一種人細(xì)胞色素酶p450基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種人細(xì)胞色素酶P450基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒，該試劑盒采用從外周血細(xì)胞中提取基因組DNA的方法，用CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，將帶生物素標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物與固定在醛基片上的相應(yīng)基因型檢測(cè)探針進(jìn)行特異雜交反應(yīng)，洗去未結(jié)合產(chǎn)物后加入標(biāo)記液，反應(yīng)一段時(shí)間再清洗后對(duì)芯片進(jìn)行掃描，得到樣品DNA擴(kuò)增產(chǎn)物與每個(gè)相應(yīng)基因位點(diǎn)的野生型和突變型探針雜交形成的雜交圖像，經(jīng)過(guò)軟件分析圖像，判斷待檢品的基因型。上述試劑盒提供的利用基因芯片法檢測(cè)基因多樣性，操作過(guò)程簡(jiǎn)單，包含的信息量大，具有良好的市場(chǎng)前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種人細(xì)胞色素酶P450基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種檢測(cè)人細(xì)胞色素酶P450基因多態(tài)性的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]人細(xì)胞色素P450酶(CYP)是定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(微粒體)上的一類(lèi)結(jié)合有亞鐵血紅素的蛋白。CYP酶系是由超基因家族編碼的一組結(jié)構(gòu)與功能相關(guān)的同工酶，該酶系能夠催化許多不同類(lèi)型的氧化反應(yīng)，包括羥基化、環(huán)氧化、雜環(huán)原子氧化、雜環(huán)原子脫烷基化、氧化基團(tuán)遷移、脫酯化和脫氫反應(yīng)。因此該酶家族是人體中重要的一類(lèi)單氧化酶，在體內(nèi)發(fā)揮著許多功能，特別在藥物代謝過(guò)程中具有重要作用，是人體內(nèi)主要的藥物代謝酶。
[0003]大量的研究結(jié)果表明，細(xì)胞色素P450酶系的基因多態(tài)性在個(gè)體對(duì)藥物的代謝及處置、對(duì)環(huán)境毒物的敏感性、以及與代謝相關(guān)的疾病發(fā)生等方面都有著重要的影響。細(xì)胞色素P450酶系也已經(jīng)成為了臨床上指導(dǎo)個(gè)體化給藥，研究毒物暴露引起的疾病，以及遺傳代謝相關(guān)疾病的重要生物標(biāo)記物。
[0004]CYP有多個(gè)亞家族，其中CYP2C9是第二亞家族中的一個(gè)重要成員，占肝微粒體P450蛋白總量的20%。CYP2C9能羥化代謝許多不同性質(zhì)的藥物，主要是酸性底物。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前約有16%的的臨床藥物由CYP2C9負(fù)責(zé)代謝。CYP2C9的基因頻率在不同人種和不同民族之間差異很大。在中國(guó)人口中，除了野生型CYP2C9*1，已發(fā)現(xiàn)的最主要的基因型是CYP2C9*3，其基因頻率約為3.3%。CYP2C19也是CYP450酶第二亞家族中的重要成員，是人體重要的藥物代謝酶，在肝臟中有很多表達(dá)。CYP2C19具有很多基因多態(tài)(SNP)位點(diǎn)，最常見(jiàn)的是 CYP2C19*2 和 CYP2C19*3。`
[0005]因此，分析CYP2C9和CYP2C9基因多態(tài)性可推斷代謝表型，從而預(yù)測(cè)解毒能力和患病風(fēng)險(xiǎn)，在臨床研究上意義重大?？梢?jiàn)，尋求一種能夠快速檢測(cè)識(shí)別CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3基因的方法在實(shí)現(xiàn)上述目的時(shí)尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種用于快速檢測(cè)人細(xì)胞色素酶P450( CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3)基因多態(tài)性的試劑盒。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的是上述試劑盒在檢測(cè)CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3基因
多態(tài)性上的應(yīng)用。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0009]本發(fā)明提供一種基因芯片，該基因芯片上連接有CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3
