基于成體干細(xì)胞?再生絲素蛋白組織工程支架的人工肝修復(fù)材料的培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于成體干細(xì)胞?再生絲素蛋白組織工程支架的人工肝修復(fù)材料的培養(yǎng)方法，主要分為兩步，第一步采用靜電紡絲法制備混有HGF、FGF4因子、牛血清蛋白和再生絲素蛋白材料的用于生物人工肝的成體干細(xì)胞?再生絲素蛋白組織工程支架，第二步基于成體干細(xì)胞?再生絲素蛋白組織工程支架培養(yǎng)人工肝修復(fù)材料，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)或骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)在再生絲素蛋白材料上粘附、增殖，在支架緩釋的HGF、FGF4因子作用下誘導(dǎo)成肝臟樣細(xì)胞。本發(fā)明制備的基于成體干細(xì)胞?再生絲素蛋白組織工程支架的人工肝修復(fù)材料生物相容性好、生物降解性優(yōu)異、力學(xué)性能優(yōu)異，是一種良好的生物人工肝備選支架材料。
【專利說明】
基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架的人工肝修復(fù) 材料的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬人工肝技術(shù)領(lǐng)域，涉及基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架的 人工肝修復(fù)材料的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國(guó)是一個(gè)乙型肝炎大國(guó)，肝炎病毒的攜帶率高達(dá)近10%;隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生活 方式的改變，大量飲酒所致的酒精性肝病也呈逐年上升趨勢(shì);隨著抗生素、減肥藥及保健品 的濫用，藥物性肝病也逐年上升。這些數(shù)目巨大的肝病病人，經(jīng)過一定的病程部分病人會(huì)進(jìn) 展至終末期肝病或出現(xiàn)急性肝功能衰竭。原位肝移植是該類疾病的唯一有效的治療手段， 但由于供肝缺乏、免疫排斥、手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)、費(fèi)用昂貴等諸多因素，嚴(yán)重限制了其在臨床的廣泛 應(yīng)用。部分患者甚至在等待肝源中去世。人工肝和生物人工肝支持系統(tǒng)為嚴(yán)重肝臟疾病患 者的肝臟修復(fù)以及肝移植搭建了"橋梁"。但是，人工肝支持系統(tǒng)對(duì)于嚴(yán)重肝臟疾病患者而 言不僅費(fèi)用昂貴，而且難以較長(zhǎng)時(shí)間維持治療。近年來，組織工程在肝臟方面的應(yīng)用研究備 受關(guān)注，特別是種子細(xì)胞的選擇，使用何種細(xì)胞外基質(zhì)，以及構(gòu)建什么樣的環(huán)境來創(chuàng)建組織 工程肝臟成為了研究的熱點(diǎn)。
[0003] 種子細(xì)胞和載體材料是生物人工肝支持系統(tǒng)的兩大基礎(chǔ)，而二者的相容性則是構(gòu) 建肝組織工程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道可獲得具有肝臟功能的細(xì)胞的途徑主要 有：（1)肝細(xì)胞的原代培養(yǎng)；（2)胚胎、臍血干細(xì)胞體外誘導(dǎo)獲得；（3)IPS(Induced Pluripotent Stem Cell)細(xì)胞體外誘導(dǎo)獲得(4)成體干細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)獲得。然而，只有通 過成體干細(xì)胞體外誘導(dǎo)途徑獲得既能避免倫理限制、又能通過體外大量擴(kuò)增，且安全性高 的肝臟樣細(xì)胞。近年來，大量文獻(xiàn)報(bào)道了不同組織來源的成體干細(xì)胞體外均能被誘導(dǎo)成肝 臟樣細(xì)胞，包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs )、外周血單核細(xì)胞(PBMCs )、脂肪干細(xì)胞(ADSCs)、 肝臟原位干細(xì)胞(HSL)等。但是，對(duì)于眾多成體組織來源的干細(xì)胞，尚未有人對(duì)其體外成肝 臟樣細(xì)胞的能力做過橫向比較和系統(tǒng)研究。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)BMSCs和ADSCs體外可大量 增殖，并被誘導(dǎo)成肝臟樣細(xì)胞，是理想的種子細(xì)胞來源。我們將這兩種成體干細(xì)胞種植在再 生絲素蛋白纖維支架材料上發(fā)現(xiàn)其具有良好的粘附性及相容性，并在HGF、FGF4等因子誘導(dǎo) 下，可被誘導(dǎo)成肝臟樣細(xì)胞。因此構(gòu)建添加 HGF、FGF4等因子的再生絲素蛋白纖維支架，模擬 肝臟微環(huán)境，探討添加細(xì)胞因子的再生絲素蛋白纖維支架對(duì)BMSCs和ADSCs的粘附、增殖及 誘導(dǎo)成肝的能力，為構(gòu)建一種優(yōu)化的生物人工肝支持系統(tǒng)具有十分重要的臨床意義。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程 支架的人工肝修復(fù)材料的培養(yǎng)方法，是將含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生絲素蛋白溶 液通過靜電紡絲技術(shù)的方法制備。通過該方法制得的纖維氈為混合有HGF、FGF4因子和牛血 清蛋白的再生絲素蛋白纖維構(gòu)成的具有三維交錯(cuò)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)特征的纖維氈，HGF、FGF4因子在 再生絲素蛋白纖維中分散均勻，保證了其可以逐漸釋放細(xì)胞因子促干細(xì)胞向肝臟樣細(xì)胞誘 導(dǎo)分化，再生絲素蛋白纖維則賦予支架優(yōu)異的力學(xué)性能。同時(shí)，該制備過程簡(jiǎn)單，易于操作， 對(duì)環(huán)境無污染。本發(fā)明的目的在于提供一種生物相容性好、生物降解性優(yōu)異、力學(xué)性能優(yōu) 異，與干細(xì)胞相容性好的組織工程支架及其制備方法。本發(fā)明的組織工程支架可通過緩釋 HGF、FGF4等細(xì)胞因子，使脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)較好地在 再生絲素蛋白材料上粘附、增殖，并分化為肝臟樣細(xì)胞，ADSCs和BMSCs兩種成體干細(xì)胞-再 生絲素蛋白材料是一種良好的生物人工肝備選支架材料。
[0005] 基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架的人工肝修復(fù)材料的培養(yǎng)方法，包 括以下步驟：
[0006] (a)成體干細(xì)胞的原代培養(yǎng)與傳代；
[0007]將成體干細(xì)胞原代接種培養(yǎng)，待接種后細(xì)胞密度達(dá)90%以上，則傳代；
[0008] (b)細(xì)胞培養(yǎng)；
[0009] 進(jìn)行傳代后在用于生物人工肝的成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架上接 種，并恒溫培養(yǎng);培養(yǎng)基為α-ΜΕΜ+10~20v/v%FBS或DMEM+10~20v/v%FBS;
[0010] (c)成肝臟樣細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)；
[0011] 細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)基更換為加入所述用于生物人工肝的組織工程支架的基礎(chǔ)培 養(yǎng)基中，每隔3~4天換一次基礎(chǔ)培養(yǎng)基；
[0012] 所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為含5~10v/v%FBS的DMEM培養(yǎng)基；
[0013] (d)再生絲素蛋白纖維支架上成體干細(xì)胞的體外誘導(dǎo)成肝能力；
[0014] 種植于再生絲素蛋白纖維支架上的成體干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)7~15天后，成體干細(xì) 胞即誘導(dǎo)成肝臟樣細(xì)胞；
[0015] 所述成體干細(xì)胞為ADSCs或BMSCs;
[0016] 所述用于生物人工肝的成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架的制備方法如 下：
[0017] (1)以蠶繭為原料，經(jīng)脫膠、溶解、透析和濃縮后，制備質(zhì)量百分比為30~40%的再 生絲素蛋白水溶液；
[0018] (2)以水為溶劑，配制HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液，其中HGF與FGF4因子的 質(zhì)量濃度都為15~25yg/mL，牛血清蛋白的質(zhì)量濃度為0.6~lmg/mL;
[0019] ⑶將所述再生絲素蛋白水溶液與所述HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液以60~ 130:1的體積比混合，制備含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生絲素蛋白溶液；
[0020] (4)以所述含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生絲素蛋白溶液為紡絲液，采用靜 電紡絲法制備得到用于生物人工肝的成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架。
[0021] 作為優(yōu)選的技術(shù)方案：
[0022] 如上所述的基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架的人工肝修復(fù)材料的培 養(yǎng)方法，所述再生絲素蛋白水溶液的制備步驟如下:將蠶繭用質(zhì)量百分比為0.3~0.7%的 碳酸鈉水溶液脫膠后，溶解于摩爾濃度為9.0~9.5mol/L的溴化鋰水溶液中，得到再生絲素 蛋白-溴化鋰水溶液;將此溶液離心、過濾、透析和濃縮，得到質(zhì)量百分比為30~40%的再生 絲素蛋白水溶液。
