基于有機(jī)胍鹽和聚乙二醇的抗菌涂層的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了基于有機(jī)胍鹽和聚乙二醇的抗菌涂層，其組份按重量份數(shù)包括聚六亞甲基胍鹽酸鹽或聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽20?30份、烯丙基縮水甘油醚10?15份、聚乙二醇單烯丙基醚10?15份，4?甲苯磺酰氯7?15份，本發(fā)明制作工藝簡(jiǎn)單，制備的涂層具有良好的抗菌和抗細(xì)菌粘附性能，從而達(dá)到了抗生物被膜的作用，同時(shí)具有較低的哺乳動(dòng)物細(xì)胞毒性。
【專利說明】
基于有機(jī)胍鹽和聚乙二醇的抗菌涂層
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及抗菌涂層制備技術(shù)領(lǐng)域，具體為基于有機(jī)胍鹽和聚乙二醇的抗菌涂 層。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，越來越多的生物醫(yī)學(xué)器件應(yīng)用于人體，而這些生物醫(yī)學(xué)器 件的植入后感染對(duì)患者健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，例如骨科植入物、各類支架、尿路/靜脈導(dǎo)管等 在使用過程中都存在著較高的感染率，這些感染的起源大多是由于這些設(shè)備合成表面細(xì)菌 粘附和增殖。因此，醫(yī)療和衛(wèi)生保健系統(tǒng)迫切需要開發(fā)新技術(shù)來減少各種植入的生物醫(yī)學(xué) 設(shè)備引起的感染。近年來，許多研究人員關(guān)注在抗菌涂層技術(shù)，不少研究都證實(shí)了其可以有 效地減少微生物感染，特別是這一技術(shù)可以避免過量使用傳統(tǒng)的抗生素，通過表面修飾方 法而不改變材料的本體性能，建立一層表面抗菌涂層于生物醫(yī)學(xué)器件或植入物，以防止微 生物粘附以及抑制其擴(kuò)散，或者在微生物和表面接觸時(shí)就殺死它們。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供基于有機(jī)胍鹽和聚乙二醇的抗菌涂層，以解決上述背景技 術(shù)中提出的問題。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:基于有機(jī)胍鹽和聚乙二醇的抗菌涂 層，其組份按重量份數(shù)包括聚六亞甲基胍鹽酸鹽或聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽20-30份、烯丙基 縮水甘油醚10-15份、聚乙二醇單烯丙基醚10-15份，4-甲苯磺酰氯7-15份。
[0005] 優(yōu)選的，其制備方法包括以下步驟：
[0006] A、對(duì)甲苯磺?；垡叶紗蜗┍训暮铣煞椒òㄒ韵虏襟E：
[0007] a、將0.056摩爾聚乙二醇單烯丙基醚添加到含有10毫升無水吡啶的三口圓底燒瓶 內(nèi)，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下冰浴攪拌；
[0008] b、之后將0.102摩爾4-甲苯磺酰氯添加進(jìn)三口圓底燒瓶?jī)?nèi)攪拌5小時(shí)；之后將60毫 升二氯甲烷添加進(jìn)三口圓底燒瓶?jī)?nèi)，在室溫下攪拌30小時(shí)；
[0009] c、之后，混合稀釋了60毫升二氯甲烷和2100毫升有機(jī)相隨后用水、100毫升濃度為 10mol/L鹽酸水溶液，100毫升濃度為1.2mol/L飽和碳酸氫鈉洗脫；
[0010] d、然后加入硫酸鎂進(jìn)行干燥，最后采用用真空蒸餾，得到一種無色液體。
[0011] B、聚乙二醇單烯丙基醚功能化聚六亞甲基胍或聚六亞甲基雙胍的制備包括以下 步驟：
[0012] a、將聚六亞甲基胍鹽酸鹽或聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽溶解于甲醇，配成20 %質(zhì)量濃 度的溶液；
