分泌表達(dá)外源蛋白的酵母轉(zhuǎn)化子及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種分泌表達(dá)外源蛋白的酵母轉(zhuǎn)化子及其制備方法，所述方法步驟為：正向引物5’端引入XhoI，對(duì)應(yīng)Kex2識(shí)別區(qū)域P1’位點(diǎn)分別引入20種氨基酸密碼子，反向引物5’端引入NotI，得20對(duì)引物；以目標(biāo)基因CDS序列cDNA或DNA為模板擴(kuò)增，TA克隆得載體群P1’-CDS-pMD20-T；構(gòu)建酵母真核表達(dá)載體群P1’-CDS-pPICZαA；轉(zhuǎn)化載體群至酵母，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，并接到Y(jié)PD平板，得相同拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)化子群甲醇誘導(dǎo)，分析蛋白產(chǎn)量，即得表達(dá)水平最高的轉(zhuǎn)化子。本發(fā)明制備方法通過(guò)對(duì)Kex2的P1’氨基酸殘基的優(yōu)選以提高Kex2蛋白酶識(shí)別底物的活性，從而提高酵母分泌表達(dá)重組蛋白的產(chǎn)量。
【專(zhuān)利說(shuō)明】分泌表達(dá)外源蛋白的酵母轉(zhuǎn)化子及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)基因工程蛋白藥物技術(shù)，具體來(lái)說(shuō)，特別涉及一種通過(guò)重組載體構(gòu)建和酵母轉(zhuǎn)化子篩選獲得外源蛋白高水平分泌表達(dá)的酵母轉(zhuǎn)化子及其制備方法。
【背景技術(shù)】[0002]KEX2是巨大的前體蛋白轉(zhuǎn)化酶家族的成員，該蛋白家族與細(xì)菌枯草桿菌素相關(guān)。Kex2在病原性酵母Candida albicans上的同源蛋白是一個(gè)毒性因子。該蛋白的真核同源蛋白包括furin，PCI, PC2和其他用于處理諸如前體胰島素、前體胰高血糖素和前體神經(jīng)肽等等分泌激素的前體蛋白轉(zhuǎn)化酶。這些基因的缺失被認(rèn)為與諸如糖尿病和癌癥等重大疾病關(guān)系密切。
[0003]KEX2基因編碼了一個(gè)參與細(xì)胞內(nèi)蛋白前體加工的依賴(lài)于Ca2+的中性絲氨酸蛋白酶。Kex2蛋白是膜綁定蛋白，它最早定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜并最終在反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮功能，在反式高爾基體囊泡和晚期的內(nèi)吞體膜泡上循環(huán)。
[0004]Kex2最初以一個(gè)無(wú)活性的前體形式被表達(dá)出來(lái)，這個(gè)前體蛋白含有多個(gè)結(jié)構(gòu)域，有一些最終會(huì)被切除掉以形成成熟的蛋白。Kex2酶原的結(jié)構(gòu)域包括:一個(gè)N末端內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)肽，后面接著一個(gè)前體結(jié)構(gòu)域，一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域，一個(gè)P結(jié)構(gòu)域，功能未知但是在該蛋白所屬的前體蛋白轉(zhuǎn)化酶家族中保守而且對(duì)于該蛋白的體內(nèi)催化活性是必須的，一個(gè)高糖基化的絲氨酸/蘇氨酸富集區(qū)域，一個(gè)單次跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)含有反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)定位信號(hào)的深入胞漿的尾部。在Kex2的激活過(guò)程中，該蛋白的N末端會(huì)經(jīng)歷多次翻譯后修飾步驟。首先，信號(hào)肽在翻譯的同時(shí)就在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)被切除；然后通過(guò)分子內(nèi)部的自身介導(dǎo)的切除作用移除掉作為分子伴侶和自身抑制子的前體結(jié)構(gòu)域，這個(gè)酶分子就被激活了 ；之后還有進(jìn)一步的在高爾基體中通過(guò)Stel3雙肽氨肽酶進(jìn)行N末端修飾，最后生成成熟的Kex2。
