改良的grg23 epsp合酶：組合物和使用方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了賦予細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、組織和種子除草劑抗性或耐性的組合物和方法。組合物包括編碼除草劑抗性或耐性多肽的多核苷酸、包含那些多核苷酸的載體以及包含所述載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的核苷酸序列可以在DNA構(gòu)建物或表達(dá)盒中使用，用于在生物體——包括微生物和植物——中轉(zhuǎn)化和表達(dá)。組合物也包括轉(zhuǎn)化的細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、組織和種子。具體而言，提供了編碼草甘膦抗性或耐性多肽的分離的多核苷酸。此外，也包括與多核苷酸對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。尤其是，本發(fā)明提供了分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸包含編碼SEQ?ID?NO:9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35中示出的氨基酸序列的核苷酸序列，或SEQ?ID?NO:6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34中列出的核苷酸序列。
【專利說(shuō)明】改良的GRG23 EPSP合酶:組合物和使用方法
[0001]本申請(qǐng)為分案申請(qǐng)，原申請(qǐng)的申請(qǐng)日為2007年11月20日，申請(qǐng)?zhí)枮?00780049630.6 (PCT/US2007/085164)，發(fā)明名稱為“改良的GRG23EPSP合酶:組合物和使
用方法”。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)，特別是涉及新型EPSP合酶多肽，所述合酶多肽賦予增加的對(duì)除草劑草甘膦的抗性和耐性。
【背景技術(shù)】
[0003]N-膦酰甲基甘氨酸，一般稱為草甘膦，是重要的農(nóng)學(xué)化學(xué)制品。草甘膦抑制將磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和3-磷酸莽草酸(S3P)轉(zhuǎn)化為5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸的酶。這種酶(5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶，本文稱為“EPSP合酶”或“EPSPS”)的抑制通過(guò)關(guān)閉莽草酸途徑，從而抑制芳香族氨基酸的生物合成來(lái)殺死植物細(xì)胞。
[0004]由于草甘膦類除草劑抑制芳香族氨基酸的生物合成，所以它們不僅殺死植物細(xì)胞，而且也對(duì)細(xì)菌細(xì)胞具有毒性。草甘膦抑制多種細(xì)菌EPSP合酶，因而對(duì)這些細(xì)菌具有毒性。然而，某些細(xì)菌EPSP合酶對(duì)草甘膦具有高的耐性。
[0005]可以通過(guò)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞以表達(dá)抗草甘膦的細(xì)菌EPSP合酶來(lái)產(chǎn)生抗草甘膦毒性的植物細(xì)胞。值得注意，來(lái)自根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株CP4的細(xì)菌基因已經(jīng)被用于在植物中表達(dá)之后賦予植物細(xì)胞除草劑抗性。來(lái)自鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)菌株CT7的突變EPSP合酶賦予細(xì)菌細(xì)胞草甘膦抗性，并且賦予植物細(xì)胞草甘膦抗性(美國(guó)專利第4，535，060、4，769，061和5，094，945號(hào))。
[0006]美國(guó)專利第6，040，497號(hào)報(bào)道了突變玉米EPSP合酶，其在102位具有蘇氨酸到異亮氨酸的置換并且在106位具有脯氨酸到絲氨酸的置換(“TIPS”突變)。這樣的改變賦予了玉米酶草甘膦抗性。來(lái)自鼠傷寒沙門氏菌菌株CT7的突變EPSP合酶賦予細(xì)菌細(xì)胞的草甘膦抗性，并且據(jù)報(bào)道賦予植物細(xì)胞草甘膦抗性(美國(guó)專利第4，535，060,4, 769，061和5，094，945 號(hào))。He 等，((2001) Biochim et Biophysica Actal568:1-6)已經(jīng)通過(guò)在大腸桿菌(E.coli)和鼠傷寒沙門氏菌EPSP合酶基因之間進(jìn)行誘變和重組而開(kāi)發(fā)了具有增加的草甘膦耐性的EPSP合酶，并且提出在位置42 (T42M)和位置230 (Q230K)的突變可能是造成觀測(cè)到的抗性的原因。后續(xù)工作(He 等，(2003) Biosc1.Biotech.Biochem.67:1405-1409)顯示，T42M突變(蘇氨酸到甲硫氨酸)足以提高大腸桿菌酶和鼠傷寒沙門氏菌酶兩者的耐性。由于除草劑抗性植物提供的許多優(yōu)勢(shì)，除草劑抗性基因改善的抗草甘膦活性是期望的。
[0007]誘變的可選方法是“變換誘變(permutational mutagenesis)”方法,所述方法在2006年6月13日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)第60/813,095號(hào)中被描述。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]提供了賦予抗性或耐性的組合物和方法。組合物包括抗草甘膦除草劑的EPSP合酶，以及編碼這種酶的核酸分子，包含那些核酸分子的載體和包含這些載體的宿主細(xì)胞。組合物包括編碼除草劑抗性多肽的核酸分子，其包括編碼包含SEQ ID N0:9、ll、13、15、17、
19、21、23、25、27、29、31、33 或 35 的多肽的那些核酸分子，以及 SEQ ID NO:6、8、10、12、14、
16、18、20、22、24、26、28、30、32或34的多核苷酸序列。編碼序列可以在DNA構(gòu)建物或表達(dá)盒中使用，用于在生物體一包括微生物和植物一中轉(zhuǎn)化和表達(dá)。組合物還包括轉(zhuǎn)化的細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、組織和種子，它們通過(guò)將本發(fā)明的組合物引入到生物體的基因組中而具有草甘膦抗性。在所述生物體是植物時(shí)，序列的引入允許含草甘膦的除草劑應(yīng)用到植物以選擇性地殺死對(duì)草甘膦敏感的雜草或其它未轉(zhuǎn)化的植物，但是不殺死轉(zhuǎn)化的生物體。該序列可以另外用作標(biāo)記，用于選擇在草甘膦條件下生長(zhǎng)的植物細(xì)胞。
[0009]另外提供了鑒定具有抗草甘膦活性的EPSP合酶的方法。所述方法包括在本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域存在的基礎(chǔ)上鑒定對(duì)草甘膦具有抗性的另外的EPSP合酶序列。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1 顯示 GRG23(acel) ( “M5”，SEQ ID NO: 10)在 37。。0 至 25 小時(shí)相比于野生型GRG23 ( “WTGRG23”，SEQ ID NO: 2)的酶促活性。
[0011]圖2示出了 GRG23和幾種變體對(duì)草甘膦的抗性，表示為抑制常數(shù)，或I。
[0012]圖3示出了 GRG23和GRG23變體在37°C的半衰期。
【具體實(shí)施方式】
[0013]現(xiàn)在本發(fā)明將在下文中參考附圖更充分地進(jìn)行描述，其中，本發(fā)明的一些但不是全部實(shí)施方式被示出。實(shí)際上，這些發(fā)明可以以許多不同的形式加以體現(xiàn)并且不應(yīng)該被解釋為限于本文提出的實(shí)施方`式；相反，這些實(shí)施方式被提供以使本公開(kāi)滿足可適用的法律要求。在全文中同樣的數(shù)字是指同樣的要素。
[0014]本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員在了解了前述描述和相關(guān)附圖中給出的教導(dǎo)的益處之后將會(huì)想到本文提出的發(fā)明的許多修改和其它實(shí)施方式。因此，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于公開(kāi)的【具體實(shí)施方式】并且修改和其它實(shí)施方式擬被包括在所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。雖然本文使用了具體術(shù)語(yǔ)，但它們只以一般性和描述性的意義被使用，并不用于限制的目的。
[0015]本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)生物體、尤其是植物和植物細(xì)胞中的除草劑抗性的組合物和方法。所述方法包括用編碼本發(fā)明的抗草甘膦基因的核苷酸序列轉(zhuǎn)化生物體。本發(fā)明的核苷酸序列可用于制備對(duì)除草劑草甘膦顯示出增加的抗性的植物。因而，本發(fā)明的“草甘膦抗性”或“草甘膦耐性”基因意指 SEQ ID N0:6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34中列出的核苷酸序列及其片段和變體，所述片段和變體編碼草甘膦抗性或耐性多肽。同樣，本發(fā)明的“草甘膦抗性”或“草甘膦耐性”多肽是具有SEQ ID N0:9、ll、13、15、17、19、
21、23、25、27、29、31、33或35列出的氨基酸序列的多肽及其片段和變體，所述片段和變體賦予宿主細(xì)胞草甘膦抗性或耐性。
[0016]A.分離的多核苷酸及其變體和片段
