專利名稱：一種黃曲霉菌遺傳轉(zhuǎn)化表達載體的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種黃曲霉菌遺傳轉(zhuǎn)化表達載體的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
本發(fā)明構(gòu)建的表達載體適用于黃曲霉菌遺傳轉(zhuǎn)化研究，特別適用于黃曲霉菌相關(guān)功能基因的研究，以及監(jiān)測黃曲霉菌對農(nóng)作物和食品的侵染過程。也可用于其它真菌的遺傳轉(zhuǎn)化研究。
背景技術(shù)：
黃曲霉常侵染玉米、花生、大米、棉籽等糧油作物及其制品，其分泌的兩種毒素AFBUAFB2對家畜、動物和人類健康構(gòu)成極大的潛在危害。該菌的基因組已測序，對它的研究進入了功能基因組時代。目前黃曲霉的轉(zhuǎn)基因研究主要采用PEG法，此方法有以下不足:一、需要制備原生質(zhì)體。除了制備原生質(zhì)體過程復(fù)雜，重復(fù)性差外，此方法最大的問題在于轉(zhuǎn)化子不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率低。二、這種方法轉(zhuǎn)化的多是黃曲霉營養(yǎng)缺陷型菌株，即突變后的菌株，而非野生菌株。在目標突變產(chǎn)生的同時，一些潛在的不易檢測到的突變可能會影響后期對功能基因的研究。在眾多以獲得真菌突變體為目的的技術(shù)中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化具有效率高，成本低，操作方便和重復(fù)性好等特點，為真菌的功能基因組研究提供了有力的工具，到目前為止已在30多種真菌上取得成功。但至今尚無農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化黃曲霉菌的報道，是因為真菌遺傳轉(zhuǎn)化廣泛使用的是植物雙元表達載體，大多采用潮霉素抗性標記，而黃曲霉菌對潮霉素敏感性較差， 在篩選階段需加入大量的潮霉素，成本較高，費時費力；且多數(shù)黃曲霉菌株抗潮霉素，無法進行篩選。熒光報告蛋白，尤其是綠色熒光蛋白GFP，已被廣泛用于轉(zhuǎn)基因后代的篩選，能有效提高篩選效率。但對一些綠色熒光本底較高的宿主，則給轉(zhuǎn)化子鑒定及監(jiān)測真菌和宿主的相互作用帶來困難。此外，將篩選標記基因與突光報告基因構(gòu)建于同一個載體，同時轉(zhuǎn)化真菌已有應(yīng)用，但多為潮霉素抗性標記和綠色熒光GFP基因，分屬于2個表達盒，致使最后的表達載體T-DNA插入?yún)^(qū)較大，影響轉(zhuǎn)化效率，目前在黃曲霉菌中尚無有關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種黃曲霉菌遺傳轉(zhuǎn)化表達載體的構(gòu)建方法。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的。一種黃曲霉菌遺傳轉(zhuǎn)化表達載體的構(gòu)建方法，包括步驟:(I)以 pAF2 載體為模板，以引物①:TAGGATCCATGGCCAAGTTGACCAGTG 和引物②:acttccgctaccaccGTCCTGCTCCTCGGCCAC對上述pAF2載體模板進行PCR擴增獲得ble基因片段；(2)以含玉米upmt基因的質(zhì)粒pUC-upmt載體為模板，以引物③:ggtggtagcggaagtCAGCTGCCGGAACTGCGG 和弓 I 物④:GCTCTGCAGCTATGACTCAACCCAGAAG 對上述 pUC-upmt 載體模板進行PCR擴增獲得upmt基因片段；(3)將上述ble基因片段、upmt基因片段等量混合作為模板，以引物①④擴增獲得融合基因ble-upmt ；(4)將上述融合基因ble-upmt使用BamHI和PstI雙酶切，插入經(jīng)相同酶切的pUC18載體,構(gòu)建成pUC-ble-upmt載體；(5)以 pAN7-l 載體為模板，以引物⑤:ATACTGCAGCCGCGGGATCCACTTAACG和引物⑥:CGCAAGCTTTCGAGTGGAGATGTGGAG, PCR 擴增 trpc 終止子片段，經(jīng) PstI 和 HindIII 雙酶切后，插入上述pUC-ble-upmt載體,構(gòu)建成pUC-ble-upmt-trpc載體；(6)以 pAN7-l 載體為模板，以引物⑦:GCGAATTCCCTTGTATCTCTACACACAG 和引物⑧ CTAGGTACCGTTCTTGGATGGGAAGATG, PCR 