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，還提供了使用提取的血液的方法，包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；在包括促生長(zhǎng)分子而非膠原或纖連蛋白的表面上培養(yǎng)第二批細(xì)胞；和鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，祖細(xì)胞包括內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，并且其中鑒別祖細(xì)胞包括鑒別EPC。在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)第二批細(xì)胞包括在表面上培養(yǎng)第二批細(xì)胞，除了包括促生長(zhǎng)分子外，該表面還包括膠原和纖連蛋白中的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，還提供了使用提取的血液的方法，包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；在包括最高為5%血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第二批細(xì)胞1到5天；以及鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，祖細(xì)胞包括內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，并且其中鑒別祖細(xì)胞包括鑒別EPC。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，還提供了使用提取的血液的方法，包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；在包括大于10%血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第二批細(xì)胞1到5天；以及鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)第二批細(xì)胞包括在包括少于20%血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第二批細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，還提供了使用提取血液的方法，包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；批細(xì)胞的第二梯度；在低血清階段，在包括少于10%血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第二批細(xì)胞；在高血清階段，在包括大于或等于10%血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第二批細(xì)胞；以及鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，在低血清階段培養(yǎng)第二批細(xì)胞包括在包括最高為5%血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第二批細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，在低血清階段培養(yǎng)第二批細(xì)胞包括在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)第二批細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，在低血清階段培養(yǎng)第二批細(xì)胞包括培養(yǎng)第二批細(xì)胞的時(shí)間在1到5天之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，在高血清階段培養(yǎng)第二批細(xì)胞包括培養(yǎng)第二批細(xì)胞的時(shí)間在1到30天之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，在高血清階段培養(yǎng)第二批細(xì)胞之前，在低血清階段培養(yǎng)第二批細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，在高血清階段培養(yǎng)第二批細(xì)胞之后進(jìn)行在低血清階段培養(yǎng)第二批細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，還提供了使用提取血液的方法，包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；在一至少2小時(shí)的低氧階段中，在低氧條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞；在一至少1天的非低氧階段中，在非低氧條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞；禾口鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，祖細(xì)胞包括內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，并且其中鑒別祖細(xì)胞包括鑒別EPC。在一個(gè)實(shí)施方案中，低氧和非低氧階段都在一小于30天的培養(yǎng)期內(nèi)，并且其中在低氧條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞包括在培養(yǎng)期的最初兩天在低氧條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，低氧和非低氧階段都在一小于30天的培養(yǎng)期內(nèi)，并且其中在低氧條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞包括在培養(yǎng)期的最后兩天在低氧條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，低氧和非低氧階段都在一小于30天的培養(yǎng)期內(nèi)，并且其中在低氧條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞包括在培養(yǎng)期的最初兩天和最后兩天之間在低氧條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞至少2小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在非低氧條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞之前在低氧條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，在非低氧條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞之后在低氧條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，還提供了使用提取血液的方法，包括將血液施加到梯度中以選擇具有第一希望密度范圍的細(xì)胞；通過(guò)在包括雌激素的培養(yǎng)基并隨后包括孕激素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所選細(xì)胞來(lái)增加具有第二希望密度范圍的細(xì)胞的數(shù)量；以及鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，還提供了使用提取血液的方法，包括:將血液施加到梯度中以選擇具有第一希望密度范圍的細(xì)胞；通過(guò)在包括孕激素的培養(yǎng)基并隨后包括雌激素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所選細(xì)胞來(lái)增加具有第二希望密度范圍的細(xì)胞的數(shù)量；以及鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，還提供了使用提取血液的方法，包括:將血液施加到梯度中以選擇具有第一希望密度范圍的細(xì)胞；通過(guò)在包括雌激素和孕激素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所選細(xì)胞來(lái)增加具有第二希望密度范圍的細(xì)胞的數(shù)量；以及鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，孕激素包括孕酮。在一個(gè)實(shí)施方案中，雌激素包括雌二醇。在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)包括培養(yǎng)3到30天。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，還提供了使用提取血液的方法，包括:將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；在一至少2小時(shí)的高碳酸階段中，在高碳酸條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞，高碳酸階段特征在于大于5%的C02水平；在一至少1天的非高碳酸階段中，在非高碳酸條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞，非高碳酸階段特征在于小于或等于5%的(:02水平；以及鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，設(shè)定高碳酸階段中的C02水平為至少6%。在一個(gè)實(shí)施方案中，高碳酸階段和非高碳酸階段都在少于30天的培養(yǎng)期內(nèi)，并且其中在高碳酸條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞包括在培養(yǎng)期的最初兩天在高碳酸條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，高碳酸階段和非高碳酸階段都在少于30天的培養(yǎng)期內(nèi)，并且其中在高碳酸條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞包括在培養(yǎng)期的最后兩天在高碳酸條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，高碳酸階段和非高碳酸階段都在少于30天的培養(yǎng)期內(nèi)，并且其中在高碳酸條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞包括在培養(yǎng)期的最初兩天和最后兩天之間在高碳酸條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞至少2小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在非高碳酸條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞之前在高碳酸條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，在非高碳酸條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞之后在高碳酸條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，還提供了使用提取血液的方法，包括:將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；在包括選自以下至少一種物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第二批細(xì)胞促紅細(xì)胞生成素、VEGF、IGF、FGF、雌激素、17-P-雌二醇、雌酮、雌三醇、雌二醇衍生物、戊酸雌二醇、環(huán)戊丙酸雌二醇、美雌醇、炔雌醚、孕激素、來(lái)自孕激素家族的分子、孕酮、合成孕酮、hydroxyprogesteronecaroate、醋酸甲羥孕酮、他汀類(lèi)藥物、辛伐他汀、阿伐他汀、抗糖尿病藥物和羅格列酮；和鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，還提供了使用提取血液的方法，包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；通過(guò)培養(yǎng)第二批細(xì)胞3到30天來(lái)增加密度在1.055到1.074g/ml之間的細(xì)胞的數(shù)量；以及鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，施加組織包括將臍帶血施加到第一梯度。在一個(gè)實(shí)施方案中，施加組織包括將胚胎細(xì)胞施加到第一梯度。在一個(gè)實(shí)施方案中，施加組織包括將胎盤(pán)細(xì)胞施加到第一梯度。在一個(gè)實(shí)施方案中，施加組織包括將胎兒細(xì)胞施加到第一梯度。在一個(gè)實(shí)施方案中，從骨髓中提取干細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，動(dòng)員來(lái)自骨髓的干細(xì)胞以方便干細(xì)胞的提取。在一個(gè)實(shí)施方案中，從外周血提取干細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)第二批細(xì)胞包括在培養(yǎng)的第一階段期間于第一容器中培養(yǎng)第二批細(xì)胞；在培養(yǎng)的第一階段末從第一容器中取出至少一些第二批細(xì)胞；和在培養(yǎng)的第二階段期間于第二容器中培養(yǎng)從第一容器中所取出的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，取出至少一些第二批細(xì)胞包括選擇取出粘附在第一容器表面上的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，取出至少一些第二批細(xì)胞包括選擇取出沒(méi)有粘附在第一容器表面上的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一容器在其表面上包括促生長(zhǎng)分子，并且其中在第一容器中培養(yǎng)細(xì)胞包括在包括促生長(zhǎng)分子的第一容器中培養(yǎng)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，促生長(zhǎng)分子選自如下血漿、膠原、纖連蛋白、生長(zhǎng)因子、以及干細(xì)胞表面受體的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二容器在其表面上包括促生長(zhǎng)分子，并且其中在第二容器中培養(yǎng)細(xì)胞包括在包括促生長(zhǎng)分子的第二容器中培養(yǎng)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，促生長(zhǎng)分子選自如下血漿、膠原、纖連蛋白、生長(zhǎng)因子、以及千細(xì)胞表面受體的抗體。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，還提供了治療疾病的方法，包括將內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)施加到選自如下的個(gè)體的組織附近或間隙個(gè)體的外周神經(jīng)組織、個(gè)體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)組織、個(gè)體的視神經(jīng)、個(gè)體的脈絡(luò)膜組織、個(gè)體的視網(wǎng)膜組織、個(gè)體的視網(wǎng)膜下間隙、個(gè)體的角膜組織、個(gè)體的腎組織、個(gè)體的受損骨組織、個(gè)體的骨折的骨組織、個(gè)體的發(fā)炎組織、個(gè)體的被感染組織、個(gè)體的挫傷組織、個(gè)體皮膚的損傷、潰瘍或創(chuàng)傷組織及個(gè)體的腦組織、個(gè)體的肢體組織、個(gè)體的皮膚移植物組織及個(gè)體的再植的斷肢組織。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括通過(guò)下面步驟產(chǎn)生EPC:將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；通過(guò)培養(yǎng)第二批細(xì)胞3到30天，增加密度在1.055到1.074g/ml之間的細(xì)胞的數(shù)量。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括通過(guò)下面步驟產(chǎn)生EPC:將包括干細(xì)胞的組織施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；將第二批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.068g/ml之間的第三批細(xì)胞的第三梯度；和通過(guò)培養(yǎng)第三批細(xì)胞3到30天，增加密度在1.055到1.068g/ml之間的細(xì)胞的數(shù)量。