[0017]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明包括分離的、重組的或純化的多核苷酸?！胺蛛x的”“或“純化的”多核苷酸或多肽、或其生物學(xué)活性部分在通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí)基本上不含其它的細(xì)胞材料或培養(yǎng)基，或在化學(xué)合成時(shí)基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)制品?！吧飳W(xué)活性的”意指具有天然多肽的所需生物學(xué)活性，也就是說(shuō)，保持抗除草劑活性?！胺蛛x的”多核苷酸可以不含這樣的序列(例如，蛋白質(zhì)編碼序列)，所述序列天然地位于生物體的基因組DNA中的核酸側(cè)翼(即，位于所述核酸的5’和3’端的序列)，所述多核苷酸來(lái)源于所述生物體。對(duì)于本發(fā)明的目的，“分離的”當(dāng)用于指多核苷酸時(shí)不包括分離的染色體。例如，在各種實(shí)施方式中，分離的草甘膦抗性編碼多核苷酸可以包含小于大約5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，其天然地位于細(xì)胞的基因組DNA中的多核苷酸的側(cè)翼，所述多核苷酸來(lái)源于所述細(xì)胞。[0018]本發(fā)明的多核苷酸包括編碼包含SEQ ID N0:9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35的草甘膦抗性多肽的那些多核苷酸，以及SEQ ID NO: 6、8、10、12、14、16、18、
20、22、24、26、28、30、32或34的多核苷酸序列。
[0019]“草甘膦”意指N-膦酰甲基甘氨酸的任何除草劑形式(包括其任何鹽)和導(dǎo)致草甘膦陰離子在植物中(in planta)產(chǎn)生的其它形式?！俺輨┛剐缘鞍住被蛴伞俺輨┛剐跃幋a核酸分子”的表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)包括這樣的蛋白質(zhì)，其賦予細(xì)胞比不表達(dá)所述蛋白質(zhì)的細(xì)胞耐受更高濃度的除草劑的能力，或賦予比不表達(dá)所述蛋白質(zhì)的細(xì)胞耐受某一濃度的除草劑更長(zhǎng)時(shí)間的能力。“草甘膦抗性蛋白”包括這樣的蛋白質(zhì)，其賦予細(xì)胞比不表達(dá)所述蛋白質(zhì)的細(xì)胞耐受更高濃度的草甘膦的能力，或者比不表達(dá)所述蛋白質(zhì)的細(xì)胞耐受某一濃度的草甘膦更長(zhǎng)一段時(shí)間的能力?！澳褪堋被颉澳托浴币庵复婊罨蛞圆蝗菀着c未處理細(xì)胞區(qū)別的方式進(jìn)行基本的細(xì)胞功能，例如蛋白質(zhì)合成和呼吸。
[0020]本發(fā)明進(jìn)一步考慮本文描述的多核苷酸的變體和片段。多核苷酸的“片段”可以編碼多肽的生物學(xué)活性部分，或其可以是采用本文其它地方公開(kāi)的方法可用作雜交探針或PCR引物的片段。取決于意圖的用途，多核苷酸——其是多核苷酸的片段——包括至少大約
15、20、50、 75、100、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、I100、I150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950個(gè)連續(xù)核苷酸，或可達(dá)存在于本文公開(kāi)的全長(zhǎng)多核苷酸的核苷酸數(shù)(例如包含SEQ ID NO:1的EPSP合酶多核苷酸)?！斑B續(xù)”核苷酸意指彼此緊鄰的核苷酸殘基。
[0021]本發(fā)明的多核苷酸片段一般將編碼保持全長(zhǎng)草甘膦抗性蛋白的生物學(xué)活性——即抗除草劑活性——的多肽片段。“保持抗除草劑活性”意指所述片段將具有本文公開(kāi)的如SEQ ID N0:2、3或5的全長(zhǎng)草甘膦抗性蛋白的至少大約30%，至少大約50%、至少大約70%、至少大約 80%、85%、90%、95%、100%、110%、125%、150%、175%、200%、250%、至少大約 300% 或以上的抗除草劑活性。測(cè)量抗除草劑活性的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利第4，535，060和5，188，642號(hào)，其每一個(gè)通過(guò)引用以其全部并入本文。
[0022]編碼本發(fā)明多肽的生物學(xué)活性部分的多核苷酸片段將編碼至少大約15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400個(gè)連續(xù)氨基酸，或可達(dá)存在于本發(fā)明的全長(zhǎng)多肽中的氨基酸的總數(shù)。
[0023]本發(fā)明也包括變體多核苷酸。多核苷酸的“變體”包括編碼本文公開(kāi)的多肽但由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而保守地不同的那些序列，以及足夠相同的那些序列。
[0024]術(shù)語(yǔ)“足夠相同的”意指采用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)，應(yīng)用比對(duì)程序之一，與參考序列相比具有至少大約60%或65%的序列同一性、大約70%或75%的序列同一性、大約80%或85%的序列同一性、大約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的多肽或多核
苷酸序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到這些值可以適當(dāng)調(diào)整以通過(guò)考慮密碼簡(jiǎn)并性、氨基酸相似性、閱讀框定位等來(lái)確定由兩個(gè)多核苷酸編碼的多肽的對(duì)應(yīng)同一性。
[0025]細(xì)菌基因很經(jīng)常具有多個(gè)靠近開(kāi)放閱讀框起點(diǎn)的甲硫氨酸起始密碼子。通常，在一個(gè)或多個(gè)這些起始密碼子的翻譯起始將導(dǎo)致功能蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。這些起始密碼子可以包括ATG密碼子。然而，細(xì)菌如芽孢桿菌(Bacillus sp.)也識(shí)別密碼子GTG作為起始密碼子，并且在GTG密碼子處起始翻譯的蛋白質(zhì)包含在第一個(gè)氨基酸處的甲硫氨酸。而且，經(jīng)常不能先驗(yàn)確定這些密碼子中的哪個(gè)在細(xì)菌中天然使用。因而，應(yīng)理解的是，可選的甲硫氨酸密碼子之一的使用可導(dǎo)致賦予除草劑抗性的變體產(chǎn)生。這些除草劑抗性蛋白被包括在本發(fā)明中并且可以在本發(fā)明的方法中使用。
[0026]可以應(yīng)用熟知的分子生物學(xué)技術(shù)，如下面概述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和雜交技術(shù)，鑒定天然發(fā)生的等位基因變體。變體多核苷酸也包括合成來(lái)源的多核苷酸，其通過(guò)例如采用定點(diǎn)誘變或其它誘變策略產(chǎn)生，但是仍然編碼具有期望的生物學(xué)活性的多肽。
[0027]技術(shù)人員將進(jìn)一步理解，可以通過(guò)進(jìn)一步突變本發(fā)明的多核苷酸從而導(dǎo)致所編碼的多肽的氨基酸序列的進(jìn)一步改變但不改變所述多肽的生物學(xué)活性來(lái)引入改變。因而，分離的變體多核苷酸可以通過(guò)引入一個(gè)或多個(gè)額外的核苷酸置換、添加或缺失到編碼本文公開(kāi)的EPSP合酶結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)多核苷酸中而產(chǎn)生，以使一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、添加或缺失被引入到所編碼的多肽中。進(jìn)一步的突變可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變或基因改組(gene shuffling)技術(shù)引入。這種變體多核苷酸也被本發(fā)明包括。
[0028]變體多核苷酸可以通過(guò)沿著全部或部分編碼序列隨機(jī)引入突變，如通過(guò)飽和突變來(lái)制備，并且可以篩選得到的突變體賦予抗除草劑活性的能力，以鑒定保持活性的突變體。
[0029]基因改組或有性PCR (sexual PCR)法(例如，Smith(1"4)Nature370:3M-325 ;美國(guó)專利第5,837,458,5,830`, 721,5,811,238和5，733，731號(hào)，其每一篇通過(guò)引用被并入本文)可以被用于進(jìn)一步修飾或增強(qiáng)具有本發(fā)明的EPSP合酶結(jié)構(gòu)域的多核苷酸和多肽(例如，賦予草甘膦抗性的多肽)?；蚋慕M包括幾種突變DNA的隨機(jī)斷裂，然后通過(guò)PCR將它們重裝配成全長(zhǎng)分子。各種基因改組法的例子包括但不限于，DNase處理后的裝配、交錯(cuò)延伸法(staggered extension process, STEP)和體外隨機(jī)引發(fā)重組(random priming invitro recombination)。在DNase介導(dǎo)的方法中，用DNaseI將從陽(yáng)性突變體庫(kù)分離的DNA區(qū)段切割成隨機(jī)片段并且在未添加引物的情況下進(jìn)行多輪PCR。當(dāng)PCR循環(huán)進(jìn)行時(shí)，隨機(jī)片段的長(zhǎng)度接近未切割的區(qū)段的長(zhǎng)度，導(dǎo)致在不同的克隆中的突變混合在一起并且在一些得到的序列中累積。多個(gè)循環(huán)的選擇和改組已經(jīng)導(dǎo)致幾種酶的功能增強(qiáng)(Stemmer(1994)Nature370:389-391 ;Stemmer (1994)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA91:10747-10751 ；Crameri等，(1996) Nat.Biotechnol.14: 315-319 ;Zhang 等，(1997) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA94:4504-4509 ;和 Crameri 等，(1997)Nat.Biotechnol.15:436-438)?？梢岳鐚?duì)編碼具有本發(fā)明的序列結(jié)構(gòu)域的多肽的多核苷酸進(jìn)行這類方法，以產(chǎn)生賦予草甘膦抗性的多肽。