基因特異檢測(cè)探針。
[0010]上述基因芯片上連接的CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3基因特異檢測(cè)探針是:
[0011]CYP2C9*3 野生型 ACTCATCACGCAGCTCATTTTTTTTTTTTT;
[0012]CYP2C9*3 突變型 ACTCATCATGCAGCTCATTTTTTTTTTTTT;[0013]CYP2C19*2 野生型 GATGGCCAGCGTGGACAATTTTTTTTTTTT;
[0014]CYP2C19*2 突變型 GATGGCCATCGTGGACAATTTTTTTTTTTT;
[0015]CYP2C19*3 野生型 CAACCCCCACGTGTGCCGTTTTTTTTTTT;
[0016]CYP2C19*3 突變型 ACCCCCACCACGTGTGCCGTTTTTTTTTTT。
[0017]上述基因芯片上還連接有質(zhì)控探針，該質(zhì)控探針是:TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT。
[0018]本發(fā)明還提供包含上述基因芯片的一種用于人細(xì)胞色素酶Ρ450基因多態(tài)性的檢測(cè)試劑盒。
[0019]本發(fā)明的試劑盒還包括以下部分:PCR反應(yīng)液，酶混合物(Emix)，野生型質(zhì)控品，突變型質(zhì)控品，陰性對(duì)照，雜交液，標(biāo)記液，洗滌母液A，洗滌母液B，洗滌母液C，顯色液A，顯色液B。
[0020]上述試劑盒各部分的組分與配比如下:
[0021]PCR 反應(yīng)液:KC1，Tris-HCl 緩沖液，MgCl2, NTP, CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3基因特異引物對(duì)的混合液
[0022]酶混合物(Emix)=Taq 酶
[0023]野生型質(zhì)控品:含CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3野生型基因的重組DNA片段
[0024]突變型質(zhì)控品:含CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3突變型基因的重組DNA片段
[0025]陰性對(duì)照:TE緩沖液
[0026]雜交液:8X SSC, 0.2%SDS，甲酰胺
[0027]標(biāo)記液:辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素復(fù)合物
[0028]洗滌母液A:10%SDS
[0029]洗滌母液B:20 X SSC
[0030]洗滌母液C:磷酸鹽吐溫緩沖液
[0031]顯色液A:魯米諾溶液
[0032]顯色液B:過(guò)氧化氫水溶液
[0033]上述PCR反應(yīng)液中的CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3基因特異引物對(duì)是:
[0034]CYP2C9*3 上游引物 ATCGCATTCATGCGTCTTCA ；
[0035]CYP2C9*3 下游引物 ATCCCCATGGCAAACTCTTG;
[0036]CYP2Cl9*2 上游引物 GACTGAATATAAACTTGTGG;
[0037]CYP2Cl9*2 下游引物 CTGTATCAAAGAATGGTCCT;
[0038]CYP2Cl9*3 上游引物 GACTGTGTTTCTCCCTTCT;
[0039]CYP2C19*3 下游引物 TGGCAAATACACAAAGAAAG。
[0040]本發(fā)明試劑盒檢測(cè)人細(xì)胞色素酶P450基因多態(tài)性，包括如下步驟:
[0041]1、核酸提取
[0042]DNA的濃度應(yīng)達(dá)到10-60ng/ul，A260/A280比值在1.5~2.0之間，如果DNA必須稀釋?zhuān)褂肞H7.6的TE緩沖液作為稀釋液。
[0043]2、PCR 反應(yīng)
[0044]在分別包含 有野生型質(zhì)控品、突變型質(zhì)控品，PCR反應(yīng)液和酶混合物的體系中進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增，擴(kuò)增后進(jìn)行雜交反應(yīng)。
[0045]3、芯片雜交[0046](I)預(yù)處理芯片:首先在洗滌母液A漂洗30s，再在純化水中漂洗30s。甩去芯片表面的純化水，于室溫晾干備用；
[0047](2)配置雜交液:將PCR產(chǎn)物置95°C中熱變性5min后，立即置于冰水浴中5min后，取變性的擴(kuò)增產(chǎn)物4 μ 1，與4 μ I雜交液充分混勻。
[0048](3)雜交反應(yīng):立即吸取全部雜交混合液加入芯片反應(yīng)區(qū)中，使其分布均勻，然后將芯片平置于濕盒或雜交盒中，于45°C水浴中雜交I小時(shí)。
[0049](4)配置洗液:在雜交反應(yīng)過(guò)程中，按下述配方配制洗滌液1、I1、II1、IV，將洗滌液1、I1、II1、IV分別盛于三個(gè)250ml燒杯中。