[0013 ] b、在溶液中加入4摩爾當(dāng)量的碳酸鉀，攪拌均勻；
[0014] C、將反應(yīng)混合物用氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下加熱到65°C至回流30分鐘，將1.2或2.4當(dāng)量的 聚乙二醇單烯丙基醚加入，在65°C下回流反應(yīng)24小時(shí)；
[0015] d、反應(yīng)結(jié)束后，混合液用0.5摩爾鹽酸溶液中和至中性，然后在透析袋中透析4至5 天，濃縮后冷凍干燥得到產(chǎn)品聚六亞甲基胍-聚乙二醇單烯丙基醚二嵌段共聚物，或聚六亞 甲基雙胍-聚乙二醇單烯丙基醚二嵌段共聚物。
[0016] C、烯丙基功能化聚六亞甲基胍鹽酸鹽或聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽的制備方法包括 以下步驟：
[0017] a、將一定量濃度為38. Owt %的聚六亞甲基胍鹽酸鹽或聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽低 聚物溶液在DMSO中，之后將混合物倒入配有電磁攪拌器的圓底燒瓶?jī)?nèi)；
[0018] b、對(duì)圓底燒瓶進(jìn)行加熱，加熱溫度為60°c-65°c，加熱持續(xù)時(shí)間為30分鐘-40分鐘， 之后迅速注入一定體積的烯丙基縮水甘油醚，且烯丙基縮水甘油醚與聚六亞甲基胍鹽酸鹽 的進(jìn)料摩爾比為1.0，得到混合物A、；
[0019] c、混合物A在60 °C下在不斷攪拌，反應(yīng)60小時(shí)結(jié)束，粗產(chǎn)物通過反復(fù)沉淀、溶解在 丙酮或甲醇溶液中三次，來完全去除DMSO和未反應(yīng)的烯丙基縮水甘油醚，得到混合物B;
[0020] d、將混合物B在室溫下真空干燥后12小時(shí)，得到純化產(chǎn)物。
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明制作工藝簡(jiǎn)單，制備的涂層具有良 好的抗菌和抗細(xì)菌粘附性能，從而達(dá)到了抗生物被膜的作用，同時(shí)具有較低的哺乳動(dòng)物細(xì) 胞毒性;另外，本發(fā)明制得的涂層不但表面抗菌而且抗生物膜，改性涂層表面不支持細(xì)菌細(xì) 胞附著，因此預(yù)防生物膜的形成。經(jīng)過烯丙基縮水甘油醚和聚乙二醇單烯丙基醚改性后涂 層表面增加了表面親水性被認(rèn)為有助于抗生物膜，與其他抗生素涂層技術(shù)相比，這種抗生 物膜屬性使得修飾后的聚六亞甲基胍鹽酸鹽成為表面涂層一個(gè)優(yōu)越的選擇。
【附圖說明】
[0022]圖1為本發(fā)明的聚六亞甲基胍鹽酸鹽和烯丙基縮水甘油醚以及對(duì)甲苯磺?；垡?二醇單烯丙基醚的反應(yīng)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；?本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他 實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0024]請(qǐng)參閱圖1，本發(fā)明提供一種技術(shù)方案:基于有機(jī)胍鹽和聚乙二醇的抗菌涂層，其 組份按重量份數(shù)包括聚六亞甲基胍鹽酸鹽或聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽20-30份、烯丙基縮水 甘油醚10-15份、聚乙二醇單烯丙基醚10-15份，4-甲苯磺酰氯7-15份。
[0025] 實(shí)施例一：
[0026] 采用的成分配比為：聚六亞甲基胍鹽酸鹽或聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽20份、烯丙基 縮水甘油醚10份、聚乙二醇單烯丙基醚10份，4-甲苯磺酰氯7份。
[0027]本實(shí)施例的制備方法包括以下步驟：
[0028]其制備方法包括以下步驟：