[0005]Kex2作為一個(gè)對(duì)底物序列有嚴(yán)格選擇性的蛋白內(nèi)切酶，其底物選擇性已經(jīng)了解的比較清楚了。這里先介紹一種被科學(xué)界廣泛接受的命名底物及相關(guān)的蛋白酶上單個(gè)氨基酸殘基的方法:從被酶切斷的肽鍵開(kāi)始，往底物的N末端數(shù)過(guò)去，底物的氨基酸依次被標(biāo)示為Pl，P2，P3，P4，……，與它們綁定并相互作用的酶分子的氨基酸依次被標(biāo)示為SI，S2，S3，S4,……；同理，往底物的C末端數(shù)過(guò)去，底物的氨基酸依次被標(biāo)示為P1’，P2’，P3’，P4’，……，與它們綁定并相互作用的酶分子的氨基酸依次被標(biāo)示為SI’，S2’，S3’，S4，，......。
[0006]國(guó)外雖已有報(bào)道，較好的Kex2活性會(huì)帶來(lái)較高的酵母天然外激素的分泌表達(dá)量，但我們的方案是在該報(bào)道已經(jīng)獲得的最優(yōu)水平的條件之上，進(jìn)一步進(jìn)行的優(yōu)化。目前，對(duì)于Kex2，公認(rèn)的底物特異性為:P1嚴(yán)格特異的只能識(shí)別Arg ；P2可識(shí)別堿性氨基酸殘基，如Lys7Arg和鳥(niǎo)氨酸；P4可識(shí)別脂肪族或者堿性氨基酸殘基；對(duì)于被裂解肽鍵的另外一側(cè)，一般認(rèn)為沒(méi)有特別的選擇性，只是在Ρ1位點(diǎn)比較排斥體積較大的側(cè)鏈；所以，沒(méi)有報(bào)道Kex2的Ρ1'殘基的選擇性的特殊形式，更沒(méi)有報(bào)道這會(huì)顯著影響酵母分泌表達(dá)水平，并進(jìn)而可以利用來(lái)極大的提高重組蛋白的酵母分泌表達(dá)的水平。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]基于此，本發(fā)明提供一種高水平分泌表達(dá)外源蛋白的酵母轉(zhuǎn)化子及其制備方法，該方法通過(guò)優(yōu)化酵母Kex2蛋白酶活性和提升其表達(dá)量，獲得重組的外源基因的高水平分泌表達(dá)的酵母轉(zhuǎn)化子。
[0008]解決上述技術(shù)問(wèn)題的具體技術(shù)方案如下:
[0009]一種獲得外源蛋白高水平分泌表達(dá)的酵母轉(zhuǎn)化株的方法，包括以下步驟:
[0010](I)設(shè)計(jì)合成一系列克隆外源基因⑶S的引物:在正向引物對(duì)應(yīng)于Ρ1'的位置，即Kex2剪切位點(diǎn)C末端方向的第一個(gè)氨基酸，分別引入20種天然氨基酸的密碼子，正向引物5’端設(shè)計(jì)XhoI位點(diǎn)，XhoI位點(diǎn)和Ρ1'位點(diǎn)之間的區(qū)域由原始的酵母分泌表達(dá)載體的對(duì)應(yīng)序列(AAAAGA)填充，Ρ1'位點(diǎn)下游至引物3’末端為PCR反應(yīng)擴(kuò)增序列互補(bǔ)區(qū)域，從XhoI位點(diǎn)開(kāi)始到被擴(kuò)增的CDS應(yīng)融合在同一個(gè)表達(dá)框下，反向引物的3’區(qū)域與被擴(kuò)增的外源基因3’末端互補(bǔ)，5’端引入NotI位點(diǎn)用于插入酵母分泌表達(dá)載體，即得20對(duì)系列引物；
[0011](2) TA克隆感興趣的某種外源基因⑶S:利用步驟(1)所述的系列引物，每個(gè)正向引物一個(gè)PCR反應(yīng)，都搭配同一個(gè)反向引物，以含有目標(biāo)基因完整CDS序列的cDNA或者其他DNA分子為模板，擴(kuò)增出完整的基因片段，回收PCR產(chǎn)物TA連接入TA克隆載體pMD20_T，得到系列Ρ1'變化載體群Ρ1' -⑶S-pMD20-T，經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證所有載體Ρ1'位點(diǎn)氨基酸密碼子與設(shè)計(jì)相同，并且外源基因也是正確的可表達(dá)序列；