[0050]洗滌液1:4ml洗滌母液A、IOml洗滌母液B，加蒸餾水稀釋至200ml ；
[0051]洗滌液II:2ml洗滌母液B加蒸餾水稀釋至200ml ；
[0052]洗滌液III: Iml洗滌母液B加蒸餾水稀釋至200ml ；
[0053]洗滌液IV:5ml洗滌母液C加超純水稀釋至100ml ；
[0054](5)清洗芯片:雜交反應(yīng)結(jié)束后，將雜交反應(yīng)區(qū)中的雜交混合液吸出；芯片依次置于洗滌液1、I1、III中各漂洗30s，其間不斷攪動(dòng)。取出芯片，甩去殘留在芯片上的液體，室溫避光晾干。
[0055](6)標(biāo)記顯色:在芯片的每個(gè)雜交區(qū)加入標(biāo)記液10μ 1，37°C溫育25min，取出后用洗滌液IV清洗3次，每次20s，輕輕甩去芯片上的洗液，再用超純水清洗3次后置于室溫晾干后在芯片的每個(gè)雜交區(qū)加入`混合液25 μ I。
[0056](7)芯片掃描。
[0057]本發(fā)明選取檢測(cè)相應(yīng)基因的SNP位點(diǎn)作為增靶區(qū)域，設(shè)計(jì)特異性引物及各型特異型探針，采用PCR體外擴(kuò)增法結(jié)合DNA雜交技術(shù)，可同時(shí)用于檢測(cè)細(xì)胞色素酶中的CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3基因多態(tài)性，此方法檢測(cè)基因多樣性，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，包含的信息量大。本發(fā)明的試劑盒可用于有相應(yīng)基因主導(dǎo)的藥物代謝能力的輔助診斷，檢測(cè)結(jié)果可供臨床參考，具有良好的市場(chǎng)前景和應(yīng)用價(jià)值。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0058]圖1是基因芯片掃描圖；其中白色實(shí)框內(nèi)是CYP2C19*3基因檢測(cè)結(jié)果，白色虛框內(nèi)是CYP2C9*3基因檢測(cè)結(jié)果。
[0059]圖2是基因芯片掃描圖；其中白色實(shí)框內(nèi)是CYP2C19*3基因檢測(cè)結(jié)果，白色虛框內(nèi)是CYP2C9*3基因檢測(cè)結(jié)果。
[0060]圖3是是基因芯片掃描圖；其中白色實(shí)框內(nèi)是CYP2C19*3基因檢測(cè)結(jié)果，白色虛框內(nèi)是CYP2C9*3基因檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0061]以下實(shí)施例用于進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的前提下，對(duì)本發(fā)明所作的修飾或者替換，均屬于本發(fā)明的范疇。
[0062]實(shí)施例1人細(xì)胞色素酶P450基因多態(tài)性基因芯片法檢測(cè)試劑盒的建立
[0063]1、引物
[0064]將合成好的引物結(jié)合PCR緩沖液和酶系，以企業(yè)工作參考品中最低檢出量參考品為樣本，在適用的儀器上，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。檢測(cè)結(jié)果表明:最低檢出量參考品檢測(cè)能區(qū)分相應(yīng)的基因型。
[0065]2、探針
[0066]取每條探針I(yè)OD分別溶于探針buffer，配制成終濃度分別為100 μ mol/L，-20±5°C保存。將保存濃度的探針用探針buffer稀釋成工作濃度，分別點(diǎn)制在芯片的相應(yīng)位置上。將制備好的芯片結(jié)合質(zhì)檢合格的細(xì)胞色素酶P450 (CYP)基因多態(tài)性基因芯片法檢測(cè)試劑盒的其它組分，以企業(yè)工作參考品中最低檢出量參考品為樣本，在適用的儀器上，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。檢測(cè)結(jié)果表明:最低檢出量參考品檢測(cè)能區(qū)分相應(yīng)的基因型。
[0067]3、分型陰性質(zhì)控品的制備
[0068]為無(wú)DNA的TE緩沖溶液，按每管20 μ I分裝，制備成分型陰性質(zhì)控品，-20±5°C保存。
[0069]在確定無(wú)任何外源性污染的條件下，用人細(xì)胞色素酶P450(CYP450)基因多態(tài)性基因芯片法檢測(cè)試劑盒，以分型陰性質(zhì)控品為樣本，在適用的儀器上，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。檢測(cè)結(jié)果顯示為陰性，無(wú)DNA擴(kuò)增。
`[0070]4、野生型質(zhì)控品的制備
[0071]為人工構(gòu)建的質(zhì)粒提取的DNA樣本，樣本經(jīng)測(cè)序證實(shí)為CYP2C9*3野生型、CYP2C19*2野生型、CYP2C19*3野生型，用TE緩沖液稀釋約至104copies/ul，按每管20 μ I分裝，-20 ±5 °C保存。