[0029] A、對(duì)甲苯磺?；垡叶紗蜗┍训暮铣煞椒òㄒ韵虏襟E：
[0030] a、將0.056摩爾聚乙二醇單烯丙基醚添加到含有10毫升無水吡啶的三口圓底燒瓶 內(nèi)，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下冰浴攪拌；
[0031] b、之后將0.102摩爾4-甲苯磺酰氯添加進(jìn)三口圓底燒瓶?jī)?nèi)攪拌5小時(shí)；之后將60毫 升二氯甲烷添加進(jìn)三口圓底燒瓶?jī)?nèi)，在室溫下攪拌30小時(shí)；
[0032] c、之后，混合稀釋了60毫升二氯甲烷和2100毫升有機(jī)相隨后用水、100毫升濃度為 10mol/L鹽酸水溶液，100毫升濃度為1.2mol/L飽和碳酸氫鈉洗脫；
[0033] d、然后加入硫酸鎂進(jìn)行干燥，最后采用用真空蒸餾，得到一種無色液體。
[0034] B、聚乙二醇單烯丙基醚功能化聚六亞甲基胍或聚六亞甲基雙胍的制備包括以下 步驟：
[0035] a、將聚六亞甲基胍鹽酸鹽或聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽溶解于甲醇，配成20 %質(zhì)量濃 度的溶液；
[0036] b、在溶液中加入4摩爾當(dāng)量的碳酸鉀，攪拌均勻；
[0037] c、將反應(yīng)混合物用氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下加熱到65°C至回流30分鐘，將1.2當(dāng)量的聚乙 二醇單烯丙基醚加入，在65°C下回流反應(yīng)24小時(shí)；
[0038] d、反應(yīng)結(jié)束后，混合液用0.5摩爾鹽酸溶液中和至中性，然后在透析袋中透析4天， 濃縮后冷凍干燥得到產(chǎn)品聚六亞甲基胍-聚乙二醇單烯丙基醚二嵌段共聚物，或聚六亞甲 基雙胍-聚乙二醇單烯丙基醚二嵌段共聚物。
[0039] C、烯丙基功能化聚六亞甲基胍鹽酸鹽或聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽的制備方法包括 以下步驟：
[0040] a、將一定量濃度為38. Owt %的聚六亞甲基胍鹽酸鹽或聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽低 聚物溶液在DMSO中，之后將混合物倒入配有電磁攪拌器的圓底燒瓶?jī)?nèi)；
[0041] b、對(duì)圓底燒瓶進(jìn)行加熱，加熱溫度為60 °C，加熱持續(xù)時(shí)間為30分鐘，之后迅速注入 一定體積的烯丙基縮水甘油醚，且烯丙基縮水甘油醚與聚六亞甲基胍鹽酸鹽的進(jìn)料摩爾比 為1.0,得到混合物A、；
[0042] c、混合物A在60 °C下在不斷攪拌，反應(yīng)60小時(shí)結(jié)束，粗產(chǎn)物通過反復(fù)沉淀、溶解在 丙酮或甲醇溶液中三次，來完全去除DMSO和未反應(yīng)的烯丙基縮水甘油醚，得到混合物B; [0043] d、將混合物B在室溫下真空干燥后12小時(shí)，得到純化產(chǎn)物。
[0044] 實(shí)施例二：
[0045] 采用的成分配比為：聚六亞甲基胍鹽酸鹽或聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽30份、烯丙基 縮水甘油醚15份、聚乙二醇單烯丙基醚15份，4-甲苯磺酰氯15份。
[0046]本實(shí)施例的制備方法包括以下步驟：
[0047] A、對(duì)甲苯磺?；垡叶紗蜗┍训暮铣煞椒òㄒ韵虏襟E：
[0048] a、將0.056摩爾聚乙二醇單烯丙基醚添加到含有10毫升無水吡啶的三口圓底燒瓶 內(nèi)，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下冰浴攪拌；
[0049] b、之后將0.102摩爾4-甲苯磺酰氯添加進(jìn)三口圓底燒瓶?jī)?nèi)攪拌5小時(shí);之后將60毫 升二氯甲烷添加進(jìn)三口圓底燒瓶?jī)?nèi)，在室溫下攪拌30小時(shí)；
