專利名稱：表達(dá)融合外源表位n蛋白的重組小反芻獸疫病毒的構(gòu)建及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫標(biāo)記疫苗領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及表達(dá)融合外源表位N蛋白的重組小反芻獸疫病毒的構(gòu)建及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
小反會獸疫(Peste des petits ruminants, PPR)是由副黏病毒科麻疫病毒屬的小反會獸疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的急性、烈性傳染??；臨床以發(fā)熱、口炎、腹瀉和肺炎為特征。對山羊和綿羊等小反芻動物危害嚴(yán)重，給畜牧業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失[I]。PPR于2007年傳入我國西部邊境地區(qū)，導(dǎo)致局部疫情，對我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)形成嚴(yán)重威脅。小反芻獸疫病毒基因組為不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA，基因組長15948bp。從3’至5’依次分布著N、P、M、F、H、L基因，分別編碼核蛋白(N)、磷酸蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、融合基質(zhì)蛋白(F)、血凝素蛋白(H)和大聚合蛋白(L)這六種結(jié)構(gòu)蛋白，P基因還編碼兩種非結(jié)構(gòu)蛋白C和V。N蛋白為小反芻獸疫病毒的核衣殼蛋白，是PPRV中含量最豐富和免疫原性最強(qiáng)的結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中起主要的作用，其抗原性穩(wěn)定，在病毒感染的動物血清中針對N蛋白的抗體占主導(dǎo)地位，主要用于檢測診斷研究[2-4]，是引入外源表位用以構(gòu)建標(biāo)記疫苗的合適靶蛋白。防治小反芻獸疫的主要措施就是進(jìn)行疫苗免疫接種。常用的PPRV疫苗株Nigeria75/1是在Vero細(xì)胞上多次傳代致弱所獲得，是一種安全經(jīng)濟(jì)的疫苗，但該疫苗的缺陷在于無法區(qū)分自然感染動物與免疫接種動物[5]。我國西部小反芻獸疫疫情的防控需要有效的血清學(xué)監(jiān)控，因此標(biāo)記疫苗的研制有其必要性和緊迫性。本研究室小反芻獸疫病毒反向遺傳操作平臺的建立為小反芻獸疫標(biāo)記疫苗的構(gòu)建提供全新的技術(shù)途徑[6]，在此基礎(chǔ)之上本研究于PPRV N蛋白羧基端分別弓I入HA、FLAG、5B19表位，利用反向遺傳操作技術(shù)，分別成功拯救出表達(dá)融合外源表 位N蛋白的重組病毒，并對重組病毒的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。

發(fā)明內(nèi)容
核衣殼蛋白(nucleocapsid,N)是小反會獸疫病毒(pestedes petits ruminantsvirus, PPRV)中含量最豐富和免疫原性最強(qiáng)的結(jié)構(gòu)蛋白，是引入外源表位用以構(gòu)建標(biāo)記疫苗的合適靶蛋白。為構(gòu)建小反芻獸疫標(biāo)記疫苗，首先分別構(gòu)建了在N蛋白羧基端引入外源表位(HA:YPYDVPDYA ；FLAG:DYKDDDDK ;小鼠肝炎病毒S2糖蛋白的優(yōu)勢B細(xì)胞表位5B19:SPLLGCIGSTCAEDGN)的融合基因儼、Nflag, N5b19,并克隆至pCAGGS載體，以其替代PPRV反向遺傳拯救系統(tǒng)中的表達(dá)天然PPRV N蛋白的輔助質(zhì)粒后仍能夠成功拯救出小反芻獸疫病毒，且拯救效率前后相差無幾，表明融合外源表位后對N蛋白的功能影響不大。隨后分別以N'Nflag, N5b19基因替換PPRV感染性克隆中的N基因，體外救獲表達(dá)融合外源表位N蛋白的重組病毒。蛋白印跡試驗和間接免疫熒光試驗表明分別融合外源表位的N蛋白獲得了正確表達(dá)；體外生長動力學(xué)試驗分析表明重組病毒的生長最高滴度雖比親本毒低，但并不影響其今后作為標(biāo)記疫苗的使用。小鼠免疫試驗表明，本研究構(gòu)建的三種標(biāo)記疫苗rPPRV/GFP/NHA、rPPRV/GFP/NFLAG, rPPRV/GFP/N5B19都能夠誘導(dǎo)特異性的針對外源表位的抗體，具有顯著的標(biāo)記作用，同時誘導(dǎo)的PPRV病毒中和抗體能夠100%轉(zhuǎn)陽。這些結(jié)果初步表明標(biāo)記疫苗在山羊、綿羊等小反芻動物上使用的使用價值，不但能夠提供區(qū)別自然感染和疫苗免疫感染的外源標(biāo)記基因的抗體，還能夠提供顯著的PPRV病毒中和抗體以預(yù)防小反芻獸疫，是預(yù)防小反芻獸疫的新一代的標(biāo)記弱毒疫苗。