[0023] 如上所述的基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架的人工肝修復(fù)材料的培 養(yǎng)方法，所述蠶繭為桑蠶繭、柞蠶繭或蓖麻蠶繭中的一種。
[0024] 如上所述的基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架的人工肝修復(fù)材料的培 養(yǎng)方法，靜電紡絲的紡絲環(huán)境溫度為2~6 °C。
[0025] 如上所述的基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架的人工肝修復(fù)材料的培 養(yǎng)方法，步驟（2)中，還包含20-40ng/mL 0SM、20-50ng/mL aFGF、l-20ymol/L Dex、50-200y 111〇1/1￥??、1-1〇111111〇1/1￥(3和0.9-1.1父胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒。
[0026] 如上所述的基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架的人工肝修復(fù)材料的培 養(yǎng)方法，所述原代接種時(shí)間為72小時(shí);所述傳代按1:2~3傳代;步驟(a)中，若細(xì)胞密度未達(dá) 90%，則半量換液，延長(zhǎng)培養(yǎng)一天傳代。
[0027] 如上所述的基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架的人工肝修復(fù)材料的培 養(yǎng)方法，傳代后接種是指:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的第2~4代細(xì)胞，以I X IOVcm2的濃度進(jìn)行傳代后接 種;所述恒溫培養(yǎng)是指:于5v/v % 0)2和37 °C條件下恒溫培養(yǎng)。
[0028] 如上所述的基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架的人工肝修復(fù)材料的培 養(yǎng)方法，所述細(xì)胞貼壁是指細(xì)胞培養(yǎng)24h后見細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。
[0029] 如上所述的基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架的人工肝修復(fù)材料的培 養(yǎng)方法，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中還含有20ng/mL EGF和/或10ng/mL bFGF。
[0030] 有益效果：
[0031] 本發(fā)明創(chuàng)造性地提出了基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架的人工肝修 復(fù)材料的培養(yǎng)方法，采用了用于生物人工肝的成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架進(jìn) 行人工肝修復(fù)材料的培養(yǎng)。在保證再生絲素蛋白較高濃度的前提下，避免了有機(jī)溶劑(如甲 酸、六氟異丙醇等)的使用，不僅降低了生產(chǎn)成本，而且避免了對(duì)人體的傷害。
[0032] 按照本發(fā)明的方法制得的用于生物人工肝的成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程 支架不僅具有優(yōu)異的力學(xué)性能，而且可將成體干細(xì)胞誘導(dǎo)成肝臟樣細(xì)胞，滿足人工肝修復(fù) 的使用要求。
[0033] 本發(fā)明為生物人工肝篩選理想的種子細(xì)胞，為臨床進(jìn)行干細(xì)胞移植治療急慢性肝 臟衰竭提供理想的移植供體細(xì)胞。
[0034] 本發(fā)明成肝效率高，一周即能取得較好的誘導(dǎo)效果，誘導(dǎo)時(shí)間短，細(xì)胞成肝比例 尚。
[0035] 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蘇木精-伊紅(HE)染色可見細(xì)胞均勻分布于材料表面，材料內(nèi) 部也有少許細(xì)胞。掃描電鏡顯示兩種成體干細(xì)胞在再生絲素蛋白材料上呈旋渦狀生長(zhǎng)，形 態(tài)基本不變，粘附性良好。3D共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示兩種不同成體干細(xì)胞在材料不同層面 上均可以生長(zhǎng)。
[0036]動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：小鼠背部再生絲素蛋白材料移植后HE染色顯示材料與組 織相容性良好。小動(dòng)物活體顯像和熒光顯微鏡觀察顯示CM-Dil熒光標(biāo)記的兩種成體干細(xì) 胞-再生絲素蛋白纖維復(fù)合材料移植后的2天、5天、7天、14天和1個(gè)月均能檢測(cè)到CM-Dil熒 光標(biāo)記的兩種成體干細(xì)胞。HE染色結(jié)果顯示在成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白復(fù)合材料移植的2 天、5天、7天、14天、1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月材料與肝組織間相容性良好，無大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)， 移植在背部再生絲素蛋白材料在第4個(gè)月幾乎完全降解，移植在肝臟再生絲素蛋白材料在 第3個(gè)月幾乎完全降解。此外，在第5天和第7天發(fā)現(xiàn)材料有新生血管生成，在2個(gè)月和3個(gè)月 觀察到新生的肝臟樣細(xì)胞。
[0037] ADSCs和BMSCs可較好地在再生絲素蛋白材料上粘附、增殖，并分化為肝臟樣細(xì)胞， ADSCs和BMSCs兩種成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白材料是一種良好的生物人工肝備選支架材 料·
[0038]本發(fā)明創(chuàng)造性地將ADSCs和BMSCs復(fù)合再生絲素蛋白纖維移植到急性肝損傷小鼠 的肝臟，在移植后24h，48h，72h檢測(cè)小鼠肝功能指標(biāo)(ALT，AST)，發(fā)現(xiàn)相比于單純的ADSCs和 BMSCs移植組和單純的材料移植組，兩種成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白纖維復(fù)合材料能夠明顯 修復(fù)小鼠肝功能損傷，肝功能指標(biāo)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，單純的材料移植組也顯示出了修復(fù)小鼠 急性肝損傷的作用，肝功能指標(biāo)子在48h和72h相比于四氯化碳(CCl 4)組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。按 照本發(fā)明的方法制得的成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白纖維支架不僅與生物體有良好的生物相 容性，而且能夠顯著修復(fù)急性肝損傷小鼠的肝功能，滿足了生物人工肝材料修復(fù)肝損傷的 使用要求。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限 定的范圍。
[0040] 實(shí)施例1
[0041] -種基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架的人工肝修復(fù)材料的培養(yǎng)方 法，首先，制備用于生物人工肝的成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架，步驟如下：
[0042] 1)將桑蠶繭用質(zhì)量百分比為0.3%的碳酸鈉水溶液脫膠后，溶解于摩爾濃度為 9.Omol/L的溴化鋰水溶液中，得到再生絲素蛋白-溴化鋰水溶液，將此溶液離心、過濾、透析 和濃縮，得到質(zhì)量百分比為30 %的再生絲素蛋白水溶液；
[0043] 2)以水為溶劑，配制HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液，其中HGF與FGF4因子的質(zhì) 量濃度都為I Syg/mL，牛血清蛋白的質(zhì)量濃度為0.6mg/mL;
[0044] 3)將再生絲素蛋白水溶液與HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液以60:1的體積比 混合，制備含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生絲素蛋白溶液；
[0045] 4)以含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生絲素蛋白溶液為紡絲液，在紡絲環(huán)境溫 度為2°C條件下，采用靜電紡絲法制備得到用于生物人工肝的成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組 織工程支架。
[0046] 然后，基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架培養(yǎng)人工肝修復(fù)材料，步驟如 下：
[0047] 1)分別將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)進(jìn)行原代培養(yǎng) 與傳代，將ADSCs和BMSCs分別原代接種72小時(shí)培養(yǎng)，待接種后細(xì)胞密度達(dá)到90%，按1:2傳 代；
[0048] 2)細(xì)胞培養(yǎng)，進(jìn)行傳代后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的第2代細(xì)胞在用于生物人工肝的成體干細(xì) 胞-再生絲素蛋白組織工程支架上以lX104/cm2的濃度進(jìn)行接種，并于5v/v%C〇dP37°C條 件下恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)基為a_MEM+10v/v%FBS;
[0049] 3)成肝臟樣細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)24h后見細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，將培養(yǎng)基更換為加 入用于生物人工肝的組織工程支架的含5v/v%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，每隔3天換一次培養(yǎng) 基；