[0050] c、之后，混合稀釋了60毫升二氯甲烷和2100毫升有機(jī)相隨后用水、100毫升濃度為 10mol/L鹽酸水溶液，100毫升濃度為1.2mol/L飽和碳酸氫鈉洗脫；
[0051] d、然后加入硫酸鎂進(jìn)行干燥，最后采用用真空蒸餾，得到一種無色液體。
[0052] B、聚乙二醇單烯丙基醚功能化聚六亞甲基胍或聚六亞甲基雙胍的制備包括以下 步驟：
[0053] a、將聚六亞甲基胍鹽酸鹽或聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽溶解于甲醇，配成20%質(zhì)量濃 度的溶液；
[0054] b、在溶液中加入4摩爾當(dāng)量的碳酸鉀，攪拌均勻；
[0055] c、將反應(yīng)混合物用氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下加熱到65°C至回流30分鐘，將2.4當(dāng)量的聚乙 二醇單烯丙基醚加入，在65°C下回流反應(yīng)24小時(shí)；
[0056] d、反應(yīng)結(jié)束后，混合液用0.5摩爾鹽酸溶液中和至中性，然后在透析袋中透析5天， 濃縮后冷凍干燥得到產(chǎn)品聚六亞甲基胍-聚乙二醇單烯丙基醚二嵌段共聚物，或聚六亞甲 基雙胍-聚乙二醇單烯丙基醚二嵌段共聚物。
[0057] C、烯丙基功能化聚六亞甲基胍鹽酸鹽或聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽的制備方法包括 以下步驟：
[0058] a、將一定量濃度為38. Owt %的聚六亞甲基胍鹽酸鹽或聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽低 聚物溶液在DMSO中，之后將混合物倒入配有電磁攪拌器的圓底燒瓶?jī)?nèi)；
[0059] b、對(duì)圓底燒瓶進(jìn)行加熱，加熱溫度為65°C，加熱持續(xù)時(shí)間為40分鐘，之后迅速注入 一定體積的烯丙基縮水甘油醚，且烯丙基縮水甘油醚與聚六亞甲基胍鹽酸鹽的進(jìn)料摩爾比 為1.0,得到混合物A、；
[0060] C、混合物A在60 °C下在不斷攪拌，反應(yīng)60小時(shí)結(jié)束，粗產(chǎn)物通過反復(fù)沉淀、溶解在 丙酮或甲醇溶液中三次，來完全去除DMSO和未反應(yīng)的烯丙基縮水甘油醚，得到混合物B; [0061 ] d、將混合物B在室溫下真空干燥后12小時(shí)，得到純化產(chǎn)物。
[0062] 實(shí)施例三：
[0063] 采用的成分配比為：聚六亞甲基胍鹽酸鹽或聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽25份、烯丙基 縮水甘油醚12份、聚乙二醇單烯丙基醚12份，4-甲苯磺酰氯11份。
[0064]本實(shí)施例的制備方法包括以下步驟：
[0065] A、對(duì)甲苯磺?；垡叶紗蜗┍训暮铣煞椒òㄒ韵虏襟E：
[0066] a、將0.056摩爾聚乙二醇單烯丙基醚添加到含有10毫升無水吡啶的三口圓底燒瓶 內(nèi)，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下冰浴攪拌；
[0067] b、之后將0.102摩爾4-甲苯磺酰氯添加進(jìn)三口圓底燒瓶?jī)?nèi)攪拌5小時(shí)；之后將60毫 升二氯甲烷添加進(jìn)三口圓底燒瓶?jī)?nèi)，在室溫下攪拌30小時(shí)；
[0068] c、之后，混合稀釋了60毫升二氯甲烷和2100毫升有機(jī)相隨后用水、100毫升濃度為 10mol/L鹽酸水溶液，100毫升濃度為1.2mol/L飽和碳酸氫鈉洗脫；
[0069] d、然后加入硫酸鎂進(jìn)行干燥，最后采用用真空蒸餾，得到一種無色液體。
[0070] B、聚乙二醇單烯丙基醚功能化聚六亞甲基胍或聚六亞甲基雙胍的制備包括以下 步驟：
[0071] a、將聚六亞甲基胍鹽酸鹽或聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽溶解于甲醇，配成20 %質(zhì)量濃 度的溶液；