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括通過(guò)下面步驟產(chǎn)生EPC:將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；和在包括抗體的表面上培養(yǎng)第二批細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括通過(guò)下面步驟產(chǎn)生EPC:將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.07化/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；在包括促生長(zhǎng)分子而非膠原或纖連蛋白的表面上培養(yǎng)第二批細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括通過(guò)下面步驟產(chǎn)生EPC:將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；和在包括最高為5%血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第二批細(xì)胞1到5天。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括通過(guò)下面步驟產(chǎn)生EPC:將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；和在包括大于10%血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第二批細(xì)胞1到5天。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括通過(guò)下面步驟產(chǎn)生EPC:將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；在低血清階段，在包括小于10%血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第二批細(xì)胞；禾口在高血清階段，在包括大于或等于10%血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第二批細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括通過(guò)下面步驟產(chǎn)生EPC:將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；在一至少2小時(shí)的低氧階段中，在低氧條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞；和在一至少1天的非低氧階段中，在非低氧條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括通過(guò)下面步驟產(chǎn)生EPC:將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；在一至少2小時(shí)的高碳酸階段中，在高碳酸條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞，高碳酸階段特征在于大于5X的C02水平；和在一至少1天的非高碳酸階段中，在非高碳酸條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞，非高碳酸階段特征在于小于或等于5X的C02水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括通過(guò)下面步驟產(chǎn)生EPC:將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；和在包括選自下列至少一種物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第二批細(xì)胞促紅細(xì)胞生成素、雌激素、雌激素家族分子、17-P-雌二醇、雌酮、雌三醇、雌二醇衍生物、戊酸雌二醇、環(huán)戊丙酸雌二醇、美雌醇、炔雌醚、孕激素、孕漠i素家族分子、孕酮、合成孕酮、hydroxyprogesteronecaroate、醋酸甲羥孕酮、他汀類(lèi)藥物、辛伐他汀、阿伐他汀、抗糖尿病藥物和羅格列酮。將包括干細(xì)胞的組織施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；通過(guò)培養(yǎng)第二批細(xì)胞3到30天來(lái)增加密度在1.055到1.074g/ml之間的細(xì)胞的數(shù)量。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，還提供了使用提取血液的方法，包括:將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；通過(guò)培養(yǎng)第二批細(xì)胞1到30天來(lái)增加密度在1.055到1.074g/ml之間的細(xì)胞的數(shù)量；以及鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，祖細(xì)胞包括內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，并且其中鑒別祖細(xì)胞包括鑒別EPC。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，還提供了使用提取血液的方法，包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞分成其各自的第一和第二部分；將第一批細(xì)胞的第一部分施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；將第一批細(xì)胞的第二部分與密度在1.055到1.074g/ml之間的細(xì)胞混合.通過(guò)培養(yǎng)第二批細(xì)胞3到30天來(lái)增加密度在1.055到1.074g/ml之間的細(xì)胞的數(shù)量；以及鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，劃分第一批細(xì)胞包括設(shè)定第一部分大于第二部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，劃分第一批細(xì)胞包括設(shè)定第一部分小于第二部分。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，還提供了使用提取血液的方法，包括:將血液施加到梯度以選擇具有第一希望密度范圍的細(xì)胞；通過(guò)培養(yǎng)所選細(xì)胞3到30天來(lái)增加具有第二希望密度范圍的細(xì)胞的數(shù)量；和鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，將血液施加到梯度中包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的細(xì)胞的梯度。在一個(gè)實(shí)施方案中，將血液施加到梯度中包括將血液施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的細(xì)胞的梯度。在一個(gè)實(shí)施方案中，增加細(xì)胞的數(shù)量包括培養(yǎng)細(xì)胞4到8天。在一個(gè)實(shí)施方案中，將血液施加到梯度中包括將血液施加到包括蔗糖和環(huán)氧氯丙垸的共聚物的溶液中。在一個(gè)實(shí)施方案中，將血液施加到梯度中包括將血液施加到包括用聚乙烯吡咯烷酮包被的硅膠的梯度密度溶液中。在一個(gè)實(shí)施方案中，將血液施加到梯度中包括將血液施加到碘克沙醇的水溶液中。在一個(gè)實(shí)施方案中，將血液施加到梯度中包括將血液施加到Ficoll樣梯度中。在一個(gè)實(shí)施方案中，將血液施加到梯度中包括將血液施加到OptiPrep樣梯度中。在一個(gè)實(shí)施方案中，將血液施加到梯度中包括將血液施加到Percoll樣梯度中。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，還提供了使用提取血液的方法，包括將血液施加到梯度以選擇具有希望密度范圍的細(xì)胞；在包括自體血漿的表面上培養(yǎng)所選細(xì)胞3到30天；和鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，還提供了使用提取血液的方法，包括將血液施加到梯度以選擇具有希望密度范圍的細(xì)胞；在包括抗體的表面上培養(yǎng)所選細(xì)胞；和鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)包括當(dāng)表面用自體血漿包被時(shí)在該表面上培養(yǎng)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)包括當(dāng)表面用選自同種異型血漿和異種血漿中的至少一種血漿包被時(shí)，在該表面上培養(yǎng)細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，還提供了使用提取血液的方法，包括將血液施加到梯度以選擇具有希望密度范圍的細(xì)胞；在包括促生長(zhǎng)分子而非膠原或纖連蛋白的表面上培養(yǎng)所選細(xì)胞；和鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)細(xì)胞包括在表面上培養(yǎng)細(xì)胞，該表面除了促生長(zhǎng)分子外還包括膠原和纖連蛋白中的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，還提供了使用提取血液的方法，包括將血液施加到梯度以選擇具有希望密度范圍的細(xì)胞；在包括最高為5%血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所選細(xì)胞1到5天；和鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，還提供了使用提取血液的方法，包括將血液施加到梯度以選擇具有希望密度范圍的細(xì)胞；在包括大于10%血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所選細(xì)胞1到5天；和鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)細(xì)胞包括在包括小于20%血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，還提供了使用提取血液的方法，包括將血液施加到梯度以選擇具有希望密度范圍的細(xì)胞；在低血清階段，在包括少于10%血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所選擇的細(xì)胞；在高血清階段，在大于或等于10%血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所選擇的細(xì)胞；以及鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，在低血清階段培養(yǎng)細(xì)胞包括在包括最高為5%血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，在低血清階段培養(yǎng)細(xì)胞包括在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，在低血清階段培養(yǎng)細(xì)胞包括培養(yǎng)細(xì)胞1到5天。在一個(gè)實(shí)施方案中，在高血清階段培養(yǎng)細(xì)胞包括培養(yǎng)細(xì)胞1到30天。在一個(gè)實(shí)施方案中，在高血清階段培養(yǎng)細(xì)胞之前，在低血清階段培養(yǎng)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，在高血清階段培養(yǎng)細(xì)胞之后，在低血清階段培養(yǎng)細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，還提供了使用提取血液的方法，包括將血液施加到梯度以選擇具有希望密度范圍的細(xì)胞；在一至少2小時(shí)的低氧階段中，在低氧條件下培養(yǎng)所選細(xì)胞；在一至少l天的非低氧階段中，在非低氧條件下培養(yǎng)所選細(xì)胞；和鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，低氧和非低氧階段都在一小于30天的培養(yǎng)期內(nèi)，并且其中在低氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞包括在培養(yǎng)期的最初兩天在低氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，低氧和非低氧階段都在一小于30天的培養(yǎng)期內(nèi)，并且其中在低氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞包括在培養(yǎng)期的最后兩天在低氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，低氧和非低氧階段都在一小于30天的培養(yǎng)期內(nèi)，并且其中在低氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞包括在培養(yǎng)期的最初兩天和最后兩天之間在低氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞至少2小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在非低氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞之前，在低氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，在非低氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞之后，在低氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，還提供了使用提取血液的方法，包括:將血液施加到梯度以選擇具有希望密度范圍的細(xì)胞；在一至少2小時(shí)的高碳酸階段中，在高碳酸條件下培養(yǎng)所選擇的細(xì)胞，高碳酸階段特征在于大于5X的C02水平；在一至少1天的非高碳酸階段中，在非高碳酸條件下培養(yǎng)所選擇的細(xì)胞，非高碳酸階段特征在于小于或等于5X的C02水平；以及鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括設(shè)定高碳酸階段中的C02水平為至少6%。在一個(gè)實(shí)施方案中，高碳酸階段和非高碳酸階段都在少于30天的培養(yǎng)期內(nèi)，并且其中在高碳酸條件下培養(yǎng)細(xì)胞包括在培養(yǎng)期的最初兩天在高碳酸條件下培養(yǎng)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，高碳酸階段和非高碳酸階段都在少于30天的培養(yǎng)期內(nèi)，并且其中在高碳酸條件下培養(yǎng)細(xì)胞包括在培養(yǎng)期的最后兩天在高碳酸條件下培養(yǎng)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，高碳酸階段和非高碳酸階段都在少于30天的培養(yǎng)期內(nèi)，并且其中在高碳酸條件下培養(yǎng)細(xì)胞包括在培養(yǎng)期的最初兩天和最后兩天之間在高碳酸條件下培養(yǎng)細(xì)胞至少2小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在非高碳酸條件下培養(yǎng)細(xì)胞之前，在高碳酸條件下培養(yǎng)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，在非高碳酸條件下培養(yǎng)細(xì)胞之后，在高碳酸條件下培養(yǎng)細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，還提供了使用提取血液的方法，包括將血液施加到梯度以選擇具有第一希望密度范圍的細(xì)胞；在包括選自下列中至少一種物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所選細(xì)胞VEGF、IGF、FGF、促紅細(xì)胞生成素、雌激素、雌激素家族分子、17-e-雌二醇、雌酮、雌三醇、雌二醇衍生物、戊酸雌二醇、環(huán)戊丙酸雌二醇、美雌醇、炔雌醚、孕激素、孕激素家族分子、孕酮、合成孕酮、hydroxyprogesteronecaroate、醋酸甲羥孕酮、他汀類(lèi)藥物、辛伐他汀、阿伐他汀、抗糖尿病藥物和羅格列酮；和鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，祖細(xì)胞包括內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，并且其中鑒別祖細(xì)胞包括鑒別EPC。在一個(gè)實(shí)施方案中，將血液施加到梯度中包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的細(xì)胞的梯度。在一個(gè)實(shí)施方案中，將血液施加到梯度中包括將血液施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的細(xì)胞的梯度。