[0050] 4)再生絲素蛋白纖維支架上ADSCs和BMSCs的體外誘導(dǎo)成肝能力，種植于再生絲素 蛋白纖維支架上的ADSCs和BMSCs分別經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)7天后，ADSCs和BMSCs分別誘導(dǎo)成肝臟樣 細(xì)胞。
[0051 ]最后，進(jìn)行小鼠實(shí)驗(yàn)，步驟如下：
[0052] 1)再生絲素蛋白纖維支架上成體干細(xì)胞的體內(nèi)誘導(dǎo)成肝能力，將再生絲素蛋白纖 維材料移植到小鼠背上，在移植后的第3和第4個(gè)月取材，采用HE染色觀察材料的降解情況； 將CM-Dil熒光標(biāo)記的ADSCs和BMSCs分別移植到再生絲素蛋白材料上，并移植到急性肝損傷 小鼠模型肝臟表面，在不同時(shí)間點(diǎn)（2天、5天、7天、14天、1個(gè)月）用小動(dòng)物活體顯像技術(shù)及熒 光顯微鏡下觀察移植細(xì)胞的在材料上的定植情況，同時(shí)采用HE染色的方法觀察不同時(shí)間點(diǎn) (2天、5天、7天、14天、1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月）移植細(xì)胞材料在肝臟表面的定植情況、分化情況 以及再生絲素蛋白材料與肝臟組織的相容性；
[0053] 2)成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白纖維復(fù)合材料（以下簡(jiǎn)稱細(xì)胞-RSF材料）的制備，將 制備好的再生絲素蛋白纖維剪成I. IcmX I. Icm大小的正方形材料;鈷60照射后置于超凈臺(tái) 內(nèi)保存;使用前將材料置于24孔板中，75%酒精浸泡2個(gè)小時(shí)，PBS洗滌后，加入培養(yǎng)基置于 37 °C恒溫培養(yǎng)箱孵育24h;胰酶消化ADSCs和BMSCs，終止消化，細(xì)胞離心后，調(diào)整細(xì)胞濃度， 以0.5X 106/cm2材料接種細(xì)胞，培養(yǎng)3天后，準(zhǔn)備移植到急性肝損傷模型的體內(nèi)；
[0054] 3)急性肝損傷小鼠模型制備，購買實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，預(yù)先在動(dòng)物房實(shí)驗(yàn)性飼養(yǎng)一周;在細(xì) 胞及細(xì)胞-RSF材料移植的前一天，配置ΙΟv/v%的四氯化碳(CCl4)_橄欖油，以每100yL/20g (0.5mL/kg)小鼠腹腔注射，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)5只小鼠；觀察小鼠一般生 長(zhǎng)狀況及體重變化；
[0055] 4)細(xì)胞-RSF材料移植到急性肝損傷小鼠模型的肝臟表面，小鼠手術(shù)前兩個(gè)小時(shí)禁 食、禁水；乙醚誘導(dǎo)，200μ!7只，4mg/mL的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠；固定小鼠四肢，剔 除小鼠腹部毛發(fā)，碘伏棉球消毒小鼠腹部;腹正中線打開小鼠腹腔，暴露小鼠肝臟，造模后 小鼠肝臟成土黃色，肝臟明顯變大;將空白再生絲素蛋白材料、兩種細(xì)胞(ADSCs和BMSCs)及 兩種細(xì)胞-RSF材料移植在小鼠肝臟左外葉上，8號(hào)帶線美容縫合針固定;移植結(jié)束，4號(hào)線縫 合小鼠皮膚，注意小鼠術(shù)后復(fù)溫，觀察小鼠一般狀態(tài)；
[0056] 5)小鼠肝功能檢測(cè)，預(yù)先將準(zhǔn)備的EP管(微量離心管）固定在泡沫板上；采用眼球 取血法收集小鼠血液，使血液滴入EP管中，勿在管壁摩擦，以防溶血;血樣室溫靜置2h后， 3000rpm離心15min;將上清轉(zhuǎn)移至檢測(cè)容器中，送生化科檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨 酶水平(AST)，檢測(cè)結(jié)果如下：
[0057] 移植后各組小鼠肝功能指標(biāo)ALT的改變見表1，表中Dl、D2、D3和D7分別為第一天、 第二天、第三天和第四天，噸〈0.05，*郵〈0.01;￥8〇：14組;#口>0.05，##口〈0.05￥8正常組(和 CCl4組的數(shù)值相比，有*的代表p〈0.05，表示兩組數(shù)據(jù)在0.05水平上具備顯著性差異;有** 的代表P〈〇. 01，表示兩組數(shù)據(jù)在〇. 01水平上具備極顯著性差異;和正常組數(shù)值相比，有#的 代表p>0.05，即兩組數(shù)據(jù)在0.05水平上不具備顯著性差異;有邱的代表p〈0.05，即兩組數(shù)據(jù) 在0.05水平上具備顯著性差異。顯著性差異是一種有量度的或然性評(píng)價(jià)，A、B兩數(shù)據(jù)在0.05 水平上具備顯著性差異，說明兩組數(shù)據(jù)具備顯著性差異的可能性為95%，兩個(gè)數(shù)據(jù)所代表 的樣本還有5%的可能性是沒有差異的，這5%的差異是由于隨機(jī)誤差造成的。）。
[0058]由表中的數(shù)據(jù)可以看出，移植后第1天，BMSCs、ADSCs和兩種細(xì)胞-RSF復(fù)合材料能 夠明顯促進(jìn)肝臟再生;移植后第2天和第3天，BMSCs、ADSCs、兩種細(xì)胞-RSF復(fù)合材料組和單 純的再生絲素蛋白材料組(RSF組)均有改善急性肝損傷小鼠肝功能的作用；移植后第7天， 除CCl 4組，各組肝功能均恢復(fù)正常。不同救治組肝功能的改善結(jié)果表明，再生絲素蛋白材料 復(fù)合細(xì)胞后改善肝功能的水平明顯優(yōu)于單純的細(xì)胞治療組以及單純的再生絲素蛋白材料 組。
[0059] 表1移植后各組ALT比較
[0061 ] 移植后各組小鼠肝功能指標(biāo)AST的改變見表2,表中Dl、D2、D3和D7分別為第一天、 第二天、第三天和第四天，噸〈0.05，*郵〈0.01;￥8〇：14組;#口>0.05，##口〈0.05￥8正常組(和 CCl4組的數(shù)值相比，有*的代表p〈0.05，表示兩組數(shù)據(jù)在0.05水平上具備顯著性差異;有** 的代表P〈〇. 01，表示兩組數(shù)據(jù)在〇. 01水平上具備極顯著性差異;和正常組數(shù)值相比，有#的 代表p>0.05，即兩組數(shù)據(jù)在0.05水平上不具備顯著性差異;有邱的代表p〈0.05，即兩組數(shù)據(jù) 在0.05水平上具備顯著性差異。由表中的數(shù)據(jù)可以看出，移植后第1天，BMSCs、ADSCs和兩種 細(xì)胞-RSF復(fù)合材料能夠明顯促進(jìn)肝臟再生;移植后第2天，兩種細(xì)胞-RSF復(fù)合材料組和單純 RSF材料組均有改善急性肝損傷小鼠肝功能的作用;移植后第3天，BMSCs、ADSCs、兩種細(xì)胞-RSF復(fù)合材料組和單純的再生絲素蛋白材料組(RSF組)均有改善急性肝損傷小鼠肝功能的 作用;移植后第7天，各組肝功能均恢復(fù)正常。不同救治組肝功能的改善結(jié)果表明，再生絲素 蛋白材料復(fù)合細(xì)胞后改善肝功能的水平明顯優(yōu)于單純的細(xì)胞治療組以及單純的再生絲素 蛋白材料組。
[0062] 表2移植后各組AST比較
[0064] 實(shí)施例2
[0065] -種基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架的人工肝修復(fù)材料的培養(yǎng)方 法，首先，制備用于生物人工肝的成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架，步驟如下：
[0066] 1)將柞蠶繭用質(zhì)量百分比為0.4%的碳酸鈉水溶液脫膠后，溶解于摩爾濃度為 9. lmol/L的溴化鋰水溶液中，得到再生絲素蛋白-溴化鋰水溶液，將此溶液離心、過濾、透析 和濃縮，得到質(zhì)量百分比為32 %的再生絲素蛋白水溶液；
[0067] 2)以水為溶劑，配制HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液，其中HGF與FGF4因子的質(zhì) 量濃度都為I eyg/mL，牛血清蛋白的質(zhì)量濃度為0.7mg/mL;
[0068] 3)將再生絲素蛋白水溶液與HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液以80:1的體積比 混合，制備含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生絲素蛋白溶液；
[0069] 4)以含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生絲素蛋白溶液為紡絲液，在紡絲環(huán)境溫 度為:TC條件下，采用靜電紡絲法制備得到用于生物人工肝的成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組 織工程支架。
[0070]然后，基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架培養(yǎng)人工肝修復(fù)材料，步驟如 下：
[0071] 1)分別將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)進(jìn)行原代培養(yǎng) 與傳代，將ADSCs和BMSCs分別原代接種72小時(shí)培養(yǎng)，待接種后細(xì)胞密度達(dá)到91%，按1:3傳 代；
[0072] 2)細(xì)胞培養(yǎng)，進(jìn)行傳代后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的第3代細(xì)胞在用于生物人工肝的成體干細(xì) 胞-再生絲素蛋白組織工程支架上以lX10 4/cm2的濃度進(jìn)行接種，并于5v/v%C〇dP37°C條 件下恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)基為α-ΜΕΜ+12v/v % FBS;
[0073] 3)成肝臟樣細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)24h后見細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，將培養(yǎng)基更換為加 入用于生物人工肝的組織工程支架的含6v/v%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，每隔4天換一次培養(yǎng) 基；
