專利名稱：一種提高誘導(dǎo)生成多能性干細(xì)胞效率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高誘導(dǎo)生成多能性干細(xì)胞效率的方法。尤其涉及用修飾組蛋白基因jhdmlb和jhdmla提高誘導(dǎo)生成多能性干細(xì)胞效率的方法。
背景技術(shù)：
我國是世界人口大國，每年因為創(chuàng)傷、疾病、衰老、以及遺傳所導(dǎo)致的器官缺損、衰竭、功能障礙也居世界之首，以藥物和手術(shù)治療為基本支柱的經(jīng)典醫(yī)學(xué)治療手段已不能滿足臨床醫(yī)學(xué)的巨大需求，所以對干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)的研究受到了相當(dāng)多科研單位以及社會各界的普遍重視。細(xì)胞移植治療是再生醫(yī)學(xué)研究的一個重要方向，特定類型的細(xì)胞移植可被用來治療心臟損傷，神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，脊髓損傷，腎衰竭、血液系統(tǒng)疾病等等。然而，細(xì)胞移植治療面臨著異體排斥、細(xì)胞來源有限等很多難以解決的問題。干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制能力的細(xì)胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能細(xì)胞。根據(jù)干細(xì)胞所處的發(fā)育階段分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。根據(jù)干細(xì)胞的發(fā)育潛能分為三類全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞和單能干細(xì)胞。干細(xì)胞是一種未充分分化，尚不成熟的細(xì)胞，具有再生各種組織器官和人體的潛在功能，醫(yī)學(xué)界稱之為“萬用細(xì)胞”。為了解決細(xì)胞移植治療面臨的問題，細(xì)胞命運的轉(zhuǎn)化受到越來越多科學(xué)家的重視。雖然細(xì)胞分化和命運的決定一直認(rèn)為是發(fā)育過程中不可逆轉(zhuǎn)而且是穩(wěn)定的過程，而在體外，越來越多的證據(jù)表明，這一過程是可以被逆轉(zhuǎn)的。對于細(xì)胞命運調(diào)節(jié)的研究還只是處于實驗室研究狀態(tài)，離臨床實驗還有很長的距離。這些通過轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)獲得的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞還存在很多應(yīng)用上的難題，比如說，病毒插入、潛在致瘤性、獲得轉(zhuǎn)分化細(xì)胞的純度、在機(jī)體內(nèi)能否彌補正常細(xì)胞發(fā)揮應(yīng)有的功能等寸。誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(iPS，Induced pluripotent stem cell)是一種類似于胚胎干細(xì)胞、具有發(fā)育全能性的細(xì)胞，通過導(dǎo)入特定的基因誘導(dǎo)體細(xì)胞使其獲得干細(xì)胞特性。 2006年日本科學(xué)家Yamanaka將M個候選基因用逆轉(zhuǎn)錄病毒一起導(dǎo)入小鼠成纖維細(xì)胞， 通過G418抗性篩選FBX15陽性細(xì)胞從而分離出類似胚胎干細(xì)胞的iPS克隆，最終鑒定出 0ct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4這4個因子足以誘導(dǎo)小鼠FBX15_iPS細(xì)胞產(chǎn)生，這些細(xì)胞具有與胚胎干細(xì)胞相似的形態(tài)、增殖能力以及形成畸胎瘤的能力，但是在基因表達(dá)以及甲基化模式方面卻與胚胎干細(xì)胞不同，也不能夠得到活體的嵌合體小鼠；隨后，該小組和其他兩個小組改變篩選方法，他們以Nanog陽性細(xì)胞作為標(biāo)準(zhǔn)，得到了在多個方面均與胚胎干細(xì)胞相似的iPS，這種細(xì)胞能夠產(chǎn)生嵌合體后代。最近，三個研究組應(yīng)用四倍體互補試驗分別獨立證明了小鼠的iPS細(xì)胞能夠發(fā)育成一個個體，具有發(fā)育全能性。遵循誘導(dǎo)小鼠iPS試驗的方法，2007年Yamanaka [8]和俞君英[9]兩個小組分別成功地將人的體細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞，前者應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒將0ct3/4，SoX2，C-MyC，Klf4 轉(zhuǎn)導(dǎo)入人的表皮成纖維細(xì)胞，后者則是應(yīng)用慢病毒將0ct3/4，Sox2, Nanog, Lin28導(dǎo)入包皮細(xì)胞?；虮磉_(dá)譜分析，0ct3/4，NanOg基因啟動子區(qū)域甲基化分析都表明人的iPS細(xì)胞系與相應(yīng)的胚胎干細(xì)胞系非常相似，將這些細(xì)胞注射到裸鼠體內(nèi)，都能夠發(fā)育成3個胚層組織。此外，能夠成功誘導(dǎo)體細(xì)胞轉(zhuǎn)變成iPS不僅限于小鼠和人，還有大鼠、豬和猴。能夠成功重編程的細(xì)胞不僅限于成纖維細(xì)胞，很多其他類型的成體細(xì)胞也能夠被誘導(dǎo)成為iPS細(xì)胞，包括胰腺beta細(xì)胞、成體神經(jīng)干細(xì)胞、肝細(xì)胞、胃細(xì)胞、成熟B細(xì)胞、造血細(xì)胞、腦膜細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、臍帶血細(xì)胞、外周血CD34陽性細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞。處于分化不同階段的細(xì)胞，誘導(dǎo)其重編程為iPS的難易程度也不同，以小鼠的造血細(xì)胞為例造血干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞的重編程效率可以達(dá)到觀％，是末端分化T細(xì)胞、B細(xì)胞的300倍。在誘導(dǎo)iPS過程中常借助于逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒將外源基因?qū)爰?xì)胞，通過這種方式可以得到很高的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，但是由于病毒序列整合到細(xì)胞的基因組中，會導(dǎo)致基因插入突變發(fā)生，甚至具有致癌性，所以這種具有潛在危險性的基因?qū)敕椒@然不利于iPS技術(shù)在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，因此不同的研究小組采用了非整合載體來誘導(dǎo) iPS并取得了成功，這些載體包括腺病毒載體、普通表達(dá)載體、轉(zhuǎn)座子、附加體載體、小環(huán) DNA(minicircle DNA)載體。Sox2, Klf4, 0ct3/4, c-Myc 和 Sox2，0ct3/4, Nanog, Lin28 兩種組合都能夠成功誘導(dǎo)iPS產(chǎn)生，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)c-Myc不是重編程所必需的，僅有三個轉(zhuǎn)錄因子Sox2， Klf4, 0ct3/4足以推動人和小鼠的體細(xì)胞重編程。神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)源表達(dá)高水平的Sox2、 Klf4,c-Myc,因此只需要導(dǎo)入外源0ct3/4就足以成功誘導(dǎo)iPS。