[0072] b、在溶液中加入4摩爾當(dāng)量的碳酸鉀，攪拌均勻；
[0073] c、將反應(yīng)混合物用氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下加熱到65°C至回流30分鐘，將1.2當(dāng)量的聚乙 二醇單烯丙基醚加入，在65°C下回流反應(yīng)24小時(shí)；
[0074] d、反應(yīng)結(jié)束后，混合液用0.5摩爾鹽酸溶液中和至中性，然后在透析袋中透析4天， 濃縮后冷凍干燥得到產(chǎn)品聚六亞甲基胍-聚乙二醇單烯丙基醚二嵌段共聚物，或聚六亞甲 基雙胍-聚乙二醇單烯丙基醚二嵌段共聚物。
[0075] C、烯丙基功能化聚六亞甲基胍鹽酸鹽或聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽的制備方法包括 以下步驟：
[0076] a、將一定量濃度為38. Owt %的聚六亞甲基胍鹽酸鹽或聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽低 聚物溶液在DMSO中，之后將混合物倒入配有電磁攪拌器的圓底燒瓶?jī)?nèi)；
[0077] b、對(duì)圓底燒瓶進(jìn)行加熱，加熱溫度為62 °C，加熱持續(xù)時(shí)間為35分鐘，之后迅速注入 一定體積的烯丙基縮水甘油醚，且烯丙基縮水甘油醚與聚六亞甲基胍鹽酸鹽的進(jìn)料摩爾比 為1.0,得到混合物A、；
[0078] c、混合物A在60 °C下在不斷攪拌，反應(yīng)60小時(shí)結(jié)束，粗產(chǎn)物通過反復(fù)沉淀、溶解在 丙酮或甲醇溶液中三次，來完全去除DMSO和未反應(yīng)的烯丙基縮水甘油醚，得到混合物B; [0079] d、將混合物B在室溫下真空干燥后12小時(shí)，得到純化產(chǎn)物。
[0080]本發(fā)明制備的涂層進(jìn)行最小抑菌濃度測(cè)定:使用了大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅 綠假單胞菌和腐皮鐮孢菌通過使用一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的對(duì)倍稀釋法測(cè)定了原始聚六亞甲基胍鹽酸 鹽和修飾過后的聚六亞甲基胍鹽酸鹽的最小抑菌濃度;首先，96孔板上加入100.0微升不同 濃度的原始聚六亞甲基胍鹽酸鹽，烯丙基縮水甘油醚修飾聚六亞甲基胍鹽酸鹽、聚乙二醇 單烯丙基醚修飾聚六亞甲基胍鹽酸鹽;接著，100.0微升IO 6CFU/毫升濃度的細(xì)菌或真菌孢 子懸浮液被添加到孔板內(nèi)使得最后微生物濃度是5X IO5CFU/毫升。96孔板放置在37.(TC的 微生物培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)16小時(shí)取出。從每個(gè)孔吸出5. ΟμL細(xì)胞懸液涂布在穆勒-辛頓瓊脂培養(yǎng) 基上。最低抑制濃度的結(jié)果通過樣品濃度的孔內(nèi)吸出的混合液在瓊脂板上沒有菌落可以觀 察到，測(cè)定數(shù)據(jù)如下表：
[0082]本發(fā)明修飾后的聚六亞甲基胍鹽酸鹽涂層聚二甲基硅氧烷進(jìn)行表面抗菌活性測(cè) 定:首先，金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌菌株在LB培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)16小時(shí)，過夜的細(xì)菌懸 液重新接種于新鮮培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)到0D600 = 0.5。此外，腐皮鐮孢菌是種植在YM瓊脂斜面28 °C培養(yǎng)72小時(shí)后，通過添加2毫升的聚丁二酸丁二醇酯到上述的斜面中，用旋渦震蕩器震蕩 1分鐘后得到它的孢子，以上的三個(gè)菌液稀釋至I X l〇7cfu/毫升的濃度備用；取35毫米無菌 培養(yǎng)皿放置材料，10. ΟμL細(xì)菌和真菌的孢子懸浮液分別滴加在每個(gè)修飾后的聚六亞甲基胍 鹽酸鹽涂層表面，然后覆蓋另一個(gè)聚二甲基硅氧烷片，輕輕按壓將培養(yǎng)液散布在整個(gè)表面， 樣品放置37.