[0030]應(yīng)用方法如PCR、雜交等，相應(yīng)除草劑抗性序列可以通過(guò)尋找本發(fā)明的EPSP合酶結(jié)構(gòu)域來(lái)鑒定。見(jiàn)，例如，Sambrook 和 Russell (2001)，Molecular Cloning: A LaboratoryManual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)和 Innis 等，(1990)PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Academic Press, NY)。
[0031]B.分離的蛋白質(zhì)及其變體和片段
[0032]除草劑抗性多肽也被包括在本發(fā)明之內(nèi)。基本上不含細(xì)胞材料(cellularmaterial)的除草劑抗性多肽包括具有小于大約30%、20%、10%或5% (按干重計(jì))的非除草劑抗性多肽(本文也稱為“污染蛋白質(zhì)”)的多肽制劑。在本發(fā)明中，“除草劑抗性蛋白”意指具有本發(fā)明的序列結(jié)構(gòu)域的EPSP合酶多肽。片段、生物活性部分、及其變體也被提供，并且可以被用于實(shí)踐本發(fā)明的方法。
[0033]“片段”或“生物活性部分”包括多肽片段，其含有編碼除草劑抗性蛋白的氨基酸序列的一部分并保持抗除草劑活性。除草劑抗性蛋白的生物學(xué)活性部分可以是多肽，所述多肽的長(zhǎng)度為例如10、25、50、100個(gè)或更多的氨基酸。這種生物學(xué)活性部分可以通過(guò)重組技術(shù)制備并且可以評(píng)價(jià)抗除草劑活性。
[0034]“變體”意指具有這樣的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或多肽，所述氨基酸序列與具有本發(fā)明的EPSP合酶結(jié)構(gòu)域的EPSP合酶多肽具有至少大約60%、65%、大約70%、75%、大約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到這些值可以被適當(dāng)調(diào)整以通過(guò)考慮密碼子簡(jiǎn)并性、氨基酸相似性、閱讀框定位等來(lái)確定由兩個(gè)多核苷酸編碼的多肽的對(duì)應(yīng)同一丨I"生。
[0035]例如，可以在一個(gè)或多個(gè)非必需氨基酸殘基處進(jìn)行保守氨基酸置換?！胺潜匦璧摹卑被釟埢强梢栽诙嚯牡囊吧托蛄兄屑右愿淖兌桓淖兩飳W(xué)活性的殘基，而“必需的”氨基酸殘基對(duì)于生物學(xué)活性是必需的?！氨Ｊ匕被嶂脫Q”是這樣的置換，其中氨基酸殘基用具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基置換。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族在本領(lǐng)域中已經(jīng)被定義。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、無(wú)荷電極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、3 -支 化側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。氨基酸置換可以在保持功能的非保守區(qū)進(jìn)行。一般而言，將不會(huì)對(duì)保守的氨基酸殘基或?qū)ξ挥诒Ｊ鼗蛑械陌被釟埢黄渲羞@類殘基對(duì)于多肽活性是必需的——進(jìn)行這樣的置換。然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會(huì)理解，功能變體可以在保守殘基中具有不重要的保守或非保守改變。
[0036]本發(fā)明的多肽或其變體或片段的抗體也被包括。產(chǎn)生抗體的方法在本領(lǐng)域是熟知的(參見(jiàn)，例如，Harlow 和 Lane (1988) Antibodies:ALaboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY;美國(guó)專利第 4，196，265 號(hào))。
[0037]C.多核苷酸構(gòu)建物
[0038]編碼本發(fā)明的EPSP合酶多肽的多核苷酸可以被修飾以獲得或增強(qiáng)在植物細(xì)胞中的表達(dá)。編碼本文鑒定的多肽的多核苷酸可以被提供于表達(dá)盒中，所述表達(dá)盒用于在目標(biāo)植物中表達(dá)?！爸参锉磉_(dá)盒”包括DNA構(gòu)建物——包括重組DNA構(gòu)建物，其能夠?qū)е露嗪塑账嵩谥参锛?xì)胞中的表達(dá)。所述盒可以包括以5’-3’的轉(zhuǎn)錄方向、可操作地連接到一個(gè)或多個(gè)感興趣多核苷酸的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(即，啟動(dòng)子，特別是異源啟動(dòng)子)、和/或植物中發(fā)揮功能的翻譯和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)(即，終止區(qū))。所述盒可以額外包含至少一個(gè)將被引入到生物體的額外多核苷酸，如選擇性標(biāo)記基因?？蛇x地，額外的多核苷酸(一個(gè)或多個(gè))可以被提供在多個(gè)表達(dá)盒上。這種表達(dá)盒被提供有多個(gè)限制性位點(diǎn)，用于插入所述多核苷酸(一個(gè)或多個(gè))，使之受調(diào)節(jié)區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。
[0039]“異源的”一般是指這樣的多核苷酸或多肽，其對(duì)于細(xì)胞而言不是內(nèi)源的或?qū)τ谒嬖诘奶烊换蚪M中的位置而言不是內(nèi)源的，并且其通過(guò)感染、轉(zhuǎn)染、顯微注射、電穿孔、顯微投影等被加入到細(xì)胞中?！翱刹僮鞯剡B接”意指兩個(gè)多核苷酸之間的功能連接。例如，當(dāng)啟動(dòng)子可操作地連接到DNA序列時(shí)，該啟動(dòng)子序列起始并且調(diào)節(jié)所述DNA序列的轉(zhuǎn)錄。已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，可操作地連接的多核苷酸可以相鄰或可以不相鄰，并且在用于指兩個(gè)多肽編碼區(qū)的接合時(shí)，所述多肽在同一閱讀框中表達(dá)。
[0040]啟動(dòng)子可以是在選擇的植物細(xì)胞、植物部分或植物中顯示出轉(zhuǎn)錄活性的任何多核苷酸序列。啟動(dòng)子對(duì)于植物宿主和/或?qū)τ诒景l(fā)明的DNA序列可以是天然的或類似的，或者外源的或異源的。在啟動(dòng)子對(duì)于植物宿主是“內(nèi)源的”或“類似的”時(shí)，意指該啟動(dòng)子在其被引入的天然植物中被找到。當(dāng)啟動(dòng)子對(duì)于本發(fā)明的DNA序列是“外源的”或“異源的”時(shí)，意指該啟動(dòng)子對(duì)于本發(fā)明的可操作連接的DNA序列而言不是天然的或天然發(fā)生的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型或組成型。它可以是天然發(fā)生的，可以由各種天然發(fā)生的啟動(dòng)子部分組成，或可以是部分或全部合成的。啟動(dòng)子設(shè)計(jì)指導(dǎo)由啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)的研究提供，如Harley和Reynolds (1987)Nucleic Acids Res.15:2343-2361中的指導(dǎo)。同樣，啟動(dòng)子相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始的位置可以被優(yōu)化。見(jiàn)，例如，Roberts 等，(1979)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 76:760-764。許多用于植物的合適啟動(dòng)子在本領(lǐng)域中是熟知的。
[0041]例如，適合用于植物的組成型啟動(dòng)子包括:來(lái)自植物病毒的啟動(dòng)子，如花生褪綠條死病花椰菜花葉病毒組(peanut chlorotic streak caulimovirus (PClSV))啟動(dòng)子(美國(guó)專利第5,850,019號(hào));來(lái)自花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動(dòng)子(Odell等，(1985)Nature313:810-812);小球`藻病毒甲基轉(zhuǎn)移酶基因啟動(dòng)子(美國(guó)專利第5，563，328號(hào))和來(lái)自玄參花葉病毒(FMV)的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子(美國(guó)專利第5，378，619號(hào))；來(lái)自基因如水稻肌動(dòng)蛋白(McElroy 等,(1990)Plant Cell2:163-171 )、泛素(Christensen 等,(1989)Plant Mol.Biol.12:619-632 和 Christensen 等，(1992)Plant Mol.Biol.18:675-689)、pEMU(Last 等，(1991)Theor.Appl.Genet.81:58h588)、MAS(Velten 等，(1984)EMB0J.3:2723-2730)、玉米 H3 組蛋白(L印etit 等，(1992)Mol.Gen.Genet.231:276-285 和Atanassova 等，(1992)Plant J.2 (3): 291-300)、油菜(Brassica napus) ALS3 (PCT 申請(qǐng)W097/41228)的啟動(dòng)子；以及各種農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)基因的啟動(dòng)子(見(jiàn)，美國(guó)專利第 4，771，002,5, 102，796,5, 182，200 和 5，428，147 號(hào))。