重編程所用的轉(zhuǎn)錄因子中， Sox2、Klf4和c-Myc都能夠被同家族的其他成員所替代，例如Klf2和Klf5能夠替代Klf4 ； Soxl和Sox3能夠替代Sox2 ；N-Myc和L-Myc能夠替代c_Myc ；但是Octl和0ct6并不能替代0ct4。Esrrb直接與0ct3/4蛋白相結(jié)合調(diào)控干細(xì)胞自我更新和全能性，在重編程過程中 Esrrb能夠替代Klf4，與Sox2、0ct3/4組合即能夠誘導(dǎo)iPS ；0ct3/4是重編程過程中極為重要的一個轉(zhuǎn)錄因子，最近研究發(fā)現(xiàn)核受LRH-I (Nr5a2)和Nr5al能夠替代0ct3/4，其與 Klf4、Sox2組合即能夠誘導(dǎo)小鼠成體細(xì)胞轉(zhuǎn)變成iPS。但是，目前能夠重編程的轉(zhuǎn)錄因子組合有0ct4，Klf4，Sox2, c-Myc ；0ct4, Nanog, Lin28, Sox2 ；Sox2, Klf4和Lrhl ；0ct4, bmil等幾種不同的組合以及esrrb, tbx3等與重編程相關(guān)的基因，現(xiàn)有的重編程方法所需要的轉(zhuǎn)錄因子組合需要導(dǎo)入的轉(zhuǎn)錄因子多達(dá)三個或四個，而且誘導(dǎo)效率低下，如何減少轉(zhuǎn)錄因子并且保持較高的重編程效率對于減少重編程細(xì)胞突變的積累，提高重編程技術(shù)的可操作性具有重要的意義。而且，尋找替代常用轉(zhuǎn)錄因子的基因有利于重編程機(jī)理的研究和重編程技術(shù)的改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一減少轉(zhuǎn)錄因子并且保持較高的重編程效率對于減少重編程細(xì)胞突變的積累，提高重編程技術(shù)的可操作性的方法。為實現(xiàn)該目的，采用如下技術(shù)方案提供一種提高誘導(dǎo)生成多能性干細(xì)胞效率的方法，包括如下步驟a、將轉(zhuǎn)錄因子與Jhdmlb轉(zhuǎn)入哺乳動物的成體細(xì)胞，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，，誘導(dǎo)獲得多能性干細(xì)胞克隆，所述轉(zhuǎn)錄因子為單獨的0ct4，或0ct4和Klf4和Sox2的組合，或 0ct4、Klf4、c-Myc 和 Sox2 的組合；
b、將誘導(dǎo)獲得的多能性干細(xì)胞克隆在干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)擴(kuò)增。本發(fā)明的另一個技術(shù)方案為提供一種提高誘導(dǎo)生成多能性干細(xì)胞效率的方法，包括如下步驟a、將轉(zhuǎn)錄因子與Jhdmlb轉(zhuǎn)入哺乳動物的成體細(xì)胞，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含維生素C，誘導(dǎo)獲得多能性干細(xì)胞克隆，所述轉(zhuǎn)錄因子為單獨的0ct4，或0ct4 和Sox2的組合，或0ct4、Klf4的組合，或0ct4、Klf4和Sox2的組合，或0ct4和Klf4和 Sox2和c-myc的組合；b、將誘導(dǎo)獲得的多能性干細(xì)胞克隆在干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)擴(kuò)增，。優(yōu)選的，以上步驟為a、將轉(zhuǎn)錄因子與Jhdmlb轉(zhuǎn)入哺乳動物的成體細(xì)胞，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導(dǎo)獲得多能性干細(xì)胞克隆，所述轉(zhuǎn)錄因子為單獨的0ct4，或0ct4和Sox2的組合，或0ct4和Klf4 的組合，或0ct4和Klf4和Sox2的組合；b、將誘導(dǎo)獲得的多能性干細(xì)胞克隆在干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)擴(kuò)增。優(yōu)選的，所述轉(zhuǎn)錄因子和Jhdmlb為具有多能干細(xì)胞誘導(dǎo)功能的編碼或非編碼 RNA、蛋白質(zhì)或多肽。優(yōu)選的，所述將Jhdmlb轉(zhuǎn)入哺乳動物的成體細(xì)胞是以包含能夠表達(dá)Jhdmlb的載體導(dǎo)入細(xì)胞中來實現(xiàn)的。優(yōu)選的，所述載體為病毒載體、質(zhì)粒載體、外隨體載體、mRNA載體或直接化學(xué)合成。優(yōu)選的，所述病毒載體為逆轉(zhuǎn)錄病毒，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒為pMXs載體。優(yōu)選的，所述Jhdmlb是進(jìn)行去甲基化修飾的多肽，其功能性變體以及其功能性片段。優(yōu)選的，所述哺乳動物的成體細(xì)胞為成纖維細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、造血細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。優(yōu)選的，所述哺乳動物的成體細(xì)胞為小鼠胚胎成纖維細(xì)胞。本發(fā)明還提供又一個技術(shù)方案為提供一種提高誘導(dǎo)生成多能性干細(xì)胞效率的方法，包括如下步驟a、將轉(zhuǎn)錄因子與Jhdmlb和Jhdmla轉(zhuǎn)入哺乳動物的成體細(xì)胞，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導(dǎo)獲得多能性干細(xì)胞克隆，所述轉(zhuǎn)錄因子為單獨的0ct4，或0ct4和Sox2的組合，或 0ct4和Klf4的組合，或0ct4和Klf4和Sox2的組合；b、將誘導(dǎo)獲得的多能性干細(xì)胞克隆在干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)擴(kuò)增。優(yōu)選的，上述方法包括如下步驟a、將轉(zhuǎn)錄因子與Jhdmlb和Jhdmla轉(zhuǎn)入哺乳動物的成體細(xì)胞，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含維生素C，誘導(dǎo)獲得多能性干細(xì)胞克隆，所述轉(zhuǎn)錄因子為0ct4 ；b、將誘導(dǎo)獲得的多能性干細(xì)胞克隆在干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)擴(kuò)增，所述干細(xì)胞培養(yǎng)基包含維生素C。本發(fā)明的有益效果為利用對組蛋白進(jìn)行修飾的多肽Jhdmlb、Jhdmla和干細(xì)胞誘導(dǎo)因子提高了誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的效率，提高了誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的質(zhì)量。相比于現(xiàn)有的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，本發(fā)明的方法用較少的干細(xì)胞誘導(dǎo)因子種類實現(xiàn)了更好的效果，優(yōu)選地本發(fā)明的方法使用0ct4、Klf4和Sox2, 0ct4和Klf4，0ct4和Sox2,以及單獨的0ct4。本發(fā)明的方法還包括將所述細(xì)胞暴露于維生素C，其相比于不使用維生素C進(jìn)一步提高了誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的效率。本發(fā)明的方法通過使用較少的干細(xì)胞誘導(dǎo)因子降低了潛在的致癌性，同時獲得了較高的誘導(dǎo)效率，并可以得到高質(zhì)量的具有生殖系傳遞能力的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。


