一種重組大腸桿菌的破碎方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重組大腸桿菌的破碎方法，其特征在于：發(fā)酵獲得的重組大腸桿菌菌液，經(jīng)陶瓷膜或離心機濃縮后，按照比例加入溶菌酶及Mg2+，并在低溫條件下保持?jǐn)嚢?.5~1h，然后經(jīng)過均質(zhì)機進(jìn)行高壓勻漿破碎1~3次，用顯微鏡鏡檢菌體至達(dá)標(biāo)。本發(fā)明是一種快速高效、運行方便且能用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的細(xì)胞破碎方法。
【專利說明】 —種重組大腸桿菌的破碎方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及大腸桿菌重組蛋白的大規(guī)模提取生產(chǎn)領(lǐng)域，特別涉及一種重組大腸桿菌的破碎方法。

【背景技術(shù)】
[0002]大腸桿菌常用的菌體破碎方法有:反復(fù)凍溶法、超聲破碎法、溶菌酶法、化學(xué)試劑法等，反復(fù)凍溶法僅限于小批量破菌，且破菌效果較差，耗時較長，效率低；超聲破碎法破碎效果較好，但是僅限于實驗室規(guī)模，存在放大瓶頸；溶菌酶破碎法存在破碎不完全，破碎后酶收率較低，且費用較高等缺點；化學(xué)試劑法一般用于實驗室檢測分析，如SDS等，化學(xué)試劑一般會引起蛋白質(zhì)變性，致使酶失活，因此該方法大部分僅限于蛋白質(zhì)的變性檢測分析。均質(zhì)機高壓勻漿破碎法廣泛應(yīng)用于實驗室及工廠規(guī)模，其破碎效果好，破碎效率高，且不容易引起蛋白質(zhì)變性，但是高壓勻漿破碎由于工作壓力高，一般為80(Tl000Bar，對設(shè)備要求較高，配件容易損毀，設(shè)備維修保養(yǎng)費用高，而且破碎時菌體濃度有所限制，一般濕菌體含量在100g/L?200g/L，菌體濃度提高后破碎效果大打折扣。破碎時菌體濃度的高低直接影響了后續(xù)酶液濃度的高低，較低的酶液濃度導(dǎo)致做酶催化反應(yīng)時酶液投量過高，給后續(xù)純化帶來困難。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]針對以上所述各種破菌方法存在的問題，本發(fā)明的目的是為了提供一種快速高效、運行方便且能用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的細(xì)胞破碎方法。
[0004]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案:一種重組大腸桿菌的破碎方法，其特征在于:發(fā)酵獲得的重組大腸桿菌菌液，經(jīng)陶瓷膜或離心機濃縮后，按照比例加入溶菌酶及Mg2+，并在低溫條件下保持?jǐn)嚢?.5?lh，然后經(jīng)過均質(zhì)機進(jìn)行高壓勻漿破碎f 3次，用顯微鏡鏡檢菌體至達(dá)標(biāo)。
[0005]進(jìn)一步地，所述的重組大腸桿菌菌液經(jīng)陶瓷膜或離心機濃縮后濕菌體濃度為200?400g/L。
[0006]進(jìn)一步地，所述的溶菌酶加入量為2?10mg/ (g濕菌體)，所述Mg2+的加入量為終濃度2?10 mM。Mg2+能夠促使溶菌酶保持高活力狀態(tài)，從而減少了溶菌酶的使用量，降低了生產(chǎn)成本。
[0007]進(jìn)一步地，所述的加入溶菌酶和Mg2+后的菌液在4?8°C下保持8(Tl50rpm攪拌
0.5?lh。
[0008]進(jìn)一步地，菌液經(jīng)過均質(zhì)機進(jìn)行30(T400Bar的高壓勻漿破碎1?3次，并用顯微鏡進(jìn)行鏡檢以保證破碎完全。
[0009]進(jìn)一步地，加入Mg2+的形式為Mg2+的可溶性無機鹽及其結(jié)晶水合物，例如包括但不限于MgCl2、MgSO4及其結(jié)晶水合物。
[0010]本發(fā)明所述的重組大腸桿菌的破碎方法，能夠有效破碎高濃度菌體，破碎菌體濃度達(dá)20(T400g/L，破碎率達(dá)到99%以上，而單純高壓均質(zhì)破碎僅為10(T200g/L。同時，能夠有效降低均質(zhì)機勻漿破碎的壓力，本發(fā)明的破菌壓力為30(T400Bar，而現(xiàn)有技術(shù)為80(Tl000Bar，因此有效延長了機器配件的使用壽命。而且使溶菌酶保持了活力，減少了溶菌酶的用量，降低了成本。

【具體實施方式】
[0011]實施例1
發(fā)酵獲得的重組大腸桿菌菌液2000L，經(jīng)陶瓷膜或離心機濃縮至500L，菌體濃度300g/L，濃縮后添加300g溶菌酶和246.47g MgS04*7H20，8°C條件下10rpm攪拌lh，然后利用均質(zhì)機在400Bar的壓力下進(jìn)行細(xì)胞破碎，流速200L/h，共破碎I次，用顯微鏡進(jìn)行鏡檢，菌體破碎率在80%。
[0012]實施例2
發(fā)酵獲得的重組大腸桿菌菌液2000L，經(jīng)陶瓷膜或離心機濃縮至490L，菌體濃度300g/L，濃縮后添加900g溶菌酶和739.41g MgS04*7H20，4?8°C條件下10rpm攪拌lh，然后利用均質(zhì)機在400Bar的壓力下進(jìn)行細(xì)胞破碎，流速200L/h，共破碎I次，用顯微鏡進(jìn)行鏡檢，菌體破碎率在87%。
[0013]實施例3