[0072]在確定無(wú)任何外源性污染的條件下，用人細(xì)胞色素酶P450 (CYP)基因多態(tài)性基因芯片法檢測(cè)試劑盒，以野生型質(zhì)控品為樣本，在適用的儀器上，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。檢測(cè)結(jié)果顯示為CYP2C9*3野生型、CYP2C19*2野生型、CYP2C19*3野生型。
[0073]5、突變型質(zhì)控品的制備
[0074]為人工構(gòu)建的質(zhì)粒提取的DNA樣本，樣本經(jīng)測(cè)序證實(shí)為CYP2C9*3突變型、CYP2C19*2突變型、CYP2C19*3突變型，用TE緩沖液稀釋約至104copies/ul,按每管20 μ I分裝，-20 ±5 °C保存。
[0075]在確定無(wú)任何外源性污染的條件下，用人細(xì)胞色素酶P450(CYP450)基因多態(tài)性基因芯片法檢測(cè)試劑盒，以突變型質(zhì)控品為樣本，在適用的儀器上，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。檢測(cè)結(jié)果顯示為CYP2C9*3突變型、CYP2C19*2突變型、CYP2C19*3突變型。
[0076]6、PCR 反應(yīng)液
[0077]將配制好的PCR反應(yīng)液(購(gòu)自天根生物)結(jié)合質(zhì)檢合格的人細(xì)胞色素酶P450 (CYP)基因多態(tài)性基因芯片法檢測(cè)試劑盒的其它組分，以企業(yè)工作參考品中最低檢出量參考品為樣本，在適用的儀器上，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。檢測(cè)結(jié)果表明:最低檢出量參考品檢測(cè)能區(qū)分相應(yīng)的基因型。
[0078]7、酶系的配制
[0079]配制好的酶系(購(gòu)自天根生物)結(jié)合PCR反應(yīng)液及質(zhì)檢合格的人細(xì)胞色素酶P450 (CYP)基因多態(tài)性基因芯片法檢測(cè)試劑盒的其它組分，以企業(yè)工作參考品中最低檢出量參考品為樣本，在適用的儀器上，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。檢測(cè)結(jié)果表明:最低檢出量參考品檢測(cè)能區(qū)分相應(yīng)的基因型。[0080]8、雜交試劑的配制
[0081]雜交試劑由雜交液、洗滌母液A、洗滌母液B組成。
[0082]雜交液:成分為8 X SSC,0.2%SDS和4%甲酰胺。
[0083]洗滌母液A: 10%SDS。
[0084]洗滌母液B:20XSSC。
[0085]將雜交液、洗滌母液A、洗滌母液B配制成工作液后，結(jié)合質(zhì)檢合格的人細(xì)胞色素酶P450(CYP)基因多態(tài)性基因芯片法檢測(cè)試劑盒的其它組分，以企業(yè)工作參考品中最低檢出量參考品為樣本，在適用的儀器上，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。檢測(cè)結(jié)果表明:最低檢 出量參考品檢測(cè)能區(qū)分相應(yīng)的基因型。
[0086]9、基因芯片制備
[0087]按設(shè)計(jì)好的分隔膜貼在醛基片上，然后按規(guī)定的陣列點(diǎn)上探針，經(jīng)過(guò)固定后裝入芯片盒中完成基因芯片的制備。
[0088]將制備好的基因芯片結(jié)合質(zhì)檢合格的人細(xì)胞色素酶P450 (CYP)基因多態(tài)性基因芯片法檢測(cè)試劑盒的其它組分，以企業(yè)工作參考品中最低檢出量參考品為樣本，在適用的儀器上，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。檢測(cè)結(jié)果表明:最低檢出量參考品檢測(cè)能區(qū)分相應(yīng)的基因型。
[0089]10、試劑盒重復(fù)性試驗(yàn)
[0090]分別用野生型企業(yè)參考品和突變型企業(yè)參考品重復(fù)檢測(cè)5次，用信號(hào)值計(jì)算變異系數(shù)(CV)均不大于20%。
[0091]11、試劑盒保存后敏感性試驗(yàn)
[0092]試劑盒到達(dá)效期后一個(gè)月，用企業(yè)靈敏度參考品檢測(cè)，靈敏度符合產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)要求。
[0093]實(shí)施例2人細(xì)胞色素酶P450基因多態(tài)性基因芯片法檢測(cè)試劑盒的組裝
[0094]本發(fā)明的試劑盒由以下部分組成:基因芯片，PCR反應(yīng)液，酶混合物(Emix)，野生型質(zhì)控品，突變型質(zhì)控品，陰性對(duì)照，雜交液，標(biāo)記液，洗滌母液A，洗滌母液B，洗滌母液C，顯色液A，顯色液B。
[0095]上述試劑盒各部分的組分與配比如下:
[0096]基因芯片:連接有CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3基因特異檢測(cè)探針和質(zhì)控探
針的醛基芯片。