圖1顯示了 Jhdmla或Jhdmlb提高SKO介導(dǎo)的誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞效率的數(shù)據(jù)，其中對照是沒有插入任何基因序列的pMXs-FLAG空載體；圖2為Jhdmla或jhdmlb促進(jìn)SKOM介導(dǎo)的重編程效率數(shù)據(jù)圖；圖3顯示了在維生素C存在的條件下，jhdmla和jhdmlb共同作用能夠在只有SO、 KO以及0ct4的條件下進(jìn)行重編程；圖4中a，d為0ct4+jhdmlb (簡寫為0B)最終形成的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的顯微照片； b，e為OB最終形成的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞注射囊胚后發(fā)育形成的嵌合體后代照片；c，f為OB最終形成的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞注射囊胚后發(fā)育形成的嵌合體與野生型小鼠個體交配后產(chǎn)生的后代的照片；圖5顯示了對多能干細(xì)胞克隆的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果表明OB誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞克隆C4、C14、C15和C16基因組中只有0ct4和Jhdmlb整合，對照是感染Sox2、 klf4.oct4.cMyc和Jhdmlb的細(xì)胞提取的基因組DNA，MEF表示從小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中提取的基因組DNA;圖6顯示了定量PCR結(jié)果，表明OB誘導(dǎo)的多能性干細(xì)胞克隆C4、C14、C15和C16 外源基因被沉默表達(dá)，其中OB D4對照是從感染0ct4和Jhdmlb并培養(yǎng)4天后的細(xì)胞中提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA模板，MEF是小鼠胚胎成纖維細(xì)胞；圖7顯示了實時定量PCR結(jié)果，其表明OB誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞克隆C4、C14、C15和 C16表達(dá)胚胎干細(xì)胞特異性基因，其中Rl是小鼠胚胎干細(xì)胞系，MEF是小鼠胚胎成纖維細(xì)胞；圖8顯示了免疫熒光的結(jié)果，其表明OB誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞克隆C14表達(dá)胚胎干細(xì)胞特異性基因Rexl和胚胎干細(xì)胞特異性表面標(biāo)記物SSEA-1，其中Marker表示干細(xì)胞特異性標(biāo)記分子(即Rexl或SSEA-1)；圖9顯示了小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和誘導(dǎo)的多能性干細(xì)胞的0ct4鄰近啟動子區(qū)域里Cpk甲基化實測程度分析結(jié)果；圖10顯示了小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和誘導(dǎo)的多能性干細(xì)胞的Nanog鄰近啟動子區(qū)域里Cpk甲基化實測程度分析結(jié)果；圖11顯示了 0ct4和Jhdmlb誘導(dǎo)產(chǎn)生的多能干細(xì)胞的核型圖；圖12顯示了 Jhdmlb的不同突變體誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的效率。Jmjc突變是將221 位的組氨酸、222位的異亮氨酸、223位的天冬氨酸均突變?yōu)楸彼幔籆xxC突變是將586、589 和592位的半胱氨酸突變?yōu)楸彼幔粓D13顯示了 pMXs-FLAG質(zhì)粒圖譜。
具體實施方式
本文使用的所有科技術(shù)語具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的相同含義。關(guān)于本領(lǐng)域的定義及術(shù)語，專業(yè)人員例如具體可參考Current Protocols in Molecular Biology, edited by Ausubel，et al, John Wiley & Sons，2009。氨基酸殘基的縮寫是本領(lǐng)域中所用的指代20個常用L-氨基酸之一的標(biāo)準(zhǔn)3字母和/或1字母代碼。盡管本發(fā)明的廣義范圍所示的數(shù)字范圍和參數(shù)近似值，但是具體實施例中所示的數(shù)值盡可能準(zhǔn)確的進(jìn)行記載。然而，任何數(shù)值本來就必然含有一定的誤差，其是由它們各自的測量中存在的標(biāo)準(zhǔn)偏差所致。另外，本文公開的所有范圍應(yīng)理解為涵蓋其中包含的任何和所有子范圍。本文中所使用的術(shù)語“多肽”、“蛋白質(zhì)”可互換地表示通過共價鍵(例如肽鍵)相互連接的一串至少兩個氨基酸殘基，其可以是重組多肽、天然多肽或合成多肽。特別地，本文所述多肽是人和/或小鼠來源的多肽。本文使用的術(shù)語“變體”、“多肽變體”或“類似物”表示通過一個或多個取代、缺失、插入、融合、截短或其任意組合在氨基酸序列上有所不同的多肽。變體多肽可以是完全功能性的或者可缺乏一種或多種活性的功能。本文使用的術(shù)語“功能性變體”表示含有例如僅僅保守性改變或非關(guān)鍵殘基或非關(guān)鍵區(qū)域的改變，并且保留原始多肽的功能。功能性變體還可包含相似氨基酸的替換，其導(dǎo)致功能未改變或不顯著的改變?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法鑒定對于功能來說重要的氨基酸，所述方法例如定點誘變或甘氨酸掃描誘變 (Cunningham, B. ^P Wells, J. ,Science, 244 :1081-1085，1989)?？梢岳缤ㄟ^結(jié)構(gòu)分析如結(jié)晶、核磁共振或光親和標(biāo)記來確定對于多肽活性來說關(guān)鍵的位點(Smith，L.等，J. Mol. Biol.，224 :899-904,1992 ；de Vos, A.等，Science,255 :306-312,1992)。在本發(fā)明的實施方案中，Jhdmla的變體選自包含與SEQ ID NO 1所編碼的氨基酸序列有至少70%同源性(優(yōu)選80%、90%、95%、98%、99%)的氨基酸序列的多肽。在本發(fā)明的另一些實施方案中，Jhdmlb的變體選自包含與SEQ ID NO :2所編碼的氨基酸序列有至少70%同源性(優(yōu)選80%、90%、95%、98%、99%)的氨基酸序列的多肽。所述Jhdmla 編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO :7，所述Jhdmlb編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO :8.本文使用的術(shù)語“片段”指僅有全長序列一部分的分子。例如，Jhdmlb多肽片段是截短的Jhdmlb。片段可含有來自全長序列任一端的序列，或者它們可含有來自全長序列中間的序列。片段可以是“功能性片段”，例如保留全長多肽的一種或多種功能的片段。本文使用的術(shù)語“功能性片段”表示所述片段保留了全長多肽的功能，例如誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞或者提高誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞效率。除非另外指明，在本文中提到多肽、核酸或其它分子時，其含義包括了功能性變體和功能性片段。例如，Jhdmlb和Jhdmla還分別表示天然Jhdmlb和Jhdmla的功能性變體和功能性片段。本文使用的術(shù)語“Jhdmlb”可以表示含JmjC結(jié)構(gòu)域的組蛋白去甲基化酶 (JmjC-domain-containing histone demethylase, JHDM)家族中一個進(jìn)化上保守且普遍表達(dá)的成員，其也被稱為!^ 110。特別地，所述多肽是人和/或小鼠來源的。本文使用的術(shù)語“Jhdmla”可以表示含JmjC結(jié)構(gòu)域的組蛋白去甲基化酶 (JmjC-domain-containing histone demethylase, JHDM)家族中的另一個成員，其也被稱為i^bxlll。特別地，所述多肽是人和/或小鼠來源的。