[0074] 4)再生絲素蛋白纖維支架上ADSCs和BMSCs的體外誘導(dǎo)成肝能力，種植于再生絲素 蛋白纖維支架上的ADSCs和BMSCs分別經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)8天后，ADSCs和BMSCs分別誘導(dǎo)成肝臟樣 細(xì)胞。
[0075]經(jīng)與實(shí)施例1中相同的小鼠實(shí)驗(yàn)，結(jié)果基本一致，不同救治組肝功能的改善結(jié)果表 明，再生絲素蛋白材料復(fù)合細(xì)胞后改善肝功能的水平明顯優(yōu)于單純的細(xì)胞治療組以及單純 的再生絲素蛋白材料組。
[0076] 實(shí)施例3
[0077] -種基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架的人工肝修復(fù)材料的培養(yǎng)方 法，首先，制備用于生物人工肝的成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架，步驟如下：
[0078] 1)將蓖麻蠶繭用質(zhì)量百分比為0.5 %的碳酸鈉水溶液脫膠后，溶解于摩爾濃度為 9.2mol/L的溴化鋰水溶液中，得到再生絲素蛋白-溴化鋰水溶液，將此溶液離心、過濾、透析 和濃縮，得到質(zhì)量百分比為34%的再生絲素蛋白水溶液；
[0079] 2)以水為溶劑，配制HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液，其中HGF與FGF4因子的質(zhì) 量濃度都為I Syg/mL，牛血清蛋白的質(zhì)量濃度為0.8mg/mL;
[0080] 3)將再生絲素蛋白水溶液與HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液以90:1的體積比 混合，制備含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生絲素蛋白溶液；
[0081] 4)以含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生絲素蛋白溶液為紡絲液，在紡絲環(huán)境溫 度為4°C條件下，采用靜電紡絲法制備得到用于生物人工肝的成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組 織工程支架。
[0082] 然后，基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架培養(yǎng)人工肝修復(fù)材料，步驟如 下：
[0083] 1)分別將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)進(jìn)行原代培養(yǎng) 與傳代，將ADSCs和BMSCs分別原代接種72小時(shí)培養(yǎng)，待接種后細(xì)胞密度達(dá)到92%，按1:2傳 代；
[0084] 2)細(xì)胞培養(yǎng)，進(jìn)行傳代后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的第4代細(xì)胞在用于生物人工肝的成體干細(xì) 胞-再生絲素蛋白組織工程支架上以lX10 4/cm2的濃度進(jìn)行接種，并于5v/v%C〇dP37°C條 件下恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)基為α-ΜΕΜ+15v/v % FBS;
[0085] 3)成肝臟樣細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)24h后見細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，將培養(yǎng)基更換為加 入用于生物人工肝的組織工程支架的含7v/v%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，每隔3天換一次培養(yǎng) 基；
[0086] 4)再生絲素蛋白纖維支架上ADSCs和BMSCs的體外誘導(dǎo)成肝能力，種植于再生絲素 蛋白纖維支架上的ADSCs和BMSCs分別經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)10天后，ADSCs和BMSCs分別誘導(dǎo)成肝臟樣 細(xì)胞。
[0087] 經(jīng)與實(shí)施例1中相同的小鼠實(shí)驗(yàn)，結(jié)果基本一致，不同救治組肝功能的改善結(jié)果表 明，再生絲素蛋白材料復(fù)合細(xì)胞后改善肝功能的水平明顯優(yōu)于單純的細(xì)胞治療組以及單純 的再生絲素蛋白材料組。
[0088] 實(shí)施例4
[0089] -種基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架的人工肝修復(fù)材料的培養(yǎng)方 法，首先，制備用于生物人工肝的成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架，步驟如下：
[0090] 1)將桑蠶繭用質(zhì)量百分比為0.3%的碳酸鈉水溶液脫膠后，溶解于摩爾濃度為 9.Omol/L的溴化鋰水溶液中，得到再生絲素蛋白-溴化鋰水溶液，將此溶液離心、過濾、透析 和濃縮，得到質(zhì)量百分比為30 %的再生絲素蛋白水溶液；
[0091] 2)以水為溶劑，配制HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液，其中HGF與FGF4因子的質(zhì) 量濃度都為15yg/mL，牛血清蛋白的質(zhì)量濃度為0.6mg/mL，溶液中還包含20ng/mL OSM、 20ng/mL aFGF、lymol/LDex、50ymol/L VPP、lmmol/L Vc和0·9X膜島素轉(zhuǎn)鐵蛋白砸；
[0092] 3)將再生絲素蛋白水溶液與HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液以60:1的體積比 混合，制備含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生絲素蛋白溶液；
[0093] 4)以含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生絲素蛋白溶液為紡絲液，在紡絲環(huán)境溫 度為2°C條件下，采用靜電紡絲法制備得到用于生物人工肝的成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組 織工程支架。
[0094]然后，基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架培養(yǎng)人工肝修復(fù)材料，步驟如 下：
[0095] 1)分別將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)進(jìn)行原代培養(yǎng) 與傳代，將ADSCs和BMSCs分別原代接種72小時(shí)培養(yǎng)，待接種后細(xì)胞密度達(dá)到90%，按1:2傳 代；
[0096] 2)細(xì)胞培養(yǎng)，進(jìn)行傳代后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的第2代細(xì)胞在用于生物人工肝的成體干細(xì) 胞-再生絲素蛋白組織工程支架上以lX104/cm2的濃度進(jìn)行接種，并于5v/v%C〇dP37°C條 件下恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)基為a_MEM+10v/v%FBS;
[0097] 3)成肝臟樣細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)24h后見細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，將培養(yǎng)基更換為加 入用于生物人工肝的組織工程支架的含5v/v%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，每隔3天換一次培養(yǎng) 基；
[0098] 4)再生絲素蛋白纖維支架上ADSCs和BMSCs的體外誘導(dǎo)成肝能力，種植于再生絲素 蛋白纖維支架上的ADSCs和BMSCs分別經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)7天后，ADSCs和BMSCs分別誘導(dǎo)成肝臟樣 細(xì)胞。
[0099] 經(jīng)與實(shí)施例1中相同的小鼠實(shí)驗(yàn)，結(jié)果基本一致，不同救治組肝功能的改善結(jié)果表 明，再生絲素蛋白材料復(fù)合細(xì)胞后改善肝功能的水平明顯優(yōu)于單純的細(xì)胞治療組以及單純 的再生絲素蛋白材料組。
[0100] 實(shí)施例5
[0101] -種基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架的人工肝修復(fù)材料的培養(yǎng)方 法，首先，制備用于生物人工肝的成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架，步驟如下：
[0102] 1)將柞蠶繭用質(zhì)量百分比為0.6%的碳酸鈉水溶液脫膠后，溶解于摩爾濃度為 9.3mol/L的溴化鋰水溶液中，得到再生絲素蛋白-溴化鋰水溶液，將此溶液離心、過濾、透析 和濃縮，得到質(zhì)量百分比為36 %的再生絲素蛋白水溶液；
[0103] 2)以水為溶劑，配制HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液，其中HGF與FGF4因子的質(zhì) 量濃度都為20yg/mL，牛血清蛋白的質(zhì)量濃度為0.9mg/mL，溶液中還包含25ng/mL 0SM、 26ng/mL aFGF、5ymol/L Dex、80ymol/L VPP、3mmol/L Vc和IX膜島素轉(zhuǎn)鐵蛋白砸；
[0104] 3)將再生絲素蛋白水溶液與HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液以100:1的體積比 混合，制備含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生絲素蛋白溶液；
[0105] 4)以含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生絲素蛋白溶液為紡絲液，在紡絲環(huán)境溫 度為5°C條件下，采用靜電紡絲法制備得到用于生物人工肝的成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組 織工程支架。