[0097]PCR 反應(yīng)液:KC1，Tris-HCl 緩沖液，MgCl2, NTP, CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3基因特異引物對(duì)的混合液
[0098]酶混合物(Emix):Taq 酶
[0099]野生型質(zhì)控品:含CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3野生型基因的重組DNA片段
[0100]突變型質(zhì)控品:含CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3突變型基因的重組DNA片段
[0101]陰性對(duì)照:TE緩沖液
[0102]雜交液:8XSSC，0.2%SDS，甲酰胺
[0103]標(biāo)記液:辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素復(fù)合物
[0104]洗滌母液A:10%SDS
[0105]洗滌母液B:20 X SSC
[0106]洗滌母液C:磷酸鹽吐溫緩沖液[0107]顯色液A:魯米諾溶液
[0108]顯色液B:過(guò)氧化氫水溶液
[0109]該試劑盒，上述組分的量為:PCR反應(yīng)液:450 μ I ;酶混合物Taq酶6 μ I野生型質(zhì)控品:20μ I ;突變型質(zhì)控品:20μ I ;陰性對(duì)照:20μ I ;雜交液:60 μ I ;標(biāo)記液:120 μ I ;洗漆母液A:5ml ;洗漆母液B:6.5ml ;洗漆母液C:6.5ml ；PBST:5ml ;顯色液A:120 μ I ;顯色液 B:120 μ I。
[0110]實(shí)施例3人細(xì)胞色素酶Ρ450基因多態(tài)性基因芯片法檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)程序
[0111]3.1測(cè)定步驟
[0112]3.1.1核酸提取
[0113]1.按照血液基因組DNA提取試劑盒使用說(shuō)明書(shū)提取和純化DNA，進(jìn)行樣本基因組DNA提取時(shí)，尤其是大樣本量提取時(shí)，應(yīng)采用必要的標(biāo)記方法，避免試劑漏加。
[0114]2.DNA的濃度應(yīng)達(dá)到10-60ng/ μ 1，Α260/Α280比值在1.5~2.0之間，如果DNA必須稀釋?zhuān)褂忙宝?.6的TE緩沖液作為稀釋液，樣品DNA提取后一 20°C冰箱保存或直接進(jìn)入下一步。
[0115]3.-20°C冷藏的DNA樣品使用前置于室溫待融后混勻，且反復(fù)凍融不超過(guò)5次。
[0116]3.1.2 PCR 反 應(yīng)
[0117]1.取出PCR反應(yīng)液放置室溫待凍融后，漩渦振蕩混勻片刻，離心，放置在冰上；
[0118]2.取0.2ml的PCR反應(yīng)管，每管加入19.5ul PCR反應(yīng)液，做好標(biāo)記、編號(hào)；
[0119]3.加入5 μ I核酸模板，0.5ul酶混合物(Emix)，蓋緊離心管蓋，混勻；
[0120]4.質(zhì)控品使用:取PCR反應(yīng)液分別加入5μ I的野生型質(zhì)控品、突變型質(zhì)控品，
0.5ul酶混合物(Emix)，做好標(biāo)記后蓋緊離心管蓋，混勻；
[0121]5.陰性對(duì)照-M PCR反應(yīng)液加入5 μ I的TE緩沖液，再加0.5ul酶混合物(Emix)，做好標(biāo)記后蓋緊離心管蓋，混勻；
[0122]6.離心:6000rpm，離心片刻。
[0123]7.擴(kuò)增:放入基因擴(kuò)增儀，按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。
[0124]預(yù)變性:95°C,15min
[0125]
變性:94V, 30s 、
退火:60°C，Imin >擴(kuò)增35次循環(huán)
延伸:72O, ,Os.[0126]延伸:72°C，5min
[0127]保持:4°C，——
[0128]擴(kuò)增完成后立即進(jìn)行雜交反應(yīng)或者4°C暫時(shí)保存。
[0129]3.1.3芯片雜交
[0130]1.將試劑盒中的雜交液、洗滌母液A、洗滌母液B置于45°C水浴中，至其中析出的晶體或沉淀全部溶解，搖勻。
[0131]2.取4ml洗滌母液A加純水至200ml作為芯片預(yù)洗液，盛于250ml燒杯中，取另一 250ml燒杯盛裝純化水；取出基因芯片，先在芯片預(yù)洗液中漂洗30s后，再在純化水中漂洗30s。甩去芯片表面的純化水，于室溫晾干備用。
[0132]3.將PCR產(chǎn)物置95°C中熱變性5min后，立即置于冰水浴中5min，以形成單鏈便于雜交反應(yīng)(注意:熱變性過(guò)程中將反應(yīng)管封好，以免液體蒸發(fā))。
[0133]4.取變性的擴(kuò)增產(chǎn)物4 μ I，與4 μ I雜交液充分混勻(共8 μ I )，配制雜交混合液；立即吸取全部雜交混合液加入芯片反應(yīng)區(qū)中，使其分布均勻(以雜交混合液覆蓋雜交反應(yīng)區(qū)且不溢出為準(zhǔn))。
[0134]5.將芯片平置于濕盒或雜交盒中，于45°C水浴中雜交I小時(shí)。