[0042]適合用于植物的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括:來(lái)自對(duì)銅作出反應(yīng)的ACEl系統(tǒng)的啟動(dòng)子(Mett等，(1993)PNAS90:4567-4571);對(duì)苯磺酰胺除草劑安全劑作出反應(yīng)的玉米In2基因的啟動(dòng)子(Hershey 等，(1991)Mol.Gen.Genetics227:229-237 和 Gatz 等，(1994)Mol.Gen.Genetics243:32-38);和來(lái)自 TnlO 的 Tet 阻抑子的啟動(dòng)子(Gatz 等，(1991)Mol.Gen.Genet.227:229-237)。另外的用于植物的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是對(duì)誘導(dǎo)劑作出反應(yīng)的啟動(dòng)子，植物通常對(duì)所述誘導(dǎo)劑不作出反應(yīng)。這種類型的示例性誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是來(lái)自類固醇激素基因的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，其轉(zhuǎn)錄活性被糖皮質(zhì)類固醇激素誘導(dǎo)(Schena等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88:10421)或通過(guò)嵌合轉(zhuǎn)錄激活劑XVE的最近應(yīng)用來(lái)誘導(dǎo)，用于通過(guò)雌二醇活化的基于雌激素受體的誘導(dǎo)型植物表達(dá)系統(tǒng)(Zuo等，(2000)Plant J.，24:265-273)。其它的用于植物的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在EP332104、PCT W093/21334和PCT W097/06269中被描述，其通過(guò)引用以其全部并入本文。也可以使用由其它啟動(dòng)子部分組成的啟動(dòng)子以及部分或全部合成的啟動(dòng)子。見(jiàn)，例如，Ni等，(1995)Plant J.7:661-676和PCT W095/14098，它們描述了用于植物的這類啟動(dòng)子。
[0043]啟動(dòng)子可以包括，或被修飾以包括，一個(gè)或多個(gè)增強(qiáng)子元件。在一些實(shí)施方式中，啟動(dòng)子可以包括多個(gè)增強(qiáng)子元件。與不包含增強(qiáng)子元件的啟動(dòng)子相比，包含增強(qiáng)子元件的啟動(dòng)子提供了更高水平的轉(zhuǎn)錄。用于植物的合適增強(qiáng)子元件包括PClSV增強(qiáng)子元件(美國(guó)專利第5，850，019號(hào))、CaMV35S增強(qiáng)子元件(美國(guó)專利第5，106，739和5，164，316號(hào))和FMV增強(qiáng)子元件(Maiti 等，(1997)Transgenic Res.6:143-156)。也參見(jiàn) PCT W096/23898。
[0044]通常，這種構(gòu)建物可包含5’和3’非翻譯區(qū)。這種構(gòu)建物可以包含“信號(hào)序列”或“前導(dǎo)序列”，以促進(jìn)感興趣肽的共翻譯或翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)到某些細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)如葉綠體(或其它質(zhì)體)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體，或被分泌。例如，構(gòu)建物可以被設(shè)計(jì)為包含信號(hào)肽來(lái)促進(jìn)肽至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)移?！靶盘?hào)序列”意指已知或疑似導(dǎo)致共翻譯或翻譯后肽運(yùn)輸穿過(guò)細(xì)胞膜的序列。在真核細(xì)胞中，這典型地包括分泌到高爾基體，帶有一些因而發(fā)生的糖基化?！扒皩?dǎo)序列”意指當(dāng)翻譯時(shí)，導(dǎo)致足以引起肽鏈共翻譯運(yùn)輸?shù)絹喖?xì)胞器的氨基酸序列的任何序列。因而，這包括通過(guò)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，到達(dá)液泡、包括葉綠體、線粒體等在內(nèi)的質(zhì)體而靶向運(yùn)輸和/或糖基化的前導(dǎo)序列。也可以優(yōu)選的是，設(shè)計(jì)包含內(nèi)含子的植物表達(dá)盒，以使內(nèi)含子的mRNA加工對(duì)于表達(dá)是必需的。
[0045]“3’非翻譯區(qū)”意指位于編碼序列下游的多核苷酸。多腺苷酸化信號(hào)序列和編碼調(diào)控信號(hào)的其它序列是3’非翻譯區(qū),所述調(diào)控信號(hào)能夠影響聚腺苷酸束(polyadenylic acidtract)添加到mRNA前體的3’端?！?’非翻譯區(qū)”意指位于編碼序列上游的多核苷酸。
[0046]其它的上游或下游非翻譯元件包括增強(qiáng)子。增強(qiáng)子是用于增加啟動(dòng)子區(qū)表達(dá)的多核苷酸。增強(qiáng)子在本領(lǐng)域是熟知的，且包括但不限于SV40增強(qiáng)子區(qū)和35S增強(qiáng)子元件。
`[0047]終止區(qū)可以是對(duì)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)天然的，可以是對(duì)本發(fā)明的序列天然的，或可以源自另一來(lái)源。合適的終止區(qū)可從根癌農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)的T1-質(zhì)粒得到,如章魚(yú)堿合酶和胭脂氨酸合成酶終止區(qū)。也參見(jiàn)Guerineau等人，(1991)Mol.Gen.Genet.262:141-144 ；Proudfoot(1991)Cell64:671-674 ;Sanfacon 等人，(1991)Genes Dev.5:141-149 ；Mogen等人，(1990)Plant Cell2:1261-1272 ;Munroe 等人，(1990)Gene91:151-158 ;Ballas等人，(1989)Nucleic Acids Res.17:7891-7903 ;和 Joshi 等人，(1987)Nucleic AcidRes.15:9627-9639o
[0048]在本發(fā)明的一個(gè)方面，合成的DNA序列被設(shè)計(jì)用于給定的多肽，如本發(fā)明的多肽。細(xì)胞中合成DNA序列的開(kāi)放閱讀框的表達(dá)導(dǎo)致本發(fā)明的多肽的產(chǎn)生。合成DNA序列可以用于簡(jiǎn)單地除去不必要的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)，以促進(jìn)DNA克隆策略，改變或除去任何潛在的密碼子偏倚，改變或提高GC含量，除去或改變另起讀框，和/或改變或除去內(nèi)含子/外顯子剪接識(shí)別位點(diǎn)、多腺苷酸化位點(diǎn)、SD序列、不必要的啟動(dòng)子元件和可能存在于天然DNA序列中的類似物。也可能的是，合成DNA序列可以被用于將其它改良引入DNA序列，如引入內(nèi)含子序列、產(chǎn)生作為融合到細(xì)胞器引導(dǎo)肽的蛋白質(zhì)表達(dá)的DNA序列，所述細(xì)胞器引導(dǎo)肽例如葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽、質(zhì)外體/液泡導(dǎo)向肽、或?qū)е滤玫降碾谋３衷趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)中的肽序列。合成基因也可以使用宿主細(xì)胞優(yōu)選的密碼子合成，用于改進(jìn)表達(dá)，或可以使用具有宿主優(yōu)選的密碼子使用頻率的密碼子進(jìn)行合成。見(jiàn)，例如，Campbell和Gowri (1990)Plant Physiol.92:1-11 ;美國(guó)專利第 6，320，100,6, 075，185,5, 380，831 和 5，436，391 號(hào)，美國(guó)公布申請(qǐng)第 20040005600 和 20010003849 號(hào)、以及 Murray 等，(1989)Nucleic AcidsRes.17:477-498，其通過(guò)引用并入本文。
[0049]在一種實(shí)施方式中，感興趣的多核苷酸被靶向葉綠體來(lái)進(jìn)行表達(dá)。在這種方式中，在感興趣的多核苷酸不直接插入到葉綠體中時(shí)，表達(dá)盒將額外包含編碼指引感興趣的核苷酸到葉綠體中的轉(zhuǎn)運(yùn)肽的多核苷酸。這種轉(zhuǎn)運(yùn)肽在本領(lǐng)域是已知的。見(jiàn)，例如，Von Heijne 等人，(1991) Plant Mol.Biol.Rep.9:104-126 ；Clark 等，(1989)J.Biol.Chem.264:17544-17550 ；Della-Cioppa 等，(1987)Plant Physiol.84:965-968 ；Romer 等，(1993) Biochem.Biophys.Res.Commun.196:1414-1421 ；以及 Shah 等，(1986)Science233:478-481。
[0050]靶向葉綠體的感興趣多核苷酸可以被優(yōu)化，用于在葉綠體中表達(dá)，以說(shuō)明在植物細(xì)胞核和該細(xì)胞器之間密碼子使用的不同。在這種方式中，可以使用葉綠體優(yōu)選的密碼子合成感興趣多核苷酸。見(jiàn)，例如，美國(guó)專利第5，380，831號(hào)，其通過(guò)引用并入本文。