[0106] 然后，基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架培養(yǎng)人工肝修復(fù)材料，步驟如 下：
[0107] 1)分別將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)進(jìn)行原代培養(yǎng) 與傳代，將ADSCs和BMSCs分別原代接種72小時(shí)培養(yǎng)，待接種后細(xì)胞密度達(dá)到93%，按1:3傳 代；
[0108] 2)細(xì)胞培養(yǎng)，進(jìn)行傳代后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的第2代細(xì)胞在用于生物人工肝的成體干細(xì) 胞-再生絲素蛋白組織工程支架上以lX104/cm2的濃度進(jìn)行接種，并于5v/v%C〇dP37°C條 件下恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)基為a_MEM+18v/v%FBS;
[0109] 3)成肝臟樣細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)24h后見細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，將培養(yǎng)基更換為加 入用于生物人工肝的組織工程支架的含8v/v%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，每隔4天換一次培養(yǎng) 基；
[0110] 4)再生絲素蛋白纖維支架上ADSCs和BMSCs的體外誘導(dǎo)成肝能力，種植于再生絲素 蛋白纖維支架上的ADSCs和BMSCs分別經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)12天后，ADSCs和BMSCs分別誘導(dǎo)成肝臟樣 細(xì)胞。
[0111] 經(jīng)與實(shí)施例1中相同的小鼠實(shí)驗(yàn)，結(jié)果基本一致，不同救治組肝功能的改善結(jié)果表 明，再生絲素蛋白材料復(fù)合細(xì)胞后改善肝功能的水平明顯優(yōu)于單純的細(xì)胞治療組以及單純 的再生絲素蛋白材料組。
[0112] 實(shí)施例6
[0113] -種基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架的人工肝修復(fù)材料的培養(yǎng)方 法，首先，制備用于生物人工肝的成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架，步驟如下：
[0114] 1)將蓖麻蠶繭用質(zhì)量百分比為0.7%的碳酸鈉水溶液脫膠后，溶解于摩爾濃度為 9.4mol/L的溴化鋰水溶液中，得到再生絲素蛋白-溴化鋰水溶液，將此溶液離心、過濾、透析 和濃縮，得到質(zhì)量百分比為38 %的再生絲素蛋白水溶液；
[0115] 2)以水為溶劑，配制HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液，其中HGF與FGF4因子的質(zhì) 量濃度都為22yg/mL，牛血清蛋白的質(zhì)量濃度為lmg/mL，溶液中還包含30ng/mL OSM、32ng/ mL aFGF、8ymol/L Dex、100ymol/L VPP、5mmol/L Vc和I · IX膜島素轉(zhuǎn)鐵蛋白砸；
[0116] 3)將再生絲素蛋白水溶液與HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液以120:1的體積比 混合，制備含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生絲素蛋白溶液；
[0117] 4)以含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生絲素蛋白溶液為紡絲液，在紡絲環(huán)境溫 度為6°C條件下，采用靜電紡絲法制備得到用于生物人工肝的成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組 織工程支架。
[0118] 然后，基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架培養(yǎng)人工肝修復(fù)材料，步驟如 下：
[0119] 1)分別將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)進(jìn)行原代培養(yǎng) 與傳代，將ADSCs和BMSCs分別原代接種72小時(shí)培養(yǎng)，待接種后細(xì)胞密度達(dá)到94%，按1:2傳 代；
[0120] 2)細(xì)胞培養(yǎng)，進(jìn)行傳代后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的第3代細(xì)胞在用于生物人工肝的成體干細(xì) 胞-再生絲素蛋白組織工程支架上以lX104/cm 2的濃度進(jìn)行接種，并于5v/v%C〇dP37°C條 件下恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)基為α_ΜΕΜ+20v/v % FBS;
[0121 ] 3)成肝臟樣細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)24h后見細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，將培養(yǎng)基更換為加 入用于生物人工肝的組織工程支架的含9v/v%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，每隔3天換一次培養(yǎng) 基；
[0122] 4)再生絲素蛋白纖維支架上ADSCs和BMSCs的體外誘導(dǎo)成肝能力，種植于再生絲素 蛋白纖維支架上的ADSCs和BMSCs分別經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)13天后，ADSCs和BMSCs分別誘導(dǎo)成肝臟樣 細(xì)胞。
[0123] 經(jīng)與實(shí)施例1中相同的小鼠實(shí)驗(yàn)，結(jié)果基本一致，不同救治組肝功能的改善結(jié)果表 明，再生絲素蛋白材料復(fù)合細(xì)胞后改善肝功能的水平明顯優(yōu)于單純的細(xì)胞治療組以及單純 的再生絲素蛋白材料組。
[0124] 實(shí)施例7
[0125] -種基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架的人工肝修復(fù)材料的培養(yǎng)方 法，首先，制備用于生物人工肝的成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架，步驟如下：
[0126] 1)將柞蠶繭用質(zhì)量百分比為0.4%的碳酸鈉水溶液脫膠后，溶解于摩爾濃度為 9. lmol/L的溴化鋰水溶液中，得到再生絲素蛋白-溴化鋰水溶液，將此溶液離心、過濾、透析 和濃縮，得到質(zhì)量百分比為32 %的再生絲素蛋白水溶液；
[0127] 2)以水為溶劑，配制HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液，其中HGF與FGF4因子的質(zhì) 量濃度都為I eyg/mL，牛血清蛋白的質(zhì)量濃度為0.7mg/mL;
[0128] 3)將再生絲素蛋白水溶液與HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液以80:1的體積比 混合，制備含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生絲素蛋白溶液；
[0129] 4)以含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生絲素蛋白溶液為紡絲液，在紡絲環(huán)境溫 度為:TC條件下，采用靜電紡絲法制備得到用于生物人工肝的成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組 織工程支架。
[0130] 然后，基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架培養(yǎng)人工肝修復(fù)材料，步驟如 下：
[0131] 1)分別將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)進(jìn)行原代培養(yǎng) 與傳代，將ADSCs和BMSCs分別原代接種72小時(shí)培養(yǎng)，待接種后細(xì)胞密度達(dá)到91%，按1:3傳 代；
[0132] 2)細(xì)胞培養(yǎng)，進(jìn)行傳代后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的第3代細(xì)胞在用于生物人工肝的成體干細(xì) 胞-再生絲素蛋白組織工程支架上以lX10 4/cm2的濃度進(jìn)行接種，并于5v/v%C〇dP37°C條 件下恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)基為α-ΜΕΜ+12v/v % FBS;
[0133] 3)成肝臟樣細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)24h后見細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，將培養(yǎng)基更換為加 入用于生物人工肝的組織工程支架的含6v/v%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中還含有20ng/ mL EGF，每隔4天換一次培養(yǎng)基；
[0134] 4)再生絲素蛋白纖維支架上ADSCs和BMSCs的體外誘導(dǎo)成肝能力，種植于再生絲素 蛋白纖維支架上的ADSCs和BMSCs分別經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)8天后，ADSCs和BMSCs分別誘導(dǎo)成肝臟樣 細(xì)胞。
[0135] 經(jīng)與實(shí)施例1中相同的小鼠實(shí)驗(yàn)，結(jié)果基本一致，不同救治組肝功能的改善結(jié)果表 明，再生絲素蛋白材料復(fù)合細(xì)胞后改善肝功能的水平明顯優(yōu)于單純的細(xì)胞治療組以及單純 的再生絲素蛋白材料組。