[0012](3)亞克隆構(gòu)建酵母真核表達(dá)載體:將步驟(2)所述的系列Ρ1'變化載體群Pl’-CDS-pMD20-T和酵母分泌表達(dá)載體pPICZ α Α,經(jīng)過(guò)XhoI和NotI雙酶切消化，分別回收插入片段和載體片段，用Solution I連接試劑連接上述回收片段，得到pPICZ a A重組的系列Ρ1'變化重組載體群Ρ1' -CDS-pPICZ α A ；
[0013](4)轉(zhuǎn)化重組酵母分泌表達(dá)載體至酵母宿主中:將步驟(3)所得的重組載體群Ρ1'-⑶S-pPICZ a A經(jīng)SacI單酶切線(xiàn)性化后，回收酶切產(chǎn)物，經(jīng)氯化鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入畢赤酵母Pichia pastoris的X-33宿主菌中，經(jīng)過(guò)zeocin90_110 μ g/ml篩選得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,用PCR反應(yīng)驗(yàn)證陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；
[0014](5)確定酵母轉(zhuǎn)化子拷貝數(shù):將步驟(4)所得的陽(yáng)性酵母轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到含有zeocin的濃度水平遞增的YH)平板上，用于確定轉(zhuǎn)化子的外源基因整合拷貝數(shù)，所有能夠在同一 zeocin濃度水平的YPD平板上生長(zhǎng)而不能在下一更高濃度水平生長(zhǎng)的酵母轉(zhuǎn)化子視為具有相同的外源基因整合拷貝數(shù)，每個(gè)重組載體酵母轉(zhuǎn)化子都確定了具有抗相同zeocin濃度水平的酵母克隆各5-6個(gè)，篩選分泌表達(dá)量最高的特定P1’氨基酸的重組載體轉(zhuǎn)化子須在拷貝數(shù)相同的各Ρ1'變化系列載體轉(zhuǎn)化子Ρ1' -CDS之間進(jìn)行比較得出結(jié)論；
[0015](6)酵母轉(zhuǎn)化子的液體培養(yǎng)及甲醇誘導(dǎo)表達(dá):將步驟(5)所得的有相同外源基因整合拷貝數(shù)的Pr變化轉(zhuǎn)化子群Pr -CDS及空載轉(zhuǎn)化子對(duì)照接種至BMGY液體培養(yǎng)基，于25-30°C搖床培養(yǎng)至0D_為1.8-2.2，收集酵母細(xì)胞，并于BMMY液體培養(yǎng)基重懸，稀釋至0D_值為0.8-9-1.1，并繼續(xù)在25-30°C搖床培養(yǎng)以誘導(dǎo)外源重組基因分泌表達(dá)，離心酵母培養(yǎng)物收集上清；
[0016](7)篩選表達(dá)水平最高的重組載體轉(zhuǎn)化子:通過(guò)分析步驟(6)所得上清中外源重組蛋白的產(chǎn)量，即得產(chǎn)量最高的特定Ρ1’氨基酸的重組載體轉(zhuǎn)化子。
[0017]在一些實(shí)施例中，步驟(1)中所述20種天然氨基酸的密碼子的正向引物為:
【權(quán)利要求】
1.一種分泌表達(dá)外源蛋白的酵母轉(zhuǎn)化子的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)設(shè)計(jì)克隆外源基因⑶S的引物:正向引物的5’端引入XhoI位點(diǎn)，并在對(duì)應(yīng)于Kex2蛋白酶識(shí)別區(qū)域的Ρ1'位點(diǎn)分別引入20種天然氨基酸的密碼子，反向引物的5’端引入NotI位點(diǎn)，得20對(duì)系列引物； (2)TA克隆感興趣的外源基因CDS:以含有步驟(1)所述20對(duì)系列引物感興趣的目標(biāo)基因完整⑶S序列的cDNA或者DNA為模板，用步驟(1)所述系列引物擴(kuò)增出完整