[0051]這種植物表達(dá)盒可以被插入到植物轉(zhuǎn)化載體中。“轉(zhuǎn)化載體”意指允許轉(zhuǎn)化細(xì)胞的DNA分子。這樣的分子可以由一個(gè)或多個(gè)表達(dá)盒組成，并且可以組織成一個(gè)以上的載體DNA分子。例如，二元載體是植物轉(zhuǎn)化載體，其利用兩個(gè)非鄰接DNA載體來(lái)編碼所有必需的順式_和反式作用功能，用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞(Hellens和Mullineaux(2000)Trends in PlantScience5:446-451).“載體”是指設(shè)計(jì)用于在不同宿主細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移的多核苷酸構(gòu)建物?！氨磉_(dá)載體”是指具有在外源細(xì)胞中摻入、整合和表達(dá)異源DNA序列或片段的能力的載體。
[0052]植物轉(zhuǎn)化載體包括一個(gè)或多個(gè)實(shí)現(xiàn)植物轉(zhuǎn)化的DNA載體。例如，本領(lǐng)域內(nèi)的常見(jiàn)做法是應(yīng)用包含一個(gè)以上鄰接DNA區(qū)段的植物轉(zhuǎn)化載體。這些載體在本領(lǐng)域內(nèi)通常稱為二元載體。二元載體以及具有輔助質(zhì)粒的載體最常用于農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，其中實(shí)現(xiàn)有效轉(zhuǎn)化所需要的DNA區(qū)段的 大小和復(fù)雜性是相當(dāng)大的，并且將單獨(dú)的功能分開(kāi)在單獨(dú)的DNA分子上是有利的。二元載體通常包含質(zhì)粒載體，所述質(zhì)粒載體包含T-DNA轉(zhuǎn)移必需的順式作用序列(如左邊界和右邊界)、被工程化為能夠在植物細(xì)胞中表達(dá)的選擇性標(biāo)記、和“感興趣的多核苷酸”(被工程化為能夠在植物細(xì)胞中表達(dá)的多核苷酸，轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生對(duì)于所述植物細(xì)胞是期望的)。也在該質(zhì)粒載體上存在的是細(xì)菌復(fù)制必需的序列。順式作用序列以允許有效轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞并且在其中表達(dá)的方式排列。例如，選擇性標(biāo)記序列和感興趣的序列位于左邊界和右邊界之間。第二質(zhì)粒載體經(jīng)常包含介導(dǎo)T-DNA從農(nóng)桿菌屬轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的反式作用因子。該質(zhì)粒經(jīng)常包含侵入性功能(Vir基因)，其允許植物細(xì)胞被農(nóng)桿菌屬感染，以及通過(guò)在邊界序列切割的DNA轉(zhuǎn)移，和病毒介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移，如本領(lǐng)域所理解的(Hellens 和 Mullineaux (2000) Trends in Plant Science, 5:446-451 )。幾種類型的農(nóng)桿菌屬菌株(例如，LBA4404、GV3101、EHA10U EHA105等)可用于植物轉(zhuǎn)化。第二質(zhì)粒載體對(duì)于通過(guò)其它方法如顯微投影、顯微注射、電穿孔、聚乙二醇等將多核苷酸引入到植物中不是必需的。
[0053]D.植物轉(zhuǎn)化
[0054]本發(fā)明的方法包括將核苷酸構(gòu)建物引入到植物中。“引入”意指將核苷酸構(gòu)建物以該構(gòu)建物進(jìn)入到植物細(xì)胞內(nèi)部的方式呈遞給植物。本發(fā)明的方法不需要使用將核苷酸構(gòu)建物引入植物的具體方法，只需要核苷酸構(gòu)建物進(jìn)入到植物的至少一個(gè)細(xì)胞的內(nèi)部。將核苷酸構(gòu)建物引入植物中的方法在本領(lǐng)域是已知的，包括但不限于，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化法、瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法和病毒介導(dǎo)法。
[0055]一般而言，植物轉(zhuǎn)化法包括將異源DNA轉(zhuǎn)移到靶植物細(xì)胞(例如，未成熟或成熟胚、懸浮培養(yǎng)物、未分化的愈傷組織、原生質(zhì)體等)，隨后應(yīng)用最大閾值水平的適當(dāng)選擇(取決于選擇性標(biāo)記基因并且在此情況下為“草甘膦”)以從未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞團(tuán)中回收轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。外植體被典型地轉(zhuǎn)移到新鮮供給的相同培養(yǎng)基中并且常規(guī)培養(yǎng)。之后，轉(zhuǎn)化細(xì)胞在放置在補(bǔ)充有最大閾值水平的選擇劑(例如，“草甘膦”)的再生培養(yǎng)基上之后分化成莖干。然后，莖干被轉(zhuǎn)移到選擇性生根培養(yǎng)基，用于回收生根的莖干或小植株。轉(zhuǎn)基因小植株然后生長(zhǎng)成為成熟的植物并且產(chǎn)生能育種子(例如，Hiei等，(1994)The PlantJournal6:271-282 ;Ishida等，(1996)Nature Biotechnology 14:745-750)。外植體典型地被轉(zhuǎn)移到新鮮供給的相同培養(yǎng)基中并且常規(guī)培養(yǎng)。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的技術(shù)和方法的一般描述在Ayres和Park(1994) Critical Reviews in Plant Sciencel3:219-239 以及Bommineni和Jauhar (1997)Maydica42:107-120中找到。由于轉(zhuǎn)化的材料包含許多細(xì)胞；轉(zhuǎn)化的和未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞都出現(xiàn)在任何一塊經(jīng)受處理的靶愈傷組織或組織或細(xì)胞群中。殺死非轉(zhuǎn)化細(xì)胞并允許轉(zhuǎn)化細(xì)胞增殖的能力產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物培養(yǎng)物。通常，除去非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的能力限制了轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的快速回收和轉(zhuǎn)基因植物的成功產(chǎn)生。分子方法和生化方法可以用于確定整合的感興趣異源基因在轉(zhuǎn)基因植物的基因組中的存在。
[0056]轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生可以通過(guò)幾種方法之一進(jìn)行，包括但不限于，通過(guò)農(nóng)桿菌屬將異源DNA引入到植物細(xì)胞中(農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)，用附到粒子的異源外來(lái)DNA轟擊植物細(xì)胞，和用于轉(zhuǎn)移DNA的各種其它非粒子直接介導(dǎo)法(例如，Hiei等，(1994)The PlantJournal6:271-282 ;Ishida 等，(1996)Nature Biotechnologyl4:745-750 ；Ayres 和Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 ;Bommineni 和 Jauhar (1997)Maydica42:107-120)。
[0057]轉(zhuǎn)化葉綠體的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。見(jiàn)，例如，Svab等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87:8526-8530 ；Svab 和 Maliga(1993`)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:913-917 ；Svab和Maliga(1993)EMBO J.12:601-606。該方法依賴于粒子槍輸送含選擇性標(biāo)記的DNA以及通過(guò)同源重組將DNA靶向質(zhì)體基因組。此外，質(zhì)體轉(zhuǎn)化可以通過(guò)核編碼和質(zhì)體介導(dǎo)的RNA聚合酶的組織優(yōu)選表達(dá)來(lái)反式激活沉默的質(zhì)體攜帶的轉(zhuǎn)基因來(lái)完成。這種系統(tǒng)已經(jīng)在McBride 等，(1994)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA91:7301-7305 中進(jìn)行了報(bào)道。
[0058]按照常規(guī)方法，已經(jīng)被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以生長(zhǎng)成植物。參見(jiàn)，例如，McCormick等，(1986)Plant Cell Reports 5:81-84。然后這些植物可以生長(zhǎng)并且或者用同一轉(zhuǎn)化株系或不同株系進(jìn)行授粉，并且得到的雜種具有經(jīng)過(guò)鑒定的期望表型特征的組成型表達(dá)。可以生長(zhǎng)兩代或兩代以上以保證期望表型特征的表達(dá)被穩(wěn)定地保持并且遺傳，然后收獲種子以確保期望表型特征的表達(dá)已經(jīng)獲得。以這種方式，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)化種子(也稱為“轉(zhuǎn)基因種子”)，其具有穩(wěn)定摻入它們的基因組中的本發(fā)明的核苷酸構(gòu)建物，例如，本發(fā)明的表達(dá)盒。
[0059]E.植物轉(zhuǎn)化的評(píng)價(jià)