(TC微生物培養(yǎng)箱內(nèi)培育1小時(shí)后取出，2毫升聚丁二酸丁二醇酯添加到35毫米 培養(yǎng)皿洗下所有的微生物，再從每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)取100. 〇微升的混合液涂布在LB瓊脂培養(yǎng)基 上計(jì)算菌落數(shù)。殺死率是由下列公式計(jì)算而來的：
[0083]殺死率=χ 1〇〇%
[0084] 實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，經(jīng)過上述測(cè)試后，用75%的乙醇浸泡30分鐘這些涂層片用于清洗， 然后再用超純水清洗這些涂層片數(shù)遍，在空氣中干燥后，開始第二次測(cè)試，方法同上，一直 做到第10次的重復(fù)。
[0085] 本發(fā)明修飾后的聚六亞甲基胍鹽酸鹽涂層聚二甲基硅氧烷進(jìn)行表面抗生物膜性 能測(cè)定:過夜培養(yǎng)的銅綠假單胞菌用MH肉湯培養(yǎng)基稀釋至濃度IX IOScfu/毫升。烯丙基縮 水甘油醚修飾聚六亞甲基胍鹽酸鹽涂層片、分子量為1200的聚乙二醇單烯丙基醚修飾聚六 亞甲基胍鹽酸鹽涂層片、分子量為2400的聚乙二醇單烯丙基醚修飾聚六亞甲基胍鹽酸鹽涂 層片和原始的聚二甲基硅氧烷幻燈片都沉浸在2.0毫升細(xì)菌懸液內(nèi)5天，以確保完整的生物 膜形成，5天后，每片聚二甲基硅氧烷片上的浮游細(xì)菌被聚丁二酸丁二醇酯清洗干凈，接著， 各種聚二甲基硅氧烷片使用活/死試劑盒染色，染色之后的樣品用LSM710倒置熒光顯微鏡 觀測(cè)。檢測(cè)SYTO 9，激發(fā)波長(zhǎng)被設(shè)定為488納米，而PI檢測(cè)的激發(fā)波長(zhǎng)561納米。圖像在激發(fā) 波長(zhǎng)處使用Zen 2009軟件拍攝以及處理。
[0086] 本發(fā)明制備的涂層進(jìn)行抗血小板粘附測(cè)試:富含血小板血漿通過離心健康兔新鮮 血液在1000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘獲得。首先，聚二甲基硅氧烷片浸在37°C聚丁二酸丁二醇酯 溶液中1小時(shí)，之后，聚丁二酸丁二醇酯溶液移走并加入1毫升的富含血小板血漿，聚二甲基 硅氧烷片與富含血小板血漿在37°C中培育30分鐘后移走富含血小板血漿，然后用聚丁二酸 丁二醇酯沖洗至少三次。最后，使用2.5wt %戊二醛4°C固定過夜，再通過不同濃度梯度的乙 醇溶液脫水并真空干燥備用，樣品用掃描電子顯微鏡觀察。
[0087] 本發(fā)明制備的涂層溶血性試驗(yàn):取新鮮人類紅細(xì)胞用Tris緩沖液沖洗三次，每次 以900轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心10分鐘，最后用Tris稀釋至最終紅細(xì)胞濃度為5.0%。原始的和修 飾后的聚六亞甲基胍鹽酸鹽涂層聚二甲基硅氧烷都浸泡在37°C的2.0毫升人類紅細(xì)胞溶液 內(nèi)培育1小時(shí)，之后，樣本以1000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心5分鐘取上清液用酶標(biāo)儀測(cè)定其540納 米處的吸光值。0 %溶血和100 %溶血值分別用只加入Tris和1 %的Triton X代表。
[0088]本發(fā)明制備的涂層進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn):分子量為2400的聚乙二醇單烯丙基醚修飾 聚六亞甲基胍鹽酸鹽涂層片被切成1平方厘米大小并在121°c高壓滅菌20分鐘，再放置在24 孔板用聚丁二酸丁二醇酯溶液中浸泡16小時(shí)。之后，平滑肌細(xì)胞和培養(yǎng)基被添加孔板內(nèi)，細(xì) 胞種植5天，培養(yǎng)基每2天一換，在第1，3，5天，含有分子量為2400的聚乙二醇單烯丙基醚修 飾聚六亞甲基胍鹽酸鹽涂層片空白原始的聚二甲基硅氧烷片的空版內(nèi)的細(xì)胞使用活/死染 色試劑盒染色用倒置熒光顯微鏡觀測(cè)，其中，檢測(cè)FITC，激發(fā)波長(zhǎng)為488納米。Rhod檢測(cè)的激 發(fā)波長(zhǎng)561納米。圖像在激發(fā)波長(zhǎng)處使用Zen 2009軟件拍攝并處理。