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本文使用的術(shù)語“誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞”、“誘導(dǎo)的多能性干細(xì)胞”、“誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞”、“誘導(dǎo)多能干細(xì)胞”或者“iPS”(induced pluropotent stem cells)可互換地使用，表示人工地將非多能性細(xì)胞(例如體細(xì)胞)誘導(dǎo)而成的多能性干細(xì)胞。所述誘導(dǎo)通常是通過強制(forced)表達(dá)特定基因來實現(xiàn)的，這一過程在本文中也稱為“將細(xì)胞誘導(dǎo)成多能性干細(xì)胞”。本文使用的術(shù)語“干細(xì)胞誘導(dǎo)因子”表示能夠單獨地或與其他因子相組合地將細(xì)胞誘導(dǎo)成多能性干細(xì)胞的因子，例如蛋白質(zhì)、多肽、編碼或非編碼RNA等。優(yōu)選地，所述干細(xì)胞誘導(dǎo)因子是轉(zhuǎn)錄因子，包括Oct-3/4、Sox家族成員、Klf家族成員、Myc家族成員、Nanog, LIN28等。優(yōu)選地，所述干細(xì)胞誘導(dǎo)因子選自0ct4、Klf4、Sox2和c_myc中的一種或多種。 更優(yōu)選地，所述干細(xì)胞誘導(dǎo)因子至少包括0ct4。特別地，所述多肽是人和/或小鼠來源的。本文使用的術(shù)語“0ct4”表示八聚體轉(zhuǎn)錄因子家族(the family of octamer transcription factors)的一個成員，其在維持細(xì)胞的多能性上起到關(guān)鍵作用。在文獻(xiàn)中， 0ct4也曾被稱為0ct3。本文使用的術(shù)語“Klf4”表示Kriippel樣轉(zhuǎn)錄因子家族(Kriippel-like family of transcription factors)的一個成員。本文使用的術(shù)語“Sox2”表示Sox轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一。本文使用的術(shù)語“c-myc”表示本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的一種轉(zhuǎn)錄因子，其調(diào)控許多基因的表達(dá)，募集組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶，并且其突變與許多癌癥有關(guān)。本文使用的術(shù)語“組蛋白修飾”表示多種對組蛋白的修飾，例如乙?；?、甲基化、去甲基化、磷酸化、腺苷酸化、泛素化、ADP核糖基化等。特別地，所述組蛋白修飾包括組蛋白的去甲基化。本文所使用的術(shù)語“對象”是指哺乳動物，如人類，但也可以是其它動物，如家養(yǎng)動物(如狗、貓等)，家畜(如牛、羊、豬、馬等)或?qū)嶒瀯游?如猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠
寸乂 O本文使用的術(shù)語“一致性”、“百分比一致性”、“同源性”或“同一性”指兩個氨基酸序列之間或者核酸序列之間的序列同一性?？梢酝ㄟ^比對兩個序列來確定百分比一致性， 百分比一致性指所比較的序列共有位置相同殘基(即氨基酸或核苷酸)的數(shù)量?？墒褂帽绢I(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)算法(例如 Smith 和 Waterman，1981，Adv. App 1. Math. 2 :482 ；Needleman 和 Wunsch,1970，J.MoI. Biol. 48 :443 ；Pearson 禾口 Lipman，1988，Proc. Natl. Acad. Sci. ，USA, 85 :2444)或者通過這些算法的計算機(jī)化版本(Wisconsin Genetics Software Package Release 7. O, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI)進(jìn)行序列比對和比較，所述計算機(jī)化版本公開可用為BLAST和FASTA。另外，通過美國國家衛(wèi)生研究院 (Bethesda MD)可用的ENTREZ可用于序列比較。當(dāng)使用BLAST和缺口 BLAST程序時，可使用各個程序(例如BLASTN，在美國國家生物技術(shù)信息中心的因特網(wǎng)站點上可用)的缺省參數(shù)。在一個實施方案中，可使用缺口權(quán)重為1的GCG來確定兩個序列的百分比同一性，使得每個氨基酸缺口給予權(quán)重如同它是兩個序列間的單氨基酸不匹配?；蛘?，可使用ALIGN程序(2. O版)，其是GCG(Accelrys，San Diego, CA)序列比對軟件包的一部分。本文中的術(shù)語“載體”以本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的意義使用，其可以是表達(dá)載體。所述載體可包括病毒(例如痘病毒、腺病毒、桿狀病毒等)；酵母載體、噬菌體、染色體、人工染色體、質(zhì)粒、粘粒、附加體載體、mRNA載體或直接化學(xué)合成。優(yōu)選的，所述病毒載體為逆轉(zhuǎn)錄病毒和/或慢病毒載體。更優(yōu)選地，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒為PMXs載體。本文中使用的術(shù)語“過量的”表示顯著地高于正常水平，特別地表示多肽的表達(dá)量統(tǒng)計學(xué)顯著地高于正常細(xì)胞中的表達(dá)量。優(yōu)選地，高出20%、50%、100%、200%或者甚至5 倍、10倍或100倍。本文中使用的術(shù)語“過表達(dá)”表示表達(dá)水平顯著地高于正常水平，特別地表示多肽的表達(dá)量統(tǒng)計學(xué)顯著地高于正常細(xì)胞中的表達(dá)量。優(yōu)選地，高出20 %、50 %、100 %、200 %或者甚至5倍、10倍或100倍。本文使用的術(shù)語“導(dǎo)入”表示將外源物質(zhì)(如核酸或蛋白質(zhì))引入細(xì)胞的過程，例如通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染、病毒感染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔或基因槍等方式進(jìn)行。在本文中，將外源的多肽遞送進(jìn)細(xì)胞可通過多種方式進(jìn)行，例如通過運載體和/ 或轉(zhuǎn)運因子進(jìn)行，優(yōu)選通過脂質(zhì)體、細(xì)菌多肽片段等(可參見W02002/079417，其內(nèi)容通過引用并入本文)。本發(fā)明方法可使用的細(xì)胞優(yōu)選地是哺乳動物細(xì)胞，更優(yōu)選人和小鼠細(xì)胞。特別地， 所述細(xì)胞是體細(xì)胞，例如上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肌細(xì)胞、造血細(xì)胞、 免疫細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等。