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，還提供了使用提取的干細(xì)胞的方法，包括將包括干細(xì)胞的組織施加到梯度中以選擇具有第一希望密度范圍的細(xì)胞；通過(guò)培養(yǎng)所選細(xì)胞3到30天來(lái)增加具有第二希望密度范圍的細(xì)胞的數(shù)量；和鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，施加組織包括將臍帶血施加到梯度。在一個(gè)實(shí)施方案中，施加組織包括將胚胎細(xì)胞施加到梯度。在一個(gè)實(shí)施方案中，施加組織包括將胎兒細(xì)胞施加到梯度。在一個(gè)實(shí)施方案中，施加組織包括將胎盤(pán)細(xì)胞施加到梯度。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括自骨髓提取干細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括動(dòng)員來(lái)自骨髓的干細(xì)胞以方便干細(xì)胞的提取。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括自血液提取干細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括培養(yǎng)細(xì)胞，其包括在培養(yǎng)的第一階段期間于第一容器中培養(yǎng)細(xì)胞；在培養(yǎng)的第一階段末從第一容器中取出至少一些所述細(xì)胞；和在培養(yǎng)的第二階段期間于第二容器中培養(yǎng)從第一容器中所取出的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括取出至少一些細(xì)胞包括選擇取出粘附在第一容器表面上的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，取出至少一些細(xì)胞包括選擇取出沒(méi)有粘附在第一容器表面上的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一容器包括在其表面上的促生長(zhǎng)分子，并且其中在第一容器中培養(yǎng)細(xì)胞包括在包括促生長(zhǎng)分子的第一容器中培養(yǎng)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，促生長(zhǎng)分子選自如下血漿、膠原、纖連蛋白、生長(zhǎng)因子、以及干細(xì)胞表面受體的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二容器包括在其表面上的促生長(zhǎng)分子，并且其中在第二容器中培養(yǎng)細(xì)胞包括在包括促生長(zhǎng)分子的第二容器中培養(yǎng)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，促生長(zhǎng)分子選自如下血漿、膠原、纖連蛋白、生長(zhǎng)因子、以及干細(xì)胞表面受體的抗體。具體實(shí)施方式根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，提供了用于從人體外周血液中分離、分化和生長(zhǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)的方法。典型地將EPC植入到患者體內(nèi)以誘導(dǎo)血管生成和/或血管發(fā)生和/或新血管化。典型地，由如Ficoll密度梯度分離的外周血單核細(xì)胞(PBMC)進(jìn)一步通過(guò)一或多個(gè)其它密度梯度(如Percoll、OptiPrep或Nycodenz)來(lái)富集，接著使其能夠粘附在組織培養(yǎng)皿上。細(xì)胞典型地在富集的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)3—30天。在培養(yǎng)期間的一些時(shí)間點(diǎn)上，采樣進(jìn)行表型評(píng)估。收集擴(kuò)增的細(xì)胞并將其保存直到移植到患者體內(nèi)。在下文中描述了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案在適當(dāng)時(shí)可單獨(dú)使用或組合使用的一系列方案。應(yīng)當(dāng)意識(shí)到的是提供的數(shù)值用于闡述而非限定。典型但非必要地，所示的每個(gè)數(shù)值是從所示數(shù)值的25%以?xún)?nèi)的數(shù)值范圍內(nèi)選出的例子。同樣，雖然描述了具有很高水平特異性的某些步驟，但是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到也可進(jìn)行已作必要改動(dòng)的其它步驟。組織培養(yǎng)皿包被方案如培養(yǎng)皿的適當(dāng)容器可用EPC-促生長(zhǎng)分子的一種或其組合來(lái)包被。這些分子可包含如CD34、CD133、Tie-2、VEGFR-2(KDR)、CD144的祖細(xì)胞表面受體的抗體或者如LDL、VEGF、FGF、IGF或血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)的分子。實(shí)施例1:用自體血漿包被T-75燒瓶對(duì)于20個(gè)T-75燒瓶在細(xì)胞制備當(dāng)天準(zhǔn)備好用血漿包被T-75燒瓶表面可利用從離心分離的組織樣品中取出的自體血漿來(lái)進(jìn)行，或者可使用來(lái)自不同來(lái)源的血漿，如得自ChemiconofTemecula，CA、US的商購(gòu)血漿。從Ficoll試管的上部級(jí)分中收集血漿。用2—5ml血漿填充每個(gè)燒瓶。在37'C中溫育至少30分鐘。清除血漿。在10ml的PBS中洗滌燒瓶?jī)纱?。燒瓶?zhǔn)備使用。實(shí)施例2:用25Hg/ml的纖連蛋白包被T-75燒瓶對(duì)于20個(gè)T-75燒瓶(a)在細(xì)胞制備的當(dāng)天準(zhǔn)備好，或者(b)細(xì)胞制備的前一天準(zhǔn)備好。在PBS中制備25ug/ml的纖連蛋白溶液50ml將250u1纖連蛋白5mg/ml加入到50ml的PBS中對(duì)每個(gè)燒瓶填充25iig/ml的纖連蛋白2-5ml。在37°C中溫育至少30分鐘。收集纖連蛋白溶液。如果將纖連蛋白保存在4t:、無(wú)菌50ml試管中，則纖連蛋白溶液可重復(fù)使用，典型地可保存最多l(xiāng)周。在PBS中洗滌燒瓶?jī)纱?。在室溫下干燥燒瓶。在室溫?RT)干燥的燒瓶可保存一周。實(shí)施例3:用纖連蛋白和5Ug/ml的抗-CD34包被T-75燒瓶對(duì)于20個(gè)T-75燒瓶(a)在細(xì)胞制備的當(dāng)天準(zhǔn)備好，或者(b)細(xì)胞制備的前一天準(zhǔn)備好。如實(shí)施例1所述，用纖連蛋白包被燒瓶。在PBS中制備5ug/ml的抗-CD34溶液25ml將125y1的lmg/ml的抗-CD34加入到25ml的PBS中對(duì)每個(gè)燒瓶填充5ug/ml的抗-CD345ml。在37'C溫育2小時(shí)或者在4'C溫育過(guò)夜。撤出抗體溶液。在PBS中洗滌燒瓶?jī)纱?。燒瓶備用。?xì)胞制備通過(guò)輕柔地上下翻轉(zhuǎn)血袋將血液混合。將血液從袋子中轉(zhuǎn)移到500ml的無(wú)菌瓶中。將血液加載到Ficoll梯度中。用血液將試管填充到50ml。在1050g時(shí)于室溫下不間斷旋轉(zhuǎn)試管20分鐘。將大多數(shù)上層血槳收集在空的50ml試管內(nèi)。從每個(gè)試管中收集白細(xì)胞層(例如PBMC)級(jí)分。將每個(gè)PBMC轉(zhuǎn)移到新的50ml試管中，用15-20ml的PBS預(yù)填充。使用PBS將每個(gè)試管體積調(diào)整到30ml。在580g于室溫下旋轉(zhuǎn)試管15分鐘并清除上清。輕柔地混合沉淀并用l-5ml的PBS重懸。將每四個(gè)試管中的內(nèi)容物組合到一個(gè)50ml的試管中，并將該試管用PBS填充到50ml。例如(1)制備1.072g/ml的OptiPrep梯度。對(duì)于1.072g/ml的OptiPrep梯度36ml通過(guò)將如下溶液混合在一起來(lái)制備1.072g/ml的梯度(i)0.5%人或牛的血清白蛋白、0.8%NaCl、10mMHepes、lmMEDTA(緩沖到pH7.4)的溶液25ml與(ii)10mlOptiPrep溶液+5ml0.5%人或牛的血清白蛋白、0.8%NaCl、10mMHepes、lmMEDTA(緩沖至lJpH7.4)溶液的混合溶液llml。將(a)來(lái)自上述細(xì)胞制備步驟的10ml細(xì)胞與(b)10ml的OptiPrep溶液+5ml的0.5%人或牛的血清白蛋白、0.8%NaCl、10mMHepes、lmMEDTA(緩沖到pH7.4)的溶液的10ml混合物混合在一起。將20ml的步驟(i)禾B(ii)中制備的1.072g/ml的OptiPrep梯度加至(a)與(b)的混合物的上方，并在其上方加上1.5ml0.5%人或牛血清白蛋白、0.8%NaCl、10mMHepes、lmMEDTA(緩沖到pH7.4)的溶液。在700g下離心30分鐘，例如在室溫或者4。C，無(wú)間斷。從梯度和0.5X牛血清白蛋白、0.8。/。NaCl、10mMHepes、lmMEDTA、pH7.4的溶液之間的界面處收集分離的細(xì)胞。在395g于室溫離心IO分鐘。丟棄上清液并在10ml的培養(yǎng)基中重懸沉淀。(2)制備用于1.060-1.068g/ml細(xì)胞密度的Perco11梯度。例如，在50ml試管中，30ml連續(xù)Percoll梯度制備混合物13.5mlPercoll(Amersham)15.OmlMEM旋轉(zhuǎn)修飾液(spinnermodification)1.5ml1OxEarle，s鹽溶液在固定角度轉(zhuǎn)子內(nèi)于14000xg無(wú)間斷離心10分鐘。小心地將梯度從轉(zhuǎn)子中取出。該梯度現(xiàn)在備用。所述試管應(yīng)該能夠抵抗14000xg離心。將所有的細(xì)胞施加到Percoll梯度中。在400xg無(wú)間斷離心30分鐘。收集富集的PBMC并轉(zhuǎn)移到50ml試管中。用PBS充滿(mǎn)試管，在300xg離心IO分鐘。在50ml的PBS中重懸，于200xg離心IO分鐘。在50ml的PBS中重懸，于200xg離心IO分鐘。取50ul樣品用于細(xì)胞計(jì)數(shù)。血清制備血清可直接從患者的凝固血漿中獲得("除凝塊(offtheclot)"血清)，或者從用抗凝血?jiǎng)╊A(yù)處理過(guò)的血液中所產(chǎn)生的血槳來(lái)制備。例如，為了從用抗凝血?jiǎng)╊A(yù)處理過(guò)的血液中制備血清采集從Ficoll試管的上部級(jí)分收集的血漿(見(jiàn)上述的細(xì)胞制備)。對(duì)于每50ml的血漿，加入1.2ml0.8M的CaCl22H20或者任何別的化學(xué)/生物凝固誘導(dǎo)物，如氯化鈣、組織促凝血酶原激酶、凝血酶激動(dòng)肽或其它物質(zhì)以催化凝結(jié)機(jī)制。在37"C溫育0.5-4小時(shí)。在3500g下離心凝固血漿10分鐘。將血清收集到新的試管中。不要將凝結(jié)物并與血清混合。使用所收集的血清用于培養(yǎng)基制備，或者將其等份保存在-20。C直到使用。細(xì)胞計(jì)數(shù)對(duì)四個(gè)96w平板的每一個(gè)預(yù)先填充50u1的臺(tái)盼藍(lán)(TB)。通過(guò)將20ul的細(xì)胞樣品轉(zhuǎn)移至一個(gè)含有TB的孔中并上下吹打輕輕混合來(lái)制備l:5的稀釋液。將10u1稀釋后的細(xì)胞加載到血細(xì)胞計(jì)數(shù)器兩個(gè)槽中的每一個(gè)。計(jì)數(shù)處于上下槽的中間25個(gè)方格內(nèi)的透明細(xì)胞(活的)和藍(lán)色細(xì)胞(死的)。如果計(jì)數(shù)少于10個(gè)細(xì)胞，則通過(guò)將50u1的細(xì)胞樣品轉(zhuǎn)移到50u1TB中來(lái)制備l:2的稀釋液。如果計(jì)數(shù)多于200個(gè)細(xì)胞，則通過(guò)20nl的1:5的懸浮液轉(zhuǎn)移到一個(gè)含有TB的孔中并通過(guò)上下吹打輕柔混合來(lái)制備h25的稀釋液。根據(jù)下面的等式計(jì)算每個(gè)槽的細(xì)胞數(shù)活細(xì)胞數(shù)x10000x稀釋因子二活細(xì)胞數(shù)/ml死細(xì)胞數(shù)x10000x稀釋因子二死細(xì)胞數(shù)/ml%死細(xì)胞=死細(xì)胞數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))x100°/。死細(xì)胞典型地不超過(guò)30%。計(jì)算平均細(xì)胞數(shù)記錄計(jì)數(shù)結(jié)果。總結(jié)最終細(xì)胞數(shù)并得到細(xì)胞/ml血液。培養(yǎng)基制備計(jì)算所需培養(yǎng)基的體積制備培養(yǎng)基。培養(yǎng)基應(yīng)含有1-20%的自體血清。培養(yǎng)基可以0.5pg/ml-lng/ml、或者lng/ml-100ug/ml的不同濃度含有以下添加劑，例如EPO(0.01-10IU/ml)、IGF(l-100ng/ml)、FGF10-100ng/ml、VEGF(0.5-20ng/ml);肝素5-100IU/ml;不同分子根據(jù)它們的分子量及所需的體積摩爾濃度，范圍可以是從pg-ug，或者相應(yīng)的體積摩爾濃度他汀類(lèi)分子(例如辛伐他汀5-100ug/ml)、抗糖尿病藥物(例如羅格列酮5-500ug/ml)，和/或類(lèi)固醇激素，如雌激素(例如17-e-雌二醇(2-2000ng/ml)和孕激素(例如孕酮2-2000ng/ml)及其組合。假設(shè)類(lèi)固醇生殖系統(tǒng)激素(例如雌激素和孕激素)通過(guò)升高EPC血液水平來(lái)施加它們的影響。因此，特別是當(dāng)來(lái)自外周血液的細(xì)胞受到它們的影響時(shí)，施加這些分子或其組合可增加生產(chǎn)產(chǎn)量或在體外將祖細(xì)胞分化為EPC。低％血清培養(yǎng)基的例子對(duì)于100ml培養(yǎng)基加入100iig/ml的VEGF2u1(終濃度為10ug/ml)5000U/ml的肝素100u1(終濃度為5U/ml)5ml的自體血清94.9ml的無(wú)血清培養(yǎng)基高％血清培養(yǎng)基的例子1對(duì)于100ml培養(yǎng)基加入100ug/ml的VEGF2u1(終濃度為10ug/ml)5000U/ml的肝素100u1(終濃度為5U/ml)20ml的自體血清79.9ml的無(wú)血清培養(yǎng)基高％血清培養(yǎng)基的例子2對(duì)于100ml培養(yǎng)基加入100iig/ml的VEGF5u1(終濃度為10ug/ml)5000U/ml的肝素100u1(終濃度為5U/ml)5mg/ml的孕酮4P1(終濃度為0.2ug/ml)10ml的自體血清89.9ml的無(wú)血清培養(yǎng)基高％血清培養(yǎng)基的例子3對(duì)于100ml培養(yǎng)基加入100iig/ml的VEGF5y1(終濃度為10ug/ml)5000U/ml的肝素100p1(終濃度為5U/ml)0.05mg/ml的17-P-雌二醇4u1(終濃度為0.002pg/ml)10ml的自體血清89.9ml的無(wú)血清培養(yǎng)基高％血清培養(yǎng)基的例子3對(duì)于100ml培養(yǎng)基加入100ug/ml的VEGF5y1(終濃度為10ug/ml)5000U/ml的肝素100u1(終濃度為5U/ml)0.05mg/ml的孕酮4u1(終濃度為0.002ug/ml)0.005mg/ml的17-P-雌二醇4u1(終濃度為0.0002ug/ml)10ml的自體血清89.9ml的無(wú)血清培養(yǎng)基高％血清培養(yǎng)基的例子4對(duì)于100ml培養(yǎng)基加入100ug/ml的VEGF2u1(終濃度為10ug/ml)5000U/ml的肝素100u1(終濃度為5U/ml)570uM的辛伐他汀330ul(終濃度為0.95uM)10ml的自體血清89.6ml的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)將混合的細(xì)胞懸液分開(kāi)。在500g下于室溫離心試管15分鐘，丟棄上清液。輕輕混合細(xì)胞沉淀并重懸細(xì)胞至5-50X106/ml。種下l-5Xl(^細(xì)胞/ml。在37'C、5%032下溫育燒瓶。在含有低血清水平(例如最高為5%)的培養(yǎng)基中溫育細(xì)胞?；蛘呋蛄硗?，使用高(>10%)血清水平。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，在高血清培養(yǎng)基中溫育之前先在低血清培養(yǎng)基中溫育細(xì)胞?；蛘撸诟哐迮囵B(yǎng)基中溫育之后在低血清培養(yǎng)基中溫育細(xì)胞。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，(a)在高血清培養(yǎng)基(>10%血清)中溫育之前，在包含0.5%-5%血清的培養(yǎng)基中溫育，以及(b)(i)在0.5%-5%血清培養(yǎng)基中溫育之前、(ii)在包含0.5%-5%血清培養(yǎng)基中溫育與在高血清培養(yǎng)基中溫育之間、和/或(iii)在高血清培養(yǎng)基中溫育之后，在無(wú)血清培養(yǎng)基中進(jìn)行溫育。或者，(a)在高血清培養(yǎng)基(>10%血清)中溫育之后，在包含0.5%-5%血清的培養(yǎng)基中溫育，以及(b)(0在0.5%-5%血清培養(yǎng)基中溫育之前、(ii)在高血清培養(yǎng)基中溫育與在包含0.5%-5%血清的培養(yǎng)基中溫育之間、和/或(iii)在高血清培養(yǎng)基中溫育之前，在無(wú)血清培養(yǎng)基中進(jìn)行溫育。