[0135]注意:雜交反應(yīng)時(shí)應(yīng)防止冷凝水滴落在芯片上；移動(dòng)雜交盒時(shí)應(yīng)充分注意，以防各反應(yīng)區(qū)的反應(yīng)液交叉污染。
[0136]6.在雜交反應(yīng)過(guò)程中，按下述配方配制洗滌液1、I1、II1、IV，將洗滌液1、11、111、IV分別盛于三個(gè)250ml燒杯中。
[0137]洗滌液1:4ml洗滌母液A、IOml洗滌母液B，加蒸餾水稀釋至200ml ；
[0138]洗滌液II:2ml洗滌母液B加蒸餾水稀釋至200ml ；
[0139]洗滌液III: Iml洗滌母液B加蒸餾水稀釋至200ml ；
[0140]洗滌液IV:5ml洗滌母液C加超純水稀釋至100ml ；
[0141]7.雜交反應(yīng)結(jié)束后，將雜交反應(yīng)區(qū)中的雜交混合液吸出；芯片依次置于洗滌液
1、I1、III中各漂洗30s，其間不斷攪動(dòng)。取出芯片，甩去殘留在芯片上的液體，室溫避光晾干。注意:洗滌過(guò)程應(yīng)連續(xù)進(jìn)行，避免在洗滌過(guò)程中芯片干燥。
[0142]8.在芯片的每個(gè)雜交區(qū)加入標(biāo)記液10μ 1，37°C溫育25min，取出后用洗滌液IV清洗3次，每次20s，輕輕甩去芯片上的洗液，再用超純水清洗3次后置于室溫晾干；
[0143]9.取130 μ I顯色液A和130 μ I顯色液B混勻后，在芯片的每個(gè)雜交區(qū)加入混合液 25 μ I。
[0144]10.芯片掃描
[0145]3.2結(jié)果分析
[0146]芯片掃描結(jié)束后進(jìn)行數(shù)據(jù)化處理并導(dǎo)出、保存掃描數(shù)據(jù)文件，應(yīng)用結(jié)果分析判讀軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行自動(dòng)判讀分析。
[0147]3.2.1質(zhì)控結(jié)果有效性
[0148]I)引物互補(bǔ)序列探針信號(hào)值> 10 ；
[0149]2)基片質(zhì)控信號(hào)值≥10 ；
[0150]3)內(nèi)陰性對(duì)照信號(hào)值〈10 ；
[0151]4)野生型質(zhì)控品檢測(cè)結(jié)果為CYP2C9*3野生型(CYP2C9*1/*1)、CYP2C19野生型(CYP2C19*1/*1)；
[0152]5)野生型質(zhì)控品檢測(cè)結(jié)果為CYP2C9*3突變型(CYP2C9*3/*3)、CYP2C19*2突變型(CYP2C19*2/*2), CYP2C19*3 突變型(CYP2Cl9*3/*3)；
[0153]6)陰性對(duì)照檢測(cè)結(jié)果為陰性:所有檢測(cè)的野生型探針和突變型探針的信號(hào)值<100 ；
[0154]7)野生型、突變型檢測(cè)探針的信號(hào)值均〈100時(shí)，無(wú)目的基因擴(kuò)增，需重新檢測(cè)。
[0155]3.2.2 CYP2C9*3 基因型判定:
[0156]I)基因芯片上CYP2C9*3野生型、突變型檢測(cè)探針的均值之比≥1.0，實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定為野生型基因(CYP2C9*1/*1)；
[0157]2)基因芯片上CYP2C9*3野生型、突變型檢測(cè)探針的均值之比為0.4-1.0,實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定為雜合型基因(CYP2C9*l/*3)；
[0158]3)基因芯片上CYP2C9*3野生型、突變型檢測(cè)探針的均值之比≤ 0.4，實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定為突變型基因(CYP2C9*3/*3) 。
[0159]3.2.3 CYP 2C19*2 基因型判定:
[0160]I)基因芯片上CYP 2C19*2野生型、突變型檢測(cè)探針的均值之比≥1.0，實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定為野生型基因(CYP2C19*1/*1)；
[0161]2)基因芯片上CYP 2C19*2野生型、突變型檢測(cè)探針的均值之比為0.2-1.0，實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定為雜合型基因(CYP2C19*l/*2)；
[0162]3)基因芯片上CYP 2C19*2野生型、突變型檢測(cè)探針的均值之比≤0.2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定為突變型基因(CYP2C19*2/*2)；
[0163]3.2.4 CYP 2C19*3 基因型判定:
[0164]I)基因芯片上CYP 2C19*3野生型、突變型檢測(cè)探針的均值之比≥1.0，實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定為野生型基因(CYP2C19*1/*1)；