[0060]在將異源外來(lái)DNA引入到植物細(xì)胞中以后，異源基因在植物基因組中的轉(zhuǎn)化或整合通過(guò)各種方法如與整合基因有關(guān)的核酸、蛋白質(zhì)和代謝物的分析來(lái)證實(shí)。[0061]PCR分析是移種到土壤之前篩選早期轉(zhuǎn)化細(xì)胞、組織或莖中摻入基因存在的快速Sti(Sambrook^pRusselioooi)Molecular Cloning:ALaboratory Manual (Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY))。應(yīng)用對(duì)感興趣基因或農(nóng)桿菌屬載體背景等特異的寡核苷酸引物進(jìn)行PCR。
[0062]植物轉(zhuǎn)化可以通過(guò)基因組DNA的DNA印跡分析來(lái)證實(shí)(Sambrook和Russell (2001)，見(jiàn)前)。一般而言，從轉(zhuǎn)化體提取總DNA，用適當(dāng)?shù)南拗菩悦赶?，在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行分離并且轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素或尼龍膜上。然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(SambiOok和Russell, 2001，見(jiàn)前)，可以用例如放射性標(biāo)記的32P靶DNA片段探測(cè)所述膜或“印跡”，以證實(shí)被引入的基因在植物基因組中的整合。
[0063]在RNA印跡分析中，根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)使用的標(biāo)準(zhǔn)程序，從轉(zhuǎn)化體的特異組織分離RNA，所述RNA在甲醛瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分離，并且印跡到尼龍濾膜上(SambiOok和Russell (2001),見(jiàn)前)。然后通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法(Sambrook和Russell (2001),見(jiàn)前)，使所述濾膜與源自GDC的放射性探針雜交，來(lái)檢測(cè)由本發(fā)明的grg序列編碼的RNA的表達(dá)。
[0064]根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序(Sambrook和Russell (2001),見(jiàn)前),使用與存在于除草劑抗性蛋白上的一個(gè)或多個(gè)表位結(jié)合的抗體，可以對(duì)轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡和生化分析等，以確定由除草劑抗性基因編碼的蛋白質(zhì)的存在。
[0065]在本發(fā)明的一個(gè)方面，本文描述的grg基因可用作標(biāo)記以評(píng)價(jià)細(xì)菌或植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。
[0066]F.植物和植物部分
[0067]“植物”意指全植物、植物器官(例如，葉、莖、根等)、種子、植物細(xì)胞、繁殖體、胚及其后代。植物細(xì)胞可以是分化`的或未分化的(例如，愈傷組織、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、原生質(zhì)體、葉細(xì)胞、根細(xì)胞、韌皮部細(xì)胞、花粉)。本發(fā)明可以用于將多核苷酸引入任何植物種類中，包括但不限于，單子葉植物和雙子葉植物。感興趣的植物的例子包括但不限于，玉米(玉蜀黍)、高粱、小麥、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、馬鈴薯、棉、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥和油菜(oilseed rape)、蕓苔屬某種、紫花苜猜、裸麥、稷、紅花、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠蘿、柑桔樹(shù)、可可、茶、香蕉、鱷梨、無(wú)花果、番石榴、芒果、橄欖、番木瓜、腰果樹(shù)、澳大利亞堅(jiān)果、杏樹(shù)、燕麥、蔬菜、觀賞植物和針葉樹(shù)。
[0068]蔬菜包括但不限于,番爺、萵苣、青豆、利馬豆、豌豆和甜瓜屬(genus Curcumis)的成員如黃瓜、甜瓜和香瓜。觀賞植物包括但不限于，杜鵑花、繡球花屬、芙蓉屬、玫瑰、郁金香、水仙花、矮牽牛屬、石竹屬、猩猩木和菊花。農(nóng)作物植物也是感興趣的，包括例如，玉米、高粱、小麥、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、馬鈴薯、棉、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥、油菜等。
[0069]本發(fā)明適合單子葉植物科的任何成員，包括但不限于，玉米、水稻、大麥、燕麥、小麥、高粱、裸麥、甘鹿、菠蘿、薯菌、洋蔥、香蕉、椰子和海棗。
[0070]G.增加植物產(chǎn)量的方法
[0071]提供了增加植物產(chǎn)量的方法。所述方法包括將包含本文公開(kāi)的grg序列的多核苷酸引入到植物或植物細(xì)胞中。如本文所定義的，植物的“產(chǎn)量”是指由植物產(chǎn)生的生物量的質(zhì)量和/或數(shù)量?！吧锪俊币庵溉魏螠y(cè)量的植物產(chǎn)物。生物量產(chǎn)率的增加是任何所測(cè)量的植物產(chǎn)物的產(chǎn)量的提高。增加植物產(chǎn)量具有幾種商業(yè)應(yīng)用。例如，增加植物葉的生物量可以增加多葉蔬菜的產(chǎn)量，用于人類和動(dòng)物消費(fèi)。此外，增加葉生物量可以用于增加植物來(lái)源的藥品或工業(yè)產(chǎn)品的生產(chǎn)。產(chǎn)量的增加可以包括統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的增加，包括但不限于，至少1%的增加、至少3%的增加、至少5%的增加、至少10%的增加、至少20%的增加、至少30%的增加、至少50%的增加、至少70%的增加、至少100%的增加或更大的增加。
[0072]在具體的方法中，用有效濃度的除草劑處理植物，其中所述除草劑應(yīng)用導(dǎo)致植物產(chǎn)量增加。“有效濃度”意指允許植物產(chǎn)量增加的濃度。感興趣除草劑的這種有效濃度通常在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。按照通常的除草劑施用技術(shù)，除草劑可以在芽前或芽后被施用到含有農(nóng)作物的田地中，所述農(nóng)作物已經(jīng)通過(guò)異源表達(dá)本發(fā)明的grg基因而獲得了除草劑抗性。
[0073]也提供了賦予植物或植物部分除草劑抗性的方法。在這種方法中，本文公開(kāi)的grg多核苷酸被引入到植物中，其中所述多核苷酸的表達(dá)導(dǎo)致草甘膦耐性或抗性。通過(guò)這種方法產(chǎn)生的植物可以用有效濃度的除草劑處理并且顯示出增加的對(duì)除草劑的耐性。本申請(qǐng)中除草劑的“有效濃度”是足以使植物或植物部分的生長(zhǎng)減緩或停止的量，所述植物或植物部分對(duì)除草劑不具有天然抗性或沒(méi)有獲得對(duì)除草劑的抗性。
[0074]H.在田地中控制雜草的方法
[0075]也提供了在含有植物的田地中選擇性控制雜草的方法。在一種實(shí)施方式中，作為本文公開(kāi)的grg多核苷酸插入到植物種子或植物的結(jié)果，植物種子或植物具有草甘膦抗性。在具體的方法中，植物用有效濃度的除草劑處理，其中所述除草劑施用導(dǎo)致選擇性控制雜草或其它未轉(zhuǎn)化的植物?！坝行舛取币庵缚刂齐s草或其它未轉(zhuǎn)化植物的生長(zhǎng)或蔓延而不顯著影響草甘膦抗性植物或植物種子的濃度。感興趣除草劑的這種有效濃度通常在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。按照通常的除草劑施用技術(shù)，除草劑可以在芽前或芽后被施用到含有獲得除草劑抗性的植物或植物種子的田地中。
[0076]1.溫度譜`
[0077]已經(jīng)進(jìn)行了幾個(gè)植物中草甘膦代謝的研究，所述研究顯示草甘膦不被植物代謝或代謝得非常緩慢。草甘膦迅速穿透角質(zhì)層，并且在相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)被轉(zhuǎn)移遍及整個(gè)植物(在 Kearney 和 Kaufman, Eds (1988) Herbicides ;Chemistry, Degradation & Mode ofAction Marcel Dekker, Inc., New York, 3:1-70 以及 Grossbard 和 Atkinson, Eds.(1985),The Herbicide Glyphosate Butterworths, London, p.25-34 中進(jìn)行綜述)。因而，可能的是，在農(nóng)學(xué)上重要的植物中，草甘膦耐性在草甘膦暴露之后的一段持續(xù)時(shí)間中是必要的。在溫度經(jīng)常在生長(zhǎng)季節(jié)期間超過(guò)30°C的情況下，使用可在升高的溫度保持活性的草甘膦耐性EPSP合酶將會(huì)是有利的。
[0078]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，EPSP合酶在比周圍環(huán)境溫度高或低的溫度下顯示出熱穩(wěn)定性?！盁岱€(wěn)定性”意指在比周圍環(huán)境溫度高或低的溫度下，所述酶比在該溫度下為非熱穩(wěn)定的EPSP合酶在更長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)具有活性。例如，熱穩(wěn)定EPSP合酶在比周圍環(huán)境溫度高或低的溫度下具有酶促活性大于大約I小時(shí)、大于大約2小時(shí)、大約3小時(shí)、大約4小時(shí)、大約5小時(shí)、大約6小時(shí)、大約7小時(shí)、大約8小時(shí)、大約9小時(shí)、大約10小時(shí)、大約11小時(shí)、大約12小時(shí)、大約13小時(shí)、大約14小時(shí)、大約15小時(shí)、大約20小時(shí)、大約25小時(shí)或更長(zhǎng)。為了本發(fā)明的目的，“周圍”環(huán)境溫度為大約30°C。在一些實(shí)施方式中，高于周圍溫度是在或高于大約32°C、大約34°C、大約37°C、大約40°C、大約45°C、大約50°C、大約55°C、大約60°C、大約65°C或更高的溫度。低于周圍溫度是在或低于大約28°C、低于大約27°C、大約26 °C、大約25 °C、大約23 °C、大約20°C、大約18 °C、大約15 °C、大約I (TC，在或低于大約5°C，或在0°C左右。分析EPSP合酶活性的方法在本文其它地方被進(jìn)一步詳細(xì)討論。為了本發(fā)明的目的，當(dāng)熱穩(wěn)定EPSP合酶以在該酶的最適溫度觀測(cè)到的最大活性水平的大約90%至100%、大約80%至大約90%、大約70%至大約80%、大約60%至大約70%或大約50%至大約60%起作用時(shí)，其被認(rèn)為是有活性的。