在一個(gè)實(shí)施方案中，利用無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行在此所描述的關(guān)于低血清培養(yǎng)基的技術(shù)。通過(guò)將細(xì)胞培養(yǎng)物暴露于低氧和/或高碳酸(H/H)2-12小時(shí)、12-24小時(shí)、24-36小時(shí)或36-48小時(shí)可獲得升高的細(xì)胞擴(kuò)增和分化。這可在細(xì)胞培養(yǎng)期間在不同的點(diǎn)上進(jìn)行一或多次。(見(jiàn)下面應(yīng)用低氧方案的例子)。在本專(zhuān)利申請(qǐng)的上下文以及權(quán)利要求中，術(shù)語(yǔ)高碳酸指C02的濃度大于5%。在培養(yǎng)的最初三天之后，細(xì)胞在含有高水平血清(例如，>10%)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。進(jìn)行培養(yǎng)物形態(tài)學(xué)檢查。每2-3天更新培養(yǎng)基。例如，當(dāng)細(xì)胞在T-75燒瓶中培養(yǎng)時(shí)1、將細(xì)胞收集到50ml試管中。2、用5ml新鮮培養(yǎng)基填充每個(gè)燒瓶3、在450g、于室溫離心試管10分鐘，丟棄上清液。4、輕柔混合細(xì)胞沉淀并將細(xì)胞重懸于每個(gè)燒瓶的5ml新鮮培養(yǎng)基中。5、將5ml的細(xì)胞懸液返回到每個(gè)燒瓶中6、采樣細(xì)胞用于熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)和/或每幾天(例如第6、9、13、16、20、24和30天)進(jìn)行免疫組織學(xué)分析。7、無(wú)論何時(shí)處理培養(yǎng)物均觀察并記錄培養(yǎng)物形態(tài)學(xué)。8、在過(guò)程的開(kāi)始和結(jié)束以及在培養(yǎng)期間每10天從生長(zhǎng)皿中采樣培養(yǎng)物用于無(wú)菌測(cè)試。9、收集所有培養(yǎng)的細(xì)胞(見(jiàn)下面的"用于FACS染色的細(xì)胞收集"部分)應(yīng)用低氧和/或高碳酸對(duì)于一些應(yīng)用來(lái)說(shuō)，通過(guò)將細(xì)胞培養(yǎng)物暴露給低氧條件(例如1-5%或者5-15%氧)或者暴露給高碳酸條件(例如6-10%CO2)2-48小時(shí)可獲得增加的細(xì)胞擴(kuò)增和分化。這典型地可在細(xì)胞培養(yǎng)期間在不同的點(diǎn)上進(jìn)行一或多次。例如在培養(yǎng)的第一天，可控氧培養(yǎng)箱中溫育T-75燒瓶。將氧壓設(shè)定在5%和/或?qū)?^02濃度設(shè)定高于5%(例如6%-8%或8%-10%)，并維持這一水平6小時(shí)。從培養(yǎng)箱中取出燒瓶并檢査所述培養(yǎng)物。提取細(xì)胞樣品并通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排除方法測(cè)試存活力。將培養(yǎng)箱的氧壓設(shè)定在21%和/或?qū)02濃度設(shè)定為5%。再次將燒瓶放入培養(yǎng)箱中并繼續(xù)培養(yǎng)剩余的時(shí)間。這一過(guò)程可重復(fù)進(jìn)行，例如培養(yǎng)期間每周一次和/或在培養(yǎng)終止前的24、48或72小時(shí)內(nèi)進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，在C02小于或等于5。％的環(huán)境中培養(yǎng)之前將細(xì)胞在高碳酸條件下培養(yǎng)?；蛘呋蛄硗獾?，在C02小于或等于5X的環(huán)境中培養(yǎng)之后將細(xì)胞在高碳酸條件下培養(yǎng)。粘附和/或分離和/或漂浮細(xì)胞的再種植例如對(duì)于一些應(yīng)用來(lái)說(shuō)，通過(guò)將所收集的細(xì)胞再種植到新的預(yù)包被的培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基中可實(shí)現(xiàn)增加的細(xì)胞擴(kuò)增和分化。在培養(yǎng)的第三或第四天，收集所有培養(yǎng)的細(xì)胞。(見(jiàn)下面的部分，"用于FACS染色的細(xì)胞收集")在450g于室溫離心試管10分鐘。丟棄上清液。接著，輕柔地混合沉淀并將細(xì)胞重懸于每個(gè)燒瓶的10ml新鮮培養(yǎng)基中。最后，將懸浮細(xì)胞種植在新的預(yù)包被的T-75燒瓶中。繼續(xù)培養(yǎng)這些細(xì)胞，并進(jìn)行本文描述的適當(dāng)?shù)乃衅渌顒?dòng)(例如，培養(yǎng)基更新、目測(cè)檢查和/或流式細(xì)胞計(jì)量術(shù))。這一過(guò)程可在培養(yǎng)期間每周進(jìn)行和/或在培養(yǎng)終止前的24、48或72小時(shí)內(nèi)進(jìn)行。細(xì)胞保藏可將細(xì)胞保存在保藏培養(yǎng)基中或者冷凍在冷凍緩沖液中直到使用，例如植入到患者體內(nèi)。用于FACS染色的細(xì)胞收集將細(xì)胞收集到50ml的試管中。用冷的PBS通過(guò)移液管小心地洗滌燒瓶表面以除去粘附的細(xì)胞。將所洗滌的粘附細(xì)胞收集到50ml的試管中。加入5ml的冷PBS。用細(xì)胞刮棒通過(guò)輕柔地圓周運(yùn)動(dòng)來(lái)除去剩余的粘附細(xì)胞。收集所分離的細(xì)胞并將它們加入到試管中。當(dāng)適當(dāng)時(shí)，加入5ml的EDTA并在37"C溫育5分鐘。收集所分離的細(xì)胞并將它們加入到試管中。在450g下于室溫離心試管5分鐘。將沉淀重懸在2-5ml的PBS中。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并記錄計(jì)數(shù)結(jié)果。總結(jié)最終細(xì)胞數(shù)量以及每個(gè)操作日的產(chǎn)量/種植細(xì)胞的數(shù)量。將等體積的細(xì)胞分入到FACS。FACS染色用PBS洗滌細(xì)胞。在450g下、4-8'C離心試管5分鐘。通過(guò)倒掉緩沖液并吸去組織上的剩余來(lái)完全丟棄上清液。輕柔地混合細(xì)胞沉淀。加入染色試劑(根據(jù)染色表)并混合細(xì)胞沉淀。在黑暗中在冰水上溫育試管15-30分鐘。用PBS洗滌細(xì)胞。在450g下、4-8'C離心試管5分鐘。通過(guò)倒掉緩沖液并吸去組織上的剩余來(lái)完全丟棄上清液。輕柔地混合細(xì)胞沉淀。每個(gè)試管加入0.5ml的PBS(或更少，如果試管含有少于1乂106個(gè)細(xì)胞)。如果可以看見(jiàn)聚積，則將細(xì)胞懸液通過(guò)200um篩。用FACS機(jī)器讀取染色結(jié)果?？偨Y(jié)并記錄FACS結(jié)果。集落形成測(cè)試1、收集培養(yǎng)的細(xì)胞(見(jiàn)"用于FACS染色的細(xì)胞收集"部分)2、將100乂103細(xì)胞懸浮在0.7ml富集培養(yǎng)基中，該富集培養(yǎng)基為含有50ng/mlSCF、2IU/mlEPO、5ng/mlIL-3和25mg/mlBTI-內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)劑(ECGS)的M199。3、向圓底試管中加入如下成分并輕柔地混合；3丄甲基纖維素2X-1.4ml3.2.FCS隱0.9ml3.3.細(xì)胞懸液0.7ml4、將3ml的每種混合物種植到兩個(gè)35mm平皿中(每個(gè)1.5ml)。5、將兩個(gè)35mm平皿放入含有用ddH20預(yù)填充另外一個(gè)35mm平皿的100mm平皿中6、在37。C、5%C02、97%濕度下溫育。7、用倒置顯微鏡，在10-14天后對(duì)集落評(píng)分管形成測(cè)試(tubeformationtest)1、在4°C融解ECMatrix過(guò)夜。2、將IOX稀釋緩沖液100微升加入到無(wú)菌微離心試管內(nèi)的900微升ECMatrix溶液中。3、輕柔地混合；不能將空氣吸到溶液中。將溶液放在冰上以避免凝固。4、將40微升的緩沖過(guò)的ECMatrix溶液轉(zhuǎn)移到已經(jīng)在4'C預(yù)冷過(guò)夜的96-孔組織培養(yǎng)平板的每個(gè)孔中。5、在37。C溫育至少1小時(shí)以便混合溶液能夠凝固。6、收集所培養(yǎng)的細(xì)胞(見(jiàn)"用于FACS染色的細(xì)胞收集"部分)7、在含有10%人血清、25微克/ml的BTI-內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)劑(ECGS)和于M199內(nèi)的5IU/ml肝素的富集培養(yǎng)基中將細(xì)胞懸浮至0.15X106/ml。8、將每個(gè)孔150微升的細(xì)胞懸液移到聚合的ECMatrix的表面上。9、在37。C、5%C02、97%濕度中溫育過(guò)夜。10、在40X-200X放大倍數(shù)的倒置光顯微鏡下觀察管形成。細(xì)胞說(shuō)明如果細(xì)胞要移植到人體內(nèi)，則典型地應(yīng)當(dāng)滿(mǎn)足下列條件(I)通常細(xì)胞應(yīng)當(dāng)沒(méi)有任何細(xì)菌或病毒污染。(II)細(xì)胞形態(tài)特征應(yīng)為(a)尺寸上大于淋巴細(xì)胞和/或(b)伸長(zhǎng)的、梭形或不規(guī)則形狀和/或(c)粒狀或深色核(darknucleated)和/或(d)具有鞭毛狀結(jié)構(gòu)或偽足和/或(e)形狀上為成纖維細(xì)胞樣或多邊形。(III)最終細(xì)胞懸液應(yīng)當(dāng)通常含有至少1X1()S個(gè)細(xì)胞，這些細(xì)胞表達(dá)一或多個(gè)標(biāo)記CD31，禾口/或CD34,和/或CD133，和/或CD34+CD133，和/或KDR，和/或CD34+KDR,和/或CD144，和/或馮維勒布蘭德因子(vonWillebrandfactor),禾口/或SH2(CD105)，禾口/或SH3，和/或纖連蛋白，和/或膠原(1、III和IV型)，禾口/或ICAM(1或2型)禾口/或VCAM1和/或波形蛋白和/或BMP-RIA禾口/或BMP-RII禾口/或CD44和/或整聯(lián)蛋白bl禾口/或aSM-肌動(dòng)蛋白和/或MUC18和/或?qū)τ诿阜磻?yīng)Dil-Ac-LDL是陽(yáng)性的。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案獲得的結(jié)果實(shí)施例1.如上所述，使用Ficoll(第一批)和OptiPrep(第二批)在七個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行EPC的兩次分離。表1中的結(jié)果顯示了第二批細(xì)胞中CD34+細(xì)胞富集百分比。富集定義為第二批后的CD34+細(xì)胞的百分比除以使用OptiPrep的第一批后的CD34+細(xì)胞百分比。表l.第二批細(xì)胞中XCD34的富集<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>實(shí)施例1.在一組單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，在存在培養(yǎng)基的纖連蛋白包被的T-75燒瓶中體外生長(zhǎng)之后用管形成測(cè)試評(píng)估第一批富集的EPC產(chǎn)生管的能力，所述培養(yǎng)基含有高血清水平(〉10%自體血清或非自體血清)、1、2、10或20ng/ml的VEGF、和5-25IU/ml的肝素。圖1呈現(xiàn)了典型的管形成圖象。在這些用人血進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，使用本文上面描述的方案，利用x4和x20放大率的倒置顯微鏡(NikonECLIPSETS100)獲得圖像。圖1顯示了來(lái)自培養(yǎng)物中第一批EPC富集物的管形成測(cè)試。實(shí)施例2.在一組單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，在存在培養(yǎng)基的纖連蛋白包被的T-75燒瓶中體外生長(zhǎng)之后，評(píng)估來(lái)自第二批細(xì)胞的EPC富集物，所述培養(yǎng)基含有自體血清、VEGF、b-FGF、IGF和肝素。實(shí)施例2的表中總結(jié)了20個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)百分比染色結(jié)果。在這些用人血進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，使用本文上面描述的方案，在含有高血清水平(>10%)和l、2、10或20ng/ml的VEGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞的FACS染色結(jié)果示出了從0天到13天染色水平的如下改變:實(shí)施例2的表.在13天培養(yǎng)后第二批EPC富集<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>實(shí)施例3.在一組單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，在存在培養(yǎng)基的纖連蛋白包被的T-75燒瓶中體外生長(zhǎng)之后，評(píng)估來(lái)自第一批細(xì)胞的EPC的富集，所述培養(yǎng)基含有自體血清、VEGF和肝素。實(shí)施例3的表中總結(jié)了獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)百分比染色結(jié)果。使用本文上面描述的方案，用人血進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)。溫育之前，細(xì)胞顯示少于1%CD34?？偨Y(jié)在含有5-20%自體血清(典型為10%);1、2、10或20ng/ml的VEGF和5-25IU/ml肝素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞的FACS染色結(jié)果。分析下列表面標(biāo)記CD45(泛淋巴細(xì)胞標(biāo)記)、干細(xì)胞/祖細(xì)胞標(biāo)記CD34和CD117、和EPC/內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記CD133、KDR(VEGF-R)、CD144和Dil-Ac-LDL。實(shí)施例3的表.在存在VEGF的情況下在纖連蛋白預(yù)包被的燒瓶中培養(yǎng)的第一批EPC的特征<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>實(shí)施例4.在一組單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，在存在培養(yǎng)基的自體血漿包被的T-75燒瓶中體外生長(zhǎng)之后，評(píng)估來(lái)自第一批細(xì)胞的EPC富集，所述培養(yǎng)基含有自體血清、VEGF和肝素。實(shí)施例4的表中總結(jié)了17個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)百分比染色結(jié)果。使用本文上面描述的方案，用人血進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)。溫育之前，細(xì)胞顯示少于1%CD34?？偨Y(jié)在含有5-20%自體血清(典型為10%)，1、2、10或20ng/ml的VEGF禾Q5-25IU/ml肝素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞的FACS染色結(jié)果。分析下列表面標(biāo)記:CD45(泛淋巴細(xì)胞標(biāo)記)、干細(xì)胞/祖細(xì)胞標(biāo)記CD34和CD117、和EPC/內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記CD133和KDR(VEGF-R)。實(shí)施例4的表.在血漿包被的燒瓶中培養(yǎng)的第一批EPC的特征標(biāo)記AVGSECD4589.461.75CD346.941.29CD1174.250.72CD1332.030.57KDR1.310.39實(shí)施例5.在一組單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，在存在培養(yǎng)基的自體血漿包被的T-75燒瓶中體外生長(zhǎng)之后，評(píng)估來(lái)自第一批細(xì)胞的EPC富集，所述培養(yǎng)基含有自體血清、VEGF、孕酮和肝素。實(shí)施例5的表中總結(jié)了3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)百分比染色結(jié)果。使用本文上面描述的方案，用人血進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)。溫育之前，細(xì)胞顯示少于1%CD34?？偨Y(jié)在含有5-20%自體血清(典型為10%)，1、2、10或20ng/ml的VEGF、0.02-2微克/ml的孕酮和5-25IU/ml肝素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞的FACS染色結(jié)果。分析下列表面標(biāo)記CD45(泛淋巴細(xì)胞標(biāo)記)、干細(xì)胞/祖細(xì)胞標(biāo)記CD34和CD117、和EPC/內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記CD133和KDR(VEGF-R)。