的⑶S基因片段，回收PCR產(chǎn)物TA連接入TA克隆載體pMD20-T，得到系列P1’變化載體群Ρ1' -⑶S-pMD20-T，經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證所有載體Ρ1'位點(diǎn)氨基酸密碼子與設(shè)計(jì)相同，且外源基因⑶S確定為正確的可表達(dá)序列； (3)亞克隆構(gòu)建酵母真核表達(dá)載體群:將步驟(2)所得的載體群Ρ1'-⑶S-pMD20-T和酵母表達(dá)載體pPICZaA，分別經(jīng)XhoI和NotI雙酶切消化并回收，用Solution I連接試劑連接，得系列Pl ’變化載體群Ρ1' -⑶S-pPICZ a A ； (4)轉(zhuǎn)化重組載體群至酵母宿主中:將步驟(3)所得的系列Ρ1'變化載體群Ρ1'-⑶S-pPICZ a A經(jīng)SacI單酶切線(xiàn)性化后，回收酶切產(chǎn)物，再經(jīng)氯化鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入畢赤酵母Pichia pastoris的X-33宿主菌中，經(jīng)zeocin90_110 μ g/ml篩選得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子； (5)確定酵母轉(zhuǎn)化子拷貝數(shù):將步驟(4)所得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到含zeocin濃度遞增的YPD平板，獲得具有相同外源基因整合拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)化子群Ρ1' -CDS ； (6)酵母轉(zhuǎn)化子的液體培養(yǎng)及甲醇誘導(dǎo)表達(dá):將步驟(5)所得的有相同外源基因整合拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)化子群Ρ1'-⑶S及空載轉(zhuǎn)化子接種至BMGY培養(yǎng)基，25-30°C搖床培養(yǎng)至OD6tltl為.1.8-2.2，收集酵母細(xì)胞用BMMY培養(yǎng)基重懸，稀釋至OD600為0.9-1.1，甲醇誘導(dǎo)110_130h,離心并收集上清； (7)篩選表達(dá)水平最高的重組載體轉(zhuǎn)化子:通過(guò)分析步驟(6)所得的上清中外源重組蛋白產(chǎn)量，即得表達(dá)水平最高的Ρ1'氨基酸的重組載體轉(zhuǎn)化子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分泌表達(dá)外源蛋白的酵母轉(zhuǎn)化子的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述20種天然氨基酸的密碼子的正向引物分別為:
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分泌表達(dá)外源蛋白的酵母轉(zhuǎn)化子的制備方法，其特征在于，步驟(4)中所述zeocin的濃度為100 μ g/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分泌表達(dá)外源蛋白的酵母轉(zhuǎn)化子的制備方法，其特征在于，步驟(5)中所述YPD平板的zeocin的濃度依次為200 μ g/ml、500 μ g/ml和1000 μ g/ml。
5.根據(jù)上述權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述制備方法獲得的酵母轉(zhuǎn)化子。
【文檔編號(hào)】C12R1/84GK103525712SQ201310317850
【公開(kāi)日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月25日
【發(fā)明者】吳東海, 楊松, 劉月紅, 李侍武, 徐愛(ài)民, 李鵬, 劉彭濤 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院