[0136] 實(shí)施例8
[0137] -種基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架的人工肝修復(fù)材料的培養(yǎng)方 法，首先，制備用于生物人工肝的成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架，步驟如下：
[0138] 1)將桑蠶繭用質(zhì)量百分比為0.3%的碳酸鈉水溶液脫膠后，溶解于摩爾濃度為 9.5mol/L的溴化鋰水溶液中，得到再生絲素蛋白-溴化鋰水溶液，將此溶液離心、過濾、透析 和濃縮，得到質(zhì)量百分比為40 %的再生絲素蛋白水溶液；
[0139] 2)以水為溶劑，配制HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液，其中HGF與FGF4因子的質(zhì) 量濃度都為25yg/mL，牛血清蛋白的質(zhì)量濃度為0.6mg/mL;
[0140] 3)將再生絲素蛋白水溶液與HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液以130:1的體積比 混合，制備含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生絲素蛋白溶液；
[0141] 4)以含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生絲素蛋白溶液為紡絲液，在紡絲環(huán)境溫 度為2°C條件下，采用靜電紡絲法制備得到用于生物人工肝的成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組 織工程支架。
[0142] 然后，基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架培養(yǎng)人工肝修復(fù)材料，步驟如 下：
[0143] 1)分別將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)進(jìn)行原代培養(yǎng) 與傳代，將ADSCs和BMSCs分別原代接種72小時(shí)培養(yǎng)，待接種后細(xì)胞密度達(dá)到91%，按1:3傳 代；
[0144] 2)細(xì)胞培養(yǎng)，進(jìn)行傳代后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的第4代細(xì)胞在用于生物人工肝的成體干細(xì) 胞-再生絲素蛋白組織工程支架上以lX10 4/cm2的濃度進(jìn)行接種，并于5v/v%C〇dP37°C條 件下恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)基為DMEM+10v/v%FBS;
[0145] 3)成肝臟樣細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)24h后見細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，將培養(yǎng)基更換為加 入用于生物人工肝的組織工程支架的含l〇v/v%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中還含有 10ng/mL bFGF，每隔4天換一次培養(yǎng)基；
[0146] 4)再生絲素蛋白纖維支架上ADSCs和BMSCs的體外誘導(dǎo)成肝能力，種植于再生絲素 蛋白纖維支架上的ADSCs和BMSCs分別經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)14天后，ADSCs和BMSCs分別誘導(dǎo)成肝臟樣 細(xì)胞。
[0147] 經(jīng)與實(shí)施例1中相同的小鼠實(shí)驗(yàn)，結(jié)果基本一致，不同救治組肝功能的改善結(jié)果表 明，再生絲素蛋白材料復(fù)合細(xì)胞后改善肝功能的水平明顯優(yōu)于單純的細(xì)胞治療組以及單純 的再生絲素蛋白材料組。
[0148] 實(shí)施例9
[0149] -種基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架的人工肝修復(fù)材料的培養(yǎng)方 法，首先，制備用于生物人工肝的成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架，步驟如下：
[0150] 1)將柞蠶繭用質(zhì)量百分比為0.4%的碳酸鈉水溶液脫膠后，溶解于摩爾濃度為 9.Omol/L的溴化鋰水溶液中，得到再生絲素蛋白-溴化鋰水溶液，將此溶液離心、過濾、透析 和濃縮，得到質(zhì)量百分比為31%的再生絲素蛋白水溶液；
[0151] 2)以水為溶劑，配制HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液，其中HGF與FGF4因子的質(zhì) 量濃度都為I Tyg/mL，牛血清蛋白的質(zhì)量濃度為0.6mg/mL;
[0152] 3)將再生絲素蛋白水溶液與HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液以70:1的體積比 混合，制備含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生絲素蛋白溶液；
[0153] 4)以含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生絲素蛋白溶液為紡絲液，在紡絲環(huán)境溫 度為:TC條件下，采用靜電紡絲法制備得到用于生物人工肝的成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組 織工程支架。
[0154] 然后，基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架培養(yǎng)人工肝修復(fù)材料，步驟如 下：
[0155] 1)分別將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)進(jìn)行原代培養(yǎng) 與傳代，將ADSCs和BMSCs分別原代接種72小時(shí)培養(yǎng)，待接種后細(xì)胞密度達(dá)到89%，半量換 液，延長(zhǎng)培養(yǎng)一天按1:2傳代；
[0156] 2)細(xì)胞培養(yǎng)，進(jìn)行傳代后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的第2代細(xì)胞在用于生物人工肝的成體干細(xì) 胞-再生絲素蛋白組織工程支架上以lX10 4/cm2的濃度進(jìn)行接種，并于5v/v%C〇dP37°C條 件下恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)基為DMEM+13v/v % FBS;
[0157] 3)成肝臟樣細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)24h后見細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，將培養(yǎng)基更換為加 入用于生物人工肝的組織工程支架的含6v/v%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中還含有20ng/ mL EGF和10ng/mL bFGF，每隔3天換一次培養(yǎng)基；
[0158] 4)再生絲素蛋白纖維支架上ADSCs和BMSCs的體外誘導(dǎo)成肝能力，種植于再生絲素 蛋白纖維支架上的ADSCs和BMSCs分別經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)15天后，ADSCs和BMSCs分別誘導(dǎo)成肝臟樣 細(xì)胞。
[0159] 經(jīng)與實(shí)施例1中相同的小鼠實(shí)驗(yàn)，結(jié)果基本一致，不同救治組肝功能的改善結(jié)果表 明，再生絲素蛋白材料復(fù)合細(xì)胞后改善肝功能的水平明顯優(yōu)于單純的細(xì)胞治療組以及單純 的再生絲素蛋白材料組。
[0160] 實(shí)施例10
[0161] -種基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架的人工肝修復(fù)材料的培養(yǎng)方 法，首先，制備用于生物人工肝的成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架，步驟如下：
[0162] 1)將柞蠶繭用質(zhì)量百分比為0.6%的碳酸鈉水溶液脫膠后，溶解于摩爾濃度為 9.3mol/L的溴化鋰水溶液中，得到再生絲素蛋白-溴化鋰水溶液，將此溶液離心、過濾、透析 和濃縮，得到質(zhì)量百分比為36 %的再生絲素蛋白水溶液；
[0163] 2)以水為溶劑，配制HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液，其中HGF與FGF4因子的質(zhì) 量濃度都為20yg/mL，牛血清蛋白的質(zhì)量濃度為0.9mg/mL，溶液中還包含25ng/mL 0SM、 26ng/mL aFGF、5ymol/L Dex、80ymol/L VPP、3mmol/L Vc和IX膜島素轉(zhuǎn)鐵蛋白砸；
[0164] 3)將再生絲素蛋白水溶液與HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液以100:1的體積比 混合，制備含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生絲素蛋白溶液；
[0165] 4)以含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生絲素蛋白溶液為紡絲液，在紡絲環(huán)境溫 度為5°C條件下，采用靜電紡絲法制備得到用于生物人工肝的成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組 織工程支架。
[0166] 然后，基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架培養(yǎng)人工肝修復(fù)材料，步驟如 下：
[0167] 1)分別將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)進(jìn)行原代培養(yǎng) 與傳代，將ADSCs和BMSCs分別原代接種72小時(shí)培養(yǎng)，待接種后細(xì)胞密度達(dá)到93%，按1:3傳 代；