[0089]本發(fā)明中采用的聚六亞甲基胍，已被證實(shí)有較高的抗菌活性，被廣泛用作消毒劑 和殺菌劑在局部傷口和環(huán)境。其機(jī)理是破壞菌體的細(xì)胞膜。
[0090] 烯丙基縮水甘油醚的活性環(huán)氧基的很容易與各種反應(yīng)官能團(tuán)如羥基、羧基、氨基 通過SN2親核開環(huán)替換反應(yīng)。活躍的聚六亞甲基胍末端氨基將與環(huán)氧基反應(yīng)，形成carbon-to-carbon雙鍵。此外，實(shí)驗(yàn)中用的烯丙基聚乙二醇是新一代的聚(羧酸)高效減水劑的重要 原料，因?yàn)榇蠖鄶?shù)生物醫(yī)學(xué)設(shè)備是由有機(jī)硅聚合物材料制作，而其中聚二甲基硅氧烷是使 用最廣泛的材料之一，因此實(shí)驗(yàn)把聚二甲基硅氧烷作為模型，本發(fā)明采用氬等離子體技術(shù) 進(jìn)行涂層前處理，等離子體表面處理技術(shù)也用于許多其他生物材料表面，本發(fā)明中應(yīng)用氬 等離子體處理聚二甲基硅氧烷表面;本發(fā)明采用了許多不同的測(cè)試方法表征各種被修飾后 的聚六亞甲基胍涂層的聚二甲基硅氧烷表面，眾所周知，生物膜難以根除，傳統(tǒng)抗生素對(duì)它 們的效果收效甚微，細(xì)菌生物被膜在生物材料產(chǎn)生胞外多糖矩陣，保護(hù)他們免受抗生素和 宿主的身體先天免疫系統(tǒng)。因此，至關(guān)重要的是，本發(fā)明制得的涂層不但表面抗菌而且抗生 物膜，改性涂層表面不支持細(xì)菌細(xì)胞附著，因此預(yù)防生物膜的形成。經(jīng)過烯丙基縮水甘油醚 和聚乙二醇單烯丙基醚改性后涂層表面增加了表面親水性被認(rèn)為有助于抗生物膜，與其他 抗生素涂層技術(shù)相比，這種抗生物膜屬性使得修飾后的聚六亞甲基胍鹽酸鹽成為表面涂層 一個(gè)優(yōu)越的選擇。
[0091] 為生物醫(yī)學(xué)植入體而言，它們對(duì)哺乳細(xì)胞毒性是至關(guān)重要的一個(gè)考量。傳統(tǒng)的抗 菌材料，如銀離子，盡管殺菌性能很強(qiáng)，但是并不廣泛用于表面涂層，因?yàn)榇嬖谳^高的細(xì)胞 毒性。修飾后聚六亞甲基胍鹽酸鹽涂層的聚二甲基硅氧烷幻燈片經(jīng)過溶血性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)幾 乎是無毒的，溶血率低于2.0%，說明抗菌表面有良好的生物相容性。接著讓涂層聚二甲基 硅氧烷與平滑肌細(xì)胞接觸時(shí)，細(xì)胞5天內(nèi)生長(zhǎng)良好，顯示良好的細(xì)胞生存能力。這個(gè)結(jié)果表 明涂層聚二甲基硅氧烷對(duì)細(xì)菌細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞有良好的選擇性。
[0092] 本發(fā)明制作工藝簡(jiǎn)單，制備的涂層具有良好的抗菌和抗細(xì)菌粘附性能，從而達(dá)到 了抗生物被膜的作用，同時(shí)具有較低的哺乳動(dòng)物細(xì)胞毒性。