[0165]2)基因芯片上CYP 2C19*3野生型、突變型檢測(cè)探針的均值之比為0.2-1.0，實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定為雜合型基因(CYP2C19*l/*3)；
[0166]3)基因芯片上CYP 2C19*3野生型、突變型檢測(cè)探針的均值之比≤ 0.2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定為突變型基因(CYP2C19*3/*3)。
[0167]實(shí)施例3人細(xì)胞色素酶P450基因多態(tài)性基因芯片法檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用
[0168]用本發(fā)明制備的人細(xì)胞色素酶P450基因多態(tài)性基因芯片法檢測(cè)試劑盒對(duì)送檢血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，圖1-3為80個(gè)血清樣本的檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)本批樣品中存在一定的檢出率。其中CYP2C19*3野生型樣品為28份，CYP2C19*3雜合型樣品為26份，CYP2C19*3突變型樣品為26份；且在本批樣本中CYP2C9*3全部都是野生型。隨機(jī)抽取每個(gè)基因型內(nèi)的20個(gè)樣本進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果證實(shí)本發(fā)明方法檢測(cè)正確率為100%?？梢?jiàn)，本發(fā)明制備的人細(xì)胞色素酶P450基因多態(tài)性基因芯片法檢測(cè)試劑盒可用于對(duì)血清樣品的檢測(cè)，這將為基因多態(tài)性的快速檢測(cè)提供有力的數(shù)據(jù)參考。
[0169]序列表
<ilO>北京普利耐特生物科技有限公司
<120> 一種人細(xì)胞色素酶P450基因多態(tài)性檢測(cè)i式剤盒
<130> PN1306346-01
<160> 13
<170> PatcntIn version 3.5
<210> I^11> 30<212〉 DNA<213>人工序列
<400>I
actcatcacg cagctcattt tttttttttt30
<2i0>2`<211>30
<212> DNA
<213>人工序列
<400>2`
acieatcgitg cagctcattt tttttttttt30
<210> 3
<211〉 30
<212> DNA
<213>人工序列
^400> 3
gatggccagc gtggacaatt ttttt/ttttt30
<210>I<211> 30
[0170]
【權(quán)利要求】
1.一種基因芯片，其特征在于，該芯片上連接有CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3基因特異檢測(cè)探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于，芯片上的CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3基因特異檢測(cè)探針?lè)謩e是: CYP2C9*3 野生型 ACTCATCACGCAGCTCATTTTTTTTTTTTT ； CYP2C9*3 突變型 ACTCATCATGCAGCTCATTTTTTTTTTTTT ； CYP2C19*2 野生型 GATGGCCAGCGTGGACAATTTTTTTTTTTT ； CYP2C19*2 突變型 GATGGCCATCGTGGACAATTTTTTTTTTTT ； CYP2C19*3 野生型 CAACCCCCACGTGTGCCGTTTTTTTTTTT ； CYP2C19*3 突變型 ACCCCCACCACGTGTGCCGTTTTTTTTTTT。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于，該芯片上還連接有質(zhì)控探針。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因芯片，其特征在于，芯片上的質(zhì)控探針是:`rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp
5.一種人細(xì)胞色素酶P450基因多態(tài)性基因芯片法檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求I所述的基因芯片。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因芯片法檢測(cè)試劑盒，其特征在于，其還包括PCR反應(yīng)液，酶混合物，野生型質(zhì)控品，突變型質(zhì)控品，陰性對(duì)照，雜交液，標(biāo)記液，洗滌母液A，洗滌母液B,洗滌母液C，顯色液A，顯色液B的其中一種或多種。