實(shí)施例5的表.在存在孕酮的情況下在血漿預(yù)包被的燒瓶中培養(yǎng)的第一批EPC的特征<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>實(shí)施例6.在一組單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，在存在培養(yǎng)基的自體血漿包被的T-75燒瓶中體外生長(zhǎng)之后，評(píng)估來(lái)自第一批細(xì)胞的EPC的富集，所述培養(yǎng)基含有自體血清、VEGF、17-e-雌二醇和肝素。實(shí)施例6的表中總結(jié)了3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)百分比染色結(jié)果。使用本文上面描述的方案，用人血進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)。溫育之前，細(xì)胞顯示少于1%CD34?？偨Y(jié)在含有5-20%自體血清(典型為10%)，1、2、10或20ng/ml的VEGF，0.002-2微克/ml的17-P-雌二醇和5-25IU/ml肝素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞的FACS染色結(jié)果。分析下列表面標(biāo)記CD45(泛淋巴細(xì)胞標(biāo)記)、干細(xì)胞/祖細(xì)胞標(biāo)記CD34和CD117、和EPC/內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記CD133禾nKDR(VEGF-R)。實(shí)施例6的表.在存在17-3-雌二醇的情況下在血漿預(yù)包被的燒瓶中培養(yǎng)的第一批EPC的特征<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>實(shí)施例7.在一組單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，在存在培養(yǎng)基的用血漿和抗CD34抗體包被的T-75燒瓶中體外生長(zhǎng)之后，評(píng)估來(lái)自第一批細(xì)胞的EPC的富集，所述培養(yǎng)基含有自體血清、VEGF和肝素。實(shí)施例7的表中顯示了2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)百分比染色結(jié)果。使用本文上面描述的方案，用人血進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)。溫育之前，細(xì)胞顯示少于1%CD34。顯示了在用5ml自體血漿和0.5-10微克/ml抗人CD34包被的T-75燒瓶中在含有5-20%自體血清(典型為10%)，1、2、10或20ng/ml的VEGF和5-25IU/ml肝素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞的FACS染色結(jié)果。分析下列表面標(biāo)記CD45(泛淋巴細(xì)胞標(biāo)記)、干細(xì)胞/祖細(xì)胞標(biāo)記CD34和CD117、和EPC/內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記CD133和KDR(VEGF-R)。實(shí)施例7的表.在血漿和抗CD34包被的燒瓶中培養(yǎng)的第一批EPC的特征<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>實(shí)施例8.在一組單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，在高XC02濕環(huán)境中，在存在培養(yǎng)基的纖連蛋白包被的T-75燒瓶中體外生長(zhǎng)之后，評(píng)估來(lái)自第一批細(xì)胞的EPC的富集，所述培養(yǎng)基含有自體血清、VEGF和肝素。實(shí)施例8的表中總結(jié)了3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)百分比染色結(jié)果。使用本文上面描述的方案，用人血進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)。溫育之前，細(xì)胞顯示少于1%CD34。顯示了在37。C、6.5-12.5%(:02和97%濕度下溫育的5-20%自體血清(典型為10%)，1、2、10或20ng/ml的VEGF，0.002-2微克/ml的17-P-雌二醇和5-25IU/ml肝素。分析下列表面標(biāo)記CD45(泛淋巴細(xì)胞標(biāo)記)、干細(xì)胞/祖細(xì)胞標(biāo)記CD34、和EPC/內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記CD133。實(shí)施例8的表.在含有高碳酸條件的潮濕環(huán)境下培養(yǎng)的第一批EPC的特征標(biāo)記AVGSECD45卯.474.53CD3423.7717-93CD1334.482.10對(duì)機(jī)體組織的血液供給完全或部分喪失(缺血)在許多疾病中或者是疾病結(jié)果的原因或者造成疾病結(jié)果的中期階段的常見(jiàn)機(jī)制。在供給上的這一短缺導(dǎo)致受影響的組織進(jìn)行性地變得不能完成其功能，導(dǎo)致由于營(yíng)養(yǎng)喪失、主要是氧的喪失以及代謝物如co2的聚集所產(chǎn)生的病理過(guò)程的開(kāi)始。如果這些過(guò)程很?chē)?yán)重，它們最終導(dǎo)致細(xì)胞和組織死亡。誘導(dǎo)新血管形成以增加或代替受損害的血液供給導(dǎo)致了受影響組織或器官的功能的恢復(fù)，并防止受影響的細(xì)胞的死亡。心臟病學(xué)家實(shí)施的對(duì)缺血器官恢復(fù)血液供給(例如，通過(guò)冠狀血管移植物手術(shù)和球囊血管成形術(shù))的原則是恢復(fù)心臟功能并防止進(jìn)一步的惡化。這一侵入性方法通常僅在較大和中等大小的血管發(fā)生梗塞時(shí)可行。然而，在許多與血管化衰退有關(guān)的疾病中，梗塞發(fā)生在并不適用于這類(lèi)介入的小血管中。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，給血液匱乏的器官和組織供應(yīng)EPC以便利用將自身或非自身內(nèi)皮祖細(xì)胞/干細(xì)胞直接注入到缺血組織或者該缺血組織周?chē)挠H代血管中，通過(guò)在匱乏器官中產(chǎn)生新的血管來(lái)增加或代替缺陷的血管化。這種脈管系統(tǒng)的成功創(chuàng)建通?；謴?fù)功能、防止進(jìn)一步惡化、阻斷在血液供給喪失所繼發(fā)的病理過(guò)程形成、和/或防止受影響器官的細(xì)胞死亡。此外，在一些情況下，在器官某些區(qū)域內(nèi)可控血管形成減少了器官內(nèi)其他區(qū)域的會(huì)降低器官功能的病理血管化。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)器官或組織供應(yīng)EPC來(lái)治療一或多種如下的缺血相關(guān)病癥。受損的血液供應(yīng)的改善結(jié)果通常部分或完全治愈了疾病或者導(dǎo)致病癥進(jìn)展的停止或減慢。*青光眼。這種疾病包括與視神經(jīng)頭部(opticnervehead)缺血相關(guān)的視神經(jīng)纖維的進(jìn)行性死亡。導(dǎo)致視神經(jīng)頭脈管系統(tǒng)康復(fù)的治療通常阻止疾病發(fā)展并恢復(fù)視神經(jīng)的一些功能(至少在那些盡管在神經(jīng)頭部處軸突已經(jīng)損害，但細(xì)胞體還沒(méi)有死亡的視神經(jīng)纖維上)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將EPC注射到視神經(jīng)頭部和/或其周?chē)ǔ．a(chǎn)生希望的脈管系統(tǒng)誘導(dǎo)。(見(jiàn)上述FlammeraJ等人的文章)*年齡相關(guān)黃斑變性。這一疾病與脈絡(luò)膜中的循環(huán)紊亂有關(guān)，脈絡(luò)膜是為視網(wǎng)膜外層供血以滿(mǎn)足其代謝需求的血管組織。這些紊亂損害視網(wǎng)膜，導(dǎo)致其進(jìn)行性死亡并相繼引起視覺(jué)功能降低。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將EPC注射到脈絡(luò)膜中通常阻止疾病的進(jìn)展并防止失明。(見(jiàn)上述ZarbinMA的文章)*糖尿病視網(wǎng)膜病。這一疾病是導(dǎo)致視網(wǎng)膜局部缺血因此水腫而損害視覺(jué)的小血管疾病。雖然發(fā)生新血管化，但是其作為缺血的結(jié)果還會(huì)發(fā)生，并且它發(fā)生在對(duì)精確視覺(jué)最重要的區(qū)域一一視網(wǎng)膜中區(qū)(macula)，從而損害視覺(jué)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)將EPC施予到鄰近但不在視網(wǎng)膜中區(qū)之中的區(qū)域而產(chǎn)生的可控誘導(dǎo)血管生長(zhǎng)來(lái)減少或者消除視網(wǎng)膜中區(qū)內(nèi)血管生長(zhǎng)和水腫形成。這一EPC誘導(dǎo)的可控誘導(dǎo)血管生長(zhǎng)典型地給視網(wǎng)膜供應(yīng)充足的血液以消除視網(wǎng)膜對(duì)視網(wǎng)膜中區(qū)血管化的需求。(見(jiàn)上面參考的FrankRN的文章以及上面參考的SingletonJR等人的文章。)*糖尿病腎病。這一疾病涉及腎臟血管的動(dòng)脈粥樣硬化堵塞和腎臟的血液過(guò)濾結(jié)構(gòu)的破壞從而導(dǎo)致必須進(jìn)行透析的腎衰竭。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)將EPC注射到腎臟中誘導(dǎo)血管替換而阻止該過(guò)程。(見(jiàn)上面參考的BahlmannFH等人的文章。(2004))*骨不結(jié)合。這一在外傷和手術(shù)后發(fā)生的事通常由受影響骨的骨折/手術(shù)切口區(qū)域內(nèi)血液供應(yīng)不足造成的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)受影響骨的骨折/手術(shù)切口區(qū)域局部應(yīng)用EPC可恢復(fù)血管化并使損傷康復(fù)。*慢性皮膚潰瘍。這些損傷是皮膚相關(guān)區(qū)域受損的血液供應(yīng)的結(jié)果。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)慢性皮膚潰瘍局部應(yīng)用EPC可恢復(fù)血液供應(yīng)并通常導(dǎo)致傷口愈合。*中風(fēng)后血管性癡呆。這一狀態(tài)由大腦中血管的進(jìn)行性不可逆閉合所產(chǎn)生。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，給大腦供應(yīng)EPC可恢復(fù)至少部分受損循環(huán)從而恢復(fù)腦功能和/或使腦功能惡化減慢。*糖尿病血管病變。在肢體上的這一小血管進(jìn)行性梗塞通常是引起手術(shù)截肢的原因。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)在受影響肢體處局部注射EPC恢復(fù)循環(huán)來(lái)防止這種截肢。類(lèi)似所有的移植，皮膚移植物倚賴(lài)血液供給存活(例如，見(jiàn)上述Greenfield編輯的書(shū)籍和上述Kouwenhoven等人的文章。)游離移植物和皮瓣都有因?yàn)檠芑蛔愣　Ｓ坞x移植物需要在床上足夠的血管化，而皮瓣需要自己連續(xù)的血液供應(yīng)直到建立局部吻合(例如，見(jiàn)上述BrowneEZ等人、Chen等人以及Beatrice等人的文章)。對(duì)于由人工皮膚制成的移植物這也是正確的(例如，見(jiàn)上述Ferretti等人的文章)。在這些例子中，良好的血管化是移植物的最佳神經(jīng)移植術(shù)的先決條件。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)用EPC種植皮膚移植物來(lái)誘導(dǎo)血管化。這種EPC誘導(dǎo)血管化通常增加皮膚移植物存活的可能性。對(duì)于一些應(yīng)用來(lái)說(shuō)，使用了這種EPC種植技術(shù)并結(jié)合了修改的上述Scheduler等人的文章中所述內(nèi)皮細(xì)胞移植技術(shù)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)在斷肢再接期間將EPC種植在連接位置處可誘導(dǎo)血管化。這種EPC種植通常幫助恢復(fù)再接肢體的微循環(huán)。注意的是本文上面所述的指示僅是治療性使用EPC的例子。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，其中血液循環(huán)受損的其它病癥可通過(guò)給血管不足或沒(méi)有血管的位置恰當(dāng)?shù)貞?yīng)用EPC來(lái)進(jìn)行治療。還值得注意的是本文所述的關(guān)于在給心臟病患者施用前增加干細(xì)胞群的技術(shù)也適用于具有本文上述任何一種病癥的患者。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包含實(shí)施在一或兩個(gè)下面臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)中所述的技術(shù)(任選結(jié)合本文所述技術(shù))(a)2004年6月1日提交的、題為"Invitrotechniquesforusewithstemcells"的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)60/576,266，禾口(b)2004年7月15日提交的、題為"Indicationsforstemcelluse"的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)60/588,520。這兩個(gè)申請(qǐng)都轉(zhuǎn)讓給本專(zhuān)利申請(qǐng)的受讓人，并并入本文參考。在正在進(jìn)行的臨床研究中評(píng)價(jià)了從第一批細(xì)胞中富集的EPC的安全性和效力。這些實(shí)驗(yàn)利用本文上述方案用患者的自體血液進(jìn)行。由TheraVitae發(fā)起并根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案進(jìn)行的臨床試驗(yàn)中已經(jīng)登記了16名在最大藥物治療中仍患有嚴(yán)重心絞痛的患者。如心血管臨床試驗(yàn)的常規(guī)做法一樣，跟蹤這些患者達(dá)6個(gè)月。每名患者用治療后的狀態(tài)與治療前的狀態(tài)相比構(gòu)成他/她的自身對(duì)照。下面顯示了已經(jīng)跟蹤至少三個(gè)月的最初十名患者的一些結(jié)果。應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)的是本文所顯示的結(jié)果不是完整的，臨床試驗(yàn)結(jié)束后將進(jìn)行數(shù)據(jù)的全面分析。安全性-該治療顯示了很高的安全特性。有限數(shù)量的患者發(fā)展了被界定為可能與治療有關(guān)的輕微的不良事件(在血管造影期間紅細(xì)胞沉降率升高、胸部疼痛)。在短暫時(shí)期后這些現(xiàn)象消失并不影響患者的臨床狀態(tài)。效力(見(jiàn)表1、2禾B3)-如在加拿大心血管協(xié)會(huì)對(duì)心絞痛評(píng)分等級(jí)(CanadianCardiovascularSocietyGradingScaleforAnginaPectoris)(CCS)中的改進(jìn)所示，所有患者一般臨床癥狀均有所改善，顯示了更好的活動(dòng)能力。所有患者改善了他們無(wú)心臟癥狀的行走能力。這一發(fā)現(xiàn)還通過(guò)估計(jì)的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷(workload)的增加而被支持，通過(guò)sestamibi掃描進(jìn)行活動(dòng)能力的客觀評(píng)估。兩個(gè)結(jié)果顯示了很高的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。表I:由加拿大心血管協(xié)會(huì)對(duì)心絞痛評(píng)分等級(jí)(CCS)所證明的患者的臨床改善<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>表III:由評(píng)估工作量(METs)所證明的在3個(gè)月時(shí)的患者改善在一個(gè)實(shí)施方案中，可給人或動(dòng)物施用本文任一權(quán)利要求記述的由任一技術(shù)所產(chǎn)生的EPC。在一個(gè)實(shí)施方案中，在治療血管和/或心臟紊亂、或者治療衰老、或者治療系統(tǒng)紊亂、或者治療多系統(tǒng)紊亂中可使用本文任一權(quán)利要求記述的任一技術(shù)所產(chǎn)生的EPC。對(duì)于一些應(yīng)用，本文所述技術(shù)可應(yīng)用于動(dòng)物組織。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到本發(fā)明并不限于本文所特定示出和描述的。