更特別地，所述細(xì)胞是胰腺beta細(xì)胞、成體神經(jīng)干細(xì)胞、肝細(xì)胞、胃細(xì)胞、成熟B細(xì)胞、造血細(xì)胞、腦膜細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、臍帶血細(xì)胞、外周血⑶34陽性細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞等。實施例1 1、包含Jhdmla和Jhdmlb編碼區(qū)的載體的構(gòu)建a.克隆引物設(shè)計從 http //www. ncbi. nlm. nih. gov/pubmed 獲取 Jhdmla 禾口 Jhdmlb 的 cDNA 的序列信息。其中Jhdmla cDNA克隆區(qū)序列為SEQ ID NO 1, Jhdmlb cDNA克隆區(qū)序列為SEQ ID NO :2，通過設(shè)計特異性的引物擴(kuò)增Jhdmla和Jhdmlb的編碼序列。Jhdmla上游引物堿基序列如SEQ ID NO 3所示；Jhdmla下游引物堿基序列如SEQ ID NO 4所示；Jhdmlb上游引物堿基序列如SEQ ID NO 5所示；Jhdmlb下游引物堿基序列如SEQ ID NO 6所示。b.通過RT-PCR擴(kuò)增編碼序列從分離的ICR小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)和人Hl胚胎干細(xì)胞中按照下述方法提取總mRNA 去除培養(yǎng)盤中的培養(yǎng)基，以3-5毫升的生理鹽水(PBS) (Gibco公司)清洗細(xì)胞并棄去漂洗液然后向培養(yǎng)盤中加入1毫升細(xì)胞裂解液Trizol (Takara公司)，用移液槍吸取混合液并輕柔吹打細(xì)胞使其完全溶解在裂解液中，隨后將其轉(zhuǎn)移至干凈的1. 5毫升離心管中于負(fù)80°C保存或立即進(jìn)行下面的提取步驟。接下來，加入200微升的三氯甲烷，顛倒混勻約30秒，然后于4°C 12000轉(zhuǎn)離心5分鐘。小心吸取上清轉(zhuǎn)移至潔凈的1. 5毫升離心管中，隨后加入等體積的異丙醇并混勻，室溫放置5分鐘后12000轉(zhuǎn)4°C離心5分鐘，管底可見白色小塊沉淀；小心棄去上清，接著加入80%乙醇溶液500微升用于漂洗掉殘余的異丙醇， 12000轉(zhuǎn)離心，去除乙醇溶液，室溫放置30分鐘使管底的白色總mRNA充分干燥。隨后，向離心管中加入30-50微升的雙蒸水于55°C孵育，30分鐘后取出，用分光光度計測定總mRNA濃
10度。所提取的總mRNA于負(fù)80°C保存或直接用于反轉(zhuǎn)錄制備cDNA備用。反轉(zhuǎn)錄具體過程和方法如下所述。通常取1微克的總mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，加入寡聚脫氧核糖脲嘧啶核苷酸(oligodT，takara公司)，dNTP (takara公司)，RTace (Toyobo公司)，RT buffer和RRI (RNAse抑制劑，takara公司)和不含RNase/DNase的水，于PCR儀上42°C反應(yīng)60分鐘，然后98°C孵育五分鐘，隨后冷卻至室溫。反轉(zhuǎn)錄成功后，從中取出0. 5 微升作為模板，使用上述方法設(shè)計的引物，采取聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增目的基因，所用的試劑有高保真聚合酶KOD及其緩沖液(Toyobo公司)，dNTP (Takara公司)，引物，在PCR儀上運行下述程序96°C變性5分鐘，95°C 30秒，60°C退火25秒，68°C延伸3. 5分鐘，2_4步循環(huán) 32次。c.質(zhì)粒構(gòu)建請參閱圖13，完成擴(kuò)增反應(yīng)后，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用凝膠回收試劑盒(天根公司，DP214-0;3)提取PCR片段。pMXs載體(載體購自addgene，插入多克隆位點和FLAG標(biāo)簽序列)，改造后的pMXs載體被稱為pMXs-FLAG，其質(zhì)粒圖參見圖13。以pmel 酶切，應(yīng)用CIAP小牛腸堿性磷酸酶對其去磷酸化以防止載體自連。用凝膠回收試劑盒(天根公司，DP214-03)回收處理好的載體備用。pMX-FLAG載體和Jhdmla/Jhdmlb的基因片段應(yīng)用連接試劑盒(Takara公司，DNA Ligation Kit)進(jìn)行，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)菌，挑選陽性克隆，提取質(zhì)粒，測序確定，最后大量制備質(zhì)粒。2、將Jhdmla/Jhdmlb以及多能性干細(xì)胞誘導(dǎo)因子(轉(zhuǎn)錄因子)的編碼序列導(dǎo)入小鼠胚胎成纖維細(xì)胞。如無特殊說明，基于小鼠的體細(xì)胞重編程均采用如下方式進(jìn)行。培養(yǎng)基飼養(yǎng)層細(xì)胞、MEF細(xì)胞和PlatE細(xì)胞的培養(yǎng)基組成為高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基 DMEM(gibco)，外加 10% 胎牛血清(FBS，PAA)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基本發(fā)明使用實驗室常規(guī)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，優(yōu)選使用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分包括DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco)、15%的胎牛血清(FBS，Gibco)、0. ImM非必需氨基酸(NEAA， Gibco)，2mML-谷氨酰胺(Glutamax，Gibco)，ImM 丙酮酸鈉(sodium pyruvate, Gibco), 55μΜβ巰基乙醇(β-ME, Gibco)，青霉素(50U/mL)和鏈霉素(50 μ g/mL)，白血病抑制因子1000U/ml (LIF，Millipore)，根據(jù)需要添加維生素C (sigma)，其濃度是50微克每毫升。干細(xì)胞培養(yǎng)基本發(fā)明使用實驗室常規(guī)的干細(xì)胞培養(yǎng)基，優(yōu)選mES干細(xì)胞培養(yǎng)基，其組分為高糖DMEM培養(yǎng)基添加15%胎牛血清、0. ImM非必需氨基酸(NEAA，Gibco), 2mML-谷氨酰胺(Glutamax，Gibco)，ImM 丙酮酸鈉(sodium pyruvate, Gibco),55 μ Μβ 巰基乙醇(gibco)、青霉素(50U/mL)和鏈霉素(50 μ g/mL)，白血病抑制因子1000U/ml (LIF, Millipore)。根據(jù)需要添加維生素C(sigma)，其濃度是50微克每毫升。KSR無血清培養(yǎng)基KSR為Knockout Serum R印lace的縮寫，為一種商品化代血清干細(xì)胞培養(yǎng)添加劑，用于培養(yǎng)干細(xì)胞或iPS克隆的完全KSR無血清培養(yǎng)基，其組成成分為KN0CK0UT DMED (—種滲透壓經(jīng)過優(yōu)化的適于干細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基)，15% KSR添加齊[J，0. ImM 非必需氨基酸(NEAA，Gibco)，2mML_ 谷氨酰胺(Glutamax，Gibco)，ImM 丙酮酸鈉 (sodium pyruvate, Gibco), 55 μ Μβ 巰基乙醇(β-ME，Gibco)，青霉素(50U/mL)和鏈霉素 (50 μ g/mL)，白血病抑制因子1000U/ml (LIF,Millipore)，。所有iPS過程與克隆培養(yǎng)基都添加鼠白細(xì)胞抑制因子LIF(millip0re，商品名為ESGR0，為一種抑制小鼠干細(xì)胞分化的生長因子)，添加的終濃度為1000U/ml。3、用于重編程的細(xì)胞重編程采用的體細(xì)胞類型均為0G2小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(由實驗室自制)，傳代數(shù)不超過三代。0G2小鼠的一個特點是在干細(xì)胞特異表達(dá)基因0ct4基因的啟動子后連有綠色熒光蛋白(GFP)。在重編程過程中，當(dāng)0G2小鼠胚胎成纖維細(xì)胞內(nèi)源0ct4被激活時，綠色熒光蛋白伴隨表達(dá)，在熒光顯微鏡下，可見成功重編程的細(xì)胞或克隆細(xì)胞團(tuán)塊呈現(xiàn)綠色，通過直接統(tǒng)計重編程克隆即綠色熒光克隆數(shù)或采用流式細(xì)胞儀分析綠色熒光細(xì)胞的比率，可以容易地比較不同條件下的重編程效率。如下所述準(zhǔn)備重編程細(xì)胞。以20000個細(xì)胞/孔的密度種植細(xì)胞于12孔培養(yǎng)板 (Corning)，細(xì)胞種植6_18小時后，視其密度和狀態(tài)用帶有小鼠重編程因子的病毒進(jìn)行感