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基因芯片法檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)液是KCl, Tris-HCl 緩沖液，MgCl2, NTP, CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3 基因特異引物對(duì)的混合液；所述酶混合物是Taq酶；所述野生型質(zhì)控品含CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3野生型基因的重組DNA片段；所述突變型質(zhì)控品含CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3突變型基因的重組DNA片段；所述陰性對(duì)照是TE緩沖液；所述雜交液是8XSSC，0.2%SDS，甲酰胺的混合液；所述標(biāo)記液是辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素復(fù)合物；所述洗滌母液A是10%SDS ；所述洗滌母液B是20 X SSC ;所述洗滌母液C是磷酸鹽吐溫緩沖液；所述顯色液A是魯米諾溶液；所述顯色液B是過(guò)氧化氫水溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的基因芯片法檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)液中的CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3 基因特異引物對(duì)是: CYP2C9*3 上游引物 ATCGCATTCATGCGTCTTCA ； CYP2C9*3 下游弓丨物 ATCCCCATGGCAAACTCTTG ； CYP2C19*2 上游引物 GACTGAATATAAACTTGTGG ； CYP2C19*2 下游引物 CTGTATCAAAGAATGGTCCT ； CYP2C19*3 上游引物 GACTGTGTTTCTCCCTTCT ； CYP2C19*3 下游引物 TGGCAAATACACAAAGAAAG。
9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的基因芯片法檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3基因多態(tài)性上的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，包括以下步驟: O核酸提取 DNA的濃度應(yīng)達(dá)到10-60ng/ μ 1，Α260/Α280比值在1.5~2.0之間，如果DNA必須稀釋?zhuān)褂肞H7.6的TE緩沖液作為稀釋液； 2)PCR反應(yīng) 分別以野生型質(zhì)控品或突變型質(zhì)控品為模板，加入PCR反應(yīng)液和酶混合物進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增，擴(kuò)增后進(jìn)行雜交反應(yīng)； 3)芯片雜交 (1)預(yù)處理芯片:首先在洗滌母液A中漂洗30s，再在純化水中漂洗30s，甩去芯片表面的純化水，于室溫晾干備用； (2)配置雜交液:將PCR產(chǎn)物置95°C中熱變性5min后，立即置于冰水浴中5min后，取變性的擴(kuò)增產(chǎn)物4 μ 1，與4 μ I雜交液充分混勻； (3)雜交反應(yīng):立即吸取全部雜交混合液加入芯片反應(yīng)區(qū)中，使其分布均勻，然后將芯片平置于濕盒或雜交盒中，于45°C水浴中雜交I小時(shí)； (4)配置洗液:在雜交反應(yīng)過(guò)程中，按下述配方配制洗滌液1、I1、II1、IV，將洗滌液1、I1、II1、IV分別盛于三個(gè)250ml燒杯中； 洗滌液1:4ml洗滌母液A、IOml洗滌母液B，加蒸餾水稀釋至200ml ； 洗滌液II:2ml洗滌母液B加蒸餾水稀釋至200ml ； 洗滌液III =Iml洗滌母液B加蒸餾水稀釋至200ml ； 洗滌液IV:5ml洗滌母液C加`超純水稀釋至100ml ； (5)清洗芯片:雜交反應(yīng)結(jié)束后，將雜交反應(yīng)區(qū)中的雜交混合液吸出；芯片依次置于洗滌液1、I1、111中各漂洗30s，其間不斷攪動(dòng)。取出芯片，甩去殘留在芯片上的液體，室溫避光晾干； (6)標(biāo)記顯色:在芯片的每個(gè)雜交區(qū)加入標(biāo)記液IOy1，37°C溫育25min，取出后用洗滌液IV清洗3次，每次20s，輕輕甩去芯片上的洗液，再用超純水清洗3次后置于室溫晾干后在芯片的每個(gè)雜交區(qū)加入顯色混合液25 μ I ; (7)芯片掃描。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103509858SQ201310317804
【公開(kāi)日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2013年7月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月26日
【發(fā)明者】王巍, 劉琪琦, 林曉云, 李洪強(qiáng), 李洪生 申請(qǐng)人:北京普利耐特生物科技有限公司, 中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所