更具體地，本發(fā)明提供以下各項:1.一種重組小反芻獸疫病毒，在所述病毒的基因組中，在編碼磷酸蛋白(P)和基質(zhì)蛋白(M)的基因之間插入有編碼綠色熒光蛋白(GFP)的基因，其特征在于:在所述病毒的基因組中，在編碼核蛋白(N)的基因的羧基端融合有編碼外源表位的基因。2.根據(jù)第I項所述的重組小反芻獸疫病毒，其中所述外源表位是HA。3.根據(jù)第2項所述的重組小反芻獸疫病毒，其基因組的核酸序列如SEQ ID N0.1的1116-17936位所示。4.根據(jù)第I項所述的重組小反芻獸疫病毒，其中所述外源表位是FLAG。5.根據(jù)第4項所述的重組小反芻獸疫病毒，其基因組的核酸序列如SEQ ID N0.2的1116-17933位所示。6.根據(jù)第I項所述的重組小反芻獸疫病毒，其中所述外源表位是5B19。7.根據(jù)第6項所述的重組小反芻獸疫病毒，其基因組的核酸序列如SEQ ID N0.3的1116-17957位所示。8.根據(jù)第1-7項中任一項所述的重組小反芻獸疫病毒在制備標(biāo)記的小反芻獸疫病毒疫苗中的用途。
9.利用根據(jù)第1-7項中任一項所述的重組小反芻獸疫病毒制備的標(biāo)記的小反芻
獸疫病毒疫苗。10.根據(jù)第1-7項中任一項所述的重組小反芻獸疫病毒用作標(biāo)記的小反芻獸疫病毒疫苗的用途。


圖1:融合外源表位的重組病毒的構(gòu)建。圖1A:將分別以引物pprv-N-F和pprv-Nm-R (或 pprv_NFUG-R 或 pprv_N5B19-R)、pprv_P_F 和 pprv-P-R 擴(kuò)增的 PCR 產(chǎn)物①(或③)和②克隆至質(zhì)粒pC1-1211-N/P/M-GFP的XhoI位點；圖中E表示外源表位HA、FLAG、5B19。圖1B:用Rsr II酶切來自質(zhì)粒pBlue-F/H/L的F-H-L片段，克隆至同樣酶切的質(zhì)粒Pc1-UI1-NhaAVM-GFP (或 pNg75/l-GFP/NFLA(:或 pNg75/l_GFP/N5B19)，圖中 E 表示外源表位HA、FLAG、5B19。圖2:輔助質(zhì)粒 pCAGGS-Nha、PCAGGS-Nfug、pCAGGS_N5B19 對病毒拯救的影響。A、C、E:用輔助質(zhì)粒pCAGGS-N、pCAGGS-P、pCAGGS-L拯救rPPRV/GFP病毒；B:用輔助質(zhì)粒PCAGGS-Nha, pCAGGS-P、pCAGGS-L拯救rPPRV/GFP病毒(其對照組為圖A) ；D:用輔助質(zhì)粒PCAGGS-Nflag, pCAGGS-P、pCAGGS-L拯救rPPRV/GFP病毒(其對照組為圖C) ;F:用輔助質(zhì)粒pCAGGS-N5B19, pCAGGS-P、pCAGGS-L 拯救 rPPRV/GFP 病毒(其對照組為圖 E)。圖3:蛋白印跡檢測外源表位在重組病毒感染vero細(xì)胞中的表達(dá)。1:免疫印跡檢測感染rPPRV/GFP/N 的細(xì)胞表達(dá)的HA表位；11:免疫印跡檢測感染rPPRV/GFP/NFUG的細(xì)胞表達(dá)的FLAG表位；111:免疫印跡檢測感染rPPRV/GFP/N5B19的細(xì)胞表達(dá)的5B19表位；A:使用鼠抗HA單抗；C:使用鼠抗FLAG單抗；E:使用鼠抗5B19單抗；B、D、F:使用兔抗PPRVN多抗；1:標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量；2:陰性對照(mock) ；3:rPPRV/GFP感染細(xì)胞；I_4:rPPRV/GFP/Nha 感染的細(xì)胞；I1-4:rPPRV/GFP/NFLAG 感染的細(xì)胞；II1-4:rPPRV/GFP/N5B19 感染的細(xì)胞。圖4:間接免疫熒光檢測重組病毒感染Vero細(xì)胞后外源表位的表達(dá)。圖 5:rPPRV/GFP/Nm, rPPRV/GFP/NFLAG、rPPRV/GFP/N5B19 和 rPPRV/GFP 病毒在 Vero細(xì)胞上的生長曲線。圖6:小鼠免疫試驗。Ctl-5B19、Ctl-HA, Ctl-FLAG分別表示以rPPRV/GFP免疫小鼠的血清分別檢測5B19、HA、FLAG的抗體，作為各自外源表位的陰性對照；*、#、$表示P< 0.05。
具體實施例方式材料和方法1.重組質(zhì)粒、病毒、動物和細(xì)胞表達(dá)GFP的重組PPRV感染性克隆質(zhì)粒pN75/l_GFP，輔助質(zhì)粒pCAGGS_N、pCAGGS-P、pCAGGS-L 及 pBlue-F/H/L、pC1-12I1-N/P/M-GFP 質(zhì)粒由本實驗室構(gòu)建并保存[7](參見發(fā)明專利，專利號:201010559545.8);表達(dá)GFP的重組小反芻獸疫病毒rPPRV/GFP由本實驗室制備并保存[7](參見國家發(fā)明專利，專利號:201010559545.8)，rPPRV/GFP滴度在Vero細(xì)胞(ATCC N0.CCL-81)上測定。BALB/C小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。