[0079]因而，本文提供的是在高于周圍環(huán)境溫度的溫度下增加草甘膦耐性的方法和組合物。在一種實(shí)施方式中，所述方法包括將編碼在SEQ ID N0:8、10、14、28、30、32或34中所示的草甘膦抗性EPSP合酶的核苷酸序列引入植物，并且使所述植物在高于周圍環(huán)境溫度的溫度下生長(zhǎng)。在【具體實(shí)施方式】中，所述生長(zhǎng)溫度在所述植物的生長(zhǎng)季節(jié)期間高于周圍溫度平均至少大約2小時(shí)每天，至少大約3小時(shí)每天、至少大約4小時(shí)每天、至少大約5小時(shí)每天、大約6小時(shí)每天、大約7小時(shí)每天、大約8小時(shí)每天、大約9小時(shí)每天、大約10小時(shí)每天、大約11小時(shí)每天、大約12小時(shí)每天、大約14小時(shí)每天、大約16小時(shí)每天、大約18小時(shí)每天、大約20小時(shí)每天、至少大約22小時(shí)每天,或可達(dá)大約24小時(shí)一天。
[0080]在另一實(shí)施方式中，所述方法包括將編碼在SEQ ID N0:8、10、14、28、30、32或34中所示的草甘膦耐性EPSP合酶的核苷酸序列引入植物，使所述植物與除草有效濃度的草甘膦接觸，和使所述植物在高于周圍環(huán)境溫度的溫度下生長(zhǎng)每天至少I小時(shí)、至少大約2小時(shí)、至少大約3小時(shí)、至少大約4小時(shí)或以上，在草甘膦施用給植物之后持續(xù)至少2、3、4、5、
6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多天，其中溫度高于周圍環(huán)境溫度的天數(shù)發(fā)生在所述植物的生長(zhǎng)季節(jié)期間。
[0081]下列實(shí)施例作為說(shuō)明而不是作為限制加以提供。
[0082]實(shí)驗(yàn)
[0083]1.svngrg23
[0084]GRG23 (SEQ ID NO: 2)是EPSP合酶，其具有極好的動(dòng)力學(xué)數(shù)值Km、Ki和Vmax (美國(guó)專利申請(qǐng)第60/741，166號(hào)，2005年12月I日提交)。新的編碼GRG23蛋白的基因序列(美國(guó)專利申請(qǐng)第60/741，166號(hào)，2005年12月I日提交)被設(shè)計(jì)并合成。所得到的序列在本文被提供為SEQ ID N0:6，并且在本文中稱為“syngrg23”。通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法，將開(kāi)放閱讀框克隆到表達(dá)載體pRSFlb (Invitrogen)中。
[0085]編碼GRG23的syngrg23基因被克隆到pUC19載體中以產(chǎn)生pAX748。應(yīng)用Mutazyme II系統(tǒng)(Stratagene),使用在該載體中在syngrg23側(cè)翼的PCR引物從pAX748擴(kuò)增syngrg23,以將隨機(jī)突變引入syngrg23編碼區(qū)。在易錯(cuò)PCR (error-prone PCR)反應(yīng)中，模板以1:50稀釋，并且擴(kuò)增進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。用限制性酶BamH I和Sgs I消化得到的PCR產(chǎn)物，凝膠純化，并且連接到載體pRSFlb中，以產(chǎn)生誘變的syngrg23文庫(kù)。
[0086]所述誘變的syngrg23文庫(kù)被轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌(E.coli)菌株BL21*DE3star (Invitrogen)中。轉(zhuǎn)化后，單個(gè)菌落被鋪板在含有150mM草甘膦的1XM63培養(yǎng)基上，以選擇保持酶促活性和具有生長(zhǎng)耐性的克隆。
[0087]實(shí)施例2.在平板上篩選草甘膦抗性
[0088]文庫(kù)連接物被轉(zhuǎn)化到BL21*DE3感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(Invitrogen)中。根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其中具有下列改變。在37°C，在SOC培養(yǎng)基中溫育I小時(shí)之后，通過(guò)離心沉淀細(xì)胞(5分鐘，1000Xg，4°C)。用Iml M63+洗滌細(xì)胞，再次離心，并且傾析上清液。再一次用lmlM63+洗滌細(xì)胞，并且將細(xì)胞重懸于200ul M63+中。
[0089]為了選擇在大腸桿菌中賦予草甘膦抗性的突變GRG23酶，細(xì)胞被鋪板在含有150mM 草甘勝、0.05mM IPTG (異丙基-β-D-硫代批喃半乳糖苷)(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)和50 μ g/ml卡那霉素的M63+瓊脂培養(yǎng)板上。M63+培養(yǎng)基含有IOOmMKH2PO4、15mM(NH4)2SO4'50 μ M CaCl2UuM FeS04、50yM MgCl2、55mM 葡萄糖、25mg/升 L-脯氨酸、IOmg/升鹽酸硫胺素、足量的NaOH以調(diào)節(jié)pH至7.0、和15g/升瓊脂。將所述平板在37°C溫育36小時(shí)。
[0090]挑取單個(gè)菌落并且排列到384孔板中。以這種方式，產(chǎn)生了兩個(gè)384孔板。從在沒(méi)有草甘膦的平板上生長(zhǎng)的菌落中挑取第三板的384個(gè)克隆。
[0091]實(shí)施例3.草甘膦抗性GRG23變體的分離和分析
[0092]通過(guò)在草甘膦平板上生長(zhǎng)來(lái)鑒定用誘變的syngrg23和/或grg23變體轉(zhuǎn)化的BL21*DE3細(xì)胞。制備誘變的syngrg23和/或grg23變體的提取物并且分析其改進(jìn)的酶促活性。用針將草甘膦平板上鑒定的菌落挑到含有LB培養(yǎng)基的96孔板中并且生長(zhǎng)至0.D大約0.6。然后加入IPTG (0.5mM)并且將所述板在20°C溫育過(guò)夜，以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。使用POP培養(yǎng)試劑(Novagen)和Lysonase (Novagen),從細(xì)胞團(tuán)中制備蛋白質(zhì)提取物，并且在37°C加熱提取物30分鐘后，測(cè)量粗制溶解產(chǎn)物中的酶促活性?；钚源笥诤羞m當(dāng)對(duì)照蛋白質(zhì)(例如，GRG23)的一組提取物的平均值以上兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的提取物被選擇，用于進(jìn)一步分析。
[0093]在作為粗制提取物溫育之后顯示出活性增加的克隆被生長(zhǎng)在250mL LB培養(yǎng)物中，并用IPTG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。誘導(dǎo)之后,使用鈷樹(shù)脂(cobalt resin) (Novagen),通過(guò)親和層析從每一培養(yǎng)物中純化突變GRG23蛋白。然后，在37°C加熱0、2、4、和大約16小時(shí)之后，檢測(cè)純化的蛋白質(zhì)的酶促活性。`
[0094]實(shí)施例4.改自的GRG23奪體
[0095]從誘變syngrg23的DNA文庫(kù)中，鑒定出幾個(gè)在37°C具有改良的活性的克隆。與這些提取物對(duì)應(yīng)的克隆的DNA序列被測(cè)定。表1示出了在6個(gè)保持草甘膦抗性的GRG23的變體中鑒定的氨基酸變化:grg23(L3Pl.B20) (SEQ ID NO: 20)，編碼氨基酸序列GRG23(L3P1.B20) (SEQ ID N0:21) ；grg23(L3Pl.B3) (SEQ ID NO:22)，編碼氨基酸序列 grg23 (L3P1B3)(SEQ ID NO:23) ；GRG23(L3P1.F18) (SEQ ID NO: 24)，編碼氨基酸序列 GRG23 (L3P1.F18)(SEQ ID NO:25);和 grg23 (L3P1.023) (SEQ ID NO: 26)，編碼氨基酸序列 GRG23 (L3P1.023)(SEQ ID NO:27)。
[0096]表1.在抗草甘膦的GRG23變體中鑒定出的突變
[0097]
克隆 I在GRG23中的氨基酸(AA)
L3P1B20 V206 — I—
L3P1B3 D75 ^ H.E217 ^ K—
L3P1F18 T274 — I—
L3P1023 |R5 — H一
[0098]克隆在250mL LB培養(yǎng)物中生長(zhǎng)，并且如上所述分離所誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)表達(dá)。然
后，在37°C加熱O、2、4、和大約16小時(shí)之后，檢測(cè)純化的蛋白質(zhì)的酶促活性。發(fā)現(xiàn)克隆之一，稱為“M5”，在37°C延長(zhǎng)溫育之后保持了增加比例的酶促活性(表2)。該克隆的DNA序列被測(cè)定，并且在本文中該基因被稱為grg23 (acel) (SEQ ID N0:8)。從grg23 (acel)表達(dá)的蛋白質(zhì)被稱為 GRG23 (ACEl) (SEQ ID NO: 9) ?