發(fā)酵獲得的重組大腸桿菌菌液2000L，經(jīng)陶瓷膜或離心機濃縮至500L，菌體濃度300g/L，濃縮后添加300g溶菌酶和246.47g MgS04*7H20，4?8°C條件下10rpm攪拌lh，然后利用均質(zhì)機在400Bar的壓力下進(jìn)行細(xì)胞破碎，流速200L/h，共破碎2次，用顯微鏡進(jìn)行鏡檢，菌體破碎率在93%。
[0014]實施例4
發(fā)酵獲得的重組大腸桿菌菌液2000L，經(jīng)陶瓷膜或離心機濃縮至490L，菌體濃度300g/L，濃縮后添加900g溶菌酶和739.41g MgS04*7H20，4?8°C條件下10rpm攪拌lh，然后利用均質(zhì)機在400Bar的壓力下進(jìn)行細(xì)胞破碎，流速200L/h，共破碎2次，用顯微鏡進(jìn)行鏡檢，菌體破碎率在99%。
[0015]實施例5
發(fā)酵獲得的重組大腸桿菌菌液3000L，經(jīng)陶瓷膜或離心機濃縮至500L，菌體濃度400g/L，濃縮后添加2000g溶菌酶和1232.35g MgSO4.7Η20, 4°C條件下80rpm攪拌lh，然后利用均質(zhì)機在300Bar的壓力下進(jìn)行細(xì)胞破碎，流速200L/h，共破碎3次，用顯微鏡進(jìn)行鏡檢，菌體破碎率在99%。
[0016]實施例6
發(fā)酵獲得的重組大腸桿菌菌液1500L，經(jīng)陶瓷膜或離心機濃縮至500L，菌體濃度200g/L，濃縮后添加400g溶菌酶和406g MgCl2.6H20，6°C條件下150rpm攪拌0.5h，然后利用均質(zhì)機在350Bar的壓力下進(jìn)行細(xì)胞破碎，流速200L/h，共破碎2次，用顯微鏡進(jìn)行鏡檢，菌體破碎率在97%。
[0017]實施例7
發(fā)酵獲得的重組大腸桿菌菌液1500L，經(jīng)陶瓷膜或離心機濃縮至500L，菌體濃度200g/L,濃縮后添加400g溶菌酶和481.66g MgSO4,6°C條件下150rpm攪拌0.5h,然后利用均質(zhì)機在350Bar的壓力下進(jìn)行細(xì)胞破碎，流速200L/h，共破碎2次，用顯微鏡進(jìn)行鏡檢，菌體破碎率在99%。
實施例8
發(fā)酵獲得的重組大腸桿菌菌液1500L，經(jīng)陶瓷膜或離心機濃縮至500L，菌體濃度200g/L,濃縮后添加400g溶菌酶和190.42g MgCl2,6O條件下150rpm攪拌0.5h,然后利用均質(zhì)機在350Bar的壓力下進(jìn)行細(xì)胞破碎，流速200L/h，共破碎2次，用顯微鏡進(jìn)行鏡檢，菌體破碎率在97%。
[0018] 實施例9
發(fā)酵獲得的重組大腸桿菌菌液1500L，經(jīng)陶瓷膜或離心機濃縮至500L，菌體濃度200g/L，濃縮后添加400g溶菌酶和769.23g Mg(NO3)2.6Η20，6?條件下150rpm攪拌0.5h，然后利用均質(zhì)機在350Bar的壓力下進(jìn)行細(xì)胞破碎，流速200L/h，共破碎2次，用顯微鏡進(jìn)行鏡檢，菌體破碎率在94%。
【權(quán)利要求】
1.一種重組大腸桿菌的破碎方法，其特征在于:發(fā)酵獲得的重組大腸桿菌菌液，經(jīng)陶瓷膜或離心機濃縮后，按照比例加入溶菌酶及Mg2+，并在低溫條件下保持?jǐn)嚢?.5?lh，然后經(jīng)過均質(zhì)機進(jìn)行高壓勻漿破碎廣3次，用顯微鏡鏡檢菌體至達(dá)標(biāo)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組大腸桿菌的破碎方法，其特征在于:所述的重組大腸桿菌菌液經(jīng)陶瓷膜或離心機濃縮后濕菌體濃度為20(T400g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組大腸桿菌的破碎方法，其特征在于:所述的溶菌酶加入量為2?1mg/ (g濕菌體)，所述Mg2+的加入量為終濃度2?10 mM。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組大腸桿菌的破碎方法，其特征在于:所述的加入溶菌酶和Mg2+后的菌液在4?8°C下保持8(Tl50rpm攪拌0.5?lh。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組大腸桿菌的破碎方法，其特征在于:菌液經(jīng)過均質(zhì)機進(jìn)行30(T400Bar的高壓勻漿破碎1?3次，并用顯微鏡進(jìn)行鏡檢以保證破碎完全。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的重組大腸桿菌的破碎方法，其特征在于=WAMg2+的形式為Mg2+的可溶性無機鹽及其結(jié)晶水合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組大腸桿菌的破碎方法，其特征在于:加入Mg2+的形式為MgCl2或MgSO4及其結(jié)晶水合物。
【文檔編號】C12R1/19GK104293671SQ201310299971
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年7月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月17日
【發(fā)明者】陳令偉 申請人:南京朗恩生物科技有限公司