[0093] 盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以 理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換 和變型，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求及其等同物限定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 基于有機(jī)胍鹽和聚乙二醇的抗菌涂層，其特征在于：其組份按重量份數(shù)包括聚六亞 甲基胍鹽酸鹽或聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽20-30份、烯丙基縮水甘油醚10-15份、聚乙二醇單 烯丙基醚10-15份，4-甲苯磺酰氯7-15份。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于有機(jī)胍鹽和聚乙二醇的抗菌涂層，其特征在于:其制備方 法包括以下步驟： A、 對(duì)甲苯磺酰基聚乙二醇單烯丙基醚的合成方法包括以下步驟： a、 將0.056摩爾聚乙二醇單烯丙基醚添加到含有10毫升無水吡啶的三口圓底燒瓶?jī)?nèi)， 在氮?dú)獗Ｗo(hù)下冰浴攪拌； b、 之后將0.102摩爾4-甲苯磺酰氯添加進(jìn)三口圓底燒瓶?jī)?nèi)攪拌5小時(shí);之后將60毫升二 氯甲烷添加進(jìn)三口圓底燒瓶?jī)?nèi)，在室溫下攪拌30小時(shí)； c、 之后，混合稀釋了60毫升二氯甲烷和2100毫升有機(jī)相隨后用水、100毫升濃度為 10mol/L鹽酸水溶液，100毫升濃度為1.2mol/L飽和碳酸氫鈉洗脫； d、 然后加入硫酸鎂進(jìn)行干燥，最后采用用真空蒸餾，得到一種無色液體。 B、 聚乙二醇單烯丙基醚功能化聚六亞甲基胍或聚六亞甲基雙胍的制備包括以下步驟： a、 將聚六亞甲基胍鹽酸鹽或聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽溶解于甲醇，配成20 %質(zhì)量濃度的 溶液； b、 在溶液中加入4摩爾當(dāng)量的碳酸鉀，攪拌均勻； c、 將反應(yīng)混合物用氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下加熱到65°C至回流30分鐘，將1.2或2.4當(dāng)量的聚乙 二醇單烯丙基醚加入，在65°C下回流反應(yīng)24小時(shí)； d、 反應(yīng)結(jié)束后，混合液用0.5摩爾鹽酸溶液中和至中性，然后在透析袋中透析4至5天， 濃縮后冷凍干燥得到產(chǎn)品聚六亞甲基胍-聚乙二醇單烯丙基醚二嵌段共聚物，或聚六亞甲 基雙胍-聚乙二醇單烯丙基醚二嵌段共聚物。 C、 烯丙基功能化聚六亞甲基胍鹽酸鹽或聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽的制備方法包括以下 步驟： a、 將一定量濃度為38. Owt %的聚六亞甲基胍鹽酸鹽或聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽低聚物 溶液在DMS0中，之后將混合物倒入配有電磁攪拌器的圓底燒瓶?jī)?nèi)； b、 對(duì)圓底燒瓶進(jìn)行加熱，加熱溫度為60 °C-65 °C，加熱持續(xù)時(shí)間為30分鐘-40分鐘，之后 迅速注入一定體積的烯丙基縮水甘油醚，且烯丙基縮水甘油醚與聚六亞甲基胍鹽酸鹽的進(jìn) 料摩爾比為1.0，得到混合物A、； c、 混合物A在60°C下在不斷攪拌，反應(yīng)60小時(shí)結(jié)束，粗產(chǎn)物通過反復(fù)沉淀、溶解在丙酮 或甲醇溶液中三次，來完全去除DMS0和未反應(yīng)的烯丙基縮水甘油醚，得到混合物B; d、 將混合物B在室溫下真空干燥后12小時(shí)，得到純化產(chǎn)物。
【文檔編號(hào)】A61L27/34GK106075577SQ201610581836
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年7月21日 公開號(hào)201610581836.4, CN 106075577 A, CN 106075577A, CN 201610581836, CN-A-106075577, CN106075577 A, CN106075577A, CN201610581836, CN201610581836.4
【發(fā)明人】李鵬
【申請(qǐng)人】南京工業(yè)大學(xué)