而是，本發(fā)明的范圍包括本文上述各種特征的組合及子組合，以及其在現(xiàn)有技術(shù)中沒(méi)有的改動(dòng)和修正，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在閱讀前面說(shuō)明時(shí)將會(huì)想到這些改動(dòng)和修正。權(quán)利要求1、一種使用所提取的血液的方法，包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；通過(guò)培養(yǎng)第二批細(xì)胞3到30天來(lái)增加密度在1.055到1.074g/ml之間的細(xì)胞的數(shù)量；和鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的內(nèi)皮祖細(xì)胞。2、根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中將血液施加到第一梯度包括將血液施加到包括蔗糖和環(huán)氧氯丙垸的共聚物的溶液中。3、根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中將第一批細(xì)胞施加到第二梯度包括將第一批細(xì)胞施加到碘克沙醇的水溶液中。4、根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中將第一批細(xì)胞施加到第二梯度包括將第一批細(xì)胞施加到包括用聚乙烯吡咯烷酮包被的硅膠的梯度密度溶液中。5、根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中將血細(xì)胞施加到第一梯度包括將血細(xì)胞施加到Ficoll樣梯度中。6、根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中將第一批細(xì)胞施加到第二梯度包括將第一批細(xì)胞施加到OptiPrep樣梯度中。7、根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中將第一批細(xì)胞施加到第二梯度包括將第一批細(xì)胞施加到Percoll樣梯度中。8、一種使用所提取的干細(xì)胞的方法，包括-將包括干細(xì)胞的組織施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；將第二批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.068g/ml之間的第三批細(xì)胞的第三梯度；和通過(guò)培養(yǎng)第三批細(xì)胞3到30天來(lái)增加密度在1.055到1.068g/ml之間的細(xì)胞的數(shù)量；以及鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的內(nèi)皮祖細(xì)胞。9、根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中第三梯度適于選擇密度在1.059到1.068g/ml之間的細(xì)胞，并且其中將第二批細(xì)胞施加到第三梯度包含選擇密度在1.059到1.068g/ml之間的細(xì)胞。10、一種使用所提取的血液的方法，包含將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；在包含血漿的表面上培養(yǎng)第二批細(xì)胞；以及鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。11、根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中培養(yǎng)包括當(dāng)所述表面用自體血漿包被時(shí)，在該表面上培養(yǎng)第二批細(xì)胞。12、根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中培養(yǎng)包括當(dāng)所述表面用選自同種異型血漿和異種血漿中的至少一種血漿包被時(shí)，在該表面上培養(yǎng)第二批細(xì)胞。13、一種使用組織的方法，包含在包含血漿的表面上培養(yǎng)組織。14、根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述組織包含血液。15、根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述血漿包含自體血漿。16、一種使用所提取的血液的方法，包含將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；在包含抗體的表面上培養(yǎng)第二批細(xì)胞；和鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。17、根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中祖細(xì)胞包括內(nèi)皮袓細(xì)胞(EPC)，并且其中鑒別所述祖細(xì)胞包含鑒別EPC。18、根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中培養(yǎng)包括當(dāng)所述表面用自體血漿包被時(shí)，在該表面上培養(yǎng)第二批細(xì)胞。19、根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中培養(yǎng)包括當(dāng)所述表面用選自同種異型血漿和異種血漿中的至少一種血漿包被時(shí)，在該表面上培養(yǎng)第二批細(xì)胞。20、一種使用所提取的血液的方法，包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；在包含促生長(zhǎng)分子而非膠原或纖連蛋白的表面上培養(yǎng)第二批細(xì)胞；和鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。21、根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中祖細(xì)胞包括內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，并且其中鑒別所述祖細(xì)胞包括鑒別EPC。22、根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中培養(yǎng)第二批細(xì)胞包括在除了促生長(zhǎng)分子外還包含膠原和纖連蛋白中的至少一種的表面上培養(yǎng)第二批細(xì)胞。23、一種使用所提取的血液的方法，包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；在包括高至5%的血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第二批細(xì)胞1到5天；以及鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。24、根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中祖細(xì)胞包括內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，并且其中鑒別所述祖細(xì)胞包括鑒別EPC。25、一種使用所提取的血液的方法，包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；在包括大于10%的血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第二批細(xì)胞1到5天；以及鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。26、根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中祖細(xì)胞包括內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，并且其中鑒別所述祖細(xì)胞包含鑒別EPC。27、根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中培養(yǎng)第二批細(xì)胞包括在包含少于20%的血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第二批細(xì)胞。28、一種使用所提取的血液的方法，包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；在低血清階段，在包括少于10%的血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第二批細(xì)胞；在高血清階段，在大于或等于10%的血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第二批細(xì)胞；以及鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。29、根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中祖細(xì)胞包括內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，并且其中鑒別所述祖細(xì)胞包括鑒別EPC。30、根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中在低血清階段培養(yǎng)第二批細(xì)胞包括在包含最高為5%的血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第二批細(xì)胞。31、根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中在低血清階段培養(yǎng)第二批細(xì)胞包括在無(wú)血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第二批細(xì)胞。32、根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中在低血清階段培養(yǎng)第二批細(xì)胞包括培養(yǎng)第二批細(xì)胞1到5天。33、根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中在高血清階段培養(yǎng)第二批細(xì)胞包括培養(yǎng)第二批細(xì)胞1到30天。34、根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中在高血清階段培養(yǎng)第二批細(xì)胞之前，在低血清階段培養(yǎng)第二批細(xì)胞。35、根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中在高血清階段培養(yǎng)第二批細(xì)胞之后，在低血清階段培養(yǎng)第二批細(xì)胞。36、一種使用所提取的血液的方法，包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；在一至少2小時(shí)的低氧階段中，在低氧條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞；在一至少1天的非低氧階段中，在非低氧條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞；及鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。37、根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中祖細(xì)胞包括內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，并且其中鑒別所述祖細(xì)胞包括鑒別EPC。38、根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中低氧和非低氧階段都在一小于30天的培養(yǎng)期內(nèi)，且其中在低氧條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞包括在培養(yǎng)期的最初兩天在低氧條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞。39、根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中低氧和非低氧階段都在一小于30天的培養(yǎng)期內(nèi)，且其中在低氧條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞包括在培養(yǎng)期的最后兩天在低氧條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞。40、根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中低氧和非低氧階段都在一小于30天的培養(yǎng)期內(nèi)，且其中在低氧條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞包括在培養(yǎng)期的最初兩天和最后兩天之間在低氧條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞至少2小時(shí)。41、根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中在非低氧條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞之前，在低氧條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞。42、根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中在非低氧條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞之后，在低氧條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞。43、一種使用所提取的血液的方法，包括將血液施加到梯度中以選擇具有第一希望密度范圍的細(xì)胞；通過(guò)在包括雌激素的培養(yǎng)基中并隨后在包括孕激素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所選擇的細(xì)胞來(lái)增加具有第二希望密度范圍的細(xì)胞的數(shù)量；以及鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。44、一種使用所提取的血液的方法，包括將血液施加到梯度中以選擇具有第一希望密度范圍的細(xì)胞；通過(guò)在包括孕激素的培養(yǎng)基中并隨后在包括雌激素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所選擇的細(xì)胞來(lái)增加具有第二希望密度范圍的細(xì)胞的數(shù)量；以及鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。45、一種使用所提取的血液的方法，包括將血液施加到梯度中以選擇具有第一希望密度范圍的細(xì)胞；通過(guò)在包括孕激素和雌激素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所選擇的細(xì)胞來(lái)增加具有第二希望密度范圍的細(xì)胞的數(shù)量；以及鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。46、根據(jù)權(quán)利要求43-45任一項(xiàng)的方法，其中祖細(xì)胞包括內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，并且其中鑒別所述祖細(xì)胞包括鑒別EPC。47、根據(jù)權(quán)利要求43-45任一項(xiàng)的方法，其中孕激素包括孕酮。48、根據(jù)權(quán)利要求43-45任一項(xiàng)的方法，其中雌激素包括雌二醇。49、根據(jù)權(quán)利要求43-45任一項(xiàng)的方法，其中培養(yǎng)包括培養(yǎng)3到30天。50、一種使用所提取的血液的方法，包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；在一至少2小時(shí)的高碳酸階段中，在高碳酸條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞，高碳酸階段特征在于C02水平大于5%;在一至少1天的非高碳酸階段中，在非高碳酸條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞，非高碳酸階段特征在于C02水平小于或等于5X;以及鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。51、根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中祖細(xì)胞包括內(nèi)皮袓細(xì)胞(EPC)，并且其中鑒別所述祖細(xì)胞包括鑒別EPC。52、根據(jù)權(quán)利要求50的方法，包括在高碳酸階段設(shè)定C02水平為至少6%。53、根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中高碳酸階段和非高碳酸階段都在一少于30天的培養(yǎng)期內(nèi)，并且其中在高碳酸條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞包括在培養(yǎng)期的最初兩天在高碳酸條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞。54、根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中高碳酸階段和非高碳酸階段都在一少于30天的培養(yǎng)期內(nèi)，并且其中在高碳酸條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞包括在培養(yǎng)期的最后兩天在高碳酸條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞。55、根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中高碳酸階段和非高碳酸階段都在一少于30天的培養(yǎng)期內(nèi)，并且其中在高碳酸條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞包括在培養(yǎng)期的最初兩天和最后兩天之間在高碳酸條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞至少2小日寸。56、根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中在非高碳酸條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞之前，在高碳酸條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞。57、根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中在非高碳酸條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞之后，在高碳酸條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞。58、一種使用所提取的血液的方法，包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；在包括選自下列至少一種物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第二批細(xì)胞促紅細(xì)胞生成素、VEGF、IGF、FGF、雌激素、17-P-雌二醇、雌酮、雌三醇、雌二醇衍生物、戊酸雌二醇、環(huán)戊丙酸雌二醇、美雌醇、炔雌醚、孕激素、來(lái)自孕激素家族的分子、孕酮、合成孕酮、hydroxyprogesteronecaroate、醋酸甲羥孕酮、他汀類(lèi)藥物、辛伐他汀、阿伐他汀、抗糖尿病藥物和羅格列酮；和鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。59、根據(jù)權(quán)利要求58的方法，其中祖細(xì)胞包括內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，并且其中鑒別所述祖細(xì)胞包括鑒別EPC。60、一種使用所提取的干細(xì)胞的方法，包括將包括干細(xì)胞的組織施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；通過(guò)培養(yǎng)第二批細(xì)胞3到30天來(lái)增加密度在1.055到1.074g/ml之間的細(xì)胞的數(shù)量；禾口鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。61、根據(jù)權(quán)利要求60的方法，其中祖細(xì)胞包括內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，并且其中鑒別所述祖細(xì)胞包括鑒別EPC。62、根據(jù)權(quán)利要求60的方法，其中施加組織包括將臍帶血施加到第一梯度。63、根據(jù)權(quán)利要求60的方法，其中施加組織包括將胚胎細(xì)胞施加到第一梯度。64、根據(jù)權(quán)利要求60的方法，其中施加組織包括將胎盤(pán)細(xì)胞施加到第一梯度。65、根據(jù)權(quán)利要求60的方法，其中施加組織包括將胎兒細(xì)胞施加到第一梯度。66、根據(jù)權(quán)利要求60的方法，包括自骨髓提取干細(xì)胞。67、根據(jù)權(quán)利要求60的方法，包括動(dòng)員來(lái)自骨髓的干細(xì)胞以方便干細(xì)胞的提取。68、根據(jù)權(quán)利要求60的方法，包括自外周血提取干細(xì)胞。69、根據(jù)權(quán)利要求60的方法，其中培養(yǎng)第二批細(xì)胞包括在培養(yǎng)的第一階段期間于第一容器中培養(yǎng)第二批細(xì)胞；在培養(yǎng)的第一階段末期從第一容器中取出至少一些第二批細(xì)胞；和在培養(yǎng)的第二階段期間于第二容器中培養(yǎng)從第一容器中所取出的細(xì)胞。70、根據(jù)權(quán)利要求69的方法，其中取出至少一些第二批細(xì)胞包括選擇取出粘附在第一容器表面上的細(xì)胞。71、根據(jù)權(quán)利要求69的方法，其中取出至少一些第二批細(xì)胞包括選擇取出沒(méi)有粘附在第一容器表面上的細(xì)胞。72、根據(jù)權(quán)利要求69的方法，其中第一容器包括在其表面上的促生長(zhǎng)分子，并且其中在第一容器中培養(yǎng)細(xì)胞包括在包括促生長(zhǎng)分子的第一容器中培養(yǎng)細(xì)胞。73、根據(jù)權(quán)利要求72的方法，其中促生長(zhǎng)分子選自如下血漿、膠原、纖連蛋白、生長(zhǎng)因子、以及干細(xì)胞表面受體的抗體。74、根據(jù)權(quán)利要求69的方法，其中第二容器包括在其表面上的促生長(zhǎng)分子，并且其中在第二容器中培養(yǎng)細(xì)胞包括在包括促生長(zhǎng)分子的第二容器中培養(yǎng)細(xì)胞。75、根據(jù)權(quán)利要求74的方法，其中促生長(zhǎng)分子選自如下血漿、膠原、纖連蛋白、生長(zhǎng)因子、以及干細(xì)胞表面受體的抗體。76、一種治療病癥的方法，包括將內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)施加到選自如下的個(gè)體的組織附近或間隙個(gè)體的外周神經(jīng)組織、個(gè)體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)組織、個(gè)體的視祌經(jīng)、個(gè)體的脈絡(luò)膜組織、個(gè)體的視網(wǎng)膜組織、個(gè)體的視網(wǎng)膜下間隙、個(gè)體的角膜組織、個(gè)體的腎組織、個(gè)體的受損骨組織、個(gè)體的骨折的骨組織、個(gè)體的發(fā)炎組織、個(gè)體的被感染組織、個(gè)體的挫傷組織、個(gè)體皮膚的損傷、潰瘍或創(chuàng)傷組織及個(gè)體的腦組織、個(gè)體的肢體組織、個(gè)體的皮膚移植物組織及個(gè)體的再植的斷肢組織。77、根據(jù)權(quán)利要求76的方法，包括通過(guò)下面步驟產(chǎn)生EPC:將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；通過(guò)培養(yǎng)第二批細(xì)胞3到30天來(lái)增加密度在1.055到1.074g/ml之間的細(xì)胞的數(shù)量。78、根據(jù)權(quán)利要求76的方法，包括通過(guò)下面步驟產(chǎn)生EPC:將包括干細(xì)胞的組織施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；將第二批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.068g/ml之間的第三批細(xì)胞的第三梯度；和通過(guò)培養(yǎng)第三批細(xì)胞3到30天來(lái)增加密度在1.055到1.068g/ml之間的細(xì)胞的數(shù)量。79、根據(jù)權(quán)利要求76的方法，包括通過(guò)下面步驟產(chǎn)生EPC:將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；和在包括抗體的表面上培養(yǎng)第二批細(xì)胞。80、根據(jù)權(quán)利要求76的方法，包括通過(guò)下面步驟產(chǎn)生EPC:將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度;在包括促生長(zhǎng)分子而非膠原或纖連蛋白的表面上培養(yǎng)第二批細(xì)胞。81、根據(jù)權(quán)利要求76的方法，包括通過(guò)下面步驟產(chǎn)生EPC:將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；和在包括最高為5%的血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第二批細(xì)胞1到5天。82、根據(jù)權(quán)利要求76的方法，包括通過(guò)下面步驟產(chǎn)生EPC:將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；和在包括大于10%的血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第二批細(xì)胞1到5天。83、根據(jù)權(quán)利要求76的方法，包括通過(guò)下面步驟產(chǎn)生EPC:將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；在低血清階段中，在包括小于10%的血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第二批細(xì)胞；禾口在高血清階段中，在包括大于或等于10%的血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第二批細(xì)胞。84、根據(jù)權(quán)利要求76的方法，包括通過(guò)下面步驟產(chǎn)生EPC:將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；在一至少2小時(shí)低氧階段中，在低氧條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞；和在一至少1天的非低氧階段中，在非低氧條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞。85、根據(jù)權(quán)利要求76的方法，包括通過(guò)下面步驟產(chǎn)生EPC:將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；在一至少2小時(shí)的高碳酸階段中，在高碳酸條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞，高碳酸階段特征在于C02水平大于5%;和在一至少1天的非高碳酸階段中，在非高碳酸條件下培養(yǎng)第二批細(xì)胞，非高碳酸階段特征在于C02水平小于或等于5X。86、根據(jù)權(quán)利要求76的方法，包括通過(guò)下面步驟產(chǎn)生EPC:將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；在包括選自下列至少一種物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第二批細(xì)胞促紅細(xì)胞生成素、雌激素、雌激素家族分子、17-e-雌二醇、雌酮、雌三醇、雌二醇衍生物、戊酸雌二醇、環(huán)戊丙酸雌二醇、美雌醇、炔雌醚、孕激素、孕激素家族分子、孕酮、合成孕酮、hydroxyprogesteronecaroate、醋酸甲羥孕酮、他汀類(lèi)藥物、辛伐他汀、阿伐他汀、抗糖尿病藥物和羅格列酮；將包括干細(xì)胞的組織施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；和通過(guò)培養(yǎng)第二批細(xì)胞3到30天來(lái)增加密度在1.055到1.074g/ml之間的細(xì)胞的數(shù)量。87、一種使用所提取的血液的方法，包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；通過(guò)培養(yǎng)第二批細(xì)胞1到30天，增加密度在1.055到1.074g/ml之間的細(xì)胞的數(shù)量；以及鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。88、根據(jù)權(quán)利要求87的方法，其中祖細(xì)胞包括內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，并且其中鑒別所述祖細(xì)胞包括鑒別EPC。89、一種使用所提取的血液的方法，包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；將第一批細(xì)胞劃分成其各自的第一和第二部分；將第一批細(xì)胞的第一部分施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；將第一批細(xì)胞的第二部分與具有1.055到1.074g/ml之間密度的細(xì)胞混合；通過(guò)培養(yǎng)第二批細(xì)胞3到30天來(lái)增加密度在1.055到1.074g/ml之間的細(xì)胞的數(shù)量；以及鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。90、根據(jù)權(quán)利要求89的方法，其中祖細(xì)胞包括內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，并且其中鑒別所述祖細(xì)胞包括鑒別EPC。91、根據(jù)權(quán)利要求89的方法，其中劃分第一批細(xì)胞包括設(shè)定第一部分大于第二部分。92、根據(jù)權(quán)利要求89的方法，其中劃分第一批細(xì)胞包括設(shè)定第一部分小于第二部分。93、一種使用所提取的血液的方法，包括將血液施加到梯度以選擇具有第一希望密度范圍的細(xì)胞；通過(guò)培養(yǎng)所選擇的細(xì)胞3到30天來(lái)增加具有第二希望密度范圍的細(xì)胞的數(shù)量；和鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。94、根據(jù)權(quán)利要求93的方法，其中祖細(xì)胞包括內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，并且其中鑒別所述祖細(xì)胞包括鑒別EPC。95、根據(jù)權(quán)利要求93的方法，其中將血液施加到梯度中包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的細(xì)胞的梯度。96、根據(jù)權(quán)利要求93的方法，其中將血液施加到梯度中包括將血液施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的細(xì)胞的梯度。97、根據(jù)權(quán)利要求93的方法，其中增加細(xì)胞的數(shù)量包括培養(yǎng)細(xì)胞4到8天。98、根據(jù)權(quán)利要求93的方法，其中將血液施加到梯度中包括將血液施加到包括蔗糖和環(huán)氧氯丙烷共聚物的溶液中。99、根據(jù)權(quán)利要求93的方法，其中將血液施加到梯度中包括將血液施加到包括用聚乙烯吡咯烷酮包被的硅膠的梯度密度溶液中。100、根據(jù)權(quán)利要求93的方法，其中將血液施加到梯度中包括將血液施加到碘克沙醇的水溶液中。101、根據(jù)權(quán)利要求93的方法，其中將血液施加到梯度中包括將血液施加到Ficoll樣梯度中。102、根據(jù)權(quán)利要求93的方法，其中將血液施加到梯度中包括將血液施加到OptiPrep樣梯度中。103、根據(jù)權(quán)利要求93的方法，其中將血液施加到梯度中包括將血液施加到Percoll樣梯度中。104、一種使用所提取的血液的方法，包括將血液施加到梯度以選擇具有希望密度范圍的細(xì)胞；在包括自體血漿的表面上培養(yǎng)所選擇的細(xì)胞3到30天；和鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。105、根據(jù)權(quán)利要求104的方法，其中祖細(xì)胞包括內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，并且其中鑒別所述祖細(xì)胞包括鑒別EPC。106、一種使用所提取的血液的方法，包括將血液施加到梯度以選擇具有希望密度范圍的細(xì)胞；在包括抗體的表面上培養(yǎng)所選擇的細(xì)胞；和鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。107、根據(jù)權(quán)利要求106的方法，其中祖細(xì)胞包括內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，并且其中鑒別所述祖細(xì)胞包括鑒別EPC。108、根據(jù)權(quán)利要求104或106的方法，其中將血液施加到梯度中包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的細(xì)胞的梯度。109、根據(jù)權(quán)利要求104或106的方法，其中將血液施加到梯度中包括將血液施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的細(xì)胞的梯度。110、根據(jù)權(quán)利要求106的方法，其中培養(yǎng)包括當(dāng)表面用自體血漿包被時(shí)，在該表面上培養(yǎng)細(xì)胞。