擴增 gpdA 啟動子，經(jīng) EcoRI 和 KpnI 雙酶切后，插入上述 pUC-ble-upmt-trpc 載體，構(gòu)建成 pUC-gpdA-ble-upmt-trpc 載體；(7)將上述pUC-gpdA-ble-upmt-trpc載體轉(zhuǎn)入Ecoli.DH5 α感受態(tài)細胞,篩選陽性轉(zhuǎn)化子；(8)將pCAMBIA1300載體經(jīng)XhoI和BstXI雙酶切，去除原載體上的CaMV35S啟動子和hph基因，凝膠電泳回收大片段,加大腸桿菌DNA polymerase I于15°C反應(yīng)2h補平末端，80°C保溫5min滅活，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收片段，并于4°C連接16h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Ecol1.DH5 α，篩選陽性轉(zhuǎn)化子；(9))將上述 pUC-gpdA-ble-upmt-trpc 載體用 EcoRI 和 HindIII 雙酶切，插入上述改造后的PCAMBIA1300的陽性轉(zhuǎn)化子載體中。

進一步地，上述步驟(7)中，pUC-gpdA-ble-upmt-trpc載體轉(zhuǎn)入 Ecol1.DH5 α 感受態(tài)細胞是采用熱擊法轉(zhuǎn)入。進一步地，上述步驟(7)中，篩選陽性轉(zhuǎn)化子是在含Amp抗生素的LB平板上進行篩選的。進一步地，上述步驟(8)中，篩選陽性轉(zhuǎn)化子是在含Kan抗生素的LB平板上進行篩選的。本發(fā)明的有益效果:1、本發(fā)明中所選的篩選標記基因ble是基于黃曲霉菌對抗生素的敏感性實驗而得；熒光報告蛋白選擇尿卟啉原III甲基化酶UPMT，這是一種新型紅色熒光蛋白，在長紫外光下產(chǎn)生強烈紅色熒光，靈敏度與信噪比均優(yōu)于GFP，已被用作大腸桿菌、酵母和哺乳動物細胞轉(zhuǎn)錄報告基因。2、本發(fā)明將篩選標記基因和報告基因融合,置于Aspergillus nidulans的gpdA強啟動子下，構(gòu)建在一個表達盒中。與分別構(gòu)建每個基因的表達盒再串聯(lián)相比，本發(fā)明構(gòu)建的載體T-DNA區(qū)較小，有利于黃曲霉菌的遺傳轉(zhuǎn)化。3、這一構(gòu)建將解決農(nóng)桿菌介導(dǎo)黃曲霉菌的遺傳轉(zhuǎn)化問題，有助于轉(zhuǎn)化后的篩選鑒定，減輕工作量，也為后期功能基因的研究奠定基礎(chǔ)。4、含紅色熒光的黃曲霉菌可作為研究黃曲霉菌與宿主細胞相互作用的工程菌。紅色熒光在活細胞成像具有以下優(yōu)點:一是在多種顏色成像實驗中需要紅色探針，二是紅色熒光較長的激發(fā)波長產(chǎn)生的光毒性較小，可以用來探測較深的生物組織。所以它能很好地追蹤黃曲霉菌的侵染過程而又不傷害宿主細胞，為這一危害人類健康的產(chǎn)毒真菌的防治提供依據(jù)。5、本發(fā)明構(gòu)建的載體除可用于黃曲霉菌外，其它可以ble基因為篩選標記基因的真菌也可利用該載體進行遺傳轉(zhuǎn)化研究。


圖1為含ble-upmt融合基因表達盒的供體質(zhì)粒的構(gòu)建過程；圖2為P1300雙元表達載體的改造過程；圖3為含ble-upmt融合基因表達盒的雙元表達載體的構(gòu)建過程。
具體實施例方式下面根據(jù)附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。實施案例1:含ble-upmt融合基因表達盒的供體質(zhì)粒的構(gòu)建I)選擇合適的供體骨架載體。用Primer Premier 5.0軟件分析ble基因、upmt基因、gpdA啟動子和trpC終止子序列的限制性酶切位點，確定pUC18作為骨架載體，且插入的先后順序為:ble-upmt融合基因，trpC終止子，gpdA啟動子。2)運用Primerdesign軟件設(shè)計引物。a)依據(jù)pAF2載體上的bIe基因序列設(shè)計弓丨物①:TAGGATCCATGGCCAAGTTGACCAGTG和引物②:acttccgct accaccGTCCTGCTCCTCGGCCAC ;依據(jù)玉米 upmt 基因設(shè)計引物③:ggtggtagcggaagtCAGCTGCCGGAACTGCGG 和弓丨物④:GCTCTGCAGCTATGACTCAACCCAGAAG。上述引物②和引物③中的小寫字母部分為基因融合所需要的連接肽GGSGS對應(yīng)的核苷酸序列。