^fe ο4、病毒的制備用于重編程的轉(zhuǎn)錄因子包括小鼠0ct4、Sox2、Klf4、c-Myc的cDNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMXs(來自 Addgene 公司，編號分別為 Plasmid 13366，Plasmid 13367，Plasmidl3370 和 Plasmid 13375) ；0ct4, NCBI 登錄號為 NM_013663 ；Sox2, NCBI 登錄號為 NM_011443 ；Klf4, NCBI登錄號為010637 ；c_Myc，NCBI登錄號為NM_001177353。應(yīng)用自制的磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑將 PMX載體上的重編程因子質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)病毒包裝細(xì)胞(PlatE)，具體過程接種750萬PlatE 細(xì)胞于10厘米直徑的培養(yǎng)盤(Corning)，12小時后以7. 5毫升不含青霉素/鏈霉素的培養(yǎng)基更換掉舊的培養(yǎng)基，隨后將細(xì)胞放進(jìn)培養(yǎng)箱。接下來準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染混合物取25微克質(zhì)粒加入15毫升離心管，按序依次加入156. 25微升2M的氯化鈣溶液，補加適量水使三者的總體積為1. 25毫升，混合均勻，然后加入1. 25毫升HBS溶液，立即混合均勻，然后靜置2分鐘， 隨后逐滴加入PlatE培養(yǎng)盤中，混合均勻。轉(zhuǎn)染后9-12小時，更換10毫升新鮮培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染后48小時收集培養(yǎng)液并以0. 45微米濾膜過濾培養(yǎng)液，作為第一次感染用病毒液，添加新鮮培養(yǎng)液M小時后如此再收集培養(yǎng)液作為第二次感染病毒液。5、用病毒感染MEF細(xì)胞感染分兩輪進(jìn)行，所用的誘導(dǎo)因子均同時感染細(xì)胞，12孔板的每個孔感染病毒用量為1毫升，第一輪感染后M小時后進(jìn)行第二輪感染，第二輪感染后M小時將病毒液更換成mES培養(yǎng)基(前述)。換液當(dāng)天記為第0天(DO)；感染后不同時間點，按實驗需要在原孔內(nèi)數(shù)GFP熒光克隆數(shù)或采用流式細(xì)胞儀分析GFP熒光細(xì)胞的比率。6、對感染后的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)直到干細(xì)胞克隆形成使用玻璃針將形態(tài)隆起，邊緣清晰的胚胎干細(xì)胞樣的單個克隆挑選出來，直接轉(zhuǎn)移至提前鋪好飼養(yǎng)層細(xì)胞(飼養(yǎng)層細(xì)胞為絲裂霉素處理過的ICR小鼠成纖維細(xì)胞)的培養(yǎng)板(Corning)中以KSR培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。感染后的第2天，將培養(yǎng)體系更換為新鮮的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，之后每天更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基直到實驗完成。按上文所述干細(xì)胞克隆形成的方法，用不同的多能干細(xì)胞誘導(dǎo)因子組合進(jìn)行實驗。各多能干細(xì)胞誘導(dǎo)因子組合說明如下Kif4, Sox2, c-Myc, 0ct4 的組合簡寫為 SK0M。
Kif4, Sox2, 0ct4 的組合簡寫為 SK0。Kif4，0ct4的組合簡寫為K0。Sox2，0ct4的組合簡寫為SO。0ct4與Jhdmlb的組合簡寫為OB。C4、C14、C15、C16是從OB誘導(dǎo)的重編程細(xì)胞中挑選的四株克隆。選用各干細(xì)胞誘導(dǎo)因子組合實驗結(jié)果如下請參閱圖1，無論是否有維生素C的存在，Jhdmla或Jhdmlb對于重編程的效率都有明顯地提高，在維生素C存在的條件下，增加幅度更為顯著，圖1顯示了 Jhdmla或 Jhdmlb提高SKO介導(dǎo)的誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞效率的數(shù)據(jù)，其中對照是沒有插入任何基因序列的pMXs-FLAG空載體；請參閱圖2，無論是否有維生素C的存在，Jhdmla或Jhdmlb對于重編程的效率都有明顯地提高，在維生素C存在的條件下，增加幅度更為顯著，圖2顯示了 Jhdmla或Jhdmlb 提高SKOM介導(dǎo)的誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞效率的數(shù)據(jù)，其中對照是沒有插入任何基因序列的 pMXs-FLAG 空載體；請參閱圖3，在維生素C存在的條件下，Jhdmla和Jhdmlb共同作用，能夠使得在只有S0、K0或者0ct4的條件下誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞，mESC+Vc表示誘導(dǎo)過程中所用的培養(yǎng)基是干細(xì)胞培養(yǎng)基mES，并且添加了 50 μ g/ml的維生素C，其中對照是pMXs-FLAG空載體。因此，本發(fā)明得出，Jhdmla和Jhdmlb能夠顯著改善誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的效率，在保持較高的重編程效率大大減少所需導(dǎo)入的轉(zhuǎn)錄因子的種類，從而對于減少重編程細(xì)胞突變的積累，減少其致癌性提供了重大的益處。另外，本發(fā)明的方法也提高重編程技術(shù)的可操作性，降低了操作的難度，為后續(xù)的醫(yī)藥用途提供了便利。實施例2:對實施例1所得誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的鑒定如圖3以及圖6至圖10所示，對0ct4和Jhdmlb誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞克隆進(jìn)行一系列鑒定實驗，以證明其是否為iPS細(xì)胞(誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞)，鑒定實驗包括定量PCR、免疫熒光分析其表面標(biāo)記物、啟動子甲基化程度分析、核型鑒定、嵌合體形成等。定量PCR實驗所有定量PCR實驗均應(yīng)用Takara公司的試劑盒在Biorad公司CFX-96型定量PCR 儀上完成，所用反應(yīng)條件是95°C 2分鐘；95°C 10秒，60°C 30秒，讀取熒光值，如此重復(fù)40個循環(huán)。啟動子區(qū)域甲基化狀況分析該分析通過亞硫酸氫鈉測序方法進(jìn)行測定。