[0099]表2.在升高的溫度下GRG23 (ACEl)對(duì)GRG23的半衰期
[0100]
[0101]相對(duì)于野生型GRG23蛋白，GRG23 (ACEl)包含兩個(gè)氨基酸置換:Α49 — T和S276 — T。含有該基因的pRSFlb被稱為ρΑΧ3801。圖1示出了在升高的溫度下GRG23 (ACEl)對(duì)GRG23的相對(duì)穩(wěn)定性。
[0102]實(shí)施例5.GRG-23奪體的EPSPS活件測(cè)定
[0103]分析了含有GRG-23變體蛋白的提取物的EPSP合酶活性，如2005年12月I日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)第60/741，166號(hào)中所述，其通過(guò)引用以其全部并入本文。根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)，在含有0.5mM莽草酸-3 -磷酸、200uM磷酸烯醇丙酮酸(PEP)、lU/ml黃嘌呤氧化酶、2U/ml核苷磷酸化酶、2.25mM肌苷、lU/ml辣根過(guò)氧化物酶、2mM草甘膦、50mM HEPES/KOH ρΗ7.0UOOmM KCl 和AMPLEX? Red(Invitrogen)的 50 μ I 終體積中進(jìn)行分析。在室溫下，提取物與除了莽草酸-3 -磷酸之外的所有分析成分溫育5分鐘，并且通過(guò)加入莽草酸_3 -磷酸開(kāi)始進(jìn)行分析。應(yīng)用Spectramax Gemini XPS突光分光計(jì)(MolecularDynamics,激發(fā):555nm ;發(fā)射:590nm),測(cè)量EPSP合酶活性。
[0104]如以前所述(2005年12月I日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0/741，166)，對(duì)純化的蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行全測(cè)定，調(diào)節(jié)由本領(lǐng)域內(nèi)已知的Bradford分析確定的蛋白質(zhì)量。對(duì)于任一種草甘膦濃度，EPSP合酶活性被測(cè)量為范圍廣泛的PEP濃度的函數(shù)。采用ICALEIDAGRAPH?軟件(Synergy Software),數(shù)據(jù)被擬合到 Michaelis-Menten 方程，并被用于確定EPSP合酶在該草甘膦濃度下的Km(表觀Km)。在不少于4個(gè)草甘膦濃度的情況下確定表觀1^值,并且應(yīng)用本領(lǐng)域已知的方程(ml*x/ (m2+x) ;ml=l ;m2=l),根據(jù)表觀1^對(duì)草甘膦濃度的曲線圖，計(jì)算EPSPS對(duì)于草甘膦的I。
[0105]表3.GRG23 (ACEl)對(duì) GRG23 的動(dòng)力學(xué)
[0106]
KmKi (μΜ)Vmax
(μΜ )( nmol/min/ pg )
GRG23?2213,800?4~77
~GRG23(ACE1)9114,62013.73
[0107]實(shí)施例 6.grg;23(ace2)的鑒定
[0108]相對(duì)于GRG23，GRG23 (ACEl)包含兩個(gè)氨基酸改變。為了確定在這些位置的另外的置換是否能夠進(jìn)一步提高活性，產(chǎn)生DNA文庫(kù)，其導(dǎo)致產(chǎn)生表達(dá)蛋白質(zhì)的克隆，所述蛋白質(zhì)在與GRG23(SEQ ID NO: 2)對(duì)應(yīng)的位置49和276上進(jìn)行實(shí)質(zhì)性突變。通過(guò)在草甘膦平板上生長(zhǎng)，選擇賦予草甘膦抗性的克隆，并且生長(zhǎng)并分析動(dòng)力學(xué)特性，如所述。
[0109]令人驚訝的是，一個(gè)克隆——本文稱為grg23(ace2) (SEQ ID N0:10)，其編碼GRG23 (ACE2)蛋白(SEQ ID NO: 11)——被鑒定為具有改進(jìn)的熱穩(wěn)定性。grg23 (ace2)的DNA序列顯示GRG23(ACE2)包含單氨基酸改變(GRG23的殘基276改變?yōu)榫彼?。
[0110]實(shí)施例7.GRG23和GRG51的比較，以及不同殘某的誘奪
[0111]產(chǎn)生兩個(gè)文庫(kù)以通過(guò)GRG23和GRG51的氨基酸序列的比較評(píng)價(jià)可能的氨基酸序列的變換。第一個(gè)文庫(kù)將變異從GRG51氨基酸序列引入grg23(ace2)編碼區(qū)。第二個(gè)文庫(kù)將變異從GRG23 (ACE2)氨基酸序列引入grg51編碼區(qū)。
[0112]評(píng)價(jià)所得到的文庫(kù)的克隆:(I)賦予細(xì)胞草甘膦抗性的能力，和(2)在37°C延長(zhǎng)溫育后的活性。全部10個(gè)克隆被測(cè)序并且更詳細(xì)地分析。一個(gè)具體克隆——本文稱為
grg51.4(SEQ ID NO: 12)，其編碼蛋白質(zhì) GRG51.4 (SEQ ID NO: 13)-相對(duì)于 GRG23 (ACE2)
和GRG51包含幾個(gè)氨基酸改變。相對(duì)于GRG23 (ACE2)存在于GRG51.4中的氨基酸改變隨后被引入 grg23(ace2)基因中，以產(chǎn)生 grg23 (ace3) (SEQ ID NO: 14)，其編碼 GRG23 (ACE3)蛋白(SEQ ID NO: 15)。GRG23 (ACE3)顯示出相對(duì)于GRG23和GRG23 (ACE2)的較高的活性和熱穩(wěn)定性。
[0113]GRG23(acel)被誘變，并且檢測(cè)克隆以鑒定表達(dá)具有改進(jìn)的熱穩(wěn)定性和/或活性的變體的克隆。一個(gè)克隆——grg23 (L5P2.J2) (SEQ ID NO: 16)，其編碼GRG23 (L5P2.J2) (SEQ ID NO: 17)——由于其改進(jìn)的動(dòng)力學(xué)特性而被鑒定。GRG23 (L5P2.J2)相對(duì)于GRG23 (ACEl)包含三個(gè)氨基酸改變，如下面表4中所示。
[0114]表4.GRG23 (L5P2.J2)中的氨基酸改變
[0115]
相對(duì)于 GRG23(ACE1)，在 GRG23(L5P2.J2)中的氨基酸(AA)
【權(quán)利要求】
1.分離的或重組的核酸分子，其選自: a)核酸分子，其包含SEQID N0:28、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、30、32 或34 的核苷酸序列；和 b)核酸分子，其編碼包含SEQ ID N0:29、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、31、33 或 35的氨基酸序列的多肽。
2.權(quán)利要求1所述的分離的或重組的核酸分子，其中所述核苷酸序列是設(shè)計(jì)用于在植物中表達(dá)的合成序列。
3.載體，其包含權(quán)利要求1或2所述的核酸分子。
4.權(quán)利要求3所述的載體，進(jìn)一步包含編碼異源多肽的核酸分子。
5.宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求3所述的核酸分子。
6.權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，其是細(xì)菌宿主細(xì)胞。
7.權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，其是植物細(xì)胞。
8.轉(zhuǎn)基因植物，其包含權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞。
9.權(quán)利要求8所 述的植物，其中所述植物選自玉米、高粱、小麥、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、馬鈴薯、棉、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥和油菜。
10.轉(zhuǎn)基因種子，其包含權(quán)利要求1所述的核酸分子。
11.分離的或重組的多肽，其選自: a)多肽，其包含SEQID NO:29、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、31、33或35 的氨基酸序列；和 b)多肽，其由SEQ ID N0:28、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、30、32或34 的核苷酸序列編碼。
12.權(quán)利要求11所述的多肽，其進(jìn)一步包含異源氨基酸序列。
13.產(chǎn)生具有抗除草劑活性的多肽的方法，包括在表達(dá)編碼所述多肽的核酸分子的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，所述多肽選自: a)多肽，其包含SEQ ID NO:29、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、31、33或35 的氨基酸序列；和 b)多肽，其由SEQ ID N0:28、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、30、32 或34 的核苷酸序列編碼。
14.賦予植物除草劑抗性的方法，所述方法包括用DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化所述植物和再生轉(zhuǎn)化的植物，所述構(gòu)建物包含驅(qū)動(dòng)在植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子與選自SEQ IDN0:28、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、30、32 或 34 的核苷酸序列可操作地連接。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述除草劑是草甘膦。
16.植物，具有穩(wěn)定摻入到其基因組的DNA構(gòu)建物，所述DNA構(gòu)建物包含編碼具有抗除草劑活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列選自: a)核酸分子，其包含SEQID N0:28、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、30、32或34 的核苷酸序列；和 b)核酸分子，其編碼包含SEQ ID NO:29、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、31、33 或 35的氨基酸序列的多肽； 其中所述核苷酸序列可操作地連接到驅(qū)動(dòng)編碼序列在植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子。
17.權(quán)利要求16所述的植物，其中所述植物是植物細(xì)胞。
18.權(quán)利要求16所述的植物，其中所述植物是大豆植物。
19.權(quán)利要求16所述的植物，其中所述植物是玉米植物。
20.權(quán)利要求16所述的植物，其中所述植物選自玉米、高粱、小麥、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、馬鈴薯、棉、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥和油菜。
21.增加植物活力或產(chǎn)量的方法，其包括: a)提供包含SEQID N0:28、8、10、14、30、32或34中所示的核苷酸序列的植物； b)使所述植物與有效濃度的草甘膦接觸；和 c)在與所述草甘膦接觸之后，使所述植物在溫度高于周圍環(huán)境溫度的條件下生長(zhǎng)每天至少2個(gè)連續(xù)小時(shí),持續(xù)至少4天,其中所述接觸之后的天數(shù)在所述植物的生長(zhǎng)季節(jié)內(nèi)， 其中所述植物的活力或產(chǎn)量高于表達(dá)草甘膦耐性EPSP合酶的植物的活力或產(chǎn)量，所述草甘膦耐性EPSP合酶不具有高于周圍環(huán)境溫度的最適溫度。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其中步驟(c)中的溫度為大約32°C至大約60°C。
23.賦予植物草甘膦抗性的方法，包括: a)提供包含SEQID N0:28、8、10、14、30、32或34中所示的核苷酸序列的植物； b)使所述植物與有效濃度的草甘膦接觸；和 c)在與所述草甘膦接觸之后， 使所述植物在溫度高于周圍環(huán)境溫度的條件下生長(zhǎng)每天至少2個(gè)連續(xù)小時(shí),持續(xù)至少4天,其中所述接觸之后的天數(shù)在所述植物的生長(zhǎng)季節(jié)內(nèi)。
24.權(quán)利要求23所述的方法，其中步驟(c)中的溫度為大約32°C至大約60°C。
25.權(quán)利要求24所述的方法，其中步驟(b)中的溫度為大約37°C。
26.權(quán)利要求1所述的分離的或重組的核酸分子，其中所述核苷酸序列與能在植物細(xì)胞中指導(dǎo)編碼序列表達(dá)的啟動(dòng)子可操作地連接。
【文檔編號(hào)】C12N9/10GK103484481SQ201310317783
【公開(kāi)日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2007年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2006年11月29日
【發(fā)明者】L·C·斯考藤, C·彼得斯, B·范德伯格, T·漢森, V·貝林遜 申請(qǐng)人:埃塞尼克斯公司