b)依據(jù)pAN7_l載體上的trpC終止子序列設(shè)計引物⑤:ATACTGCAGCCGCGGGATCCACTTAACG 和引物⑥:CGCAAGCTTTCGAGTGGAGATGTGGAG。c)依據(jù)pAN7_l上的gpdA啟動子序列設(shè)計引物⑦:GCGAATTCCCTTGTATCTCTACACACAG 和引物⑧:CTAGGTACCGTTCTTGGATGGGAAGATG。3) ble和upmt基因融合。利用2)中設(shè)計的引物①和②，以pAF2載體為模板，擴增ble基因；利用引物③和④，以含玉米upmt基因的質(zhì)粒為模板擴增upmt基因。將以上兩種基因片段回收后等量混合，作為模板，以引物①④擴增獲得融合基因ble-upmt。如圖1
(I)。4)含融合基因表達盒的供體載體的構(gòu)建，具體步驟如下:a)將融合基因用BamHI和PstI雙酶切，插入經(jīng)相同酶切的pUC18載體，構(gòu)建成pUC-ble-upmt 載體。如圖1 (2)b)利用引物⑤和⑥，以pAN7-l為模板，擴增trpc終止子片段，經(jīng)PstI和HindIII雙酶切后，插入pUC-ble-upmt載體，構(gòu)建成pUC-ble-upmt-trpc載體。如圖1 (3)。c)利用引物⑦和⑧，以PAN7-1為模板，擴增gpdA啟動子，經(jīng)EcoRI和KpnI雙酶切后，插入 pUC-ble-upmt-trpc 載體,構(gòu)建成 pUC-gpdA-ble-upmt-trpc 載體。如圖1 (4)。以上所構(gòu)建的載體均通過熱擊法轉(zhuǎn)入Ecol1.DH5a感受態(tài)細胞，在含Amp抗生素的LB平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子。雙酶切驗證質(zhì)粒，采用插入時所用的兩種限制性內(nèi)切酶。
Ecol1.DH5a可從寶生物、全式金、上海生工等生物公司購買。實施案例2:將ble-upmt融合基因表達盒克隆到雙元表達載體上。I)雙元表達載體的改造。將pCAMBIA1300載體經(jīng)XhoI和BstXI雙酶切，去除原載體上的CaMV35S啟動子和hph基因，凝膠電泳回收大片段。加大腸桿菌DNA polymerase I于151:反應(yīng)211補平末端，801:保溫51^11滅活。用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收片段，并于4°C連接16h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Ecol1.DH5 α，于含Kan抗生素的LB平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子，用XhoI和BstXI雙酶切驗證。改造過程如圖2。2)將載體 pUC-gpdA-ble-upmt-trpc 用 EcoRI 和 HindIII 雙酶切，插入上述改造后的pl300載體中。構(gòu)建成pFL-gpdA-ble-upmt-trpc載體,簡稱pFL-ble-upmt。構(gòu)建過程如圖3。上述實施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點，其目的在于讓熟悉此領(lǐng)域技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明內(nèi)容并加以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實質(zhì)所作的等效變化或修 飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種黃曲霉菌遺傳轉(zhuǎn)化表達載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括步驟: (1)以pAF2 載體為模板，以引物①:TAGGATCCATGGCCAAGTTGACCAGTG 和引物②:acttccgctaccaccGTCCTGCTCCTCGGCCAC對所述pAF2載體模板進行PCR擴增獲得ble基因片段； (2)以含玉米upmt基因的質(zhì)粒pUC-upmt載體為模板，以引物③:ggtggtagcggaagtCAGCTGCCGGAACTGCGG 和引物④:GCTCTGCAGCTATGACTCAACCCAGAAG 對所述 pAF2 載體模板進行PCR擴增獲得upmt基因片段； (3)將所述ble基因片段、upmt基因片段等量混合作為模板，以引物①④擴增獲得融合基因 ble-upmt ； (4)將所述融合基因ble-upmt使用BamHI和PstI雙酶切，插入經(jīng)相同酶切的pUC18載體，構(gòu)建成pUC-ble-upmt載體；(5)以pAN7-l載體為模板，以引物⑤:ATACTGCAGCCGCGGGATCCACTTAACG和引物⑥:CGCAAGCTTTCGAGTGGAGATGTGGAG, PCR 擴增 trpc 終止子片段，經(jīng) PstI 和 HindIII 雙酶切后，插入所述pUC-ble-upmt載體,構(gòu)建成pUC-ble-upmt-trpc載體； (6)以pAN7-l載體為模板，以引物⑦:GCGAATTCCCTTGTATCTCTACACACAG和引物⑧ CTAGGTACCGTTCTTGGATGGGAAGATG, PCR 擴增 gpdA 啟動子，經(jīng) EcoRI 和 KpnI 雙酶切后，插入所述 pUC-ble-upmt-trpc 載體，構(gòu)建成 pUC-gpdA-ble-upmt-trpc 載體； (7)將所述pUC-gpdA-ble-upmt-trpc載體轉(zhuǎn)入Ecoli.DH5 α感受態(tài)細胞,篩選陽性轉(zhuǎn)化子； (8)將pCAMBIA1300載體經(jīng)XhoI和BstXI雙酶切，去除原載體上的CaMV35S啟動子和hph基因,凝膠電泳回收大片段,加大腸桿菌DNA polymerase I于15°C反應(yīng)2h補平末端，80°C保溫5min滅活，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收片段，并于4°C連接16h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Ecol1.DH5 α，篩選陽性轉(zhuǎn)化子； (9))將所述pUC-gpdA-ble-upmt-trpc的用EcoRI和HindIII雙酶切，插入所述改造后的pCAMBIA1300的陽性轉(zhuǎn)化子載體中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃曲霉菌遺傳轉(zhuǎn)化表達載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(7)中，pUC-gpdA-ble-upmt-trpc載體轉(zhuǎn)入Ecol1.DH5 α感受態(tài)細胞是采用熱擊法轉(zhuǎn)入。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃曲霉菌遺傳轉(zhuǎn)化表達載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(7)中，篩選陽性轉(zhuǎn)化子是在含Amp抗生素的LB平板上進行篩選的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃曲霉菌遺傳轉(zhuǎn)化表達載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(8)中，篩選陽性轉(zhuǎn)化子是在含Kan抗生素的LB平板上進行篩選的。
全文摘要
本發(fā)明構(gòu)建了一種適合于黃曲霉菌遺傳轉(zhuǎn)化的表達載體，它包括以下兩個步驟一)含篩選標記基因和紅色熒光報告基因的融合基因表達盒的供體質(zhì)粒的構(gòu)建1)選擇合適的供體骨架載體，2)設(shè)計引物，3)基因融合，4)構(gòu)建含融合基因表達盒的供體載體；二)將融合基因表達盒克隆到雙元表達載體上1)雙元表達載體的改造，2)將融合基因表達盒插入改造后的雙元表達載體。本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化黃曲霉菌后，可同時進行抗性和紅色熒光篩選重組菌，提高篩選效率；還可利用紅色熒光監(jiān)測黃曲霉菌對農(nóng)作物、食品的侵染，為這一危害人類健康的產(chǎn)毒真菌的防治提供依據(jù)。亦可用于其它絲狀真菌的轉(zhuǎn)基因研究，在轉(zhuǎn)基因真菌研究中具有潛在的應(yīng)用前景。
文檔編號C12R1/67GK103224950SQ20131018286
公開日2013年7月31日 申請日期2013年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月16日
發(fā)明者陶芳, 范軍, 儲韜, 張心雨, 魏洪璇 申請人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)