提取目的細(xì)胞中的基因組 DNA(Promega 公司，Wizard Genomic DNA Purification Kit)，測定濃度值，將約 2ugDNA 于1. 5mlEP管中使用ddH20稀釋至50 μ 1，加入5. 5ul新鮮配制的3M NaOH并于42°C水浴 30min ；隨后取出溶液，加30 μ 1體積的IOmM對苯二酚(氫醌)(sigma)至上述水浴后混合液中，然后再加520 μ 1體積的3. 6Μ亞硫酸氫鈉(Sigma，S9000)至上述水浴后溶液中，EP 管外裹以鋁箔紙，避光，輕柔顛倒混勻溶液；加200 μ 1石蠟油，防止水分蒸發(fā)，防制氧化并于50°C避光水浴16h。隨后，將移液器槍頭伸入石蠟油層下，吸取混合液至一潔凈1.5ml離心管中，使用Promega Wizard Cleanup DNA純化回收系統(tǒng)(Promega，A7280)對修飾后DNA進(jìn)行回收，-20°C保存或進(jìn)行下一步的實驗。取50ng上述提取的DNA作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，隨后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收(天根公司，DP214-03)，然后將PCR產(chǎn)物與T載體(Takara公司) 進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，挑選陽性克隆送測序公司進(jìn)行測序，得到結(jié)果進(jìn)行比對，統(tǒng)計CpG島的甲基化狀態(tài)。iPS細(xì)胞的核型鑒定iPS細(xì)胞的核型鑒定按照下述方法進(jìn)行待做核型分析的細(xì)胞在收獲前2-3小時加入0. Iml 5ug/ml秋水仙素(市售，終濃度0. lug/ml)混勻后繼續(xù)培養(yǎng)2_3小時，轉(zhuǎn)入IOml 離心管中，以1500-2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，去上清液，加入8ml低滲液(0. 075M Kcl, 37°C預(yù)熱)將細(xì)胞沉淀吹打均勻，放入溫箱中37°C半小時，加入Iml新配制的固定液(甲醇冰醋酸體積比為3 1的混合物，原料市售)，輕輕混勻后以與前面相同的轉(zhuǎn)速和時間離心，吸去上清液。加入8mL固定液并充分將細(xì)胞混勻，室溫固定至少半小時，重復(fù)離心后， 去掉上清液，加入新鮮固定液再次固定至少半小時(最好過夜)經(jīng)離心和去上清液后的細(xì)胞沉淀中加入約0. 2ml新鮮固定液混勻，細(xì)胞懸液滴于預(yù)冷的載玻片上(以每張玻片3滴細(xì)胞懸液為宜)，酒精燈烘烤滴片，冷卻后進(jìn)行分帶處理。囊胚嵌合體試驗?zāi)遗咔逗象w試驗，將iPS細(xì)胞注射到供體小鼠的囊胚腔中，再將注射后的囊胚移植到假孕雌鼠的子宮中制作嵌合體小鼠，出生的小鼠根據(jù)毛色來判定是否產(chǎn)生嵌合。按以上方法進(jìn)行實驗，結(jié)果分析為請參閱圖5，顯示了對多能干細(xì)胞克隆的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果表明OB 誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞克隆C4、C14、C15和C16基因組中只有0ct4和Jhdmlb整合，對照是感染 Sox2、klf4、oct4、cMyc和Jhdmlb的細(xì)胞提取的基因組DNA，MEF表示從小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中提取的基因組DNA;請參閱圖6，顯示了定量PCR結(jié)果，表明OB誘導(dǎo)的多能性干細(xì)胞克隆C4、C14、C15 和C16外源基因被沉默表達(dá)，其中OB D4對照是從感染0ct4和Jhdmlb并培養(yǎng)4天后的細(xì)胞中提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA模板，MEF是小鼠胚胎成纖維細(xì)胞；請參閱圖7，如圖7所示，顯示了實時定量PCR結(jié)果，其表明OB誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞克隆C4、C14、C15和C16表達(dá)胚胎干細(xì)胞特異性基因，其中Rl是小鼠胚胎干細(xì)胞系，MEF是小鼠胚胎成纖維細(xì)胞；使用0ct4和Jhdmlb組合得到的干細(xì)胞的內(nèi)源性胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子等表達(dá)量與胚胎干細(xì)胞表達(dá)基本一致。表明OB誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞克隆C4、C14、C15和 C16表達(dá)胚胎干細(xì)胞特異性基因，因此說明通過本發(fā)明方法誘導(dǎo)得到的多能性干細(xì)胞具有多能性干細(xì)胞的特征。請參閱圖8，如圖8所示，免疫熒光結(jié)果顯示OB得到的多能干細(xì)胞表面表達(dá) SSEA-I，而且表達(dá)Rexl。請參閱圖9，顯示0ct4啟動子區(qū)域的CpG島甲基化狀態(tài)分析，供體細(xì)胞的CpG島未甲基化，而誘導(dǎo)多能干細(xì)胞相應(yīng)位置的CpG島發(fā)生顯著的去甲基化。請參閱圖10，顯示Nanog啟動子區(qū)域的CpG島甲基化狀態(tài)分析，0B-C14、0B_C15和 0B-C16分別是由0ct4和Jhdmlb誘導(dǎo)產(chǎn)生的多能干細(xì)胞的三株多能干細(xì)胞。黑色部分為表示已甲基化，白色表示沒有甲基化。供體細(xì)胞的CpG島未甲基化，而誘導(dǎo)多能干細(xì)胞相應(yīng)位置的CpG島發(fā)生顯著的去甲基化；Nanog和0ct4是胚胎干細(xì)胞特異性表達(dá)的基因，表達(dá)狀態(tài)與細(xì)胞的命運密切相關(guān)，這些結(jié)果說明，使用OB組獲得的細(xì)胞其命運發(fā)生了改變，也就是說被誘導(dǎo)成為了多能性干細(xì)胞。請參閱圖11，顯示通過本發(fā)明方法得到的干細(xì)胞的核型正常，0B-C14、0B-C15和 0B-C16分別是由0ct4和Jhdmlb誘導(dǎo)產(chǎn)生的多能干細(xì)胞的三株多能干細(xì)胞，它們都具有正常的核型。請參閱圖4，如圖4所示a，d為0ct4+jhdmlb(簡寫為0B)最終形成的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的顯微照片；b，e為OB最終形成的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞注射囊胚后發(fā)育形成的嵌合體后代照片；c，f為OB最終形成的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞注射囊胚后發(fā)育形成的嵌合體與野生型小鼠個體交配后產(chǎn)生的后代的照片；顯示了通過本發(fā)明方法得到的干細(xì)胞可以形成嵌合體，其中供體細(xì)胞為誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞，其細(xì)胞來源是0G2/U9細(xì)胞，而假孕小鼠是實驗飼養(yǎng)的ICR 小鼠。得到的嵌合體具有將原來供體細(xì)胞通過生殖系傳遞到下一代，說明此干細(xì)胞具有良好的質(zhì)量。Jhdmlb變體的功能性測定請參閱圖12，如圖12所示，在中發(fā)生突變的Jhdmlb變體不具有提高重編程效率的活性，因此Jhdmlb的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CXXC)和催化結(jié)構(gòu)域(Jmjc)對于重編程是必須的， 缺少任何一個均不能促進(jìn)重編程。而且，0ct4和Jhdmlb的組合在普通的培養(yǎng)基條件下就可以完成重編程，在維生素C存在的條件下效果更加顯著。以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種提高誘導(dǎo)生成多能性干細(xì)胞效率的方法，其特征在于，包括如下步驟a、將轉(zhuǎn)錄因子與Jhdmlb轉(zhuǎn)入哺乳動物的成體細(xì)胞，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導(dǎo)獲得多能性干細(xì)胞克隆，所述轉(zhuǎn)錄因子為單獨的0ct4，或0ct4和Klf4和Sox2的組合，或0ct4、 Klf4、c-Myc 和 Sox2 的組合；b、將誘導(dǎo)獲得的多能性干細(xì)胞克隆在干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)擴(kuò)增。