2.主要試劑 Primer Star HS DNA聚合酶購自TaKaRa公司；快速克隆試劑盒(ClonExpress one step Cloning Kit)購自南京諾唯贊(vazyme)生物技術(shù)有限公司；T4 DNA連接酶及其它限制性內(nèi)切酶均購自NEB公司；抗撤taq MAb購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；抗FLAG taq MAb購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗PPRV N蛋白的高免血清由本實驗室制備并保存(該高免血清由原核表達(dá)的PPRV N蛋白經(jīng)純化后免疫新西蘭大白兔所獲得，具體參見文獻(xiàn)[8]);鼠抗5B19的高免血清由本實驗室制備并保存(在上海捷瑞生物工程有限公司合成偶聯(lián)多肽5B19-KLH[完全商品化的]，該多肽多次免疫BALB/c小鼠獲得抗5B19的高免血清)；TRITC標(biāo)記山羊抗鼠IgG熒光抗體、TRITC標(biāo)記山羊抗兔IgG熒光抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗小鼠IgG抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體購自Sigma公司；鼠源反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)試劑盒以及磷酸I丐轉(zhuǎn)染試劑盒(Calciumphosphate Transfection Kit)均購自Invitrogen公司；小量病毒RNA抽提試劑盒購自上海華舜生物技術(shù)有限公司。3.引物根據(jù)GenBank中PPRV Nigeria 75/1毒株的全長基因組(HQ197753.1)基因序列，結(jié)合外源表位特點，設(shè)計將融合外源表位的N基因克隆至感染性全長cDNA的引物以及RT-PCR鑒定引物。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成(表I)。表I引物設(shè)計
權(quán)利要求
1.一種重組小反芻獸疫病毒，在所述病毒的基因組中，在編碼磷酸蛋白(P)和基質(zhì)蛋白(M)的基因之間插入有編碼綠色熒光蛋白(GFP)的基因，其特征在于:在所述病毒的基因組中，在編碼核蛋白(N)的基因的羧基端融合有編碼外源表位的基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組小反芻獸疫病毒，其中所述外源表位是HA。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組小反芻獸疫病毒，其基因組的核酸序列如SEQID N0.1的1116-17936位所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組小反芻獸疫病毒，其中所述外源表位是FLAG。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組小反芻獸疫病毒，其基因組的核酸序列如SEQID N0.2的1116-17933位所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組小反芻獸疫病毒，其中所述外源表位是5B19。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組小反芻獸疫病毒，其基因組的核酸序列如SEQID N0.3的1116-17957位所示。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項所述的重組小反芻獸疫病毒在制備標(biāo)記的小反芻獸疫病毒疫苗中的用途。
9.利用根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項所述的重組小反芻獸疫病毒制備的標(biāo)記的小反芻獸疫病毒疫苗。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-7 中任一項所述的重組小反芻獸疫病毒用作標(biāo)記的小反芻獸疫病毒疫苗的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫標(biāo)記疫苗領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及表達(dá)融合外源表位N蛋白的重組小反芻獸疫病毒的構(gòu)建及應(yīng)用。
文檔編號C12N7/01GK103224914SQ20131018286
公開日2013年7月31日 申請日期2013年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月17日
發(fā)明者步志高, 陳偉業(yè) 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所