[0168] 2)細(xì)胞培養(yǎng)，進(jìn)行傳代后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的第2代細(xì)胞在用于生物人工肝的成體干細(xì) 胞-再生絲素蛋白組織工程支架上以lX10 4/cm2的濃度進(jìn)行接種，并于5v/v%C〇dP37°C條 件下恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)基為a_MEM+18v/v%FBS;
[0169] 3)成肝臟樣細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)24h后見細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，將培養(yǎng)基更換為加 入用于生物人工肝的組織工程支架的含8v/v%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中還含有20ng/ mL EGF，每隔4天換一次培養(yǎng)基；
[0170] 4)再生絲素蛋白纖維支架上ADSCs和BMSCs的體外誘導(dǎo)成肝能力，種植于再生絲素 蛋白纖維支架上的ADSCs和BMSCs分別經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)12天后，ADSCs和BMSCs分別誘導(dǎo)成肝臟樣 細(xì)胞。
[0171] 經(jīng)與實(shí)施例1中相同的小鼠實(shí)驗(yàn)，結(jié)果基本一致，不同救治組肝功能的改善結(jié)果表 明，再生絲素蛋白材料復(fù)合細(xì)胞后改善肝功能的水平明顯優(yōu)于單純的細(xì)胞治療組以及單純 的再生絲素蛋白材料組。
[0172] 實(shí)施例11
[0173] -種基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架的人工肝修復(fù)材料的培養(yǎng)方 法，首先，制備用于生物人工肝的成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架，步驟如下：
[0174] 1)將桑蠶繭用質(zhì)量百分比為0.3%的碳酸鈉水溶液脫膠后，溶解于摩爾濃度為 9.5mol/L的溴化鋰水溶液中，得到再生絲素蛋白-溴化鋰水溶液，將此溶液離心、過濾、透析 和濃縮，得到質(zhì)量百分比為40 %的再生絲素蛋白水溶液；
[0175] 2)以水為溶劑，配制HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液，其中HGF與FGF4因子的質(zhì) 量濃度都為25yg/mL，牛血清蛋白的質(zhì)量濃度為0.6mg/mL，溶液中還包含35ng/mL 0SM、 38ng/mL aFGF、12ymol/L Dex、130ymol/L VPP、7mmol/L Vc和0.9X胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒；
[0176] 3)將再生絲素蛋白水溶液與HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液以130:1的體積比 混合，制備含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生絲素蛋白溶液；
[0177] 4)以含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生絲素蛋白溶液為紡絲液，在紡絲環(huán)境溫 度為2°C條件下，采用靜電紡絲法制備得到用于生物人工肝的成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組 織工程支架。
[0178] 然后，基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架培養(yǎng)人工肝修復(fù)材料，步驟如 下：
[0179] 1)分別將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)進(jìn)行原代培養(yǎng) 與傳代，將ADSCs和BMSCs分別原代接種72小時(shí)培養(yǎng)，待接種后細(xì)胞密度達(dá)到91%，按1:3傳 代；
[0180] 2)細(xì)胞培養(yǎng)，進(jìn)行傳代后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的第4代細(xì)胞在用于生物人工肝的成體干細(xì) 胞-再生絲素蛋白組織工程支架上以lX104/cm2的濃度進(jìn)行接種，并于5v/v%C〇dP37°C條 件下恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)基為DMEM+10v/v%FBS;
[0181 ] 3)成肝臟樣細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)24h后見細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，將培養(yǎng)基更換為加 入用于生物人工肝的組織工程支架的含l〇v/v%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中還含有 10ng/mL bFGF，每隔4天換一次培養(yǎng)基；
[0182] 4)再生絲素蛋白纖維支架上ADSCs和BMSCs的體外誘導(dǎo)成肝能力，種植于再生絲素 蛋白纖維支架上的ADSCs和BMSCs分別經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)14天后，ADSCs和BMSCs分別誘導(dǎo)成肝臟樣 細(xì)胞。
[0183] 經(jīng)與實(shí)施例1中相同的小鼠實(shí)驗(yàn)，結(jié)果基本一致，不同救治組肝功能的改善結(jié)果表 明，再生絲素蛋白材料復(fù)合細(xì)胞后改善肝功能的水平明顯優(yōu)于單純的細(xì)胞治療組以及單純 的再生絲素蛋白材料組。
[0184] 實(shí)施例12
[0185] -種基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架的人工肝修復(fù)材料的培養(yǎng)方 法，首先，制備用于生物人工肝的成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架，步驟如下：
[0186] 1)將柞蠶繭用質(zhì)量百分比為0.5%的碳酸鈉水溶液脫膠后，溶解于摩爾濃度為 9. lmol/L的溴化鋰水溶液中，得到再生絲素蛋白-溴化鋰水溶液，將此溶液離心、過濾、透析 和濃縮，得到質(zhì)量百分比為33 %的再生絲素蛋白水溶液；
[0187] 2)以水為溶劑，配制HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液，其中HGF與FGF4因子的質(zhì) 量濃度都為19yg/mL，牛血清蛋白的質(zhì)量濃度為0.7mg/mL，溶液中還包含38ng/mL 0SM、 45ng/mL aFGF、15ymol/L Dex、170ymol/L VPP、9mmol/L Vc和IX膜島素轉(zhuǎn)鐵蛋白砸；
[0188] 3)將再生絲素蛋白水溶液與HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液以88:1的體積比 混合，制備含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生絲素蛋白溶液；
[0189] 4)以含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生絲素蛋白溶液為紡絲液，在紡絲環(huán)境溫 度為4°C條件下，采用靜電紡絲法制備得到用于生物人工肝的成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組 織工程支架。
[0190] 然后，基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架培養(yǎng)人工肝修復(fù)材料，步驟如 下：
[0191] 1)分別將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)進(jìn)行原代培養(yǎng) 與傳代，將ADSCs和BMSCs分別原代接種72小時(shí)培養(yǎng)，待接種后細(xì)胞密度達(dá)到88%，半量換 液，延長(zhǎng)培養(yǎng)一天按1:3傳代；
[0192] 2)細(xì)胞培養(yǎng)，進(jìn)行傳代后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的第3代細(xì)胞在用于生物人工肝的成體干細(xì) 胞-再生絲素蛋白組織工程支架上以lX10 4/cm2的濃度進(jìn)行接種，并于5v/v%C〇dP37°C條 件下恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)基為DMEM+16v/v%FBS;
[0193] 3)成肝臟樣細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)24h后見細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，將培養(yǎng)基更換為加 入用于生物人工肝的組織工程支架的含7v/v%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中還含有20ng/ mL EGF，每隔4天換一次培養(yǎng)基；
[0194] 4)再生絲素蛋白纖維支架上ADSCs和BMSCs的體外誘導(dǎo)成肝能力，種植于再生絲素 蛋白纖維支架上的ADSCs和BMSCs分別經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)9天后，ADSCs和BMSCs分別誘導(dǎo)成肝臟樣 細(xì)胞。
[0195] 經(jīng)與實(shí)施例1中相同的小鼠實(shí)驗(yàn)，結(jié)果基本一致，不同救治組肝功能的改善結(jié)果表 明，再生絲素蛋白材料復(fù)合細(xì)胞后改善肝功能的水平明顯優(yōu)于單純的細(xì)胞治療組以及單純 的再生絲素蛋白材料組。
[0196] 實(shí)施例13
[0197] -種基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架的人工肝修復(fù)材料的培養(yǎng)方 法，首先，制備用于生物人工肝的成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架，步驟如下：