111、根據(jù)權(quán)利要求106的方法，其中培養(yǎng)包括當(dāng)表面用選自同種異型血漿和異種血漿中的至少一種血漿包被時(shí)，在該表面上培養(yǎng)細(xì)胞。112、一種使用所提取的血液的方法，包括將血液施加到梯度以選擇具有希望密度范圍的細(xì)胞；在包括促生長(zhǎng)分子而非膠原或纖連蛋白的表面上培養(yǎng)所選擇的細(xì)胞；禾口鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。113、根據(jù)權(quán)利要求112的方法，其中祖細(xì)胞包括內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，并且其中鑒別所述祖細(xì)胞包括鑒別EPC。114、根據(jù)權(quán)利要求112的方法，其中將血液施加到梯度中包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的細(xì)胞的梯度。115、根據(jù)權(quán)利要求112的方法，其中將血液施加到梯度中包括將血液施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的細(xì)胞的梯度。116、根據(jù)權(quán)利要求112的方法，其中培養(yǎng)細(xì)胞包括在表面上培養(yǎng)細(xì)胞，該表面除了促生長(zhǎng)分子外還包括膠原和纖連蛋白中的至少一種。117、一種使用所提取的血液的方法，包括將血液施加到梯度以選擇具有希望密度范圍的細(xì)胞；在包括最高為5%的血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所選擇的細(xì)胞1到5天；和鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。118、根據(jù)權(quán)利要求117的方法，其中祖細(xì)胞包括內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，并且其中鑒別所述祖細(xì)胞包括鑒別EPC。119、根據(jù)權(quán)利要求117的方法，其中將血液施加到梯度中包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的細(xì)胞的梯度。120、根據(jù)權(quán)利要求117的方法，其中將血液施加到梯度中包括將血液施加到適于選擇密度在1.055到L074g/ml之間的細(xì)胞的梯度。121、一種使用所提取的血液的方法，包括將血液施加到梯度以選擇具有希望密度范圍的細(xì)胞；在包括大于10%的血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所選擇的細(xì)胞1到5天；和鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。122、根據(jù)權(quán)利要求121的方法，其中祖細(xì)胞包括內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，并且其中鑒別所述祖細(xì)胞包括鑒別EPC。123、根據(jù)權(quán)利要求121的方法，其中將血液施加到梯度中包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的細(xì)胞的梯度。124、根據(jù)權(quán)利要求121的方法，其中將血液施加到梯度中包括將血液施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的細(xì)胞的梯度。125、根據(jù)權(quán)利要求121的方法，其中培養(yǎng)細(xì)胞包括在包括小于20%的血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。126、一種使用所提取的血液的方法，包括將血液施加到梯度以選擇具有希望密度范圍的細(xì)胞；在低血清階段，在包括少于10%的血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所選擇的細(xì)胞；在高血清階段，在包括大于或等于10%的血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所選擇的細(xì)胞；以及鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。127、根據(jù)權(quán)利要求126的方法，其中祖細(xì)胞包括內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，并且其中鑒別所述祖細(xì)胞包括鑒別EPC。128、根據(jù)權(quán)利要求126的方法，其中將血液施加到梯度中包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的細(xì)胞的梯度。129、根據(jù)權(quán)利要求126的方法，其中將血液施加到梯度中包括將血液施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的細(xì)胞的梯度。130、根據(jù)權(quán)利要求126的方法，其中在低血清階段培養(yǎng)細(xì)胞包括在包括最高為5%的血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。131、根據(jù)權(quán)利要求126的方法，其中在低血清階段培養(yǎng)細(xì)胞包括在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。132、根據(jù)權(quán)利要求126的方法，其中在低血清階段培養(yǎng)細(xì)胞包括培養(yǎng)細(xì)胞1到5天。133、根據(jù)權(quán)利要求126的方法，其中在高血清階段培養(yǎng)細(xì)胞包括培養(yǎng)細(xì)胞1到30天。134、根據(jù)權(quán)利要求126的方法，其中在高血清階段培養(yǎng)細(xì)胞之前，在低血清階段培養(yǎng)細(xì)胞。135、根據(jù)權(quán)利要求126的方法，其中在高血清階段培養(yǎng)細(xì)胞之后，在低血清階段培養(yǎng)細(xì)胞。136、一種使用所提取的血液的方法，包括將血液施加到梯度以選擇具有希望密度范圍的細(xì)胞；在一至少2小時(shí)的低氧階段中，在低氧條件下培養(yǎng)所選擇的細(xì)胞；在一至少1天的非低氧階段中，在非低氧條件下培養(yǎng)所選擇的細(xì)胞；鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。137、根據(jù)權(quán)利要求136的方法，其中祖細(xì)胞包括內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，并且其中鑒別所述祖細(xì)胞包括鑒別EPC。138、根據(jù)權(quán)利要求136的方法，其中將血液施加到梯度中包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的細(xì)胞的梯度。139、根據(jù)權(quán)利要求136的方法，其中將血液施加到梯度中包括將血液施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的細(xì)胞的梯度。140、根據(jù)權(quán)利要求136的方法，其中低氧和非低氧階段都在一小于30天的培養(yǎng)期內(nèi)，且其中在低氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞包括在培養(yǎng)期的最初兩天在低氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞。141、根據(jù)權(quán)利要求136的方法，其中低氧和非低氧階段都在一小于30天的培養(yǎng)期內(nèi)，且其中在低氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞包括在培養(yǎng)期的最后兩天在低氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞。142、根據(jù)權(quán)利要求136的方法，其中低氧和非低氧階段都在一小于30天的培養(yǎng)期內(nèi)，且其中在低氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞包括在培養(yǎng)期的最初兩天和最后兩天之間在低氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞至少2小時(shí)。143、根據(jù)權(quán)利要求136的方法，其中在非低氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞之前，在低氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞。144、根據(jù)權(quán)利要求136的方法，其中在非低氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞之后，在低氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞。145、一種使用所提取的血液的方法，包括將血液施加到梯度以選擇具有希望密度范圍的細(xì)胞；在一至少2小時(shí)的高碳酸階段中，在高碳酸條件下培養(yǎng)所選擇的細(xì)胞，高碳酸階段特征在于<:02水平大于5%;在一至少1天的非高碳酸階段中，在非高碳酸條件下培養(yǎng)所選擇的細(xì)胞，非高碳酸階段特征在于C02水平小于或等于5X;以及鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。146、根據(jù)權(quán)利要求145的方法，其中祖細(xì)胞包括內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，并且其中鑒別所述祖細(xì)胞包括鑒別EPC。147、根據(jù)權(quán)利要求145的方法，其中將血液施加到梯度中包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的細(xì)胞的梯度。148、根據(jù)權(quán)利要求145的方法，其中將血液施加到梯度中包括將血液施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的細(xì)胞的梯度。149、根據(jù)權(quán)利要求145的方法，包括設(shè)定高碳酸階段中的C02水平為至少6%。150、根據(jù)權(quán)利要求145的方法，其中高碳酸階段和非高碳酸階段都在一少于30天的培養(yǎng)期內(nèi)，并且其中在高碳酸條件下培養(yǎng)細(xì)胞包括在培養(yǎng)期的最初兩天在高碳酸條件下培養(yǎng)細(xì)胞。151、根據(jù)權(quán)利要求145的方法，其中高碳酸階段和非高碳酸階段都在一少于30天的培養(yǎng)期內(nèi)，并且其中在高碳酸條件下培養(yǎng)細(xì)胞包括在培養(yǎng)期的最后兩天在高碳酸條件下培養(yǎng)細(xì)胞。152、根據(jù)權(quán)利要求145的方法，其中高碳酸階段和非高碳酸階段都在一少于30天的培養(yǎng)期內(nèi)，并且其中在高碳酸條件下培養(yǎng)細(xì)胞包括在培養(yǎng)期的最初兩天和最后兩天之間在高碳酸條件下培養(yǎng)細(xì)胞至少2小時(shí)。153、根據(jù)權(quán)利要求145的方法，其中在非高碳酸條件下培養(yǎng)細(xì)胞之前，在高碳酸條件下培養(yǎng)細(xì)胞。154、根據(jù)權(quán)利要求145的方法，其中在非高碳酸條件下培養(yǎng)細(xì)胞之后，在高碳酸條件下培養(yǎng)細(xì)胞。155、一種使用所提取的血液的方法，包括將血液施加到梯度以選擇具有希望密度范圍的細(xì)胞；在包括選自下列至少一種物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所選擇的細(xì)胞VEGF、IGF、FGF、促紅細(xì)胞生成素、雌激素、雌激素家族分子、17-P-雌二醇、雌酮、雌三醇、雌二醇衍生物、戊酸雌二醇、環(huán)戊丙酸雌二醇、美雌醇、炔雌醚、孕激素、孕激素家族分子、孕酮、合成孕酮、hydroxyprogesteronecaroate、醋酸甲夢(mèng)5孕酮、他汀類(lèi)藥物、辛4戈他汀、阿伐他汀、抗糖尿病藥物和羅格列酮；和鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的祖細(xì)胞。156、根據(jù)權(quán)利要求155的方法，其中祖細(xì)胞包括內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，并且其中鑒別所述祖細(xì)胞包括鑒別EPC。157、根據(jù)權(quán)利要求155的方法，其中將血液施加到梯度中包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的細(xì)胞的梯度。158、根據(jù)權(quán)利要求155的方法，其中將血液施加到梯度中包括將血液施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的細(xì)胞的梯度。159、一種使用所提取的干細(xì)胞的方法，包括將包括干細(xì)胞的組織施加到梯度中以選擇具有第一希望密度范圍的細(xì)胞的梯度；通過(guò)培養(yǎng)所選擇的細(xì)胞3到30天來(lái)增加具有第二希望密度范圍的細(xì)胞的數(shù)量；和鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的袓細(xì)胞。160、根據(jù)權(quán)利要求159的方法，其中祖細(xì)胞包括內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，并且其中鑒別所述祖細(xì)胞包括鑒別EPC。161、根據(jù)權(quán)利要求159的方法，其中將血液施加到梯度中包括將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的細(xì)胞的梯度。162、根據(jù)權(quán)利要求159的方法，其中將血液施加到梯度中包括將血液施加到適于選擇密度在1.055到L074g/ml之間的細(xì)胞的梯度。163、根據(jù)權(quán)利要求159的方法，其中施加組織包括將臍帶血施加到梯度。164、根據(jù)權(quán)利要求159的方法，其中施加組織包括將胚胎細(xì)胞施加到梯度。165、根據(jù)權(quán)利要求159的方法，其中施加組織包括將胎兒細(xì)胞施加到梯度。166、根據(jù)權(quán)利要求159的方法，其中施加組織包括將胎盤(pán)細(xì)胞施加到梯度。167、根據(jù)權(quán)利要求159的方法，包括自骨髓提取干細(xì)胞。168、根據(jù)權(quán)利要求159的方法，包括動(dòng)員來(lái)自骨髓的干細(xì)胞以方便干細(xì)胞的提取。169、根據(jù)權(quán)利要求159的方法，其中包括自血液提取干細(xì)胞。170、根據(jù)權(quán)利要求159的方法，其中培養(yǎng)細(xì)胞包括在培養(yǎng)的第一階段期間于第一容器中培養(yǎng)細(xì)胞；在培養(yǎng)的第一階段末期從第一容器中取出至少一些細(xì)胞；和在培養(yǎng)的第二階段期間于第二容器中培養(yǎng)從第一容器中所取出的細(xì)胞。171、根據(jù)權(quán)利要求170的方法，其中取出至少一些細(xì)胞包括選擇取出粘附在第一容器表面上的細(xì)胞。172、根據(jù)權(quán)利要求170的方法，其中取出至少一些細(xì)胞包括選擇取出沒(méi)有粘附在第一容器表面上的細(xì)胞。173、根據(jù)權(quán)利要求170的方法，其中第一容器包括在其表面上的促生長(zhǎng)分子，并且其中在第一容器中培養(yǎng)細(xì)胞包括在包括促生長(zhǎng)分子的第一容器中培養(yǎng)細(xì)胞。174、根據(jù)權(quán)利要求173的方法，其中促生長(zhǎng)分子選自如下血漿、膠原、纖連蛋白、生長(zhǎng)因子、以及干細(xì)胞表面受體的抗體。175、根據(jù)權(quán)利要求170的方法，其中第二容器包括在其表面上的促生長(zhǎng)分子，并且其中在第二容器中培養(yǎng)細(xì)胞包括在包括促生長(zhǎng)分子的第二容器中培養(yǎng)細(xì)胞。176、根據(jù)權(quán)利要求175的方法，其中促生長(zhǎng)分子選自如下血漿、膠原、纖連蛋白、生長(zhǎng)因子、以及干細(xì)胞表面受體的抗體。全文摘要本發(fā)明提供了一種使用所提取的血液的方法，包括(a)將血液施加到適于選擇密度小于1.077g/ml的第一批細(xì)胞的第一梯度；(b)將第一批細(xì)胞施加到適于選擇密度在1.055到1.074g/ml之間的第二批細(xì)胞的第二梯度；(c)通過(guò)培養(yǎng)第二批細(xì)胞3到30天來(lái)增加密度在1.055到1.074g/ml之間的細(xì)胞的數(shù)量；和(d)鑒別所培養(yǎng)的細(xì)胞中的內(nèi)皮祖細(xì)胞。還描述了其它實(shí)施方案。文檔編號(hào)C12N5/00GK101151362SQ200580024306公開(kāi)日2008年3月26日申請(qǐng)日期2005年6月1日優(yōu)先權(quán)日2004年6月1日發(fā)明者丹尼·貝爾金,斯韋特蘭娜·波羅佐夫,瓦倫丁·富爾加,耶爾·波拉特,達(dá)夫納·希莫尼-扎爾克申請(qǐng)人:運(yùn)作投資有限公司