2.一種提高誘導(dǎo)生成多能性干細(xì)胞效率的方法，其特征在于，包括如下步驟a、將轉(zhuǎn)錄因子與Jhdmlb轉(zhuǎn)入哺乳動物的成體細(xì)胞，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含維生素C，誘導(dǎo)獲得多能性干細(xì)胞克隆，所述轉(zhuǎn)錄因子為單獨的0ct4，或0ct4和 Sox2的組合，或0ct4和Klf4的組合，或0ct4和Klf4和Sox2的組合；b、將誘導(dǎo)獲得的多能性干細(xì)胞克隆在干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)擴(kuò)增。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提高誘導(dǎo)生成多能性干細(xì)胞效率的方法，其特征在于，包括如下步驟a、將轉(zhuǎn)錄因子與Jhdmlb轉(zhuǎn)入哺乳動物的成體細(xì)胞，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含維生素C，誘導(dǎo)獲得多能性干細(xì)胞克隆，所述轉(zhuǎn)錄因子為單獨的0ct4，或0ct4和 Sox2的組合，或0ct4和Klf4的組合，或0ct4和Klf4和Sox2的組合；b、將誘導(dǎo)獲得的多能性干細(xì)胞克隆在干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)擴(kuò)增，所述干細(xì)胞培養(yǎng)基包含維生素C。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提高誘導(dǎo)生成多能性干細(xì)胞效率的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄因子和Jhdmlb為具有多能干細(xì)胞誘導(dǎo)功能的編碼或非編碼RNA、蛋白質(zhì)或多肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4任一項所述的提高誘導(dǎo)生成多能性干細(xì)胞效率的方法，其特征在于，所述將Jhdmlb轉(zhuǎn)入哺乳動物的成體細(xì)胞是以包含能夠表達(dá)Jhdmlb的載體導(dǎo)入細(xì)胞中來實現(xiàn)的。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的提高誘導(dǎo)生成多能性干細(xì)胞效率的方法，其特征在于，所述載體為病毒載體、質(zhì)粒載體、外隨體載體、mRNA載體或直接化學(xué)合成。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的提高誘導(dǎo)生成多能性干細(xì)胞效率的方法，其特征在于，所述病毒載體為逆轉(zhuǎn)錄病毒，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒為PMXs載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高誘導(dǎo)生成多能性干細(xì)胞效率的方法，其特征在于，所述 Jhdmlb是進(jìn)行去甲基化修飾的多肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高誘導(dǎo)生成多能性干細(xì)胞效率的方法，其特征在于，所述哺乳動物的成體細(xì)胞為成纖維細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、造血細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高誘導(dǎo)生成多能性干細(xì)胞效率的方法，其特征在于，所述哺乳動物的成體細(xì)胞為小鼠胚胎成纖維細(xì)胞。
11.一種提高誘導(dǎo)生成多能性干細(xì)胞效率的方法，其特征在于，包括如下步驟a、將轉(zhuǎn)錄因子與Jhdmlb和Jhdmla轉(zhuǎn)入哺乳動物的成體細(xì)胞，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導(dǎo)獲得多能性干細(xì)胞克隆，所述轉(zhuǎn)錄因子為單獨的0ct4，或0ct4和Sox2的組合，或0ct4和 Klf4的組合，或0ct4和Klf4和Sox2的組合；b、將誘導(dǎo)獲得的多能性干細(xì)胞克隆在干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)擴(kuò)增。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的提高誘導(dǎo)生成多能性干細(xì)胞效率的方法，其特征在于，包括如下步驟a、將轉(zhuǎn)錄因子與Jhdmlb和Jhdmla轉(zhuǎn)入哺乳動物的成體細(xì)胞，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含維生素C，誘導(dǎo)獲得多能性干細(xì)胞克隆，所述轉(zhuǎn)錄因子為0ct4 ；b、將誘導(dǎo)獲得的多能性干細(xì)胞克隆在干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)擴(kuò)增，所述干細(xì)胞培養(yǎng)基包含維生素C。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提高誘導(dǎo)生成多能性干細(xì)胞效率的方法，尤其涉及用修飾組蛋白基因jhdm1b和jhdm1a提高誘導(dǎo)生成多能性干細(xì)胞效率的方法。本發(fā)明利用Jhdm1b、Jhdm1a和干細(xì)胞誘導(dǎo)因子提高了誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的效率，提高了誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的質(zhì)量。所述干細(xì)胞誘導(dǎo)因子為Oct4、Klf4的組合，或Sox2、Oct4和Klf4的組合，或Oct4和Sox2的組合，以及單獨的Oct4。本發(fā)明的方法還包括將所述細(xì)胞暴露于維生素C，其相比于不使用維生素C進(jìn)一步提高了誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的效率。本發(fā)明的方法通過使用較少的干細(xì)胞誘導(dǎo)因子降低了潛在的致癌性，同時獲得了較高的誘導(dǎo)效率，并可以得到高質(zhì)量的具有生殖系傳遞能力的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。
文檔編號C12N5/10GK102417894SQ201110323779
公開日2012年4月18日 申請日期2011年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月21日
發(fā)明者王濤, 裴端卿 申請人:中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院