[0198] 1)將蓖麻蠶繭用質(zhì)量百分比為0.6%的碳酸鈉水溶液脫膠后，溶解于摩爾濃度為 9.2mol/L的溴化鋰水溶液中，得到再生絲素蛋白-溴化鋰水溶液，將此溶液離心、過濾、透析 和濃縮，得到質(zhì)量百分比為35 %的再生絲素蛋白水溶液；
[0199] 2)以水為溶劑，配制HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液，其中HGF與FGF4因子的質(zhì) 量濃度都為2 lyg/mL，牛血清蛋白的質(zhì)量濃度為0.8mg/mL，溶液中還包含40ng/mL 0SM、 50ng/mL aFGF、20ymol/L Dex、200ymol/L VPP、10mmol/L Vc和 1.1X胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒；
[0200] 3)將再生絲素蛋白水溶液與HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液以95:1的體積比 混合，制備含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生絲素蛋白溶液；
[0201] 4)以含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生絲素蛋白溶液為紡絲液，在紡絲環(huán)境溫 度為5°C條件下，采用靜電紡絲法制備得到用于生物人工肝的成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組 織工程支架。
[0202] 然后，基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架培養(yǎng)人工肝修復(fù)材料，步驟如 下：
[0203] 1)分別將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)進(jìn)行原代培養(yǎng) 與傳代，將ADSCs和BMSCs分別原代接種72小時(shí)培養(yǎng)，待接種后細(xì)胞密度達(dá)到93%，按1:2傳 代；
[0204] 2)細(xì)胞培養(yǎng)，進(jìn)行傳代后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的第4代細(xì)胞在用于生物人工肝的成體干細(xì) 胞-再生絲素蛋白組織工程支架上以lX10 4/cm2的濃度進(jìn)行接種，并于5v/v%C〇dP37°C條 件下恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)基為DMEM+18v/v%FBS;
[0205] 3)成肝臟樣細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)24h后見細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，將培養(yǎng)基更換為加 入用于生物人工肝的組織工程支架的含8v/v%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中還含有20ng/ mL EGF和10ng/mL bFGF，每隔3天換一次培養(yǎng)基；
[0206] 4)再生絲素蛋白纖維支架上ADSCs和BMSCs的體外誘導(dǎo)成肝能力，種植于再生絲素 蛋白纖維支架上的ADSCs和BMSCs分別經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)11天后，ADSCs和BMSCs分別誘導(dǎo)成肝臟樣 細(xì)胞。
[0207]經(jīng)與實(shí)施例1中相同的小鼠實(shí)驗(yàn)，結(jié)果基本一致，不同救治組肝功能的改善結(jié)果表 明，再生絲素蛋白材料復(fù)合細(xì)胞后改善肝功能的水平明顯優(yōu)于單純的細(xì)胞治療組以及單純 的再生絲素蛋白材料組。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架的人工肝修復(fù)材料的培養(yǎng)方法，其特 征是包括以下步驟： (a) 成體干細(xì)胞的原代培養(yǎng)與傳代； 將成體干細(xì)胞原代接種培養(yǎng)，待接種后細(xì)胞密度達(dá)90 %以上，則傳代； (b) 細(xì)胞培養(yǎng)； 進(jìn)行傳代后在用于生物人工肝的成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架上接種，并 恒溫培養(yǎng);培養(yǎng)基為 α-ΜΕΜ+10 ~20v/v%FBS 或 DMEM+10 ~20v/v%FBS; (c) 成肝臟樣細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)； 細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)基更換為加入所述用于生物人工肝的組織工程支架的基礎(chǔ)培養(yǎng)基 中，每隔3~4天換一次基礎(chǔ)培養(yǎng)基； 所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為含5~lOv/v %FBS的DMEM培養(yǎng)基； (d) 再生絲素蛋白纖維支架上成體干細(xì)胞的體外誘導(dǎo)成肝能力； 種植于再生絲素蛋白纖維支架上的成體干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)7~15天后，成體干細(xì)胞即 誘導(dǎo)成肝臟樣細(xì)胞； 所述成體干細(xì)胞為脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞或骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 所述用于生物人工肝的成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架的制備方法如下： (1) 以蠶繭為原料，經(jīng)脫膠、溶解、透析和濃縮后，制備質(zhì)量百分比為30~40%的再生絲 素蛋白水溶液； (2) 以水為溶劑，配制HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液，其中HGF與FGF4因子的質(zhì)量 濃度都為15~25yg/mL，牛血清蛋白的質(zhì)量濃度為0.6~lmg/mL; (3) 將所述再生絲素蛋白水溶液與所述HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液以60~130: 1的體積比混合，制備含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生絲素蛋白溶液； (4) 以所述含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生絲素蛋白溶液為紡絲液，采用靜電紡 絲法制備得到用于生物人工肝的成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架的人工肝修復(fù) 材料的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述再生絲素蛋白水溶液的制備步驟如下:將蠶繭用質(zhì)量百 分比為0.3~0.7%的碳酸鈉水溶液脫膠后，溶解于摩爾濃度為9.0~9.5mol/L的溴化鋰水 溶液中，得到再生絲素蛋白-溴化鋰水溶液;將此溶液離心、過濾、透析和濃縮，得到質(zhì)量百 分比為30~40 %的再生絲素蛋白水溶液。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架的人工肝修復(fù) 材料的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述蠶繭為桑蠶繭、柞蠶繭或蓖麻蠶繭中的一種。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架的人工肝修復(fù) 材料的培養(yǎng)方法，其特征在于，靜電紡絲的紡絲環(huán)境溫度為2~6°C。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架的人工肝修復(fù) 材料的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(2)中，還包含20-40ng/mL 0SM、20-50ng/mL aFGF、l-20 4111〇1/106叉、50-20(^111〇1/1￥??、1-10臟〇1/1￥(3和0.9-1.1父胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架的人工肝修復(fù) 材料的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述原代接種時(shí)間為72小時(shí);所述傳代按1: 2~3傳代;步驟 (a)中，若細(xì)胞密度未達(dá)90 %，則半量換液，延長(zhǎng)培養(yǎng)一天傳代。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架的人工肝修復(fù) 材料的培養(yǎng)方法，其特征在于，傳代后接種是指:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的第2~4代細(xì)胞，以1 X 104/Cm2 的濃度進(jìn)行傳代后接種;所述恒溫培養(yǎng)是指:于5v/v % 0)2和37 °C條件下恒溫培養(yǎng)。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架的人工肝修復(fù) 材料的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述細(xì)胞貼壁是指細(xì)胞培養(yǎng)24h后見細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于成體干細(xì)胞-再生絲素蛋白組織工程支架的人工肝修復(fù) 材料的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中還含有20ng/mL EGF和/或10ng/mL bFGF。
【文檔編號(hào)】A61L27/22GK106075586SQ201610567027
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年7月19日
【發(fā)明人】張耀鵬, 閻麗, 徐麗娟, 黃利, 邵惠麗, 胡學(xué)超
【申請(qǐng)人】東華大學(xué)